Summary
Descriviamo un approccio per rilevare e catturare sottopopolazioni cellulari invasive in tempo reale. Il progetto sperimentale utilizza l'analisi cellulare in tempo reale monitorando i cambiamenti nell'impedenza elettrica delle cellule. Il cancro invasivo, le cellule immunitarie, endoteliali o stromali nei tessuti complessi possono essere catturati e l'impatto delle co-colture può essere valutato.
Abstract
L'invasione e la diffusione metastatica delle cellule tumorali sono la principale causa di morte per cancro. I saggi sviluppati precocemente per misurare il potenziale invasivo delle popolazioni di cellule tumorali in genere generano una singola misurazione dell'endpoint che non distingue tra sottopopolazioni di cellule tumorali con diverso potenziale invasivo. Inoltre, il microambiente tumorale è costituito da diverse cellule stromali e immunitarie residenti che alterano e partecipano al comportamento invasivo delle cellule tumorali. L'invasione nei tessuti svolge anche un ruolo nelle sottopopolazioni di cellule immunitarie respingendo i microrganismi o eliminando le cellule malate dal parenchima e dalle cellule endoteliali durante il rimodellamento dei tessuti e l'angiogenesi. L'analisi cellulare in tempo reale (RTCA) che utilizza biosensori di impedenza per monitorare l'invasione cellulare è stato un importante passo avanti oltre la misurazione dell'invasione degli endpoint: fornisce misurazioni continue nel tempo e quindi può rivelare differenze nei tassi di invasione che vengono persi nel test dell'endpoint. Utilizzando l'attuale tecnologia RTCA, abbiamo ampliato gli array a doppia camera aggiungendo un'ulteriore camera che può contenere cellule stromali e / o immunitarie e consente di misurare il tasso di invasione sotto l'influenza di fattori secreti da cellule stromali o immunitarie co-coltivate nel tempo. Oltre a questo, il design unico consente di staccare le camere in qualsiasi momento e isolare la cellula tumorale più invasiva o altre sottopopolazioni cellulari presenti in miscele eterogenee di isolati tumorali testati. Queste cellule tumorali più invasive e altre sottopopolazioni cellulari guidano la progressione maligna verso la malattia metastatica e le loro caratteristiche molecolari sono importanti per studi meccanicistici approfonditi, lo sviluppo di sonde diagnostiche per la loro individuazione e la valutazione delle vulnerabilità. Pertanto, l'inclusione di farmaci a piccole o grandi molecole può essere utilizzata per testare il potenziale delle terapie che colpiscono il cancro e / o le sottopopolazioni di cellule stromali con l'obiettivo di inibire (ad esempio, le cellule tumorali) o migliorare (ad esempio, le cellule immunitarie) il comportamento invasivo.
Introduction
L'invasione cellulare è un processo importante che consente alle cellule di attraversare le barriere della membrana basale in risposta ai segnali ambientali forniti dalle cellule stromali. È un passo cruciale durante diverse fasi di sviluppo per le risposte immunitarie, la guarigione delle ferite, la riparazione dei tessuti e le neoplasie maligne che possono progredire dalle lesioni locali ai tumori invasivi e metastatici1. I saggi sviluppati precocemente per misurare il potenziale invasivo delle popolazioni cellulari in genere generano una singola misurazione del punto finale o richiedono la pre-etichettatura delle cellule invasive2. L'integrazione di tecniche di microelettronica e microfluidica è ora sviluppata per rilevare diversi aspetti della biologia cellulare come la vitalità, il movimento e l'attaccamento utilizzando l'impedenza elettrica delle cellule vive sui microelettrodi 3,4. La misurazione dell'impedenza consente una valutazione senza etichette, non invasiva e quantitativa dello stato cellulare3. Qui descriviamo un array a tre camere basato sul progetto del sistema Real-Time Cellular Analysis (RTCA) sviluppato da Abassi et al.5. L'array a tre camere consente la valutazione di cellule co-coltivate sull'invasione cellulare e il recupero di cellule invasive per ulteriori analisi o espansioni.
Nel sistema di analisi cellulare, le cellule invadono attraverso una matrice extracellulare rivestita su una membrana porosa e raggiungono un array di elettrodi interdigitati posizionati sul lato opposto della barriera. Mentre le cellule invasive continuano ad attaccare e occupare questo array di elettrodi nel tempo, l'impedenza elettrica cambia in parallelo. Il sistema attuale comprende una piastra di invasione e migrazione cellulare (CIM) a 16 pozzetti con due camere. Lo strumento RTCA-DP (dual purpose) (chiamato d'ora in poi analizzatore di celle a doppio scopo) contiene sensori per la misurazione dell'impedenza e software integrato per analizzare ed elaborare i dati di impedenza. I valori di impedenza al basale dipendono dalla forza ionica dei mezzi nei pozzetti e vengono modificati quando le celle si attaccano agli elettrodi. I cambiamenti di impedenza dipendono dal numero di cellule, dalla loro morfologia e dalla misura in cui le cellule si attaccano agli elettrodi. Una misurazione dei pozzetti con i media prima che le celle vengano aggiunte è considerata come il segnale di fondo. Lo sfondo viene sottratto dalle misurazioni dell'impedenza dopo aver raggiunto l'equilibrio con le celle che si attaccano e si diffondono sugli elettrodi. Un parametro unitless dello stato delle celle su un elettrodo chiamato Cell Index (CI) è calcolato come segue: CI = (impedenza dopo l'equilibrio - impedenza in assenza di celle) / valore di impedenza nominale6. Quando vengono confrontati i tassi di migrazione di diverse linee cellulari, l'IC Delta può essere utilizzato per confrontare lo stato della cella indipendentemente dalla differenza di attaccamento rappresentata nelle prime misurazioni.
L'array a tre camere di nuova concezione si basa sul progetto esistente e utilizza la camera superiore del sistema di analisi delle celle a doppio scopo che contiene gli elettrodi. Le camere centrali e inferiori modificate sono adattate per adattare l'assemblaggio all'analizzatore di celle a doppio scopo per la misurazione e l'analisi dell'impedenza utilizzando il software integrato. I due principali progressi che il nuovo progetto fornisce rispetto alla piastra CIM a doppia camera esistente (chiamata piastra di analisi cellulare d'ora in poi) sono: i) la capacità di recuperare e quindi analizzare sottopopolazioni cellulari invasive presenti in miscele cellulari eterogenee e ii) l'opzione per valutare l'impatto dei fattori secreti da cellule stromali o immunitarie co-coltivate sull'invasione cellulare (Figura 1).
Questa tecnologia può essere utile nello studio delle sottopopolazioni di cellule con diverse capacità invasive. Ciò include (a) cellule tumorali invasive che invadono i tessuti circostanti o vasi sanguigni e linfatici o stravasano in siti di semina metastatica in organi distanti, (b) cellule del sistema immunitario che invadono i tessuti per affrontare agenti patogeni o cellule malate, (c) cellule endoteliali che invadono i tessuti per formare nuovi vasi sanguigni durante la riorganizzazione dei tessuti o la guarigione delle ferite, così come (d) le cellule stromali del microambiente tumorale che supportano e invadono insieme alle cellule tumorali. L'approccio consente l'inclusione di cross-talk stromali in grado di modulare la motilità e l'invasione cellulare. Gli studi di fattibilità mostrati qui utilizzano questo array modificato focalizzato sull'invasione delle cellule tumorali e sull'interazione con lo stroma come sistema modello, compresa l'invasione endoteliale in risposta a segnali differenziali dalle cellule tumorali. L'approccio può essere estrapolato per isolare le cellule tumorali e altri tipi di cellule come sottopopolazioni di cellule immunitarie, fibroblasti o cellule endoteliali. Abbiamo testato linee cellulari di cancro al seno stabilite invasive e non invasive come prova di principio. Abbiamo anche usato cellule dall'invasione di xenotrapianti derivati dal paziente (PDX) in risposta alle cellule immunitarie del midollo osseo umano per mostrare la fattibilità per un uso futuro anche in contesti diagnostici clinici. I PDX sono tessuti tumorali del paziente che vengono impiantati in un modello di topi immunocompromessi o umanizzati per consentire lo studio della crescita, della progressione e delle opzioni di trattamento per il paziente originale 7,8.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Lo studio è stato esaminato e considerato "esente" dall'Institutional Review Board della Georgetown University (IRB # 2002-022). I tessuti del midollo osseo appena raccolti sono stati raccolti da filtri di raccolta del midollo osseo umano sano scartati che erano stati de-identificati.
1. Nuovo design della camera (Figura 2)
- Aprire una nuova piastra di analisi cellulare a doppia camera. Mettere da parte la camera superiore con gli elettrodi.
- Utilizzando una fresatrice, radere via 2 mm dei pozzetti inferiori a forma di U della piastra dell'analizzatore di celle.
- Fissare una membrana di polietersolfone (PES) di 2 cm x 7 cm con pori di 0,2 μm sul fondo dei pozzetti rasati utilizzando un adesivo curato ai raggi UV. Lasciare 30 minuti di cura per garantire che la colla sia completamente indurita e inerte.
- Utilizzando una fresatrice, ritagliare due fessure longitudinali (1,5 mm x 5,6 mm) lungo i lati per agganciarsi alle creste della terza camera appena fabbricata.
- Utilizzando una fresatrice, creare una terza camera in policarbonato che replica gli ingombri della piastra dell'analizzatore di celle; 72 mm x 18 mm (Tabella dei materiali).
- Creare pozzi di 4,8 mm di profondità e 4,75 mm di diametro per replicare il design a 16 pozzetti della piastra dell'analizzatore di celle. Ciò consente 90 μL di volume per pozzetto.
- Sui lati, create due creste triangolari in modo che la camera si blocchi nelle fessure originali create nel passaggio 1.4. La parte orizzontale del triangolo è di 1,5 mm, la verticale è di 1,4 mm e l'ipotenusa è di 2,052 mm.
- Create una manopola sul lato corto di 50,8 mm di diametro e 1,397 mm di altezza per adattarla alla tacca della piastra originale (Figura 2, al centro).
- Utilizzare una rondella in gomma spessa 0,9 mm per ogni pozzo per fornire una vestibilità sigillata.
2. Coltura cellulare (MDA-MB-231, DCIS, DCIS-Δ4, J2-fibroblasti)
- Lavare colture cellulari aderenti (~ 70% di confluenza) con 1x soluzione salina tamponata con fosfato (PBS).
- Aggiungere la soluzione di tripsina-EDTA allo 0,05% per rimuovere le cellule.
- Neutralizzare la soluzione di tripsina con terreni di coltura cellulare contenenti siero e contare le cellule usando un'aliquota della sospensione cellulare.
NOTA: i terreni di coltura cellulare specifici sono disponibili nella Tabella 1.
3. Dissociazione dello xenotrapianto derivata dal paziente
- Tritare un pezzo di tumore fresco (1 cm2) in poltiglia fine usando un bisturi sterile.
- Posto in un tubo conico da 50 mL con 20 mL di DMEM F12 media integrato con 3 mg/mL di tripsina e 2 mg/mL di collagenasi.
- Incubare in uno shaker termico (150 RPM) a 37 °C per 20 min.
- Ruotare il tubo a 500 x g per 5 minuti; rimuovere il surnatante.
- Aggiungere 20 μL di DMEM F12 + 2% FBS per lavare le cellule; girare a 300 x g per 5 minuti e rimuovere il surnatante. Ripeti il lavaggio altre due volte.
- Risospesare in 1 mL di supporti PDX (Tabella 1) per contare le cellule.
4. Estrazione delle cellule del midollo osseo
- Lavare il filtro di raccolta del midollo osseo (BM) con 25 mL di 1x PBS.
NOTA: In questo studio, PBS è stato aggiunto a un filtro di raccolta BM usato dall'ospedale per raccogliere il BM rimanente nel filtro. - Aggiungere lentamente il BM lavato a un tubo conico da 50 ml con 25 mL di gradiente di densità medio, avendo cura di mantenere gli strati il più separati possibile.
- Rotazione a 800 x g per 20 minuti a 18 °C
- Sifonare gli strati superiori dopo la centrifugazione (grasso/plasma) e trasferire 5 mL dello strato bianco sopra il mezzo gradiente di densità che ha le celle BM in un tubo conico da 15 mL.
NOTA: in alternativa, immergere una pipetta da 5 ml nello strato superiore fino a quando non tocca lo strato intermedio (BM) e pipettare lo strato intermedio molto lentamente senza spostare la pipetta. - Riempire il tubo conico da 15 mL con 1x PBS (~10 mL) e ruotare a 300 x g per 15 min.
- Rimuovere il surnatante; il restante pellet bianco è il BM.
- Se nel pellet si osservano globuli rossi, aggiungere 5 ml di soluzione di lisi RBC (Tabella dei materiali) e lasciarla riposare per 5 minuti a temperatura ambiente (RT). Girare a 300 x g per 5 minuti e rimuovere il surnatante.
- Aggiungere 10 ml di 1x PBS per lavare le cellule, girare a 300 x g per 5 minuti e rimuovere il surnatante. Ripetere la lisi RBC (punto 4.7) fino a quando il pellet è bianco.
5. Semina e assemblaggio delle cellule
- Posizionare tutte e tre le camere sterili nella cappa di coltura del tessuto.
- Posizionare la manopola sul lato corto della camera inferiore. Orientare la camera inferiore in modo che la manopola sia rivolta verso lo sperimentatore.
- Aggiungere 30.000-50.000 celle in 90 μL di fluido a ciascun pozzetto della camera inferiore. Evitare di formare bolle. Queste sono le cellule stromali che forniranno fattori secreti ma non saranno rilevati dagli elettrodi della camera superiore.
- Utilizzare il 5% di mezzi integrati con siero bovino fetale in due pozzetti a camera inferiore come controllo positivo per la motilità cellulare. Utilizzare 0% di media integrati con siero come controllo negativo.
- Lasciare riposare la camera inferiore con le celle per 10-15 minuti nel cappuccio.
NOTA: questo passaggio è consigliato se le cellule sono aderenti o crescono in sospensione. - Ruotare la camera inferiore a 90° e posizionare la camera centrale in alto in modo che la manopola sulla camera inferiore scorra nella tacca sulla camera centrale.
NOTA: la manopola sulla camera inferiore e il punto blu sulla camera centrale si trovano alle estremità opposte dell'assieme. - Spingere verticalmente verso il basso fino a quando non si sente un suono di clic da ciascuno dei lati lunghi dell'assieme.
- Aggiungere 160 μL di fluidi privi di siero a tutti i pozzetti della camera centrale.
- Assicurati che un menisco a forma di cupola sia visibile dopo che i pozzetti sono stati riempiti; in caso contrario, regolare il volume finale in base alla calibrazione della pipetta. Evitare di formare bolle.
- Posizionare la camera superiore con gli elettrodi rivolti verso il basso sulla camera centrale assicurandosi di allineare i punti blu sulle camere centrale e superiore.
- Spingere verticalmente verso il basso fino a quando non si sente un suono di clic da ciascuno dei lati lunghi dell'assieme.
- Aggiungere 25-50 μL di fluidi privi di siero alla camera superiore.
- Montare il gruppo sull'analizzatore cellulare a doppio scopo nell'incubatore di colture tissutali e attendere 30 minuti prima di misurare lo sfondo.
NOTA: questo tempo è necessario per equilibrare l'array e può essere utilizzato per preparare le linee cellulari da aggiungere alla camera superiore. - Misurare lo sfondo (vedere paragrafo 6) e riposizionare l'assemblaggio nella cappa di coltura del tessuto.
- Aggiungere 30.000-50.000 cellule in 100 μL di mezzi privi di siero a ciascun pozzetto della camera superiore. Queste sono le cellule che l'elettrodo rileverà una volta che migrano con successo attraverso la membrana.
NOTA: Per ottenere la massima risposta, si raccomanda di far crescere le cellule in mezzi sierici privi di siero o a basso siero per 6-18 ore prima di eseguire il test. - Lasciare riposare il gruppo nella cappa per 30 minuti prima di montarlo sull'analizzatore di celle a doppio scopo per la misurazione dell'impedenza.
6. Misurazione dello sfondo e dell'impedenza
- Posizionare l'array nella base nello strumento di analisi cellulare a doppio scopo.
- Aprire il software dell'analizzatore di celle e selezionare la base da utilizzare.
- Fare clic sulla scheda Messaggio e assicurarsi che sia indicato Connessioni OK per garantire che l'array sia ben posizionato nella base e che gli elettrodi siano ben allineati con i sensori.
- Fai clic sulla scheda Note dell'esperimento e inserisci quante più informazioni possibili sull'esperimento.
- Fare clic sulla scheda Layout e compilare la descrizione del layout dell'array.
- Fare clic sulla scheda Pianificazione e aggiungere due passaggi dal menu Passaggi ; una fase di sfondo (una sweep) e una fase di test con 100 sweep, una sweep ogni 15 minuti, per un totale di 25 ore.
- Dopo che l'array è stato nell'incubatore dell'analizzatore di celle a doppio scopo per 30 minuti, fare clic sul pulsante Riproduci per avviare la misurazione in background. Apparirà una finestra che chiede di scegliere la cartella in cui salvare i dati.
- Al termine della misurazione in background, rimuovere l'array dalla culla e riposizionarlo nella cappa di coltura cellulare.
- Aggiungere le cellule alla camera superiore come descritto nel passaggio 5.13 e mantenere l'assemblaggio nella cappa di coltura del tessuto per 30 minuti affinché le cellule si depositino.
- Riposizionare l'array nell'analizzatore di celle a doppio scopo e selezionare la scheda Messaggio per il messaggio Connessioni OK .
- Fare clic sul pulsante Riproduci per avviare la misurazione dell'impedenza.
- Fare clic sulla scheda Plot per monitorare l'avanzamento del segnale.
- Se l'endpoint viene raggiunto prima delle 25 ore, fare clic sul passaggio Interrompi dal menu a discesa Esegui .
- Per esportare i dati, fare clic con il pulsante destro del mouse sul grafico, scegliere Copia nel formato elenco e quindi incollare i dati in un foglio di calcolo.
NOTA: i dati possono essere esportati come indice di cella o indice di cella delta. Le informazioni sul grafico e/o sul layout possono anche essere scelte per l'esportazione.
7. Distacco e raccolta cellulare
- Monitorare il tasso di migrazione in tempo reale sull'analizzatore di celle a doppio scopo per determinare il punto di interesse di arresto (6-18 ore).
NOTA: Il punto di arresto dipende dal tasso di invasione della cellula e quando si ottiene un segnale di invasione distinto dal controllo negativo. - Una volta raggiunto, smontare l'assemblaggio dall'analizzatore cellulare a doppio scopo e posizionarlo nella cappa di coltura del tessuto.
- Preparare un numero appropriato di tubi microcentrifuga da 1,5 ml per raccogliere le cellule dai pozzetti di interesse.
- Posizionare l'assemblaggio in un piatto di 10 cm per contenere liquidi quando le camere si staccano.
- Spingere le estremità di scatto flessibili sul lato lungo della camera centrale verso l'interno fino a quando non si sente un suono di clic.
- Smontare la camera superiore e capovolgerla in un nuovo piatto da 10 cm.
- Utilizzare un sollevatore di cellule con una lama di 13 mm per raccogliere le cellule da tutti i pozzi che ospitano la stessa condizione sperimentale (ad esempio, tipo di cellula, trattamento farmacologico, ecc.).
NOTA: progettare la configurazione in modo che disponga di almeno due pozzetti per ogni condizione sperimentale per ottenere cambiamenti statisticamente significativi rispetto ai controlli negativi. - Risciacquare o immergere la lama in 1x soluzione salina tamponata con fosfato per raccogliere le cellule in tubi microcentrifuga da 1,5 ml.
- Abbassare le celle a 500 x g per 5 minuti.
- Propagare le cellule raccolte (vedere paragrafo 8) o eseguire analisi end point come RNA-seq a singola cellula.
NOTA: per l'RNA-seq di massa, utilizzare un kit di estrazione dell'RNA a basso numero di cellule.
8.3D propagazione e recupero delle cellule
NOTA: A causa del piccolo numero di cellule raccolte, seminare le cellule in 3D utilizzando una matrice extracellulare (ECM) per migliorare la vitalità. Detto questo, la coltura 2D è anche un'opzione a questo punto, specialmente se le cellule utilizzate provengono da linee cellulari stabilite.
- Scongelare un'aliquota della matrice della membrana basale a 4 °C durante la notte. Mantenere la matrice della membrana basale su ghiaccio fino al momento dell'uso.
- Aggiungere 25 μL di matrice di membrana basale fredda al pellet di cellule vive raccolte e pipettare delicatamente su e giù per mescolare. Evitare di formare bolle.
- Aggiungere la miscela di matrice di membrana cellula-basamento sul fondo di un piccolo pozzo di coltura tissutale (cioè in una piastra a 96 pozzetti), formando una cupola. Cerca di non toccare le pareti del pozzo. Incubare a 37 °C per 20 minuti prima di aggiungere delicatamente 100 μL di fluido a goccia.
- Per recuperare le cellule, aspirare il mezzo e aggiungere 100 μL di dispase a ciascun pozzetto.
- Incubare a RT per 10 minuti, pipettare su e giù di tanto in tanto.
- Trasferire le cellule e la matrice della membrana basale disciolta in un tubo microcentrifuga da 1,5 ml. Aggiungere 1 mL di 1x PBS, ruotare a 300 x g per 5 minuti e rimuovere il surnatante. Ripetere il lavaggio una volta.
- Aspirare il surnatante. Dividere le celle nel pellet o eseguire l'analisi degli endpoint.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Utilizzando l'array a tre camere di nuova concezione, l'invasione delle cellule è stata testata in presenza o assenza di cellule stromali come i fibroblasti. L'invasione cellulare MDA-MB-231 è stata potenziata quando i fibroblasti svizzeri 3T3 irradiati (ceppo J2) sono stati seminati nella camera inferiore, consentendo lo scambio di fattori tra le due linee cellulari. È interessante notare che l'invasione MDA-MB-231 è aumentata quando le cellule 3T3-J2 sono state raddoppiate in numero (Figura 3A). D'altra parte, il tasso di invasione di un clone invasivo di cellule MCFDCIS (DCIS-Δ4)9 sembra essere inibito dal cross-talk con le cellule 3T3-J2 (Figura 3B). Questi dati mostrano l'utile applicazione dell'array a tre camere per misurare i vari effetti dello stroma, in questo caso i fibroblasti, sull'invasione cellulare.
Successivamente, per monitorare il cambiamento nella motilità e nell'invasione delle cellule endoteliali in risposta ai segnali provenienti da cellule tumorali invasive (MDA-MB-231)10,11 o non invasive (DCIS)12, sono state utilizzate cellule endoteliali della vena ombelicale umana (HUVEC) che rappresentano le cellule endoteliali che rivestono le pareti dei vasi sanguigni. Gli HUVEC erano più invasivi in risposta ai fattori secreti dalle cellule MDA-MB-231, a differenza di quelli secreti dalle cellule DCIS (Figura 4). Ciò è coerente con la capacità dei tumori invasivi di reclutare cellule endoteliali per la formazione dei vasi sanguigni e la successiva diffusione nella circolazione.
I dati di cui sopra dimostrano la capacità del sistema di analisi cellulare di monitorare diversi tassi di invasione delle linee cellulari; quando inizia l'invasione, progredisce e si stabilizza. Ciò consente all'utente di scegliere il punto temporale di interesse, ad esempio, dopo le prime 2-3 ore di invasione, per catturare le cellule pioniere che iniziano l'invasione e sono distinte dalle cellule seguaci che invadono successivamente per invasione collettiva.
Mentre i dati di cui sopra dimostrano una solida prova di principio per l'uso dell'array a tre camere per osservare l'invasione in un ambiente di co-coltura, volevamo testare la potenziale usabilità di questo array in contesti clinici e diagnostici. Per questo, è stata monitorata l'invasione di sospensioni cellulari da xenotrapianti derivati dal paziente (PDX)8 co-coltivati con cellule immunitarie da campioni di midollo osseo umano. Le cellule immunitarie totali del midollo osseo umano (BM) sono state seminate sulla camera inferiore con o senza siero. L'invasione delle cellule PDX dalla camera superiore è aumentata in risposta alle cellule immunitarie BM co-coltivate (Figura 5). È interessante notare che la presenza di siero al 2% nella camera inferiore con le cellule BM era essenziale per l'invasione della PDX.
Figura 1: Flusso di lavoro del sistema di monitoraggio dell'invasione cellulare e di raccolta cellulare. (A) Le cellule Stroma vengono aggiunte alla camera inferiore montata su una camera centrale, che funge da barriera cellulare permeabile solo per fattori solubili. (B) La camera superiore con biosensori di impedenza riceve la linea cellulare da monitorare. L'invasione in tempo reale viene registrata fino a quando non viene raggiunto un punto temporale definito dall'utente per la raccolta delle celle. (C) La camera superiore smantellata viene invertita e le cellule vengono raccolte utilizzando un sollevatore di celle. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Immagini delle camere dell'array e modifiche. (A) Le tre camere utilizzate per costruire l'array. Nessuna modifica è stata apportata alla camera superiore che ospita gli elettrodi. (B) Dai pozzetti della camera centrale, è stata rasata un'altezza di 2 mm e una membrana attaccata al fondo aperto; fessure longitudinali (1,5 mm x 5,6 mm) sono state aggiunte su ciascun lato. (C) Camera inferiore (72 mm x 18 mm) fabbricata per replicare il design a 16 pozzetti; i pozzetti sono profondi 4,8 mm e hanno un diametro di 4,75 mm, le creste triangolari (1,5 mm orizzontali x 1,4 mm verticali) vengono aggiunte lungo i lati per fare clic nelle fessure della camera centrale. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: L'effetto dei fibroblasti co-coltivati sull'invasione delle cellule tumorali. (A) Analisi cellulare in tempo reale dell'invasione cellulare MDA-MB-231, da sola o in co-coltura con fibroblasti 3T3-J2 (camera inferiore). I fibroblasti 3T3-J2 sono stati seminati a 30.000 o 60.000 cellule per pozzetto. (B) Analisi cellulare in tempo reale dell'invasione cellulare DCIS-Δ4, da sola o in co-coltura con fibroblasti 3T3-J2 (camera inferiore). I cerchi solidi rappresentano la media; le sottili linee tratteggiate rappresentano la deviazione standard. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: L'effetto delle cellule tumorali sull'invasione delle cellule endoteliali. Analisi cellulare in tempo reale dell'invasione HUVEC, da sola, in co-coltura con le cellule invasive MDA-MB-231 (camera inferiore) o le cellule DCIS non invasive (camera inferiore). I cerchi solidi rappresentano la media; le sottili linee tratteggiate rappresentano la deviazione standard. Indice di cella Delta normalizzato all'impedenza al tempo = 1 h. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5: Invasione cellulare di xenotrapianti derivati dal paziente (PDX) co-coltivati con cellule immunitarie del midollo osseo. Le singole cellule disintegrate dalla PDX (camera superiore) sono state co-coltivate con cellule del midollo osseo umano (camera inferiore) e la loro invasione è stata monitorata nel tempo in presenza o assenza di siero. I cerchi solidi rappresentano la media; le sottili linee tratteggiate rappresentano la deviazione standard. Indice di cella Delta normalizzato all'impedenza al tempo = 1 ora e 36 min. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
| Media | Costituenti | Concentrazione/proporzione |
| Supporti MDA-MD-231 | DMEM · | |
| Siero bovino fetale (FBS) | 10% | |
| J2 Fibroblasti media | DMEM · | |
| Siero bovino fetale (FBS) | 10% | |
| Supporti DCIS | DMEM F12 | |
| Siero di cavallo (HS) | 5% | |
| Fattore di crescita epidermico (EGF) | 20 ng/ml | |
| Insulina | 10 μg/mL | |
| Idrocortisone | 0,5 μg/mL | |
| Tossina del colera | 100 ng/ml | |
| Supporti PDX | DMEM F12 | |
| Siero bovino fetale (FBS) | 2% | |
| HEPES · | 1 M | |
| Insulina Transferrina Selenio Etanolammina (ITS) | 10 μg/mL | |
| Idrocortisone | 0,5 μg/mL | |
| Albumina sierica bovina (BSA) | 1 mg/ml |
Tabella 1: Composizione dei terreni di coltura cellulare. La tabella elenca le composizioni dei supporti MDA-MD-231, dei supporti J2 Fibroblasts, DCIS e PDX.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Abbiamo modificato il design di un array a doppia camera per includere una terza camera per il monitoraggio dell'invasione cellulare in tempo reale in presenza di cellule stromali. Abbiamo osservato effetti distinti dei fibroblasti co-coltivati su cellule tumorali invasive e non invasive, indicando che l'array può essere utilizzato per distinguere tra sottopopolazioni di cellule tumorali che rispondono in modo diverso ai fattori prodotti da cellule stromali co-coltivate. L'array è stato utilizzato anche per monitorare l'invasione delle cellule endoteliali nei tessuti stromali, un passaggio critico durante i vasi sanguigni che spuntano verso uno stimolo angiogenico in presenza di cellule tumorali di diverso potenziale invasivo. Questi esperimenti mostrano l'uso versatile dell'array per l'isolamento delle cellule tumorali o di altre cellule.
Si consiglia di ottimizzare il numero di celle da aggiungere a ciascuna camera. Dalla nostra esperienza e dalla raccomandazione del produttore, 30.000-50.000 celle sono ottimali. Poiché due tipi di cellule possono essere co-coltivati in questo array, uno dei quali può essere una coltura primaria di cellule stroma, si suggerisce di monitorare gli effetti di diversi mezzi sulle cellule utilizzate per mantenere la vitalità. Abbiamo scoperto che la fame di cellule da monitorare riduce la variazione tra le repliche. Se le condizioni di crescita senza siero sono dannose per le cellule, è possibile utilizzare un siero basso e tempi di fame più brevi. L'aggiunta di una bassa quantità sierica (1%-2%) può essere fondamentale per la sopravvivenza delle cellule stromali (cellule primarie) nella camera inferiore, ma assicurarsi di includere le condizioni di controllo adeguate per l'interpretazione dei dati (cioè il 2% di siero con e senza cellule stromali). Se i tassi di invasione sono bassi, più pozzi per la condizione sperimentale possono aumentare il numero di cellule vitali raccolte per le analisi a valle. Quando si analizzano le biopsie dei pazienti, la disintegrazione del tessuto in singole cellule è cruciale prima del test sulla piastra dell'analizzatore cellulare. Ottimizzare le condizioni di disintegrazione per mantenere la vitalità cellulare è un passo importante prima di eseguire l'analisi dell'invasione. È anche possibile studiare ulteriori aspetti dell'invasione, come la sensibilità al trattamento farmacologico o l'effetto dei componenti della matrice basale extracellulare (ECM) sul tasso di invasione. L'ECM è un componente essenziale del microambiente ed è stato segnalato per svolgere un ruolo importante durante l'invasione cellulare13. Diversi studi pubblicati hanno utilizzato l'ECM per rivestire la camera superiore prima che le cellule invasive vengano aggiunte per monitorare la loro interazione con vari componenti ECM14,15. L'array a tre camere è uno strumento utile per studiare le interazioni di co-coltura tra cellule invasive e stroma. Mentre il design proposto garantisce una raccolta di cellule specifiche per le cellule invasive senza cellule stromali, questa configurazione potrebbe non essere ottimale se il cross-talk tra le cellule richiede l'interazione fisica dei diversi tipi di cellule. Inoltre, le cellule non aderenti che crescono in sospensione potrebbero non essere raccolte nei metodi proposti qui (rottamazione), ma un approccio diverso in cui i mezzi nelle camere smontate contenenti le cellule non aderenti possono essere raccolti per raccogliere le cellule non aderenti.
Mentre questo array può essere utilizzato per più aree di ricerca che monitorano l'invasione cellulare in presenza di un componente stromale, qui ci siamo concentrati sull'invasione delle cellule tumorali e su come questo approccio può scoprire sottopopolazioni di cellule tumorali maligne presenti in campioni biologici eterogenei. La nuova capacità dell'array a tre camere qui utilizzato fornisce un test funzionale per isolare sottopopolazioni invasive da miscele eterogenee di cellule tumorali che contengono cellule tumorali più e meno invasive. L'analisi di sottopopolazioni di cellule tumorali invasive e rilevanti per l'esito è essenziale per studi meccanicistici appropriati e approfondimenti molecolari non ottenibili o distorti dall'analisi di una popolazione cellulare mista. La camera di co-coltura per le cellule stromali fornisce informazioni sul cross-talk cellula-cellula nel microambiente tumorale durante la progressione verso la malattia invasiva.
Come passo verso l'applicazione a campioni di tessuto, ad esempio biopsie tumorali da pazienti, abbiamo utilizzato cellule tumorali isolate da xenotrapianti tumorali derivati dal paziente (PDX) e testato l'impatto delle cellule del midollo osseo umano sull'invasione delle cellule tumorali. Siamo stati in grado di raccogliere le cellule invasive presenti nei PDX per l'analisi a valle, cioè RNA-seq. Il dosaggio delle PDX è il primo passo verso l'analisi delle sottopopolazioni cellulari presenti nel mix eterogeneo di cellule tumorali nelle biopsie tumorali ottenute dai pazienti. L'obiettivo finale sarà quello di utilizzare tali biopsie tumorali e isolare sottopopolazioni di cellule tumorali che invadono e quindi portano a scarsi risultati a causa del loro potenziale di diffusione metastatica. L'identificazione delle caratteristiche molecolari e la sperimentazione della sensibilità di queste sottopopolazioni invasive al trattamento farmacologico sono applicazioni future.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
La Georgetown University ha depositato un brevetto relativo ad alcuni degli approcci descritti in questo manoscritto. G.M.S, A.W, L.D e M.P sono nominati come inventori di questa applicazione e lo dichiarano come potenziale conflitto di interessi.
Acknowledgments
Vorremmo ringraziare la dott.ssa Alana Welms, Huntsman Cancer Institute, Università dello Utah, per averci fornito gli xenotrapianti derivati dal paziente (HCI-010). Questo lavoro è stato supportato dalle sovvenzioni NIH R01CA205632, R21CA226542 e, in parte, da una sovvenzione di Agilent Technologies.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.05% Trypsin-EDTA | Thermofisher | 25300-054 | |
| Adhesive | Norland Optical Adhesive | NOA63 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma | A9418 | |
| Cell lifter | Sarstedt | 83.1832 | |
| Cholera Toxin from Vibrio cholerae | Thermofisher | 12585-014 | |
| CIM-plate | Agilent | 5665817001 | Cell analyzer plate |
| Collagenase from Clostridium histolyticum | Sigma | C0130 | |
| Dispase | StemCell | 7913 | |
| DMEM | Thermofisher | 11995-065 | |
| DMEM-F12 | Thermofisher | 11875-093 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS), Heat Inactivated | Omega Scientific | FB-12 | |
| HEPES | Thermofisher | 15630106 | |
| Horse serum (HS) | Gibco | 16050-122 | |
| Human EGF | Peprotech | AF-100-15 | |
| Human umbilical Vein endothelail cells (HUVEC) | LONZA (RRID:CVCL_2959) | C-2517A | |
| HUVEC media | LONZA | CC-3162 | |
| Hydrocortisone | Sigma | H4001 | |
| Insulin Transferrin Selenium Ethanolamine (ITSX) (100x) | Thermofisher | 51500056 | |
| Insulin, Human Recombinant, Zinc Solution | Sigma | C8052 | |
| J2 Fibroblasts | Stemcell (RRID:CVCL_W667) | 100-0353 | |
| LymphoPrep | Stemcell | 7851 | Density gradient medium for the isolation of mononuclear cells |
| Matrigel | Corning | 354230 | Basement membrane matrix |
| MCFDCIS.com cells ( DCIS) | RRID:CVCL_5552 | ||
| MDA-MB-231 cells | RRID:CVCL_0062 | ||
| Milling machine | Bridgeport Series 1 Vertical | ||
| Phosphate-buffered saline (1x) | Thermofisher | 10010049 | |
| Polyethersulfone (PES) membrane | Sterlitech | PCTF029030 | |
| RBC lysis solution | Stemcell | 7800 | |
| RNeasy Micro Kit | Qiagen | 74004 | |
| RTCA DP analyzer | Agilent | 3X16 | Dual purpose cell analyzer |
| Trypsin | Sigma | T4799 |
References
- Friedl, P., Gilmour, D. Collective cell migration in morphogenesis, regeneration and cancer. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 10 (7), 445-457 (2009).
- Boyden, S. The chemotactic effect of mixtures of antibody and antigen on polymorphonuclear leucocytes. The Journal of Experimental Medicine. 115 (3), 453-466 (1962).
- Xu, Y., et al. A review of impedance measurements of whole cells. Biosensors & Bioelectronics. 77, 824-836 (2016).
- Stylianou, D. C., et al. Effect of single-chain antibody targeting of the ligand-binding domain in the anaplastic lymphoma kinase receptor. Oncogene. 28 (37), 3296-3306 (2009).
- Abassi, Y. A., Wang, X., Xu, X. Real time electronic cell sensing system and applications for cytotoxcity profiling and compound assays. United States Patent. , 20050213374 1-88 (2013).
- Abassi, Y. A., et al. Label-free, real-time monitoring of IgE-mediated mast cell activation on microelectronic cell sensor arrays. Journal of Immunological Methods. 292 (1-2), 195-205 (2004).
- Morton, C. L., Houghton, P. J. Establishment of human tumor xenografts in immunodeficient mice. Nature Protocols. 2 (2), 247-250 (2007).
- DeRose, Y. S., et al. Tumor grafts derived from women with breast cancer authentically reflect tumor pathology, growth, metastasis and disease outcomes. Nature Medicine. 17 (11), 1514-1520 (2011).
- Sharif, G. M., et al. An AIB1 isoform alters enhancer access and enables progression of early-stage triple-negative breast cancer. Cancer Research. 81 (16), 4230-4241 (2021).
- Caileau, R., Olive, M., Cruciger, Q. V. Long-term human breast carcinoma cell lines of metastatic origin: preliminary characterization. In Vitro. 14 (11), 911-915 (1978).
- Sharif, G. M., et al. Cell growth density modulates cancer cell vascular invasion via Hippo pathway activity and CXCR2 signaling. Oncogene. 34 (48), 5879-5889 (2015).
- Miller, F. R., Santner, S. J., Tait, L., Dawson, P. J. MCF10DCIS.com xenograft model of human comedo ductal carcinoma in situ. Journal of the National Cancer Institute. 92 (14), 1185-1186 (2000).
- Winkler, J., Abisoye-Ogunniyan, A., Metcalf, K. J., zenaa, W. Concepts of extracellular matrix remodelling in tumour progression and metastasis. Nature Communications. 11 (1), 1-19 (2020).
- Nkosi, D., Sun, L., Duke, L. C., Meckes, D. G. Epstein-Barr virus LMP1 manipulates the content and functions of extracellular vesicles to enhance metastatic potential of recipient cells. PLoS Pathogens. 16 (12), 1009023 (2020).
- Eisenberg, M. C., et al. Mechanistic modeling of the effects of myoferlin on tumor cell invasion. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (50), 20078-20083 (2011).
