Summary
Förstörelsen av specifika celler i embryot är ett kraftfullt verktyg för att studera cellulära interaktioner som är involverade i cellens öde. Detta protokoll beskriver tekniker för laserablation av riktade celler i det tidiga embryot till brunalgen Saccharina latissima.
Abstract
I Saccharina latissima utvecklas embryot som ett monolagerat cellark som kallas lamina eller bladet. Varje embryocell är lätt att observera, lätt att skilja från sina grannar och kan riktas individuellt. I årtionden har laserablation använts för att studera embryoutveckling. Här utvecklades ett protokoll för cellspecifik laserablation för tidiga embryon av brunalgen S. latissima. Det presenterade arbetet inkluderar: (1) beredning av Saccharina-embryon , med en beskrivning av de kritiska parametrarna, inklusive odlingsförhållanden, (2) laserablationsinställningarna och (3) övervakningen av den efterföljande tillväxten av det bestrålade embryot med hjälp av time-lapse-mikroskopi. Dessutom ges detaljer om de optimala förhållandena för att transportera embryona från bildplattformen tillbaka till laboratoriet, vilket kan påverka efterföljande embryoutveckling djupt. Alger som tillhör ordningen Laminariales uppvisar embryogenesmönster som liknar Saccharina; detta protokoll kan således enkelt överföras till andra arter i detta taxon.
Introduction
Laserablation har använts i årtionden för att studera embryoutveckling. Bestrålning av embryoceller med en laserstråle gör det möjligt att övervaka den regenerativa potentialen och modifieringen av celllinjen under embryogenesen och undersöka effekten av riktad ablation på celldelning och cellöde. Modellorganismerna som används i laserablationsmetoder är vanligtvis djur, såsom insekter 1,2, nematoder 3,4, ryggradsdjur 5,6 och ibland växter 7,8. Dessutom användes en lasermikroablationsmetod på brunalgen Fucus 1994 och 1998 för att demonstrera cellväggens roll i fotopolariseringen av det tidiga embryot 9,10.
Bruna alger tillhör gruppen Stramenopiles, divergerade vid roten av det eukaryota trädet för 1,6 miljarder år sedan. Som ett resultat är de fylogenetiskt oberoende av andra multicellulära organismer, såsom djur och växter11. Saccharina latissima tillhör ordningen Laminariales, mer allmänt känd som kelps, och de är bland de största organismerna på jorden och når storlekar på över 30 m. Saccharina sp. är en stor tång som används för många applikationer som mat och foder, och dess polysackarider extraheras för användning i jordbruks-, farmakologiska och kosmetiska industrier över hela världen12, 13. Dess odling, främst i Asien och på senare tid i Europa, kräver beredning av embryon i kläckerier innan ungdomar släpps ut i det öppna havet. Liksom alla kelps har den en bifasisk livscykel som består av en mikroskopisk gametofytisk fas, under vilken en haploid gametofyt växer och producerar gameter för befruktning och en diploid makroskopisk sporofytisk fas, där ett stort planblad utvecklas från sitt hållfast fäst vid havsbotten eller stenarna. Sporofyten frigör haploida sporer vid mognad och fullbordar därmed livscykeln 14,15,16.
S. latissima presenterar några intressanta morfologiska egenskaper17. Dess embryo utvecklas som ett monolagerat planark 15,18,19 innan det förvärvar en flerskiktad struktur som sammanfaller med framväxten av olika vävnadstyper. Dessutom är Laminariales en av de enda taxa av bruna alger vars embryon förblir fästa vid sin moders gametofytiska vävnad (Desmarestiales och Sporochnales gör också15). Denna funktion ger möjlighet att studera moderns vävnads roll i denna utvecklingsprocess och jämföra moderns kontrollmekanismer i bruna alger med de hos djur och växter.
Denna artikel presenterar det första kompletta protokollet för laserablation i ett tidigt kelpembryo. Detta protokoll som involverar UV-ns-pulserad teknik resulterar i specifik förstörelse av enskilda embryoceller för att studera deras respektive roller under embryogenesen. Förfarandet erbjuder ett tillförlitligt tillvägagångssätt för att undersöka cellinteraktioner och cellöden under embryogenes i Laminariales.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Produktion av Saccharina latissima gametofyter
- Samla mogna sporofyter av S. latissima från naturen som tidigare beskrivits20,21. Se till att de valda sporofyterna saknar epifytter (små organismer synliga på bladets yta) eller inre parasiter (finns i de blekta områdena eller fläckarna på bladet).
- Skär med en skalpell den mörkaste delen i mitten av bladet (bördig sporproducerande vävnad22) i 1-5 fyrkantiga bitar (1 cm²) och undvik blekta fläckar, om de finns.
- Ta bort eventuella kvarvarande epifytter genom att försiktigt rengöra de skurna bitarna med baksidan av en skalpell och lite absorberande papper.
- Placera de rengjorda bitarna i en glasskål fylld med sterilt naturligt havsvatten (se materialtabell) i 45 minuter för att frigöra sporer enligt tidigare publicerad rapport22.
- Ta bort bladbitarna och filtrera havsvattnet genom en 40 μm cellsil för att ta bort skräp eller oönskade organismer.
- Späd sporerna i filtratet till en koncentration på 20-40 sporer/ml i petriskålar av plast22.
- Placera sporlösningen i ett kulturskåp (se materialtabell) som är konfigurerat med optimala odlingsförhållanden (13 °C, 24 μE.m-2.s-1, fotoperiod 16:8 L:D).
- Låt sporerna gro och utvecklas till gametofyter.
OBS: Sporgroning är synlig efter 2 dagar i skåpet, och den första celldelningen av de gametofytiska cellerna sker vanligtvis inom följande 48 timmar. - Byt ut tillväxtmediet efter 5 dagar mot mikrofiltrerat naturligt havsvatten berikat med en 0,5x Provasoli-lösning (NSW1/2) (se materialtabell).
OBS: För att undvika att upprepa dessa steg kan specifika manliga och kvinnliga gametofyter väljas och vegetativt förökas i flera månader. Gametofyterna förblir vegetativa när de odlas under rött ljus (4 μE.m-2.s-1 med en våglängd på minst 580 nm)23 under samma odlingsförhållanden som beskrivs ovan (steg 1.7).
2. Fragmentering och induktion av oogenes
- Skörda gametofyter med en cellskrapa.
- Krossa de uppsamlade gametofyterna i ett 1,5 ml rör i 4-5-cells bitar med hjälp av en liten plaststöt.
- Fyll röret med 1 ml NSW1/2 (steg 1.9).
- Tillsätt 2,5 μL av den krossade gametofytlösningen i 3 ml naturligt havsvatten berikat med 1x Provasoli-lösning (NSW) och lägg dem i en petriskål.
OBS: En 25 mm, glasbottnad petriskål rekommenderas för enklare hantering. - Placera de tillagade rätterna i ett odlingsskåp och framkalla gametogenes vid 13 °C under vitt ljus med en intensitet på 24 μE.m-2.s-1 (svagt ljus, fotoperiod 16:8 L:D).
OBS: Den första gametangia (kvinnlig oogonia och manlig archegonia) kan observeras efter 5 dagar. Hanen är hypergrenad med små celler, och honan består av större celler som bildar långa filament15,22. De första äggen observeras ~ 10 dagar senare, och den första uppdelningen av zygoter sker vanligtvis inom de följande 2 dagarna. - Sex dagar efter observation av de första äggen, överför diskarna till ljusare vita ljusförhållanden: 50 μE.m-2.s-1, fotoperiod 16:8 L:D, fortfarande vid 13 °C.
3. Bildförvärv för urval av embryon för ablation och övervakning av efterföljande tillväxt
- Avbilda hela petriskålen för att (åter)lokalisera de embryon som valts under ablationssteget (inget behov av att återföra skålen till ögonmikroskopet) och övervaka den efterföljande utvecklingen av de valda embryona.
OBS: Använd ett inverterat laserscanningskonfokalmikroskop (se materialtabell) för avbildning (figur 1), och laserablationen beskrivs i steg 5. - Placera petriskålen på scenen och orientera den med ett visuellt märke (t.ex. rita en linje med en permanent markör).
- Använd målet 10x/0,45 för att fokusera på ett embryo. Registrera positionen för de fyra kardinalpunkterna i petriskålen.
- Starta panelsökningen. Skaffa överförda / fluorescerande bilder av hela petriskålen med låg upplösning: 256 x 256 pixlar, en pixelvistelsetid på 1,54 μs med dubbelriktad skanning och en digital zoom på 0,6x med en 561 nm laser vid 1,2% överföring.
OBS: Skanningstiden för en hel 2,5 cm petriskål är ~ 6 min för 225 plattor (figur 2). Här användes 561 nm laser för överföring och fluorescensavbildning. Fluorescenssignalen samlades in mellan 580–720 nm på de konfokala fotomultiplikatorerna (PMT) och det överförda ljuset samlades in på den överförda PMT. 561 nm-lasern kan också övervaka klorofyll i detta steg, men det är onödigt eftersom det bara hjälper till att skilja signalbruset och organismerna korrekt. - Spara panelskanningsbilden och håll den öppen i fönstret för bildförvärv (se materialtabell).
- Ändra målet, ta inte bort petriskålen.
OBS: Vattenmålet på 40x/1,2 flyttades till sidan av scenen så att nedsänkningsmediet (vatten) kunde läggas till målet utan att petriskålen flyttades från sin ursprungliga position. - Navigera genom den tidigare förvärvade kakelskanningsbilden för att välja lämpligt embryo. När ett embryo har identifierats på denna bild, flytta scenen till embryots exakta position och få överförda /fluorescerande bilder av det embryot med hög upplösning.
OBS: Högupplösta inställningar: 512 x 512 pixlar, 0,130 μm / pixel, 0,208 μs pixel uppehållstid med monoriktad skanning och 2x digital zoom med en 561 nm laser vid 0,9% överföring. - Kommentera kakelskanningsbilden för varje embryokandidat för laserablation (figur 2B) och fortsätt till laserablationssteget.
4. Laserkalibrering
- Kalibrera lasern och synkronisera bildförvärvsprogramvaran med laserdrivrutinsprogramvaran i "Click &Fire mode" och en pulserad 355 nm laser.
OBS: Detta steg är avgörande för att säkerställa perfekt synkronisering mellan muspekarens position i laserdrivrutinsprogramvaran (se materialtabell) med positionen i livebilden av förvärvsprogramvaran. - Öppna programvarupaketet för laserdrivrutiner och klicka på Live i programvarupaketet för bildförvärv.
- Synkronisera båda programvarupaketen genom att klicka på Starta förvärv i laserdrivrutinens programvarupaket. Livebilden spelas nu också in i UV-laserdrivrutinen.
- Definiera ett intresseområde (AOI) genom att klicka på välj AOI-knappen och klicka på bildens kanter (höger, vänster, topp och botten) i UV-laserdrivrutinens programvarupaket.
Efter det här kalibreringssteget måste inställningarna för pixelstorlek, bildformat och zoomning i programvarupaketet för förvärv förbli konstanta. - Välj ett tomt område på skålen och sänk scenens nivå till 20 μm under provfokalplanet för att fokusera på glasbotten.
- Ställ in ablationslasern och bildlaserbanorna genom att klicka på Starta kalibrering och välj Manuell kalibrering.
- Välj en lasereffekt som är tillräckligt hög för att se en svart prick i mitten av livebilden som motsvarar hålet i glasöverdragsglaset (alla fönsterluckor måste vara öppna).
- Klicka på den här centrala svarta pricken med muspekaren och klicka på ytterligare 18 punkter som föreslås av programvaran för att slutföra justeringsproceduren.
- Kontrollera kalibreringen i "Click &Fire mode" på samma omslagslip.
OBS: Laserkalibrering beror på bildparametrarna. När lasern har kalibrerats, se till att bildparametrarna (dvs. 512 x 512 pixlar, 0,130 μm / pixel, 0,208 μs pixel uppehållstid med monoriktad skanning och 2x digital zoom) inte har ändrats.
5. Laserablation
- Välj ett embryo av intresse. Starta en time-lapse-inspelning i programvaran för bildförvärv.
- Skaffa överförda/fluorescensbilder med ett mål på 40x/1,2 W vid hög upplösning (dvs. 512 x 512 pixlar, 0,130 μm/pixel, 1,54 μs pixel uppehållstid med enkelriktad skanning och 2x digital zoom med en 561 nm laser vid 0,9% överföring). Skaffa time-lapse-inspelningen med maximal hastighet.
- Zooma ut från området i början av time-lapse-inspelningen. Zooma in på AOI.
- Använd funktionen "Click &Fire" i laserdrivrutinsprogramvaran för att applicera den skadliga bestrålningen på cellen av intresse för embryot. Använd följande parametrar: 45% laseröverföring (motsvarande maximalt 40 μW) och 1 ms pulstid (steg 4).
OBS: Videoinspelning under laserfotograferingen rekommenderas. - Under 688 nm, övervaka utstötningen av autofluorescerande kloroplaster från cytoplasman.
- Om cellinnehållet finns kvar i cellen, använd funktionen "Click &Fire" en gång till för att öka storleken på brottet i cellen. Upprepa och håll antalet bilder till ett minimum tills det mesta av cellinnehållet har släppts.
- Stoppa time-lapse-inspelningen efter att embryot har stabiliserats (dvs. ingen ytterligare intracellulär rörelse kan detekteras (~ 1-5 min).
- Uppdatera anteckningen på panelsökningsbilden om det behövs.
6. Övervakning av tillväxten av bestrålade embryon
OBS: Övervakning utförs under flera dagar.
- Bestäm överlevnadshastigheten genom att övervaka antalet embryon som utvecklas efter laserablation och jämför dem med de som dör.
OBS: Vissa embryon dör omedelbart efter ablation av olika skäl. En hög och snabb dödlighet är vanligtvis ett tecken på olämpliga laserparametrar eller högre /längre exponering för stress under experimentet eller efterföljande transport. - Bestäm tillväxtfördröjningen genom att mäta längden på de laserskottade embryona varje dag och jämföra den med intakta embryon.
OBS: Tillväxthastigheten för laserskottsorganismer är i allmänhet långsammare än för obehandlade organismer. Vissa (olämpliga) laserinställningar kan dock hämma tillväxten i mer än en vecka, med tillväxt som återupptas efter det. - Ta reda på den intilliggande skadan genom att övervaka reaktionen hos celler intill de bräkta cellerna. I vissa fall kan tryckavlastning efter burst orsaka att angränsande celler spricker.
- Kontrollera om det finns mikrobföroreningar. Övervaka tillväxten av mikroalger och bakterier i mediet. Om en ovanlig nivå av mikrober finns i skålen, kassera den och upprepa protokollet från steg 2 eller steg 3.
OBS: Efter laserablation är skadade S. latissima-embryon redan mycket stressade och ytterligare yttre stress kan orsaka ökad dödlighet. Bakteriella eller virala utbrott är möjliga eftersom de behandlade embryona inte kan växa under axeniska förhållanden. - Kontrollera den globala utvecklingen av skottorganismerna genom att studera fenotypen och förstå rollen i utvecklingen av den riktade regionen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Gametofyter av S. latissima odlades och gametogenes inducerades att producera zygoter och embryon. Tolv dagar efter induktionen av gametogenes genomgick embryon laserablation. Här syftade experimentet till att bedöma specifika cellers roll i den övergripande utvecklingen av S. latissima-embryon . Den mest apikala cellen, den mest basala cellen och mediancellerna riktades. Efter kakelskanning identifierades hela petriskålen (figur 2A), ett embryo av intresse, som en lämplig kandidat för laserfotografering (figur 2B). En specifik cell i detta embryo valdes, riktades och sköts med en pulserad UV-laserstråle med högst 40 μW lasereffekt (motsvarande 45% av maximal effekt för den utrustning som används här) i 1 ms (film 1). Cellen släppte sitt innehåll (kloroplaster och cytoplasma). Intressant nog svarade intilliggande celler på sprängningen av den bestrålade cellen genom att expandera in i det intercellulära utrymmet. Positionen för de bestrålade embryona registrerades för efterföljande övervakning under 10 dagar (figur 3). De flesta av de bestrålade embryona fortsatte att utvecklas men visade tillväxtförändring (embryoform). En detaljerad analys av de morfologiska förändringarna måste göras innan en specifik funktion kan tillskrivas varje bestrålad cell för att kontrollera den övergripande utvecklingsmekanismen.
Däremot testade embryon med andra laserparametrar (t.ex. 33 ms under fotograferingstiden 60% -80% lasereffekt; Film 2) visade snabbt tecken på allvarlig stress som cellblekning, blekning eller formförändringar (avrundning). Nästan alla embryon som sköts på detta sätt dog inom fem dagar efter experimentet (figur 4).
Figur 1: Fotografi av laserablationsmikroskopuppsättningen.
Figur 2: Annoterad kakelskanning av en hel petriskål. Transmissionen PMT användes för att få en ljusfältsskanning. När ett embryo av intresse har lokaliserats klickar användaren på embryots position i kakelskanningen och programvaran placerar scenen direkt över embryot. (B) Kakelskanningen kan sedan kommenteras specifikt för att lokalisera embryot i de efterföljande stegen, för att spåra och övervaka embryot. Här visar bilden ett embryo fäst vid botten av petriskålen, som lätt kan lokaliseras med 561 nm laser. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Tidsserier för det växande S. latissima-embryot efter bestrålning. Detta visas i film 1. Laserablation av embryots mest apikala cell blekte inte embryonets intilliggande celler. De fortsatte att växa och dela sig och bildade ett normalt embryo efter några dagar. Bilder togs var 24: e timme, 2-9 dagar efter ablation. Skalstrecket är 50 μm och är detsamma för alla foton. D2-D9 motsvarar dag-2 till dag-9. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: Tidsserier för S. latissima embryodöd efter laserablation med användning av suboptimala parametrar. Överexponering för laserbestrålning kan lätt leda till högre dödstal för målembryomet och även de närliggande. En tidsserie av embryot som tagits i film 2 visas, med tiden efter ablation angiven ovanför varje foto (3-6 dagar efter ablation). Skalstrecket är 30 μm och gäller för varje foto. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Film 1: Laserablation av den mest apikala cellen i ett 8-cells embryo av S. latissima. Fokus justerades först på embryot som valts ut bland en bukett Saccharina-sporofyter (vid olika fält, först breda, sedan smala). Den mest apikala cellen i embryot sköts sedan med 45% laserkraft i 1 ms. Den apikala cellen brast snabbt och släppte innehållet. De intilliggande cellerna, befriade från burstcellens turgor, fyllde det tomma utrymmet. Efter 5 minuter har cellen och dess innehåll slutat röra sig och har nått ett jämviktstillstånd. Filmen har accelererats 4 gånger (från 1 bild per 632 ms till 6 fps). Uppföljningen av embryoutvecklingen visas i figur 3. Klicka här för att ladda ner den här filmen.
Film 2: Betydande blekning av celler intill en burst-cell orsakad av suboptimala laserinställningar. Att använda en lasereffekt på 60% -80% för 1 ms eller en lasereffekt på 45% för 10 ms resulterade i signifikant blekning av intilliggande celler och en mycket lägre överlevnad. Inställningarna som används för lasern bör inte orsaka blekning eller partiell skada på intilliggande celler. Bästa resultat erhölls genom att minska laserpulsens effekt och / eller varaktighet och rikta in sig på punkten längst bort från de intilliggande cellerna. Härskjuts den mest apikala cellen i ett 4-cells embryo av S. latissima (80% lasereffekt, 1 ms) (lateral / toppvy). Överblekning av de nedre och laterala cellerna är lätt observerbar. Den efterföljande utvecklingen av embryot visas i figur 4. Klicka här för att ladda ner den här filmen.
Kompletterande figur 1: Schematiskt flödesschema över hela protokollet. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Lokal cellulär laserablation möjliggör tidsmässig och rumslig ablation med hög precision. Dess effektivitet kan emellertid hämmas av målcellernas bristande tillgänglighet; till exempel är alla celler av ett tredimensionellt embryo. Detta protokoll utvecklades på embryot av algen Saccharina latissima, som utvecklar en monolayered lamina där alla celler lätt kan särskiljas och förstöras individuellt med en laserstråle.
Laserkraft och våglängd
NIR fs-pulserad laser används ofta i utvecklingsstudier på djur24,25. Men när det gäller bruna alger som Saccharina kunde lasern inte spränga cellen utan att bränna hela embryot. Denna reaktion kan vara relaterad till den höga aktiviteten hos kloroplastljusskördarna.
Med hjälp av den ns-pulserade UV-lasern för ablation testades två metoder: (1) med en hög effektpuls under en kort tidsperiod eller (2) med en lägre laserexponering under en längre tidsperiod. Energin som levereras av lasern, en kombination av laserkraft och pulsvaraktighet, påverkar den energi som levereras till den bestrålade cellen. Den levererade energin kan också påverka de omgivande cellerna genom reflektion och diffraktion. Därför valdes de lägsta inställningarna av de två parametrar som gav reproducerbara resultat för att minska eventuella oönskade sidoeffekter. Lasereffekt mellan 25-40 μ W.cm-2 med en puls på 1 ms verkade vara optimal. Med hjälp av dessa parametrar begränsades effekten av UV-lasern på en mycket lokal nivå utan synlig blekning i de omgivande cellerna men tillräckligt effektiv för att få målcellen att brista. Dessa parametrar applicerades upprepade gånger utan någon direkt dödlig effekt på embryona. Längre pulstider eller högre laserkraft orsakade blekning av de omgivande cellerna eller till och med död av embryot, medan lägre värden var otillräckliga för att bryta cellväggen.
Algmaterial och odlingsförhållanden
Även om det möjliggör exakt fotografering på subcellulär nivå, kräver denna teknik att experimentören tar itu med fyra kritiska faktorer för att möjliggöra tillförlitlig tolkning av resultaten. Dessa punkter måste beaktas både före och efter laserablationsexperimentet.
Den första faktorn att ta itu med är embryopopulationstätheten. Negativ trängsel påverkar utvecklingstakten för S. latissima26. Låga densiteter ger (1) bättre pulsrepeterbarhet eftersom närvaron av andra embryon i laserbanan kan minska dess effekt, och (2) enklare övervakning av embryon som skjuts av lasern, som växer något långsammare än intakta embryon; den senare täcker snabbt de skjutna embryona. Den andra kritiska faktorn i detta protokoll är temperaturen vid vilken experimentet utförs. Laserstrålen själv värmer provet, men temperaturen i rummet och mikroskopets lokala miljö bidrar till de totala temperaturförhållandena som provet upplever, nära 18-22 °C. Här kyldes inte mikroskopets rum eftersom denna utrustning huvudsakligen används för djurceller som tolererar omgivningstemperaturer. Lyckligtvis kunde Saccharina-embryon tåla temperaturer på 22 °C (9 °C högre än den optimala odlingstemperaturen på 13 °C) i upp till 4 timmar. Anordningar som hjälper till att upprätthålla en låg omgivningstemperatur, såsom tillräcklig ventilation eller en kylplattahållare, kan dock bidra till att minska risken för negativa effekter på algembryons överlevnad och utveckling. Dessutom kan långsam förciklimatisering av gametofyter till 16 °C under rött ljus hjälpa embryona att motstå temperaturtoppar under ablationsprocessen. För det tredje, förutom temperaturökningen, berövas embryona en lämplig ljuskälla under experimentets varaktighet. Dessutom kan kloroplasterna delvis blekas av 561 nm lasern. Att använda lägsta möjliga effekt på 561 nm lasern hjälper till att minska denna effekt. För det fjärde är transport också en kritisk faktor att ta hänsyn till eftersom laserablationsutrustning inte är tillgänglig i alla laboratorier. Temperaturtoppar och yttre rörelser eller stötar bör undvikas för att förhindra att algmaterialet lossnar, förloras eller dör. När det är möjligt måste transportlådorna vara kylda, vibrationsbeständiga (t.ex. stötdämpande skum) och utrustade med lampor. Flera transportlådor som uppfyller dessa krav finns tillgängliga kommersiellt.
Även om alla dessa faktorer kontrolleras så mycket som möjligt kan svag men potentiellt betydande miljöbelastning fortfarande uppstå. Denna möjlighet måste beaktas vid analys och tolkning av embryots svar på laserablation.
Förutom de miljöförhållanden som måste hållas stabila under hela experimentet är det också en utmaning att hålla reda på de bestrålade organismerna under hela övervakningssteget. Tillväxten av de olika embryona förändrar det ursprungliga landskapet över tiden. Om inte ett automatiserat mikroskop kan ägnas åt att övervaka experimentet kan det lätt bli tidskrävande att följa embryot efter laserablation och generera stora mängder data. Videoinspelningar under den initiala laserablationspulsen rekommenderas starkt för att spåra embryots omedelbara reaktion på pulsen. Denna snabba övervakning av pulspåverkan är av stor betydelse eftersom pulsen i vissa fall, när den riktades mot mitten av cellen, fick målcellen att brista snabbt, troligen på grund av skillnaden i osmolaritet mellan cellens inre och mediet (havsvatten). När läckaget var för snabbt brast också de närliggande cellerna. Att skjuta på den mest distala regionen i den riktade cellen visade sig vara ett effektivt sätt att buffra burst-effekten på alla intilliggande celler. Ett annat effektivt sätt att undvika våldsamma skurar är att öka osmolariteten hos mediet med sackaros27. Skillnaden i osmolaritet är emellertid nödvändig för att eliminera den riktade cellens innehåll. Således krävs att tillräcklig osmolaritetspotential upprätthålls. I några fall hindrade kloroplaster och andra föreningar öppningen som gjordes av laserablationen, vilket resulterade i att celler återhämtade sig från laserskottet, med tillväxt som återupptogs efter några dagar. Ytterligare pulser riktade mot att rensa öppningen visade sig vara tillräckliga för att förhindra obstruktion.
Begränsningar
En avvägning måste göras mellan laserkraft, som ska vara tillräckligt hög för att få cellerna att tömma sitt innehåll, och överlevnaden för de närliggande cellerna, som i algembryon är särskilt känsliga för värmestress och fotoblekning. Därför är noggrann övervakning av cellerna efter laserskottet nyckeln till att kontrollera detta steg och se till att målcellerna är döda. Annars kan tolkningen av de riktade cellerna på de närliggande cellernas öde, och därmed den efterföljande utvecklingen av embryot, vara vilseledande.
Att punktera celler med en nål kan tyckas vara ett alternativ där algcellerna inte skulle uppleva någon värme- eller ljusstress. Detta tillvägagångssätt skulle dock vara utmanande eftersom bruna algembryoceller växer nedsänkta i havsvatten och inte har någon kontakt med någon fast yta. Den tjocka och elastiska cellväggen motstår nålpenetration även när embryot hålls i kontakt med en fast glasyta med hjälp av en mikromanipulator i ett standardmikroinjektionssystem.
Sammanfattningsvis beskriver detta protokoll det fullständiga experimentella förfarandet och inställningarna för laserablation och övervakning av bruna algembryon och de kritiska stegen för ett framgångsrikt experiment (kompletterande figur 1). Detta unika tillvägagångssätt är en lovande metod för att studera cellinteraktioner och cellöden i de tidiga embryona av bruna alger.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
S.B.:s doktorandstipendium finansieras av Region Bretagne (ARED-anslagsnummer COH20020) och Sorbonne Université. I.T.is doktorandbidrag finansieras av Region Bretagne (ARED-anslagsnummer COH18020) och Norvegian NMBU University. Detta projekt har fått ekonomiskt stöd från CNRS genom MITI:s tvärvetenskapliga program. MRic är medlem i den nationella infrastrukturen France-BioImaging som stöds av den franska nationella forskningsbyrån (ANR-10-INBS-04).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 25 mm glass bottom petri dish | NEST | 801001 | |
| Autoclaved sea water | - | Collected offshore near the Astan buoy (48°44.934 N 003°57.702 W) close to Roscoff, France, at a depth of 20 m. | |
| Cell scraper | MED 2 | 83.3951 | |
| Cell strainer 40 µm | Corning / Falcon | 352340 | |
| Culture cabinets | Snijders Scientific Plant Growth Cabinet ECD01 | Any other brand is suitable provided that the light intensity, the photoperiod and the temperature can be controlled. | |
| LSM 880 Zeiss confocal microscope | Carl Zeiss microscopy, Jena, Germany | Ablation and imaging were performed using a 40x/1.2 water objective | |
| Pellet pestles | Sigma Aldrich | Z359947 | Blue polypropylene (autoclavable) |
| Provasoli supplement | - | Recipe is available here: http://www.sb-roscoff.fr/sites/www.sb-roscoff.fr/files/documents/station-biologique-roscoff-preparation-du-provasoli-2040.pdf | |
| Pulsed 355 laser (UGA-42 Caliburn 355/25) | Rapp OptoElectronic, Wedel, Germany | ||
| Scalpel | Paramount | PDSS 11 | |
| SysCon software | Rapp OptoElectronic, Wedel, Germany | Laser-driver software | |
| ZEN software | Carl Zeiss microscopy, Jena, Germany | Imaging software, used together with the SysCon software; Black 2.3 version |
References
- Montell, D. J., Keshishian, H., Spradling, A. C. Laser ablation studies of the role of the Drosophila oocyte nucleus in pattern formation. Science. 254 (5029), New York, N.Y. 290-293 (1991).
- Shivakumar, P. C., Lenne, P. F. Laser ablation to probe the epithelial mechanics in drosophila. Methods In Molecular Biology. 1478, 241-251 (2016).
- Bargmann, C. I., Avery, L. Laser killing of cells in Caenorhabditis elegans. Modern Biological Analysis of an Organism. 48, 225-250 (1995).
- Fouad, A. D., Liu, A., Du, A., Bhirgoo, P. D., Fang-Yen, C. Thermal laser ablation with tunable lesion size reveals multiple origins of seizure-like convulsions in Caenorhabditis elegans. Scientific Reports. 11 (1), 5084 (2021).
- Johnson, C. S., Holzemer, N. F., Wingert, R. A. Laser ablation of the zebrafish pronephros to study renal epithelial regeneration. Journal of Visualized Experiments. (54), e2845 (2011).
- Mondia, J. P., Adams, D. S., Orendorff, R. D., Levin, M., Omenetto, F. G. Patterned femtosecond-laser ablation of Xenopus laevis melanocytes for studies of cell migration, wound repair, and developmental processes. Biomedical Optics Express. 2 (8), 2383-2391 (2011).
- Reinhardt, D., Frenz, M., Mandel, T., Kuhlemeier, C. Microsurgical and laser ablation analysis of leaf positioning and dorsoventral patterning in tomato. Development. 132 (1), 15-26 (2005).
- Berg, C., Hage, W., Weisbeek, P., Scheres, B. Laser ablation in Arabidopsis roots: a tool to study cell-to-cell communication. Cellular integration of signalling pathways in plant development. Proceedings of the NATO Advanced Study Institute. , https://eurekamag.com/research/003/488/003488317.php 237-250 (1998).
- Berger, F., Taylor, A., Brownlee, C. Cell fate determination by the cell wall in early fucus development. Science. 263 (5152), New York, N.Y. 1421-1423 (1994).
- Bouget, F. Y., Berger, F., Brownlee, C. Position dependent control of cell fate in the Fucus embryo: role of intercellular communication. Development. 125 (11), 1999-2008 (1998).
- Bringloe, T., et al. Phylogeny and evolution of the brown algae. Critical Reviews in Plant Sciences. 39 (4), 281-321 (2020).
- Saifullah, S., Olsen, Y., Surilayani, D., Handå, A. Carbohydrate of the brown seaweed, saccharina latissima: a review. Joint proceedings of the 2nd and the 3rd International Conference on Food Security Innovation (ICFSI 2018-2019). , 180-182 (2021).
- Zhang, X., Thomsen, M. Techno-economic and environmental assessment of novel biorefinery designs for sequential extraction of high-value biomolecules from brown macroalgae Laminaria digitata, Fucus vesiculosus, and Saccharina latissima. Algal Research. 60, 102499 (2021).
- Kanda, T. On the gametophytes of some japanese species of laminariales. Scientific papers of the Institute of Algological Research, Faculty of Science. 1 (2), Hokkaido Imperial University. 221-260 (1936).
- Fritsch, F. E. The structure and reproduction of the algae. Volume 2. , Cambridge University Press. Cambridge. (1945).
- Bartsch, I., et al. The genus Laminaria sensu lato : recent insights and developments. European Journal of Phycology. 43 (1), 1-86 (2008).
- Theodorou, I., Charrier, B. Chapter 2: Brown algae: ectocarpus and saccharina as experimental models for developmental biology. Handbook of Marine Model Organisms in Experimental Biology - Established and Emerging. Boutet, A., Schierwater, B. , Francis & Taylor Group, CRC Press. ISBN 9780367444471 485 (2021).
- Drew, G. H. The reproduction and early development of laminaria digitata and laminaria saccharina. Annals of Botany. 24 (1), 177-189 (1910).
- Yendo, K. The development of costaria, undaria, and laminaria. Annals of Botany. 25 (99), 691-715 (1911).
- Forbord, S., Steinhovden, K., Rød, K., Handå, A., Skjermo, J. Cultivation protocol for Saccharina latissima. Protocols for Macroalgae Research. Charrier, B., Wichard, T., Reddy, C. R. K. , CRC Press, Francis & Taylor Group. ISBN-10: 14986427. ISBN-13: 978-1498796422 37-59 (2018).
- Bartsch, I. Derivation of clonal stock cultures and hybridization of kelps. Protocols for Macroalgae Research. Charrier, B., Wichard, T., Reddy, C. R. K. , CRC Press, Francis & Taylor Group. ISBN-10: 149879627. ISBN-13: 978-1498796422 61-78 (2018).
- Theodorou, I., Opsahl-Sorteberg, H. -G., Charrier, B. Preparation of zygotes and embryos of the kelp saccharina latissima for cell biology approaches. Bio-protocol. 101, 4132 (2021).
- Lüning, K., Dring, M. J. Reproduction induced by blue light in female gametophytes of Laminaria saccharina. Planta. 104 (3), 252-256 (1972).
- de Medeiros, G., et al. Cell and tissue manipulation with ultrashort infrared laser pulses in light-sheet microscopy. Scientific Reports. 10 (1), 1942 (2020).
- Liang, X., Michael, M., Gomez, G. A. Measurement of mechanical tension at cell-cell junctions using two-photon laser ablation. Bio-protocol. 6 (24), 2068 (2016).
- Ebbing, A., Pierik, R., Bouma, T., Kromkamp, J. C., Timmermans, K. How light and biomass density influence the reproduction of delayed Saccharina latissima gametophytes (Phaeophyceae). Journal of Phycology. 56 (3), 709-718 (2020).
- Rabillé, H., Billoud, B., Tesson, B., Le Panse, S., Rolland, É, Charrier, B. The brown algal mode of tip growth: Keeping stress under control. PLoS Biology. 17 (1), 2005258 (2019).
