Summary
We beschrijven een aanpak om invasieve celsubpopulaties in realtime te detecteren en vast te leggen. Het experimentele ontwerp maakt gebruik van Real-Time Cellular Analysis door veranderingen in de elektrische impedantie van cellen te monitoren. Invasieve kanker, immuun-, endotheel- of stromale cellen in complexe weefsels kunnen worden vastgelegd en de impact van coculturen kan worden beoordeeld.
Abstract
Invasie en gemetastaseerde verspreiding van kankercellen zijn de belangrijkste doodsoorzaak van kanker. Assays die al vroeg zijn ontwikkeld om het invasieve potentieel van kankercelpopulaties te meten, genereren meestal een enkele eindpuntmeting die geen onderscheid maakt tussen subpopulaties van kankercellen met verschillende invasieve mogelijkheden. Ook bestaat de tumormicro-omgeving uit verschillende residente stromale en immuuncellen die veranderen en deelnemen aan het invasieve gedrag van kankercellen. Invasie in weefsels speelt ook een rol bij subpopulaties van immuuncellen die micro-organismen afweren of zieke cellen uit het parenchym en endotheelcellen elimineren tijdens weefselremodellering en angiogenese. Real-Time Cellular Analysis (RTCA) die impedantiebiosensoren gebruikt om celinvasie te monitoren, was een grote stap voorwaarts dan eindpuntmeting van invasie: dit biedt continue metingen in de loop van de tijd en kan dus verschillen in invasiesnelheden onthullen die verloren gaan in de eindpunttest. Met behulp van de huidige RTCA-technologie hebben we arrays met twee kamers uitgebreid door een extra kamer toe te voegen die stromale en / of immuuncellen kan bevatten en waarmee de invasiesnelheid onder invloed van uitgescheiden factoren van co-gekweekte stromale of immuuncellen in de loop van de tijd kan worden gemeten. Daarnaast maakt het unieke ontwerp het mogelijk om kamers op elk moment los te maken en de meest invasieve kankercel of andere celsubpopulaties die aanwezig zijn in heterogene mixen van geteste tumorisolaten te isoleren. Deze meest invasieve kankercellen en andere celsubpopulaties stimuleren kwaadaardige progressie naar gemetastaseerde ziekte, en hun moleculaire kenmerken zijn belangrijk voor diepgaande mechanistische studies, de ontwikkeling van diagnostische sondes voor hun detectie en de beoordeling van kwetsbaarheden. De opname van geneesmiddelen met kleine of grote moleculen kan dus worden gebruikt om het potentieel te testen van therapieën die zich richten op kanker en / of subpopulaties van stromale cellen met als doel het remmen (bijv. Kankercellen) of het verbeteren (bijv. Immuuncellen) invasief gedrag.
Introduction
Celinvasie is een belangrijk proces waarmee cellen keldermembraanbarrières kunnen passeren als reactie op omgevingssignalen van stromale cellen. Het is een cruciale stap in verschillende stadia van ontwikkeling voor immuunresponsen, wondgenezing, weefselherstel en maligniteiten die kunnen evolueren van lokale laesies tot invasieve en gemetastaseerde kankers1. Assays die al vroeg zijn ontwikkeld om het invasieve potentieel van celpopulaties te meten, genereren meestal een enkele eindpuntmeting of vereisen pre-labeling van invasieve cellen2. De integratie van micro-elektronica en microfluïdica-technieken is nu ontwikkeld om verschillende aspecten van celbiologie te detecteren, zoals levensvatbaarheid, beweging en hechting met behulp van de elektrische impedantie van levende cellen op micro-elektroden 3,4. Impedantiemeting maakt een labelvrije, niet-invasieve en kwantitatieve beoordeling van de celstatusmogelijk 3. Hier beschrijven we een array met drie kamers op basis van het ontwerp van het Real-Time Cellular Analysis (RTCA) -systeem dat werd ontwikkeld door Abassi et al.5. De driekamerige array maakt het mogelijk om co-gekweekte cellen te beoordelen op cellulaire invasie en herstel van invasieve cellen voor aanvullende analyses of uitbreiding.
In het celanalysatorsysteem dringen cellen binnen door een extracellulaire matrix die is gecoat op een poreus membraan en bereiken een interdigitated elektrode-array aan de andere kant van de barrière. Naarmate de invasieve cellen zich in de loop van de tijd blijven hechten en deze elektrode-array bezetten, verandert de elektrische impedantie parallel. Het huidige systeem bestaat uit een celinvasie en migratie (CIM) 16-well plaat met twee kamers. Het RTCA-DP (dual purpose) (voortaan dual purpose cell analyzer genoemd) instrument bevat sensoren voor impedantiemeting en geïntegreerde software om de impedantiegegevens te analyseren en te verwerken. Impedantiewaarden bij baseline zijn afhankelijk van de ionische sterkte van media in de putten en worden veranderd als cellen zich aan de elektroden hechten. De impedantieveranderingen zijn afhankelijk van het aantal cellen, hun morfologie en de mate waarin cellen zich aan de elektroden hechten. Een meting van de putten met media voordat de cellen worden toegevoegd, wordt beschouwd als het achtergrondsignaal. De achtergrond wordt afgetrokken van impedantiemetingen na het bereiken van evenwicht met cellen die zich hechten en verspreiden op de elektroden. Een eenheidsloze parameter van de status van de cellen op een elektrode genaamd Cell Index (CI) wordt als volgt berekend: CI = (impedantie na evenwicht - impedantie bij afwezigheid van cellen) / nominale impedantiewaarde6. Wanneer migratiesnelheden van verschillende cellijnen worden vergeleken, kan de Delta CI worden gebruikt om de celstatus te vergelijken, ongeacht het verschil in hechting dat wordt weergegeven in de eerste paar metingen.
De nieuw ontworpen array met drie kamers bouwt voort op het bestaande ontwerp en maakt gebruik van de bovenste kamer van het dual purpose cell analyzer-systeem dat de elektroden bevat. De gemodificeerde midden- en onderkamers zijn aangepast om de assemblage in de dual purpose celanalysator te passen voor impedantiemeting en -analyse met behulp van de geïntegreerde software. De twee belangrijkste verbeteringen die het nieuwe ontwerp biedt ten opzichte van de bestaande CIM-plaat met twee kamers (voortaan celanalysatorplaat genoemd) zijn: i) het vermogen om invasieve celsubpopulaties die aanwezig zijn in heterogene celmengsels te herstellen en vervolgens te analyseren en ii) de optie om de impact van uitgescheiden factoren van co-gekweekte stromale of immuuncellen op celinvasie te beoordelen (figuur 1).
Deze technologie kan nuttig zijn bij het bestuderen van de subpopulaties van cellen met verschillende invasieve capaciteiten. Dat omvat (a) invasieve kankercellen die omliggende weefsels of bloed- en lymfevaten binnendringen of extravaseren op gemetastaseerde zaaiplaatsen in verre organen, (b) cellen van het immuunsysteem die weefsels binnendringen om ziekteverwekkers of zieke cellen aan te pakken, (c) endotheelcellen die weefsels binnendringen om nieuwe bloedvaten te vormen tijdens weefselreorganisatie of wondgenezing, evenals (d) stromale cellen uit de tumormicro-omgeving die samen met kankercellen ondersteunen en binnendringen. De aanpak maakt de opname van stromale cross-talk mogelijk die de celmotiliteit en invasie kan moduleren. De hier getoonde haalbaarheidsstudies gebruiken deze gemodificeerde array gericht op kankercelinvasie en de interactie met het stroma als een modelsysteem, inclusief endotheelinvasie als reactie op differentiële signalen van kankercellen. De aanpak kan worden geëxtrapoleerd om kankercellen en andere celtypen zoals subpopulaties van immuuncellen, fibroblasten of endotheelcellen te isoleren. We hebben invasieve en niet-invasieve gevestigde borstkankercellijnen getest als een proof of principle. We gebruikten ook cellen van patiënt-afgeleide xenograft (PDX) invasie in reactie op immuuncellen uit menselijk beenmerg om haalbaarheid aan te tonen voor toekomstig gebruik, ook in klinische diagnostische omgevingen. PDX zijn tumorweefsels van patiënten die worden geïmplanteerd in immuungecompromitteerde of gehumaniseerde muizenmodellen om studie van groei, progressie en behandelingsopties voor de oorspronkelijke patiënt mogelijk te maken 7,8.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
De studie werd beoordeeld en beschouwd als "vrijgesteld" door de Institutional Review Board van Georgetown University (IRB # 2002-022). Vers geoogste beenmergweefsels werden verzameld uit afgedankte gezonde menselijke beenmergverzamelingsfilters die waren gedeïdentificeerd.
1. Nieuw kamerontwerp (figuur 2)
- Open een nieuwe tweekamercelanalysatorplaat. Zet de bovenste kamer opzij met elektroden.
- Scheer met behulp van een freesmachine 2 mm van de U-vormige bodemputten van de celanalysatorplaat af.
- Bevestig een polyethersulfon (PES) membraan van 2 cm x 7 cm met een poriegrootte van 0,2 μm aan de onderkant van de geschoren putten met behulp van UV-samengestelde lijm. Laat 30 minuten curatietijd om ervoor te zorgen dat de lijm volledig is uitgehard en inert.
- Snijd met behulp van een freesmachine twee langsspleten (1,5 mm x 5,6 mm) langs de zijkanten uit om in de ribbels van de nieuw gefabriceerde derde kamer te klikken.
- Maak met behulp van een freesmachine een derde polycarbonaatkamer die de totale afmetingen van de celanalysatorplaat repliceert; 72 mm x 18 mm (Materiaaltafel).
- Maak putten van 4,8 mm diep en een diameter van 4,75 mm om het 16-well ontwerp van de celanalysatorplaat te repliceren. Dit maakt 90 μL volume per put mogelijk.
- Maak aan de zijkanten twee driehoekige richels zodat de kamer vastzit in de oorspronkelijke spleten die in stap 1.4 zijn gemaakt. Het horizontale deel van de driehoek is 1, 5 mm, het verticale is 1, 4 mm en de hypotenusa is 2,052 mm.
- Maak een knop aan de korte kant met een diameter van 50,8 mm en een hoogte van 1,397 mm die in de inkeping van de originele plaat past (figuur 2, midden).
- Gebruik een 0,9 mm dikke rubberen ring voor elke put om een afgedichte pasvorm te bieden.
2. Celcultuur (MDA-MB-231, DCIS, DCIS-Δ4, J2-fibroblasten)
- Was aanhangende celculturen (~70% confluentie) met 1x fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS).
- Voeg 0,05% trypsine-EDTA-oplossing toe om de cellen op te tillen.
- Neutraliseer de trypsineoplossing met celkweekmedia die serum bevatten en tel de cellen met behulp van een aliquot van de celsuspensie.
OPMERKING: De specifieke celkweekmedia zijn te vinden in tabel 1.
3. Van de patiënt afgeleide xenograftdissociatie
- Hak een vers tumorstuk (1 cm2) in fijne brij met behulp van een steriel scalpel.
- Plaats in een conische buis van 50 ml met 20 ml DMEM F12-media aangevuld met 3 mg / ml trypsine en 2 mg / ml collagenase.
- Incubeer in een thermische shaker (150 RPM) bij 37 °C gedurende 20 min.
- Draai de buis op 500 x g gedurende 5 minuten; verwijder het supernatant.
- Voeg 20 μL DMEM F12 + 2% FBS toe om de cellen te wassen; draai gedurende 5 minuten op 300 x g en verwijder het supernatant. Herhaal het wassen nog twee keer.
- Resuspend in 1 ml PDX-media (tabel 1) om de cellen te tellen.
4. Extractie van beenmergcellen
- Spoel het beenmerg (BM) opvangfilter door met 25 ml 1x PBS.
OPMERKING: In deze studie werd PBS toegevoegd aan een gebruikt BM-verzamelfilter van het ziekenhuis om de resterende BM in het filter te verzamelen. - Voeg de gespoelde BM langzaam toe aan een conische buis van 50 ml met 25 ml dichtheidsgradiëntmedium, waarbij u ervoor zorgt dat de lagen zo gescheiden mogelijk blijven.
- Draai bij 800 x g gedurende 20 min bij 18 °C
- Hevel de bovenste lagen af na centrifugering (vet/plasma) en breng 5 ml van de witte laag over boven het dichtheidsgradiëntmedium dat de BM-cellen heeft naar een conische buis van 15 ml.
OPMERKING: U kunt ook een pipet van 5 ml in de bovenste laag dopen totdat deze de middelste laag (BM) raakt en de middelste laag heel langzaam pipetteren zonder de pipet te verplaatsen. - Vul de conische buis van 15 ml met 1x PBS (~ 10 ml) en draai gedurende 15 minuten op 300 x g .
- Verwijder het supernatant; de resterende witte pellet is de BM.
- Als rode bloedcellen in de pellet worden waargenomen, voeg dan 5 ml RBC-lysisoplossing (Table of Materials) toe en laat deze 5 minuten bij kamertemperatuur (RT) zitten. Draai gedurende 5 minuten op 300 x g en verwijder het supernatant.
- Voeg 10 ml 1x PBS toe om de cellen te wassen, draai gedurende 5 minuten op 300 x g en verwijder het supernatant. Herhaal de RBC-lysis (stap 4.7) totdat de pellet wit is.
5. Celzaaien en assemblage
- Plaats alle drie de steriele kamers in de weefselkweekkap.
- Zoek de knop aan de korte kant van de onderste kamer. Oriënteer de onderste kamer zodat de knop naar de experimentator is gericht.
- Voeg 30.000-50.000 cellen in 90 μL media toe aan elke put van de onderste kamer. Vermijd het vormen van bubbels. Dit zijn de stromale cellen die uitgescheiden factoren leveren, maar niet worden gedetecteerd door de elektroden van de bovenste kamer.
- Gebruik 5% foetale runderserum-aangevulde media in twee onderste kamerputten als een positieve controle voor de beweeglijkheid van de cel. Gebruik 0% serum-aangevulde media als een negatieve controle.
- Laat de onderste kamer met de cellen 10-15 minuten in de kap zitten om te bezinken.
OPMERKING: Deze stap wordt aanbevolen als cellen hechten of in suspensie groeien. - Draai de onderste kamer op 90° en plaats de middelste kamer bovenop zodat de knop op de onderste kamer in de inkeping op de middelste kamer schuift.
OPMERKING: De knop op de onderste kamer en de blauwe stip op de middelste kamer bevinden zich aan tegenovergestelde uiteinden van de assemblage. - Druk verticaal naar beneden totdat er een klikgeluid klinkt van elk van de lange zijden van de assemblage.
- Voeg 160 μL serumvrije media toe aan alle putjes van de middelste kamer.
- Zorg ervoor dat een koepelvormige meniscus zichtbaar is nadat putten zijn gevuld; Anders past u het uiteindelijke volume aan op basis van de pipetkalibratie. Vermijd het vormen van bubbels.
- Plaats de bovenste kamer met elektroden naar beneden gericht op de middelste kamer en zorg ervoor dat u de blauwe stippen op de middelste en bovenste kamers uitlijnt.
- Druk verticaal naar beneden totdat er een klikgeluid klinkt van elk van de lange zijden van de assemblage.
- Voeg 25-50 μL serumvrije media toe aan de bovenste kamer.
- Monteer de assemblage op de dual purpose cell analyzer in de weefselkweekincubator en wacht 30 minuten voordat u de achtergrond meet.
OPMERKING: Deze tijd is nodig om de array in evenwicht te brengen en kan worden gebruikt om de cellijnen voor te bereiden die aan de bovenste kamer moeten worden toegevoegd. - Meet de achtergrond (zie rubriek 6) en plaats de montage terug in de weefselkweekkap.
- Voeg 30.000-50.000 cellen in 100 μL serumvrije media toe aan elke put van de bovenste kamer. Dit zijn de cellen die de elektrode zal detecteren zodra ze met succes door het membraan migreren.
OPMERKING: Om een maximale respons te bereiken, wordt aanbevolen om cellen gedurende 6-18 uur in serumvrije of lage serummedia te laten groeien voordat de test wordt uitgevoerd. - Laat de assemblage 30 minuten in de kap staan voordat u deze op de dual purpose cell analyzer monteert voor impedantiemeting.
6. Achtergrond- en impedantiemeting
- Plaats de array in de houder in het dual purpose cell analyzer-instrument.
- Open de celanalysatorsoftware en selecteer de houder die moet worden gebruikt.
- Klik op het tabblad Bericht en zorg ervoor dat er Verbindingen OK staan om ervoor te zorgen dat de array goed in de houder is geplaatst en de elektroden goed zijn uitgelijnd met de sensoren.
- Klik op het tabblad Experimentnotities en vul zoveel mogelijk informatie over het experiment in.
- Klik op het tabblad Lay-out en vul de beschrijving van de array-indeling in.
- Klik op het tabblad Schema en voeg twee stappen toe vanuit het menu Stappen ; een achtergrondstap (één sweep) en een teststap met 100 sweeps- een sweep om de 15 minuten, in totaal 25 uur.
- Nadat de array gedurende 30 minuten in de incubator voor dual purpose cell analyzer heeft gelegen, klikt u op de knop Afspelen om de achtergrondmeting te starten. Er verschijnt een venster waarin wordt gevraagd om de map te kiezen waarin u de gegevens wilt opslaan.
- Nadat de achtergrondmeting is uitgevoerd, verwijdert u de array uit de houder en plaatst u deze terug in de celkweekkap.
- Voeg cellen toe aan de bovenste kamer zoals beschreven in stap 5.13 en houd de assemblage gedurende 30 minuten in de weefselkweekkap voordat de cellen bezinken.
- Plaats de array terug in de dual purpose cell analyzer en controleer op het tabblad Bericht op het bericht Verbindingen OK .
- Klik op de knop Afspelen om de impedantiemeting te starten.
- Klik op het tabblad Plot om de voortgang van het signaal te volgen.
- Als het eindpunt vóór 25 uur is bereikt, klikt u op de stap Afbreken in het vervolgkeuzemenu Uitvoeren .
- Als u gegevens wilt exporteren, klikt u met de rechtermuisknop op de grafiek, kiest u Kopiëren in de lijstindeling en plakt u de gegevens in een spreadsheet.
OPMERKING: De gegevens kunnen worden geëxporteerd als celindex of deltacelindex. Grafiek- en/of lay-outinformatie kan ook worden gekozen voor export.
7. Onthechting en celverzameling
- Bewaak de migratiesnelheid in realtime op de dual purpose cell analyzer om het stoppunt van belang te bepalen (6-18 uur).
OPMERKING: Het stoppunt hangt af van de invasiesnelheid van de cel en wanneer een duidelijk invasiesignaal van de negatieve controle wordt bereikt. - Eenmaal bereikt, ontkoppelt u de assemblage van de dual purpose cell analyzer en plaatst u deze in de weefselkweekkap.
- Bereid een passend aantal microcentrifugebuizen van 1,5 ml voor om de cellen uit de betreffende putten te verzamelen.
- Plaats de assemblage in een schaal van 10 cm om vloeistoffen te bevatten wanneer de kamers loskomen.
- Duw de flexibele knakkende uiteinden aan de lange kant van de middelste kamer naar binnen totdat er een klikgeluid te horen is.
- Demonteer de bovenste kamer en keer deze om in een nieuwe schaal van 10 cm.
- Gebruik een cellifter met een mes van 13 mm om de cellen te verzamelen uit alle putten met dezelfde experimentele toestand (d.w.z. celtype, medicamenteuze behandeling, enz.).
OPMERKING: Ontwerp de opstelling om ten minste twee putten te hebben voor elke experimentele toestand om statistisch significante verandering van negatieve controles te bereiken. - Spoel of dompel het mes in 1x fosfaat gebufferde zoutoplossing om de cellen te verzamelen in microcentrifugebuizen van 1,5 ml.
- Draai de cellen gedurende 5 minuten op 500 x g .
- De verzamelde cellen voortplanten (zie rubriek 8) of eindpuntanalyse uitvoeren, zoals eencellige RNA-seq.
OPMERKING: Gebruik voor bulk RNA-seq een RNA-extractiekit met een laag celgetal.
8.3D celvoortplanting en -opvraging
OPMERKING: Vanwege het kleine aantal verzamelde cellen, zaait u de cellen in 3D met behulp van een extracellulaire matrix (ECM) om de levensvatbaarheid te verbeteren. Dat gezegd hebbende, 2D-cultuur is op dit moment ook een optie, vooral als de gebruikte cellen afkomstig zijn van gevestigde cellijnen.
- Ontdooi een aliquot van de keldermembraanmatrix bij 4 °C 's nachts. Houd de keldermembraanmatrix op ijs totdat deze klaar is voor gebruik.
- Voeg 25 μL koude keldermembraanmatrix toe aan de pellet van levende cellen en pipetteer voorzichtig op en neer om te mengen. Vermijd het vormen van bubbels.
- Voeg het cel-keldermembraanmatrixmengsel toe aan de bodem van een kleine weefselkweekput (d.w.z. in een 96-putplaat) en vorm een koepel. Probeer de muren van de put niet aan te raken. Incubeer bij 37 °C gedurende 20 minuten voordat u voorzichtig 100 μL media druppelsgewijs toevoegt.
- Om cellen op te halen, aspirateer de media en voeg 100 μL dispase toe aan elke put.
- Incubeer bij RT gedurende 10 minuten, pipetteer af en toe op en neer.
- Breng de cellen en de opgeloste keldermembraanmatrix over in een microcentrifugebuis van 1,5 ml. Voeg 1 ml 1x PBS toe, draai gedurende 5 minuten op 300 x g en verwijder het supernatant. Herhaal de wasbeurt één keer.
- Aspirateer de supernatant. Splits de cellen in de pellet of voer eindpuntanalyse uit.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Met behulp van de nieuw ontworpen driekamerige array werd invasie van de cellen getest in de aan- of afwezigheid van stromale cellen zoals fibroblasten. MDA-MB-231 celinvasie werd versterkt wanneer bestraalde Zwitserse 3T3 fibroblasten (J2-stam) in de onderste kamer werden gezaaid, waardoor de uitwisseling van factoren tussen de twee cellijnen mogelijk werd. Interessant is dat de MDA-MB-231-invasie toenam wanneer 3T3-J2-cellen in aantal werden verdubbeld (figuur 3A). Aan de andere kant lijkt de invasiesnelheid van een invasieve kloon van MCFDCIS-cellen (DCIS-Δ4)9 te worden geremd door de cross-talk met 3T3-J2-cellen (figuur 3B). Deze gegevens tonen de nuttige toepassing van de driekamerige array om verschillende effecten van het stroma, in dit geval fibroblasten, op celinvasie te meten.
Vervolgens werden, om de verandering in de beweeglijkheid en invasie van endotheelcellen te volgen als reactie op signalen van invasieve (MDA-MB-231)10,11 of niet-invasieve (DCIS)12 kankercellen, menselijke navelstrengas endotheelcellen (HUVECs) die endotheelcellen vertegenwoordigen die de wanden van bloedvaten bekleden. HUVECs waren invasiever als reactie op factoren die werden uitgescheiden door MDA-MB-231-cellen, in tegenstelling tot die uitgescheiden door DCIS-cellen (figuur 4). Dit komt overeen met het vermogen van invasieve tumoren om endotheelcellen te rekruteren voor de vorming van bloedvaten en latere verspreiding in de bloedsomloop.
De bovenstaande gegevens tonen het vermogen van het celanalysatorsysteem om verschillende invasiesnelheden van cellijnen te volgen; wanneer de invasie begint, vordert en plateaus. Hierdoor kan de gebruiker het tijdspunt van belang kiezen, bijvoorbeeld na de eerste 2-3 uur van invasie, om de pionierscellen te vangen die een invasie initiëren en zich onderscheiden van de volgcellen die daarna binnenvallen door collectieve invasie.
Hoewel de bovenstaande gegevens een solide bewijs van principe aantonen voor het gebruik van de driekamerige array om invasie in een co-cultuuromgeving te observeren, wilden we de potentiële bruikbaarheid van deze array in klinische en diagnostische omgevingen testen. Daarvoor werd de invasie van celsuspensies van patiënt-afgeleide xenografts (PDX)8 gecokweekt met immuuncellen uit menselijke beenmergmonsters gemonitord. Totale menselijke beenmerg immuuncellen (BM) werden gezaaid op de onderste kamer met of zonder serum. Pdx-cellen invasie van de bovenste kamer nam toe als reactie op co-gekweekte BM-immuuncellen (figuur 5). Interessant is dat de aanwezigheid van 2% serum in de onderste kamer met de BM-cellen essentieel was voor PDX-invasie.
Figuur 1: Workflow van het celinvasiemonitoring- en celverzamelingssysteem. (A) Stromacellen worden toegevoegd aan de onderste kamer die op een middelste kamer is gemonteerd, die dient als een celbarrière die alleen doorlaatbaar is voor oplosbare factoren. (B) De bovenste kamer met impedantiebiosensoren ontvangt de te bewaken cellijn. Real-time invasie wordt geregistreerd totdat een door de gebruiker gedefinieerd tijdspunt voor celverzameling is bereikt. (C) De gedemonteerde bovenste kamer wordt omgekeerd en cellen worden geoogst met behulp van een cellifter. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Afbeeldingen van de arraykamers en modificaties. (A) De drie kamers die werden gebruikt om de array te bouwen. Er werd geen wijziging aangebracht aan de bovenste kamer met de elektroden. (B) Vanuit de middelste kamerputten is een hoogte van 2 mm afgeschoren en een membraan aan de open bodem bevestigd; aan elke zijde werden langsspleten (1,5 mm x 5,6 mm) toegevoegd. (C) Onderste kamer (72 mm x 18 mm) vervaardigd om het ontwerp met 16 putten te repliceren; putten zijn 4,8 mm diep en 4,75 mm in diameter, driehoekige ribbels (1,5 mm horizontaal x 1,4 mm verticaal) worden langs de zijkanten toegevoegd om in de spleten van de middelste kamer te klikken. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Het effect van co-gekweekte fibroblasten op de invasie van kankercellen. (A) Real-Time Cellulaire Analyse van MDA-MB-231 celinvasie, alleen of in co-cultuur met 3T3-J2 fibroblasten (onderste kamer). 3T3-J2 fibroblasten werden gezaaid bij 30.000 of 60.000 cellen per put. (B) Real-Time Cellulaire Analyse van DCIS-Δ4 cel invasie, alleen of in co-cultuur met 3T3-J2 fibroblasten (onderste kamer). De vaste cirkels vertegenwoordigen het gemiddelde; de dunne stippellijnen vertegenwoordigen de standaarddeviatie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Het effect van kankercellen op endotheelcelinvasie. Real-Time Cellulaire Analyse van HUVEC invasie, alleen, in co-cultuur met de invasieve MDA-MB-231 cellen (onderste kamer) of de niet-invasieve DCIS cellen (onderste kamer). De vaste cirkels vertegenwoordigen het gemiddelde; de dunne stippellijnen vertegenwoordigen de standaarddeviatie. Deltacelindex genormaliseerd naar de impedantie op tijdstip = 1 h. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 5: Celinvasie van patiënt-afgeleide xenografts (PDX) samen gekweekt met beenmerg immuuncellen. Afzonderlijke cellen gedesintegreerd uit PDX (bovenste kamer) werden samen met menselijke beenmergcellen (onderste kamer) gekweekt en hun invasie werd in de loop van de tijd gevolgd in de aan- of afwezigheid van serum. De vaste cirkels vertegenwoordigen het gemiddelde; de dunne stippellijnen vertegenwoordigen de standaarddeviatie. Deltacelindex genormaliseerd naar de impedantie op tijdstip = 1 uur en 36 min. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
| Media | Kiezers | Concentratie/verhouding |
| MDA-MD-231 media | Dmem | |
| Foetaal runderserum (FBS) | 10% | |
| J2 Fibroblasten media | Dmem | |
| Foetaal runderserum (FBS) | 10% | |
| DCIS-media | DMEM F12 | |
| Paardenserum (HS) | 5% | |
| Epidermale groeifactor (EGF) | 20 ng/ml | |
| Insuline | 10 μg/ml | |
| Hydrocortison | 0,5 μg/ml | |
| Cholera toxine | 100 ng/ml | |
| PDX-media | DMEM F12 | |
| Foetaal runderserum (FBS) | 2% | |
| Hepes | 1 miljoen | |
| Insuline Transferrine Selenium Ethanolamine (ITS) | 10 μg/ml | |
| Hydrocortison | 0,5 μg/ml | |
| Runderserumalbumine (BSA) | 1mg/ml |
Tabel 1: Samenstelling van de celkweekmedia. De tabel bevat de samenstellingen van MDA-MD-231 media, J2 Fibroblasts media, DCIS media en PDX media.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
We hebben het ontwerp van een array met twee kamers aangepast om een derde kamer op te nemen voor het monitoren van celinvasie in realtime in aanwezigheid van stromale cellen. We hebben verschillende effecten van co-gekweekte fibroblasten op invasieve en niet-invasieve kankercellen waargenomen, wat aangeeft dat de array kan worden gebruikt om onderscheid te maken tussen subpopulaties van kankercellen die anders reageren op factoren die worden geproduceerd door co-gekweekte stromale cellen. De array werd ook gebruikt om de invasie van endotheelcellen in stromale weefsels te volgen, een kritieke stap tijdens bloedvaten die ontkiemen in de richting van een angiogene stimulus in de aanwezigheid van kankercellen met een variërend invasief potentieel. Deze experimenten tonen het veelzijdige gebruik van de array voor kankercel- of andere celisolatie.
Het wordt aanbevolen om het aantal cellen dat aan elke kamer moet worden toegevoegd, te optimaliseren. Uit onze ervaring en de aanbeveling van de fabrikant zijn 30.000-50.000 cellen optimaal. Aangezien twee celtypen in deze array kunnen worden gecocultiveerd, waarvan er één een primaire cultuur van stromacellen kan zijn, wordt voorgesteld om de effecten van verschillende media op cellen die worden gebruikt om de levensvatbaarheid te behouden, te controleren. We ontdekten dat uithongering van cellen die moeten worden gecontroleerd, de variatie tussen replicaties vermindert. Als serumvrije groeiomstandigheden schadelijk zijn voor de cellen, kunnen lage serum- en kortere uithongeringstijden worden gebruikt. De toevoeging van een lage serumhoeveelheid (1% -2%) kan van cruciaal belang zijn voor de overleving van stromale cellen (primaire cellen) in de onderste kamer, maar zorg ervoor dat u de juiste controlevoorwaarden voor gegevensinterpretatie opneemt (d.w.z. 2% serum met en zonder stromale cellen). Als de invasiepercentages laag zijn, kunnen meer putten per experimentele toestand het aantal levensvatbare cellen verhogen dat wordt verzameld voor downstream-analyses. Bij het analyseren van patiëntbiopten is de desintegratie van weefsel in afzonderlijke cellen cruciaal voordat het op de celanalysatorplaat wordt getest. Het optimaliseren van de desintegratieomstandigheden om de levensvatbaarheid van cellen te behouden is een belangrijke stap voordat de invasieanalyse wordt uitgevoerd. Het is ook mogelijk om aanvullende aspecten van invasie te bestuderen, zoals gevoeligheid voor medicamenteuze behandeling of het effect van extracellulaire keldermatrix (ECM) componenten op de invasiesnelheid. ECM is een essentieel onderdeel van de micro-omgeving en er is gemeld dat het een belangrijke rol speelt tijdens celinvasie13. Verschillende gepubliceerde studies hebben ECM gebruikt om de bovenste kamer te coaten voordat invasieve cellen worden toegevoegd om hun interactie met verschillende ECM-componenten te controleren14,15. De array met drie kamers is een nuttig hulpmiddel om co-kweekinteracties tussen invasieve en stromacellen te bestuderen. Hoewel het voorgestelde ontwerp een celverzameling garandeert die specifiek is voor de invasieve cellen zonder stromale cellen, is deze opstelling mogelijk niet optimaal als de cross-talk tussen cellen de fysieke interactie van de verschillende celtypen vereist. Bovendien mogen niet-hechtende cellen die in suspensie groeien niet worden verzameld in de voorgestelde methoden hier (slopen), maar een andere benadering waarbij media in de gedemonteerde kamers met de niet-hechtende cellen kunnen worden verzameld om de niet-hechtende cellen te oogsten.
Hoewel deze array kan worden gebruikt voor meerdere onderzoeksgebieden die celinvasie volgen in de aanwezigheid van een stromale component, hebben we ons hier gericht op kankercelinvasie en hoe deze aanpak kwaadaardige subpopulaties van kankercellen kan blootleggen die aanwezig zijn in heterogene biologische monsters. De nieuwe capaciteit van de driekamerige array die hier wordt gebruikt, biedt een functionele test om invasieve subpopulaties te isoleren van heterogene kankercelmengsels die meer en minder invasieve kankercellen bevatten. Analyse van invasieve en uitkomstrelevante subpopulaties van kankercellen is essentieel voor geschikte mechanistische studies en moleculaire inzichten die niet kunnen worden verkregen of bevooroordeeld door de analyse van een gemengde celpopulatie. De co-kweekkamer voor stromale cellen geeft inzicht in cel-cel cross-talk in de tumormicro-omgeving tijdens progressie naar invasieve ziekte.
Als een stap in de richting van toepassing op weefselmonsters, bijvoorbeeld tumorbiopten van patiënten, gebruikten we kankercellen die werden geïsoleerd uit patiënt-afgeleide tumor xenografts (PDX's) en testten we de impact van menselijke beenmergcellen op de invasie van tumorcellen. We waren in staat om de invasieve cellen in de PDX's te verzamelen voor downstream-analyse, d.w.z. RNA-seq. Het testen van PDX's is de eerste stap in de richting van het analyseren van celsubpopulaties die aanwezig zijn in de heterogene mix van kankercellen in tumorbiopten verkregen van patiënten. Het uiteindelijke doel zal zijn om dergelijke tumorbiopten te gebruiken en subpopulaties van kankercellen te isoleren die binnendringen en dus slechte resultaten veroorzaken vanwege hun potentieel voor gemetastaseerde verspreiding. Identificatie van de moleculaire kenmerken en het testen van de gevoeligheid van deze invasieve subpopulaties voor medicamenteuze behandeling zijn toekomstige toepassingen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Georgetown University heeft een patent ingediend met betrekking tot enkele van de benaderingen die in dit manuscript worden beschreven. G.M.S, A.W, L.D en M.P. worden genoemd als uitvinders op deze applicatie en verklaren dat als een potentieel belangenconflict.
Acknowledgments
We willen Dr. Alana Welms, Huntsman Cancer Institute, University of Utah, bedanken voor het verstrekken van de patiënt-afgeleide xenografts (HCI-010). Dit werk werd ondersteund door NIH-subsidies R01CA205632, R21CA226542 en gedeeltelijk door een subsidie van Agilent Technologies.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.05% Trypsin-EDTA | Thermofisher | 25300-054 | |
| Adhesive | Norland Optical Adhesive | NOA63 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma | A9418 | |
| Cell lifter | Sarstedt | 83.1832 | |
| Cholera Toxin from Vibrio cholerae | Thermofisher | 12585-014 | |
| CIM-plate | Agilent | 5665817001 | Cell analyzer plate |
| Collagenase from Clostridium histolyticum | Sigma | C0130 | |
| Dispase | StemCell | 7913 | |
| DMEM | Thermofisher | 11995-065 | |
| DMEM-F12 | Thermofisher | 11875-093 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS), Heat Inactivated | Omega Scientific | FB-12 | |
| HEPES | Thermofisher | 15630106 | |
| Horse serum (HS) | Gibco | 16050-122 | |
| Human EGF | Peprotech | AF-100-15 | |
| Human umbilical Vein endothelail cells (HUVEC) | LONZA (RRID:CVCL_2959) | C-2517A | |
| HUVEC media | LONZA | CC-3162 | |
| Hydrocortisone | Sigma | H4001 | |
| Insulin Transferrin Selenium Ethanolamine (ITSX) (100x) | Thermofisher | 51500056 | |
| Insulin, Human Recombinant, Zinc Solution | Sigma | C8052 | |
| J2 Fibroblasts | Stemcell (RRID:CVCL_W667) | 100-0353 | |
| LymphoPrep | Stemcell | 7851 | Density gradient medium for the isolation of mononuclear cells |
| Matrigel | Corning | 354230 | Basement membrane matrix |
| MCFDCIS.com cells ( DCIS) | RRID:CVCL_5552 | ||
| MDA-MB-231 cells | RRID:CVCL_0062 | ||
| Milling machine | Bridgeport Series 1 Vertical | ||
| Phosphate-buffered saline (1x) | Thermofisher | 10010049 | |
| Polyethersulfone (PES) membrane | Sterlitech | PCTF029030 | |
| RBC lysis solution | Stemcell | 7800 | |
| RNeasy Micro Kit | Qiagen | 74004 | |
| RTCA DP analyzer | Agilent | 3X16 | Dual purpose cell analyzer |
| Trypsin | Sigma | T4799 |
References
- Friedl, P., Gilmour, D. Collective cell migration in morphogenesis, regeneration and cancer. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 10 (7), 445-457 (2009).
- Boyden, S. The chemotactic effect of mixtures of antibody and antigen on polymorphonuclear leucocytes. The Journal of Experimental Medicine. 115 (3), 453-466 (1962).
- Xu, Y., et al. A review of impedance measurements of whole cells. Biosensors & Bioelectronics. 77, 824-836 (2016).
- Stylianou, D. C., et al. Effect of single-chain antibody targeting of the ligand-binding domain in the anaplastic lymphoma kinase receptor. Oncogene. 28 (37), 3296-3306 (2009).
- Abassi, Y. A., Wang, X., Xu, X. Real time electronic cell sensing system and applications for cytotoxcity profiling and compound assays. United States Patent. , 20050213374 1-88 (2013).
- Abassi, Y. A., et al. Label-free, real-time monitoring of IgE-mediated mast cell activation on microelectronic cell sensor arrays. Journal of Immunological Methods. 292 (1-2), 195-205 (2004).
- Morton, C. L., Houghton, P. J. Establishment of human tumor xenografts in immunodeficient mice. Nature Protocols. 2 (2), 247-250 (2007).
- DeRose, Y. S., et al. Tumor grafts derived from women with breast cancer authentically reflect tumor pathology, growth, metastasis and disease outcomes. Nature Medicine. 17 (11), 1514-1520 (2011).
- Sharif, G. M., et al. An AIB1 isoform alters enhancer access and enables progression of early-stage triple-negative breast cancer. Cancer Research. 81 (16), 4230-4241 (2021).
- Caileau, R., Olive, M., Cruciger, Q. V. Long-term human breast carcinoma cell lines of metastatic origin: preliminary characterization. In Vitro. 14 (11), 911-915 (1978).
- Sharif, G. M., et al. Cell growth density modulates cancer cell vascular invasion via Hippo pathway activity and CXCR2 signaling. Oncogene. 34 (48), 5879-5889 (2015).
- Miller, F. R., Santner, S. J., Tait, L., Dawson, P. J. MCF10DCIS.com xenograft model of human comedo ductal carcinoma in situ. Journal of the National Cancer Institute. 92 (14), 1185-1186 (2000).
- Winkler, J., Abisoye-Ogunniyan, A., Metcalf, K. J., zenaa, W. Concepts of extracellular matrix remodelling in tumour progression and metastasis. Nature Communications. 11 (1), 1-19 (2020).
- Nkosi, D., Sun, L., Duke, L. C., Meckes, D. G. Epstein-Barr virus LMP1 manipulates the content and functions of extracellular vesicles to enhance metastatic potential of recipient cells. PLoS Pathogens. 16 (12), 1009023 (2020).
- Eisenberg, M. C., et al. Mechanistic modeling of the effects of myoferlin on tumor cell invasion. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (50), 20078-20083 (2011).
