Summary
Разрушение специфических клеток в эмбрионе является мощным инструментом для изучения клеточных взаимодействий, участвующих в судьбе клеток. Настоящий протокол описывает методы лазерной абляции клеток-мишеней в раннем зародыше бурой водоросли Saccharina latissima.
Abstract
У Saccharina latissima эмбрион развивается как монослойный клеточный лист, называемый пластинкой или лезвием. Каждая эмбриональная клетка легко наблюдается, легко отличима от своих соседей и может быть индивидуально нацелена. На протяжении десятилетий лазерная абляция использовалась для изучения развития эмбриона. Здесь был разработан протокол клеточно-специфической лазерной абляции для ранних эмбрионов бурой водоросли S. latissima. Представленная работа включает: (1) подготовку эмбрионов сахарины с описанием критических параметров, включая условия культивирования, (2) настройки лазерной абляции и (3) мониторинг последующего роста облученного эмбриона с помощью покадровой микроскопии. Кроме того, приводятся подробные сведения об оптимальных условиях транспортировки эмбрионов с платформы визуализации обратно в лабораторию, что может глубоко повлиять на последующее развитие эмбриона. Водоросли, принадлежащие к отряду Laminariales, демонстрируют паттерны эмбриогенеза, похожие на Saccharina; таким образом, этот протокол может быть легко перенесен на другие виды в этом таксоне.
Introduction
Лазерная абляция использовалась в течение десятилетий для изучения развития эмбрионов. Облучение клеток эмбриона лазерным лучом позволяет контролировать регенеративный потенциал и модификацию клеточной линии во время эмбриогенеза и исследовать влияние целенаправленной абляции на деление клеток и их судьбу. Модельными организмами, используемыми в методах лазерной абляции, обычно являются животные, такие как насекомые 1,2, нематоды 3,4, позвоночные 5,6 и иногда растения 7,8. Кроме того, лазерный подход микроабляции был использован на бурой водоросли Fucus в 1994 и 1998 годах для демонстрации роли клеточной стенки в фотополяризации раннего эмбриона 9,10.
Бурые водоросли относятся к группе Stramenopiles, разошлись у корня эукариотического дерева 1,6 миллиарда лет назад. В результате они филогенетически независимы от других многоклеточных организмов, таких как животные и растения11. Saccharina latissima принадлежит к отряду Laminariales, более известному как kelps, и они являются одними из крупнейших организмов на земле, достигая размеров более 30 м. Saccharina sp. - это большие морские водоросли, используемые для многих применений, таких как пища и корма, а ее полисахариды извлекаются для использования в сельскохозяйственной, фармакологической и косметической промышленности во всем мире12, 13. Его культивирование, главным образом в Азии и в последнее время в Европе, требует подготовки эмбрионов в инкубаториях перед выпуском молоди в открытое море. Как и все водоросли, он имеет двухфазный жизненный цикл, состоящий из микроскопической гаметофитной фазы, во время которой гаплоидный гаметофит растет и производит гаметы для оплодотворения, и диплоидной макроскопической спорофитной фазы, где большая плоская лопатка развивается из своего удержания, прикрепленного к морскому дну или скалам. Спорофит высвобождает гаплоидные споры при созревании, тем самым завершая жизненный цикл 14,15,16.
S. latissima представляет некоторые интересные морфологические особенности17. Его зародыш развивается как монослойный плоский лист 15,18,19 до приобретения многослойной структуры, совпадающей с появлением различных типов тканей. Кроме того, Laminariales является одним из немногих таксонов бурых водорослей, чьи эмбрионы остаются прикрепленными к их материнской гаметофитной ткани (Desmarestiales и Sporochnales слишком15). Эта особенность дает возможность изучить роль материнской ткани в этом процессе развития и сравнить механизмы материнского контроля у бурых водорослей с механизмами у животных и растений.
В этой статье представлен первый полный протокол лазерной абляции у раннего эмбриона ламинарии. Этот протокол, включающий метод UV ns-pulsed, приводит к специфическому разрушению отдельных эмбриональных клеток для изучения их соответствующих ролей во время эмбриогенеза. Процедура предлагает надежный подход к исследованию клеточных взаимодействий и клеточной судьбы во время эмбриогенеза в Laminariales.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Производство гаметофитов Saccharina latissima
- Собирают зрелых спорофитов S. latissima из дикой природы, как описано ранее20,21. Убедитесь, что выбранные спорофиты лишены эпифитов (мелких организмов, видимых на поверхности лезвия) или внутренних паразитов (обнаруженных в обесцвеченных участках или пятнах на лезвии).
- Используя скальпель, разрежьте самую темную часть в центре лезвия (плодородную спорообразующую ткань22) на 1-5 квадратных кусочков (1 см²), избегая любых обесцвеченных пятен, если таковые имеются.
- Удалите все оставшиеся эпифиты, аккуратно очистив разрезанные кусочки обратной стороной скальпеля и немного абсорбирующей бумаги.
- Поместите очищенные кусочки в стеклянную посуду, наполненную стерильной природной морской водой (см. Таблицу материалов) в течение 45 минут, чтобы освободить споры в соответствии с ранее опубликованным отчетом22.
- Извлеките кусочки лезвия и отфильтруйте морскую воду через 40-мкм клеточный ситечко для удаления мусора или нежелательных организмов.
- Развести споры в фильтрате до концентрации 20-40 спор/мл в пластиковых чашках Петри22.
- Поместите споровый раствор в культуральный шкаф (см. Таблицу материалов), сконфигурированный с оптимальными условиями культивирования (13 °C, 24 мкЕ.м-2.с-1, фотопериод 16:8 Л:Д).
- Позвольте спорам прорасти и развиться в гаметофиты.
ПРИМЕЧАНИЕ: Прорастание спор видно через 2 дня в шкафу, а первое деление клеток гаметофитных клеток обычно происходит в течение следующих 48 ч. - Замените питательную среду через 5 дней микрофильтрованной природной морской водой, обогащенной 0,5x раствором Provasoli (NSW1/2) (см. Таблицу материалов).
ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы избежать повторения этих шагов, конкретные мужские и женские гаметофиты могут быть выбраны и вегетативно размножаются в течение нескольких месяцев. Гаметофиты остаются вегетативными при выращивании под красным светом (4 мкЭ.м-2.с-1 с длиной волны не менее 580 нм)23 в тех же условиях культивирования, описанных выше (этап 1.7).
2. Фрагментация и индукция оогенеза
- Заготавливайте гаметофиты с помощью клеточного скребка.
- Используя небольшой пластиковый пестик, измельчите собранные гаметофиты в пробирке объемом 1,5 мл на 4-5-клеточные кусочки.
- Наполните пробирку 1 мл NSW1/2 (шаг 1.9).
- Добавьте 2,5 мкл измельченного раствора гаметофита в 3 мл природной морской воды, обогащенной 1x раствором Provasoli (NSW), и поместите их в чашку Петри.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для упрощения обработки рекомендуется 25-миллиметровая чашка Петри со стеклянным дном. - Поместите приготовленные блюда в культурологический шкаф и индуцируйте гаметогенез при 13 °C под белым светом с интенсивностью 24 мкЕ.м-2.с-1 (тусклый свет, фотопериод 16:8 Л:Д).
ПРИМЕЧАНИЕ: Первая гаметангия (женская оогония и мужская архегония) может наблюдаться через 5 дней. Самец гиперветвлен мелкими клетками, а самка состоит из более крупных клеток, образующих длинныенити 15,22. Первые яйца наблюдаются ~10 дней спустя, а первое деление зигот обычно происходит в течение следующих 2 дней. - Через шесть дней после наблюдения за первыми яйцами перенесите посуду в более яркие условия белого света: 50 мкЕ.м-2.с-1, фотопериод 16:8 Л:Д, все еще при 13 °C.
3. Получение изображения для отбора эмбрионов для абляции и мониторинга последующего роста
- Визуализируйте всю чашку Петри, чтобы (пере)локализовать эмбрионы, выбранные на этапе абляции (нет необходимости возвращать чашку в глазной микроскоп) и контролировать последующее развитие выбранных эмбрионов.
ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте инвертированный лазерный сканирующий конфокальный микроскоп (см. Таблицу материалов) для визуализации (рисунок 1), и лазерная абляция описана на шаге 5. - Поместите чашку Петри на сцену и сориентируйте ее визуальным знаком (например, проведите линию постоянным маркером).
- Используйте объектив 10x/0.45, чтобы сосредоточиться на эмбрионе. Запишите положение четырех сторон света чашки Петри.
- Запустите сканирование плитки. Получайте передаваемые/флуоресцентные изображения всей чашки Петри с низким разрешением: 256 x 256 пикселей, время выдержки пикселя 1,54 мкс при двунаправленном сканировании и цифровой зум 0,6x с использованием лазера 561 нм при передаче 1,2%.
ПРИМЕЧАНИЕ: Время сканирования для всей чашки Петри размером 2,5 см составляет ~6 минут для 225 плиток (рисунок 2). Здесь лазер 561 нм использовался для передачи и флуоресцентной визуализации. Флуоресцентный сигнал собирался между 580-720 нм на конфокальных фотоумножителях (PMT), а проходящий свет собирался на передаваемый PMT. Лазер 561 нм также может контролировать хлорофилл на этом этапе, но в этом нет необходимости, потому что он только помогает правильно различать сигнальный шум и организмы. - Сохраните изображение сканирования плитки и оставьте его открытым в окне программного обеспечения для получения изображений (см. Таблица материалов).
- Измените цель, не убирайте чашку Петри.
ПРИМЕЧАНИЕ: Водный объектив 40x/1.2 был перемещен в сторону сцены таким образом, чтобы погружная среда (вода) могла быть добавлена к объективу без перемещения чашки Петри из ее первоначального положения. - Перейдите по ранее полученному изображению плитки, чтобы выбрать подходящий эмбрион. После того, как эмбрион был идентифицирован на этом изображении, переместите стадию в точное положение эмбриона и приобретите передаваемые / флуоресцентные изображения этого эмбриона с высоким разрешением.
ПРИМЕЧАНИЕ: Настройки высокого разрешения: 512 x 512 пикселей, 0,130 мкм / пиксель, время выдержки пикселя 0,208 мкс с однонаправленным сканированием и 2-кратным цифровым зумом с использованием лазера 561 нм при передаче 0,9%. - Аннотируйте изображение сканирования плитки для каждого эмбриона-кандидата на лазерную абляцию (рисунок 2B) и переходите к этапу лазерной абляции.
4. Лазерная калибровка
- Откалибруйте лазер и синхронизируйте программное обеспечение для получения изображений с программным обеспечением лазерного драйвера в режиме «Click & Fire» и импульсным лазером 355 нм.
ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг имеет решающее значение для обеспечения идеальной синхронизации между положением курсора мыши в программном обеспечении лазерного драйвера (см. Таблицу материалов) с положением в живом изображении программного обеспечения для сбора. - Откройте пакет программного обеспечения драйвера лазера и нажмите Live в пакете программного обеспечения для получения изображений.
- Синхронизируйте оба пакета программного обеспечения, нажав кнопку Начать сбор в пакете программного обеспечения лазерного драйвера. Живое изображение теперь также записывается в программном обеспечении UV laser-driver.
- Определите область интересов (AOI), нажав на кнопку Выбрать AOI и нажав на края изображения (справа, слева, сверху и снизу) в программном пакете УФ-лазерного драйвера.
ПРИМЕЧАНИЕ: После этого шага калибровки настройки размера пикселя, формата изображения и масштабирования в пакете программного обеспечения для сбора данных должны оставаться постоянными. - Выберите пустую область на тарелке и опустите уровень сцены на 20 мкм ниже фокальной плоскости образца, чтобы сфокусироваться на дне стекла.
- Установите траектории абляционного лазера и лазера визуализации, щелкнув Начать калибровку и выбрав Ручная калибровка.
- Выберите мощность лазера, достаточно высокую, чтобы увидеть черную точку в центре живого изображения, соответствующую отверстию в стеклянной крышке (все жалюзи должны быть открыты).
- Нажмите на эту центральную черную точку курсором мыши и нажмите на 18 дополнительных точек, предложенных программным обеспечением для завершения процедуры выравнивания.
- Проверьте калибровку в режиме «Click & Fire» на том же крышке.
ПРИМЕЧАНИЕ: Лазерная калибровка зависит от параметров изображения. После калибровки лазера убедитесь, что параметры изображения (например, 512 x 512 пикселей, 0,130 мкм/пиксель, время ожидания пикселя 0,208 мкс при однонаправленном сканировании и 2-кратном цифровом зуме) не изменились.
5. Лазерная абляция
- Выберите интересующий эмбрион. Запустите покадровую запись в программном обеспечении для сбора изображений.
- Получайте передаваемые/флуоресцентные изображения с объективом 40x/1,2 Вт с высоким разрешением (т.е. 512 x 512 пикселей, 0,130 мкм/пиксель, время выдержки пикселя 1,54 мкс при однонаправленном сканировании и 2-кратный цифровой зум с использованием лазера 561 нм при передаче 0,9%). Приобретайте покадровую запись на максимальной скорости.
- Уменьшите масштаб области в начале покадровой записи. Увеличьте масштаб AOI.
- Используйте функцию «Click & Fire» программного обеспечения лазерного драйвера для нанесения повреждающего облучения на клетку, представляющую интерес для эмбриона. Используйте следующие параметры: 45% лазерной передачи (что соответствует максимуму 40 мкВт) и длительность импульса 1 мс (шаг 4).
ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуется запись видео во время лазерной съемки. - Под 688 нм контролируют выброс автофлуоресцентных хлоропластов из цитоплазмы.
- Если содержимое ячейки остается в ячейке, используйте функцию «Click & Fire» еще раз, чтобы увеличить размер нарушения в ячейке. Повторите, сводя количество выстрелов к минимуму до тех пор, пока большая часть содержимого клеток не будет освобождена.
- Остановите покадровую запись после стабилизации эмбриона (т.е. дальнейшее внутриклеточное движение не может быть обнаружено (~1-5 мин).
- При необходимости обновите аннотацию на изображении сканирования плитки.
6. Мониторинг роста облученных эмбрионов
ПРИМЕЧАНИЕ: Мониторинг осуществляется в течение нескольких дней.
- Определите выживаемость, контролируя количество эмбрионов, которые развиваются после лазерной абляции и сравнивайте их с теми, которые умирают.
ПРИМЕЧАНИЕ: Некоторые эмбрионы умирают сразу после абляции по разным причинам. Высокий и быстрый уровень смертности обычно является признаком неподходящих параметров лазера или более высокого / длительного воздействия стресса во время эксперимента или последующего переноса. - Определите задержку роста, измеряя длину эмбрионов с лазерной съемкой каждый день и сравнивая ее с неповрежденными эмбрионами.
ПРИМЕЧАНИЕ: Скорость роста организмов с лазерным выстрелом, как правило, медленнее, чем у необработанных организмов. Тем не менее, некоторые (неуместные) лазерные установки могут ингибировать рост более недели, после чего рост возобновляется. - Выясните соседние повреждения, наблюдая за реакцией клеток, прилегающих к абляционным клеткам. В некоторых случаях разгерметизация после разрыва может привести к разрыву соседних клеток.
- Проверьте наличие микробных загрязнений. Следите за ростом микроводорослей и бактерий в среде. Если в блюде присутствует необычный уровень микробов, то выбросьте его и повторите протокол из шага 2 или шага 3.
ПРИМЕЧАНИЕ: После лазерной абляции поврежденные эмбрионы S. latissima уже подвергаются сильному стрессу, и дополнительный внешний стресс может вызвать повышенную смертность. Бактериальные или вирусные вспышки возможны, потому что обработанные эмбрионы не могут расти в аксенических условиях. - Проверить глобальное развитие дробеструйных организмов, изучив фенотип и понимая роль в развитии целевого региона.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Были выращены гаметофиты S. latissima , и гаметогенез был индуцирован для производства зигот и эмбрионов. Через двенадцать дней после индукции гаметогенеза эмбрионы подверглись лазерной абляции. Здесь эксперимент был направлен на оценку роли специфических клеток в общем развитии эмбрионов S. latissima . Наиболее апикальная клетка, самая базальная клетка и срединные клетки были нацелены. После сканирования плитки вся чашка Петри (рисунок 2А), представляющий интерес эмбрион, была идентифицирована как подходящий кандидат для лазерной съемки (рисунок 2B). Конкретная клетка этого эмбриона была выбрана, нацелена и снята импульсным УФ-лазерным лучом с максимальной мощностью лазера 40 мкВт (соответствующей 45% максимальной мощности для используемого здесь оборудования) в течение 1 мс (Фильм 1). Клетка высвобождала свое содержимое (хлоропласты и цитоплазму). Интересно, что соседние клетки реагировали на разрыв облученной клетки, расширяясь в межклеточное пространство. Положение облученных эмбрионов регистрировали для последующего мониторинга в течение 10 дней (рисунок 3). Большинство облученных эмбрионов продолжали развиваться, но показали изменение роста (формы эмбриона). Необходимо провести подробный анализ морфологических изменений, прежде чем каждой облученной клетке можно будет присвоить определенную функцию в управлении общим механизмом развития.
Напротив, эмбрионы тестировали с другими параметрами лазера (например, 33 мс при длительности съемки 60%-80% мощности лазера; Фильм 2) быстро показал признаки сильного стресса, такие как отбеливание клеток, выцветание или изменение формы (округление). Почти все эмбрионы, снятые таким образом, умерли в течение пяти дней после эксперимента (рисунок 4).
Рисунок 1: Фотография установки лазерного абляционного микроскопа. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Аннотированное сканирование плитки всей чашки Петри. (A) Сканирование плитки всей чашки Петри, используемой для лазерной абляции. Трансмиссия PMT использовалась для получения сканирования яркого поля. После того, как эмбрион, представляющий интерес, был найден, пользователь нажимает на положение эмбриона в сканировании плитки, и программное обеспечение позиционирует стадию непосредственно над эмбрионом. (B) Затем сканирование плитки может быть аннотировано специально для определения местонахождения эмбриона на последующих этапах, для отслеживания и мониторинга эмбриона. Здесь на изображении показан эмбрион, прикрепленный к дну чашки Петри, который можно легко найти с помощью лазера 561 нм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Временные ряды растущего эмбриона S. latissima после облучения. Это показано в фильме 1. Лазерная абляция наиболее апикальной клетки эмбриона не отбеливала соседние клетки эмбриона. Они продолжали расти и делиться, образуя нормальный эмбрион через несколько дней. Снимки делали каждые 24 ч, через 2-9 дней после абляции. Шкала составляет 50 мкм и одинакова для всех фотографий. Д2-Д9 соответствует дню-2 дню-9. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4: Временные ряды гибели эмбриона S. latissima после лазерной абляции с использованием субоптимальных параметров. Чрезмерное воздействие лазерного облучения может легко привести к более высоким показателям смертности эмбриона-мишени, а также соседних. Показан временной ряд эмбриона, снятого в фильме 2, причем время после абляции указано над каждой фотографией (3-6 дней после абляции). Шкала составляет 30 мкм и применяется к каждой фотографии. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Фильм 1: Лазерная абляция самой апикальной клетки 8-клеточного эмбриона S. latissima. Фокус сначала корректировали на эмбрионе, выбранном среди букета сахариновых спорофитов (на разных полях, сначала широких, затем узких). Затем наиболее апикальную клетку эмбриона снимали с использованием 45% мощности лазера в течение 1 мс. Апикальная клетка быстро лопнула и выпустила свое содержимое. Соседние клетки, освободившись от тургора лопнувшей ячейки, заполнили пустое пространство. Через 5 мин клетка и ее содержимое перестали двигаться и достигли состояния равновесия. Фильм был ускорен в 4 раза (с 1 изображения на 632 мс до 6 кадров в секунду). Наблюдение за развитием эмбриона показано на рисунке 3. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот фильм.
Фильм 2: Значительное обесцвечивание клеток, прилегающих к лопнувшей ячейке, вызванное субоптимальными лазерными настройками. Использование лазерной мощности 60%-80% в течение 1 мс или лазерной мощности 45% в течение 10 мс привело к значительному обесцвечиванию соседних клеток и гораздо более низкой выживаемости. Настройки, используемые для лазера, не должны вызывать отбеливание или частичное повреждение соседних клеток. Наилучшие результаты были получены путем уменьшения мощности и/или продолжительности лазерного импульса и нацеливания на точку, наиболее удаленную от соседних ячеек. Здесьснимается самая апикальная клетка 4-клеточного эмбриона S. latissima (мощность лазера 80%, 1 мс) (боковой/верхний вид). Перебеливание нижних и боковых клеток легко наблюдается. Последующее развитие эмбриона показано на рисунке 4. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот фильм.
Дополнительный рисунок 1: Схематическая блок-схема всего протокола. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Локальная клеточная лазерная абляция позволяет проводить временную и пространственную абляцию с высоким уровнем точности. Однако его эффективность может быть затруднена недоступностью клеток-мишеней; например, все клетки принадлежат трехмерному эмбриону. Этот протокол был разработан на зародыше водоросли Saccharina latissima, которая развивает монослойную пластинку, в которой все клетки могут быть легко различимы и уничтожены по отдельности лазерным лучом.
Мощность и длина волны лазера
NIR fs-импульсный лазер обычно используется в исследованиях развития на животных24,25. Однако в случае бурых водорослей, таких как сахарина, лазер не мог разорвать клетку, не сжигая весь эмбрион. Эта реакция может быть связана с высокой активностью хлоропластовых комбайнов.
С использованием ns-импульсного УФ-лазера для абляции были протестированы два подхода: (1) использование импульса высокой мощности в течение короткого периода времени или (2) использование более низкой лазерной экспозиции в течение более длительного периода времени. Энергия, доставляемая лазером, комбинация мощности лазера и длительности импульса, влияет на энергию, доставляемую к облученной клетке. Доставляемая энергия также может влиять на окружающие клетки путем отражения и дифракции. Поэтому были выбраны самые низкие настройки из двух параметров, которые давали воспроизводимые результаты, чтобы уменьшить любые нежелательные побочные эффекты. Мощность лазера между 25-40 мк W.cm-2 с импульсом 1 мс оказалась оптимальной. Используя эти параметры, эффект УФ-лазера содержался на очень локальном уровне без видимого обесцвечивания в окружающих клетках, но достаточно эффективен, чтобы вызвать разрыв целевой клетки. Эти параметры неоднократно применялись без какого-либо прямого летального воздействия на эмбрионы. Более длительное время импульса или более высокая мощность лазера вызывали обесцвечивание окружающих клеток или даже гибель эмбриона, тогда как более низкие значения были недостаточны для разрушения клеточной стенки.
Состояние водорослевого материала и культуры
Несмотря на то, что этот метод позволяет осуществлять точную съемку на субклеточном уровне, он требует, чтобы экспериментатор рассмотрел четыре критических фактора, чтобы обеспечить надежную интерпретацию результатов. Эти моменты необходимо учитывать как до, так и после эксперимента по лазерной абляции.
Первым фактором, который необходимо учитывать, является плотность популяции эмбрионов. Отрицательная скученность влияет на темпы развития S. latissima26. Низкая плотность обеспечивает (1) лучшую повторяемость импульса, поскольку присутствие других эмбрионов на лазерном пути может снизить его мощность, и (2) более легкий мониторинг эмбрионов, снятых лазером, которые растут немного медленнее, чем интактные эмбрионы; последний быстро покрывает укол эмбрионов. Вторым критическим фактором этого протокола является температура, при которой проводится эксперимент. Лазерный луч сам нагревает образец, но температура помещения и локальная среда микроскопа добавляют к общему температурному режиму, испытываемому образцом, близкому к 18-22 °C. Здесь комната микроскопа не была охлаждена, потому что это оборудование в основном используется для клеток животных, которые переносят температуру окружающей среды. К счастью, эмбрионы сахарины смогли выдерживать температуру 22 °C (на 9 °C выше оптимальной температуры культуры 13 °C) в течение 4 ч. Тем не менее, устройства, помогающие поддерживать низкую температуру окружающей среды, такие как адекватная вентиляция или держатель охлаждающей пластины, могут помочь снизить риск неблагоприятного воздействия на выживание и развитие эмбрионов водорослей. Кроме того, медленная предварительная акклиматизация гаметофитов до 16 °C при красном свете может помочь эмбрионам выдерживать скачки температуры во время процесса абляции. В-третьих, помимо повышения температуры, эмбрионы лишаются подходящего источника света на время эксперимента. Кроме того, хлоропласты могут быть частично отбелены лазером 561 нм. Использование минимально возможной мощности на лазере 561 нм помогает уменьшить этот эффект. В-четвертых, транспорт также является критическим фактором, который следует учитывать, поскольку оборудование для лазерной абляции доступно не во всех лабораториях. Следует избегать скачков температуры и внешних движений или ударов, чтобы предотвратить смещение, потерю или гибель водорослевого материала. По возможности транспортные коробки должны быть охлаждены, виброустойчивы (например, амортизирующая пена) и оснащены огнями. Несколько транспортных коробок, отвечающих этим требованиям, доступны в продаже.
Даже если все эти факторы контролируются настолько, насколько это возможно, слабый, но потенциально значительный экологический стресс все еще может возникнуть. Эту возможность необходимо учитывать при анализе и интерпретации реакции эмбриона на лазерную абляцию.
В дополнение к условиям окружающей среды, которые должны поддерживаться стабильными на протяжении всего эксперимента, отслеживание облученных организмов на протяжении всего этапа мониторинга также является проблемой. Рост различных эмбрионов со временем изменяет первоначальный ландшафт. Если автоматизированный микроскоп не может быть посвящен мониторингу эксперимента, следование за эмбрионом после лазерной абляции может легко стать трудоемким и генерировать большие объемы данных. Видеозаписи во время начального импульса лазерной абляции настоятельно рекомендуются для отслеживания немедленной реакции эмбриона на импульс. Этот быстрый мониторинг воздействия импульса имеет важное значение, потому что в некоторых случаях импульс, направленный на середину клетки, заставлял клетку-мишень быстро лопнуть, скорее всего, из-за разницы осмолярности между внутренней частью клетки и средой (морской водой). Когда утечка была слишком быстрой, соседние клетки также лопались. Стрельба по самой дистальной области целевой клетки оказалась эффективным способом буферизации эффекта разрыва на любых соседних клетках. Другим эффективным способом избежать сильных всплесков является увеличение осмолярности среды с сахарозой27. Однако разница в осмолярности необходима для устранения содержимого клетки-мишени. Таким образом, требуется поддержание достаточного потенциала осмолярности. В некоторых случаях хлоропласты и другие соединения препятствовали открытию, сделанному лазерной абляцией, в результате чего клетки восстанавливались после лазерной съемки, а рост возобновлялся через несколько дней. Дополнительных импульсов, направленных на очистку отверстия, оказалось достаточно для предотвращения обструкции.
Ограничения
Необходимо найти компромисс между мощностью лазера, которая должна быть достаточно высокой, чтобы заставить клетки опорожнять свое содержимое, и выживанием соседних клеток, которые в эмбрионах водорослей особенно чувствительны к тепловому стрессу и фотоотбеливанию. Поэтому тщательный мониторинг клеток после лазерного выстрела является ключом к контролю этого шага и обеспечению того, чтобы клетки-мишени были мертвы. В противном случае интерпретация целевых клеток о судьбе соседних клеток, а значит и последующем развитии эмбриона, может ввести в заблуждение.
Прокалывание клеток иглой может показаться альтернативой, в которой клетки водорослей не будут испытывать никакого теплового или светового стресса. Однако этот подход будет сложным, потому что клетки эмбриона коричневых водорослей растут погруженными в морскую воду и не имеют контакта с какой-либо твердой поверхностью. Толстая и эластичная клеточная стенка сопротивляется проникновению иглы даже при поддержании эмбриона в контакте с твердой стеклянной поверхностью с помощью микроманипулятора в стандартной системе микроинъекции.
Таким образом, этот протокол описывает полную экспериментальную процедуру и настройки для лазерной абляции и мониторинга эмбрионов коричневых водорослей, а также критические шаги для успешного эксперимента (дополнительный рисунок 1). Этот уникальный подход является перспективным методом изучения клеточных взаимодействий и клеточной судьбы у ранних эмбрионов бурых водорослей.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторам нечего раскрывать.
Acknowledgments
Грант S.B. PhD финансируется Регионом Бретань (номер гранта ARED COH20020) и Университетом Сорбонны. I.T.is грант PhD финансируется Регионом Бретань (номер гранта ARED COH18020) и Норвежским университетом НМБУ. Этот проект получил финансовую поддержку от CNRS через междисциплинарные программы MITI. MRic является членом национальной инфраструктуры France-BioImaging при поддержке Французского национального исследовательского агентства (ANR-10-INBS-04).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 25 mm glass bottom petri dish | NEST | 801001 | |
| Autoclaved sea water | - | Collected offshore near the Astan buoy (48°44.934 N 003°57.702 W) close to Roscoff, France, at a depth of 20 m. | |
| Cell scraper | MED 2 | 83.3951 | |
| Cell strainer 40 µm | Corning / Falcon | 352340 | |
| Culture cabinets | Snijders Scientific Plant Growth Cabinet ECD01 | Any other brand is suitable provided that the light intensity, the photoperiod and the temperature can be controlled. | |
| LSM 880 Zeiss confocal microscope | Carl Zeiss microscopy, Jena, Germany | Ablation and imaging were performed using a 40x/1.2 water objective | |
| Pellet pestles | Sigma Aldrich | Z359947 | Blue polypropylene (autoclavable) |
| Provasoli supplement | - | Recipe is available here: http://www.sb-roscoff.fr/sites/www.sb-roscoff.fr/files/documents/station-biologique-roscoff-preparation-du-provasoli-2040.pdf | |
| Pulsed 355 laser (UGA-42 Caliburn 355/25) | Rapp OptoElectronic, Wedel, Germany | ||
| Scalpel | Paramount | PDSS 11 | |
| SysCon software | Rapp OptoElectronic, Wedel, Germany | Laser-driver software | |
| ZEN software | Carl Zeiss microscopy, Jena, Germany | Imaging software, used together with the SysCon software; Black 2.3 version |
References
- Montell, D. J., Keshishian, H., Spradling, A. C. Laser ablation studies of the role of the Drosophila oocyte nucleus in pattern formation. Science. 254 (5029), New York, N.Y. 290-293 (1991).
- Shivakumar, P. C., Lenne, P. F. Laser ablation to probe the epithelial mechanics in drosophila. Methods In Molecular Biology. 1478, 241-251 (2016).
- Bargmann, C. I., Avery, L. Laser killing of cells in Caenorhabditis elegans. Modern Biological Analysis of an Organism. 48, 225-250 (1995).
- Fouad, A. D., Liu, A., Du, A., Bhirgoo, P. D., Fang-Yen, C. Thermal laser ablation with tunable lesion size reveals multiple origins of seizure-like convulsions in Caenorhabditis elegans. Scientific Reports. 11 (1), 5084 (2021).
- Johnson, C. S., Holzemer, N. F., Wingert, R. A. Laser ablation of the zebrafish pronephros to study renal epithelial regeneration. Journal of Visualized Experiments. (54), e2845 (2011).
- Mondia, J. P., Adams, D. S., Orendorff, R. D., Levin, M., Omenetto, F. G. Patterned femtosecond-laser ablation of Xenopus laevis melanocytes for studies of cell migration, wound repair, and developmental processes. Biomedical Optics Express. 2 (8), 2383-2391 (2011).
- Reinhardt, D., Frenz, M., Mandel, T., Kuhlemeier, C. Microsurgical and laser ablation analysis of leaf positioning and dorsoventral patterning in tomato. Development. 132 (1), 15-26 (2005).
- Berg, C., Hage, W., Weisbeek, P., Scheres, B. Laser ablation in Arabidopsis roots: a tool to study cell-to-cell communication. Cellular integration of signalling pathways in plant development. Proceedings of the NATO Advanced Study Institute. , https://eurekamag.com/research/003/488/003488317.php 237-250 (1998).
- Berger, F., Taylor, A., Brownlee, C. Cell fate determination by the cell wall in early fucus development. Science. 263 (5152), New York, N.Y. 1421-1423 (1994).
- Bouget, F. Y., Berger, F., Brownlee, C. Position dependent control of cell fate in the Fucus embryo: role of intercellular communication. Development. 125 (11), 1999-2008 (1998).
- Bringloe, T., et al. Phylogeny and evolution of the brown algae. Critical Reviews in Plant Sciences. 39 (4), 281-321 (2020).
- Saifullah, S., Olsen, Y., Surilayani, D., Handå, A. Carbohydrate of the brown seaweed, saccharina latissima: a review. Joint proceedings of the 2nd and the 3rd International Conference on Food Security Innovation (ICFSI 2018-2019). , 180-182 (2021).
- Zhang, X., Thomsen, M. Techno-economic and environmental assessment of novel biorefinery designs for sequential extraction of high-value biomolecules from brown macroalgae Laminaria digitata, Fucus vesiculosus, and Saccharina latissima. Algal Research. 60, 102499 (2021).
- Kanda, T. On the gametophytes of some japanese species of laminariales. Scientific papers of the Institute of Algological Research, Faculty of Science. 1 (2), Hokkaido Imperial University. 221-260 (1936).
- Fritsch, F. E. The structure and reproduction of the algae. Volume 2. , Cambridge University Press. Cambridge. (1945).
- Bartsch, I., et al. The genus Laminaria sensu lato : recent insights and developments. European Journal of Phycology. 43 (1), 1-86 (2008).
- Theodorou, I., Charrier, B. Chapter 2: Brown algae: ectocarpus and saccharina as experimental models for developmental biology. Handbook of Marine Model Organisms in Experimental Biology - Established and Emerging. Boutet, A., Schierwater, B. , Francis & Taylor Group, CRC Press. ISBN 9780367444471 485 (2021).
- Drew, G. H. The reproduction and early development of laminaria digitata and laminaria saccharina. Annals of Botany. 24 (1), 177-189 (1910).
- Yendo, K. The development of costaria, undaria, and laminaria. Annals of Botany. 25 (99), 691-715 (1911).
- Forbord, S., Steinhovden, K., Rød, K., Handå, A., Skjermo, J. Cultivation protocol for Saccharina latissima. Protocols for Macroalgae Research. Charrier, B., Wichard, T., Reddy, C. R. K. , CRC Press, Francis & Taylor Group. ISBN-10: 14986427. ISBN-13: 978-1498796422 37-59 (2018).
- Bartsch, I. Derivation of clonal stock cultures and hybridization of kelps. Protocols for Macroalgae Research. Charrier, B., Wichard, T., Reddy, C. R. K. , CRC Press, Francis & Taylor Group. ISBN-10: 149879627. ISBN-13: 978-1498796422 61-78 (2018).
- Theodorou, I., Opsahl-Sorteberg, H. -G., Charrier, B. Preparation of zygotes and embryos of the kelp saccharina latissima for cell biology approaches. Bio-protocol. 101, 4132 (2021).
- Lüning, K., Dring, M. J. Reproduction induced by blue light in female gametophytes of Laminaria saccharina. Planta. 104 (3), 252-256 (1972).
- de Medeiros, G., et al. Cell and tissue manipulation with ultrashort infrared laser pulses in light-sheet microscopy. Scientific Reports. 10 (1), 1942 (2020).
- Liang, X., Michael, M., Gomez, G. A. Measurement of mechanical tension at cell-cell junctions using two-photon laser ablation. Bio-protocol. 6 (24), 2068 (2016).
- Ebbing, A., Pierik, R., Bouma, T., Kromkamp, J. C., Timmermans, K. How light and biomass density influence the reproduction of delayed Saccharina latissima gametophytes (Phaeophyceae). Journal of Phycology. 56 (3), 709-718 (2020).
- Rabillé, H., Billoud, B., Tesson, B., Le Panse, S., Rolland, É, Charrier, B. The brown algal mode of tip growth: Keeping stress under control. PLoS Biology. 17 (1), 2005258 (2019).
