Summary
De vernietiging van specifieke cellen in het embryo is een krachtig hulpmiddel voor het bestuderen van cellulaire interacties die betrokken zijn bij het lot van cellen. Het huidige protocol beschrijft technieken voor de laserablatie van gerichte cellen in het vroege embryo van de bruine alg Saccharina latissima.
Abstract
In Saccharina latissima ontwikkelt het embryo zich als een enkellaags celblad dat de lamina of het mes wordt genoemd. Elke embryocel is gemakkelijk waar te nemen, gemakkelijk te onderscheiden van zijn buren en kan individueel worden gericht. Al tientallen jaren wordt laserablatie gebruikt om de ontwikkeling van embryo's te bestuderen. Hier werd een protocol voor celspecifieke laserablatie ontwikkeld voor vroege embryo's van de bruine alg S. latissima. Het gepresenteerde werk omvat: (1) de voorbereiding van Saccharina-embryo's , met een beschrijving van de kritische parameters, inclusief kweekomstandigheden, (2) de laserablatie-instellingen en (3) de monitoring van de daaropvolgende groei van het bestraalde embryo met behulp van time-lapse-microscopie. Daarnaast worden details gegeven over de optimale omstandigheden voor het transport van de embryo's van het beeldvormingsplatform terug naar het laboratorium, wat de latere embryo-ontwikkeling diepgaand kan beïnvloeden. Algen van de orde Laminariales vertonen embryogenesepatronen die vergelijkbaar zijn met Saccharina; dit protocol kan dus gemakkelijk worden overgedragen op andere soorten in dit taxon.
Introduction
Laserablatie wordt al tientallen jaren gebruikt om de ontwikkeling van embryo's te bestuderen. Het bestralen van embryocellen met een laserstraal maakt het mogelijk om het regeneratieve potentieel en de wijziging van de cellijn tijdens de embryogenese te monitoren en de impact van gerichte ablatie op de celdeling en het lot van de cel te onderzoeken. De modelorganismen die worden gebruikt in laserablatiemethoden zijn meestal dieren, zoals insecten 1,2, nematoden 3,4, gewervelde dieren 5,6 en af en toe planten 7,8. Daarnaast werd in 1994 en 1998 een lasermicro-ablatiebenadering gebruikt op de bruine alg Fucus om de rol van de celwand in de fotopolarisatie van het vroege embryo aan te tonen 9,10.
Bruine algen behoren tot de groep Stramenopiles, die 1,6 miljard jaar geleden aan de wortel van de eukaryote boom uiteenvielen. Als gevolg hiervan zijn ze fylogenetisch onafhankelijk van andere meercellige organismen, zoals dieren en planten11. Saccharina latissima behoort tot de orde Laminariales, beter bekend als kelps, en ze behoren tot de grootste organismen op aarde, met afmetingen van meer dan 30 m. Saccharina sp. is een groot zeewier dat wordt gebruikt voor vele toepassingen zoals voedsel en diervoeder, en de polysacchariden worden geëxtraheerd voor gebruik in de landbouw-, farmacologische en cosmetische industrie wereldwijd12, 13. De teelt ervan, voornamelijk in Azië en meer recent in Europa, vereist de voorbereiding van embryo's in broederijen voordat juvenielen in de open zee worden vrijgelaten. Zoals alle kelps heeft het een bifasische levenscyclus die bestaat uit een microscopische gametofytische fase, waarin een haploïde gametofyt groeit en gameten produceert voor bevruchting, en een diploïde macroscopische sporofytische fase, waarbij een groot planair blad zich ontwikkelt uit zijn holdfast bevestigd aan de zeebodem of rotsen. De sporofyt geeft op volwassen leeftijd haploïde sporen af, waardoor de levenscyclus 14,15,16 wordt voltooid.
S. latissima presenteert enkele interessante morfologische kenmerken17. Het embryo ontwikkelt zich als een enkellaags planair vel 15,18,19 voordat het een meerlagige structuur krijgt die samenvalt met de opkomst van verschillende weefseltypen. Bovendien is Laminariales een van de weinige taxa van bruine algen waarvan de embryo's gehecht blijven aan hun maternale gametofytische weefsel (Desmarestiales en Sporochnales doen dat ook15). Deze functie biedt de mogelijkheid om de rol van moederlijk weefsel in dit ontwikkelingsproces te bestuderen en maternale controlemechanismen in bruine algen te vergelijken met die in dieren en planten.
Dit artikel presenteert het eerste complete protocol voor laserablatie in een vroeg kelp-embryo. Dit protocol met UV ns-gepulseerde techniek resulteert in de specifieke vernietiging van individuele embryocellen om hun respectieve rollen tijdens embryogenese te bestuderen. De procedure biedt een betrouwbare aanpak voor het onderzoeken van celinteracties en cellotgevallen tijdens embryogenese in Laminariales.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Productie van Saccharina latissima gametofyten
- Verzamel volwassen sporofyten van S. latissima uit het wild zoals eerder beschreven20,21. Zorg ervoor dat de geselecteerde sporofyten verstoken zijn van epifyten (kleine organismen zichtbaar op het oppervlak van het blad) of interne parasieten (gevonden in de gebleekte gebieden of vlekken op het blad).
- Snijd met behulp van een scalpel het donkerste deel in het midden van het mes (vruchtbaar sporenproducerend weefsel22) in 1-5 vierkante stukken (1 cm²), vermijd gebleekte vlekken, indien aanwezig.
- Verwijder alle resterende epifyten door de gesneden stukken voorzichtig schoon te maken met de achterkant van een scalpel en wat absorberend papier.
- Plaats de gereinigde stukken gedurende 45 minuten in een glazen schaal gevuld met steriel natuurlijk zeewater (zie Materiaaltabel) om sporen vrij te geven na eerder gepubliceerd rapport22.
- Verwijder de bladstukken en filter het zeewater door een celzeef van 40 μm om vuil of ongewenste organismen te verwijderen.
- Verdun de sporen in het filtraat tot een concentratie van 20-40 sporen/ml in plastic petrischalen22.
- Plaats de sporenoplossing in een kweekkast (zie Materiaaltabel) geconfigureerd met de optimale kweekomstandigheden (13 °C, 24 μE.m-2.s-1, fotoperiode 16:8 L:D).
- Laat de sporen ontkiemen en ontwikkelen tot gametofyten.
OPMERKING: Sporenkieming is zichtbaar na 2 dagen in de kast en de eerste celdeling van de gametofytische cellen vindt meestal plaats binnen de volgende 48 uur. - Vervang het groeimedium na 5 dagen door microgefilterd natuurlijk zeewater verrijkt met een 0,5x Provasoli-oplossing (NSW1/2) (zie Materiaaltabel).
OPMERKING: Om herhaling van deze stappen te voorkomen, kunnen specifieke mannelijke en vrouwelijke gametofyten gedurende enkele maanden worden geselecteerd en vegetatief worden vermeerderd. De gametofyten blijven vegetatief wanneer ze worden gekweekt onder rood licht (4 μE.m-2.s-1 met een golflengte van ten minste 580 nm)23 in dezelfde kweekomstandigheden als hierboven beschreven (stap 1.7).
2. Fragmentatie en inductie van oogenese
- Oogst gametofyten met een celschraper.
- Gebruik een kleine plastic stamper en verpletter de verzamelde gametofyten in een buis van 1,5 ml in stukjes met 4-5 cellen.
- Vul de buis met 1 ml NSW1/2 (stap 1.9).
- Voeg 2,5 μL van de gemalen gametofytoplossing toe aan 3 ml natuurlijk zeewater verrijkt met 1x Provasoli-oplossing (NSW) en plaats ze in een petrischaaltje.
OPMERKING: Een petrischaal met glazen bodem van 25 mm wordt aanbevolen voor een eenvoudigere bediening. - Plaats de bereide gerechten in een kweekkast en induceer gametogenese bij 13 °C onder wit licht met een intensiteit van 24 μE.m-2.s-1 (weinig licht, fotoperiode 16:8 L:D).
OPMERKING: De eerste gametangia (vrouwelijke oogonia en mannelijke archegonia) kan na 5 dagen worden waargenomen. Het mannetje is hypervertakt met kleine cellen en het vrouwtje bestaat uit grotere cellen die lange filamenten vormen15,22. De eerste eieren worden ~ 10 dagen later waargenomen en de eerste verdeling van zygoten vindt meestal plaats binnen de volgende 2 dagen. - Breng de gerechten zes dagen na het observeren van de eerste eieren over naar helderder wit licht: 50 μE.m-2.s-1, fotoperiode 16:8 L:D, nog steeds bij 13 °C.
3. Beeldacquisitie voor het selecteren van embryo's voor ablatie en het monitoren van de daaropvolgende groei
- Breng de hele petrischaal in beeld om de embryo's die tijdens de ablatiestap zijn geselecteerd te (her)lokaliseren (het is niet nodig om het gerecht terug te brengen naar de oculaire microscoop) en de daaropvolgende ontwikkeling van de geselecteerde embryo's te volgen.
OPMERKING: Gebruik een omgekeerde laserscan confocale microscoop (zie Tabel met materialen) voor beeldvorming (figuur 1) en de laserablatie wordt beschreven in stap 5. - Plaats de petrischaal op het podium en oriënteer deze met een visueel merkteken (teken bijvoorbeeld een lijn met een permanente markering).
- Gebruik de doelstelling 10x/0,45 om je te concentreren op een embryo. Noteer de positie van de vier kardinale punten van de petrischaal.
- Start de tegelscan. Verkrijg verzonden /fluorescerende beelden van de hele petrischaal met lage resolutie: 256 x 256 pixels, een pixel dwell-tijd van 1,54 μs met bidirectioneel scannen en een digitale zoom van 0,6x met behulp van een 561 nm-laser bij 1,2% transmissie.
OPMERKING: De scantijd voor een hele petrischaal van 2,5 cm is ~ 6 minuten voor 225 tegels (figuur 2). Hier werd de 561 nm-laser gebruikt voor transmissie en fluorescentiebeeldvorming. Het fluorescentiesignaal werd verzameld tussen 580-720 nm op de confocale fotomultipliers (PMT) en het doorgelaten licht werd verzameld op de doorgelaten PMT. De 561 nm-laser kan bij deze stap ook chlorofyl controleren, maar het is onnodig omdat het alleen helpt om de signaalruis en de organismen correct te onderscheiden. - Sla de tegelscanafbeelding op en houd deze open in het venster van de software voor het verkrijgen van afbeeldingen (zie Materiaalstructuur).
- Verander het doel, verwijder de petrischaal niet.
OPMERKING: Het waterdoel van 40x/1,2 werd naar de zijkant van het podium verplaatst, zodat het onderdompelingsmedium (water) aan het objectief kon worden toegevoegd zonder de petrischaal van zijn oorspronkelijke positie te verplaatsen. - Navigeer door de eerder verkregen tegelscanafbeelding om het juiste embryo te selecteren. Zodra een embryo op deze afbeelding is geïdentificeerd, verplaatst u het stadium naar de exacte positie van het embryo en verkrijgt u overgedragen / fluorescerende beelden van dat embryo met hoge resolutie.
OPMERKING: Instellingen met hoge resolutie: 512 x 512 pixels, 0,130 μm/pixel, 0,208 μs pixel verblijftijd met monodirectioneel scannen en 2x digitale zoom met behulp van een 561 nm laser bij 0,9% transmissie. - Annoteer de tegelscanafbeelding voor elk embryo dat kandidaat is voor laserablatie (figuur 2B) en ga verder met de laserablatiestap.
4. Laserkalibratie
- Kalibreer de laser en synchroniseer de beeldacquisitiesoftware met de laserdriversoftware in de "Click &Fire-modus" en een gepulseerde 355 nm-laser.
OPMERKING: Deze stap is cruciaal om een perfecte synchronisatie te garanderen tussen de positie van de muiscursor in de laserdriversoftware (zie Materiaaltabel) en de positie in het livebeeld van de acquisitiesoftware. - Open het laser-driver softwarepakket en klik op Live in het image acquisition softwarepakket.
- Synchroniseer beide softwarepakketten door te klikken op Start acquisitie in het laser-driver softwarepakket. Het live beeld wordt nu ook opgenomen in de UV laser-driver software.
- Definieer een interessegebied (AOI) door op de knop AOI kiezen te klikken en op de randen van de afbeelding (rechts, links, boven en onder) in het UV-laserstuurprogrammasoftwarepakket te klikken.
OPMERKING: Na deze kalibratiestap moeten de instellingen voor pixelgrootte, afbeeldingsindeling en zoom in het acquisitiesoftwarepakket constant blijven. - Selecteer een leeg gebied op de schotel en verlaag het niveau van het podium tot 20 μm onder het brandpuntsvlak van het monster om scherp te stellen op de glazen bodem.
- Stel de ablatielaser- en beeldlasertrajecten in door op Kalibratie starten te klikken en Handmatige kalibratie te kiezen.
- Selecteer een laservermogen dat hoog genoeg is om een zwarte stip in het midden van de live afbeelding te zien die overeenkomt met het gat in de glazen afdekplaat (alle luiken moeten open zijn).
- Klik op deze centrale zwarte stip met de muiscursor en klik op 18 extra stippen die door de software worden voorgesteld om de uitlijningsprocedure te voltooien.
- Controleer de kalibratie in de "Click &Fire-modus" op dezelfde coverslip.
OPMERKING: Laserkalibratie is afhankelijk van de beeldparameters. Zodra de laser is gekalibreerd, moet u ervoor zorgen dat de beeldparameters (d.w.z. 512 x 512 pixels, 0,130 μm / pixel, 0,208 μs pixel dwell time met monodirectioneel scannen en 2x digitale zoom) niet zijn gewijzigd.
5. Laserablatie
- Selecteer een embryo van belang. Start een time-lapse-opname in de beeldacquisitiesoftware.
- Verkrijg verzonden/fluorescentiebeelden met een objectief van 40x/1,2 W met een hoge resolutie (d.w.z. 512 x 512 pixels, 0,130 μm/pixel, 1,54 μs pixel dwell time met monodirectioneel scannen en 2x digitale zoom met behulp van een 561 nm laser bij 0,9% transmissie). Verkrijg de time-lapse-opname op maximale snelheid.
- Zoom uit op het gebied aan het begin van de time-lapse-opname. Zoom in op de AOI.
- Gebruik de "Click &Fire" functie van de laser-driver software om de schadelijke bestraling toe te passen op de cel van belang in het embryo. Gebruik de volgende parameters: 45% lasertransmissie (overeenkomend met een maximum van 40 μW) en 1 ms pulstijdduur (stap 4).
OPMERKING: Video-opname tijdens de laseropname wordt aanbevolen. - Controleer onder 688 nm de uitwerping van autofluorescente chloroplasten uit het cytoplasma.
- Als de celinhoud in de cel blijft, gebruikt u de functie "Klik en vuur" nogmaals om de grootte van de inbreuk in de cel te vergroten. Herhaal dit en beperk het aantal opnamen tot een minimum totdat het grootste deel van de celinhoud is vrijgegeven.
- Stop de time-lapse-opname nadat het embryo is gestabiliseerd (d.w.z. er kan geen verdere intracellulaire beweging worden gedetecteerd (~ 1-5 min).
- Werk indien nodig de annotatie op de tegelscanafbeelding bij.
6. Monitoring van de groei van doorstraalde embryo's
OPMERKING: De monitoring wordt gedurende meerdere dagen uitgevoerd.
- Bepaal de overlevingskans door het aantal embryo's te volgen dat zich ontwikkelt na laserablatie en vergelijk ze met degenen die sterven.
OPMERKING: Sommige embryo's sterven onmiddellijk na ablatie om verschillende redenen. Een hoog en snel sterftecijfer is meestal een teken van ongepaste laserparameters of een hogere / langere blootstelling aan stress tijdens het experiment of het daaropvolgende transport. - Bepaal de groeivertraging door elke dag de lengte van de lasergeschoten embryo's te meten en te vergelijken met intacte embryo's.
OPMERKING: De groeisnelheid van laser-shot organismen is over het algemeen langzamer dan die van onbehandelde organismen. Sommige (ongepaste) laserinstellingen kunnen de groei echter langer dan een week remmen, waarna de groei wordt hervat. - Ontdek de aangrenzende schade door de reactie van cellen naast de ablated cellen te volgen. In sommige gevallen kan post-burst depressurisatie ervoor zorgen dat naburige cellen barsten.
- Controleer op microbenbesmettingen. Monitor de groei van microalgen en bacteriën in het medium. Als er een ongewoon niveau van microben in het gerecht aanwezig is, gooi het dan weg en herhaal het protocol van stap 2 of stap 3.
OPMERKING: Na laserablatie zijn beschadigde S. latissima-embryo's al sterk gestrest en extra externe stress kan verhoogde mortaliteit veroorzaken. Bacteriële of virale uitbraken zijn mogelijk omdat de behandelde embryo's niet kunnen groeien in axeenaandoeningen. - Controleer de wereldwijde ontwikkeling van de geschoten organismen door het fenotype te bestuderen en de rol in de ontwikkeling van het beoogde gebied te begrijpen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Gametofyten van S. latissima werden gekweekt en gametogenese werd geïnduceerd om zygoten en embryo's te produceren. Twaalf dagen na de inductie van gametogenese ondergingen de embryo's laserablatie. Hier was het experiment gericht op het beoordelen van de rol van specifieke cellen in de algehele ontwikkeling van S. latissima-embryo's . De meest apicale cel, de meest basale cel en de mediane cellen werden geviseerd. Na het scannen van tegels werd de gehele petrischaal (figuur 2A), een embryo van belang, geïdentificeerd als een geschikte kandidaat voor laseropnamen (figuur 2B). Een specifieke cel van dit embryo werd gekozen, gericht en geschoten met een gepulste UV-laserstraal met een maximum van 40 μW laservermogen (overeenkomend met 45% van het maximale vermogen voor de hier gebruikte apparatuur) gedurende 1 ms (film 1). De cel gaf zijn inhoud vrij (chloroplasten en cytoplasma). Interessant is dat aangrenzende cellen reageerden op het barsten van de bestraalde cel door uit te breiden naar de intercellulaire ruimte. De positie van de bestraalde embryo's werd geregistreerd voor latere monitoring gedurende 10 dagen (figuur 3). De meeste bestraalde embryo's bleven zich ontwikkelen, maar vertoonden groeiverandering (embryovorm). Een gedetailleerde analyse van de morfologische veranderingen moet worden uitgevoerd voordat aan elke bestraalde cel een specifieke functie kan worden toegeschreven bij het regelen van het algehele ontwikkelingsmechanisme.
Daarentegen werden embryo's getest met andere laserparameters (bijv. 33 ms voor de opnameduur van 60% -80% laservermogen; Film 2) vertoonde al snel tekenen van ernstige stress zoals celbleking, vervaging of vormveranderingen (afronding). Bijna alle op deze manier geschoten embryo's stierven binnen vijf dagen na het experiment (figuur 4).
Figuur 1: Foto van de opstelling van de laserablatiemicroscoop. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Geannoteerde tegelscan van een hele petrischaal. (A) Tegelscan van de gehele petrischaal die wordt gebruikt voor laserablatie. De transmissie PMT werd gebruikt om een brightfield scan te verkrijgen. Zodra een embryo van belang is gelokaliseerd, klikt de gebruiker op de positie van het embryo in de tegelscan en plaatst de software het stadium direct boven het embryo. (B) De tegelscan kan vervolgens specifiek worden geannoteerd om het embryo in de volgende stappen te lokaliseren, om het embryo te volgen en te volgen. Hier toont de afbeelding een embryo dat aan de onderkant van de petrischaal is bevestigd, die gemakkelijk kan worden gelokaliseerd met behulp van de 561 nm-laser. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Tijdreeks van het groeiende S. latissima embryo na bestraling. Dit is te zien in Film 1. Laserablatie van de meest apicale cel van het embryo bleekte de aangrenzende cellen van het embryo niet. Ze bleven groeien en delen en vormden na een paar dagen een normaal embryo. Foto's werden elke 24 uur genomen, 2-9 dagen na ablatie. De schaalbalk is 50 μm en is voor alle foto's hetzelfde. D2-D9 komt overeen met dag-2 tot dag-9. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Tijdreeks van S. latissima embryo dood na laserablatie met behulp van suboptimale parameters. Overmatige blootstelling aan laserbestraling kan gemakkelijk leiden tot hogere sterftecijfers van het doelembryo en ook de naburige. Een tijdreeks van het embryo dat in film 2 is opgenomen, wordt getoond, waarbij de tijd na ablatie boven elke foto wordt aangegeven (3-6 dagen na ablatie). De schaalbalk is 30 μm en is van toepassing op elke foto. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Film 1: Laserablatie van de meest apicale cel van een 8-celig embryo van S. latissima. De focus werd eerst aangepast op het embryo dat werd geselecteerd uit een boeket Saccharina-sporofyten (op verschillende velden, eerst breed, dan smal). De meest apicale cel van het embryo werd vervolgens geschoten met 45% laservermogen gedurende 1 ms. De apicale cel barstte snel en gaf zijn inhoud vrij. De aangrenzende cellen, bevrijd van de turgor van de burst-cel, vulden de lege ruimte. Na 5 minuten zijn de cel en zijn inhoud gestopt met bewegen en hebben ze een evenwichtstoestand bereikt. De film is 4 keer versneld (van 1 beeld per 632 ms naar 6 fps). De follow-up van de embryo-ontwikkeling is weergegeven in figuur 3. Klik hier om deze film te downloaden.
Film 2: Significant bleken van cellen naast een burstcel veroorzaakt door suboptimale laserinstellingen. Het gebruik van een laservermogen van 60%-80% voor 1 ms of een laservermogen van 45% voor 10 ms resulteerde in een aanzienlijk bleken van aangrenzende cellen en een veel lagere overlevingskans. De instellingen die voor de laser worden gebruikt, mogen geen bleken of gedeeltelijke schade aan aangrenzende cellen veroorzaken. De beste resultaten werden verkregen door het vermogen en/of de duur van de laserpuls te verminderen en het punt het verst van de aangrenzende cellen te richten. Hier wordt de meest apicale cel van een 4-celig embryo van S. latissima geschoten (80% laservermogen, 1 ms) (lateraal / bovenaanzicht). Overbleaching van de onderste en laterale cellen is gemakkelijk waarneembaar. De verdere ontwikkeling van het embryo is weergegeven in figuur 4. Klik hier om deze film te downloaden.
Aanvullende figuur 1: Schematisch stroomdiagram van het gehele protocol. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Lokale cellulaire laserablatie maakt temporele en ruimtelijke ablatie mogelijk met een hoge mate van precisie. De efficiëntie ervan kan echter worden belemmerd door de niet-toegankelijkheid van doelcellen; alle cellen zijn bijvoorbeeld van een driedimensionaal embryo. Dit protocol is ontwikkeld op het embryo van de alg Saccharina latissima, dat een monolayered lamina ontwikkelt waarin alle cellen gemakkelijk kunnen worden onderscheiden en individueel kunnen worden vernietigd met een laserstraal.
Laservermogen en golflengte
NIR fs-gepulseerde laser wordt vaak gebruikt in ontwikkelingsstudies bij dieren24,25. In het geval van bruine algen zoals Saccharina kon de laser de cel echter niet laten barsten zonder het hele embryo te verbranden. Deze reactie kan te maken hebben met de hoge activiteit van de chloroplast lichtrooiers.
Met behulp van de ns-gepulseerde UV-laser voor ablatie werden twee benaderingen getest: (1) met behulp van een hoogvermogenpuls gedurende een korte periode of (2) met een lagere laserblootstelling over een langere periode. De energie die door de laser wordt geleverd, een combinatie van laservermogen en pulsduur, heeft invloed op de energie die aan de bestraalde cel wordt geleverd. De geleverde energie kan ook de omliggende cellen beïnvloeden door reflectie en diffractie. Daarom werden de laagste instellingen van de twee parameters die reproduceerbare resultaten gaven geselecteerd om ongewenste neveneffecten te verminderen. Laservermogen tussen 25-40 μ W.cm-2 met een puls van 1 ms bleek optimaal. Met behulp van deze parameters werd het effect van de UV-laser op een zeer lokaal niveau beperkt zonder zichtbare bleekvorming in de omliggende cellen, maar efficiënt genoeg om de doelcel te laten barsten. Deze parameters werden herhaaldelijk toegepast zonder direct dodelijk effect op de embryo's. Langere pulstijden of een hoger laservermogen veroorzaakten bleken van de omliggende cellen of zelfs de dood van het embryo, terwijl lagere waarden onvoldoende waren om de celwand te breken.
Materiële en culturele omstandigheden van algen
Hoewel het mogelijk is om nauwkeurig te fotograferen op subcellulair niveau, vereist deze techniek dat de experimentator vier kritieke factoren aanpakt om een betrouwbare interpretatie van de resultaten mogelijk te maken. Deze punten moeten zowel voor als na het laserablatie-experiment worden overwogen.
De eerste factor die moet worden aangepakt, is de embryopopulatiedichtheid. Negatieve drukte heeft invloed op de ontwikkelingssnelheid van S. latissima26. Lage dichtheden zorgen voor (1) betere herhaalbaarheid van de pols omdat de aanwezigheid van andere embryo's in het laserpad de kracht ervan kan verminderen, en (2) gemakkelijkere monitoring van de embryo's die door de laser worden geschoten, die iets langzamer groeien dan intacte embryo's; de laatste dekt snel de geschoten embryo's. De tweede kritische factor van dit protocol is de temperatuur waarbij het experiment wordt uitgevoerd. De laserstraal zelf verwarmt het monster, maar de temperatuur van de kamer en de lokale omgeving van de microscoop dragen bij aan de totale temperatuuromstandigheden die het monster ervaart, dicht bij 18-22 °C. Hier werd de kamer van de microscoop niet gekoeld omdat deze apparatuur voornamelijk wordt gebruikt voor dierlijke cellen die omgevingstemperaturen verdragen. Gelukkig waren Saccharina-embryo's bestand tegen temperaturen van 22 °C (9 °C hoger dan de optimale kweektemperatuur van 13 °C) tot 4 uur. Apparaten om een lage omgevingstemperatuur te helpen handhaven, zoals voldoende ventilatie of een koelplaathouder, kunnen echter helpen het risico op nadelige effecten op de overleving en ontwikkeling van de algenembryo's te verminderen. Bovendien kan langzame pre-acclimatisatie van gametofyten tot 16 °C onder rood licht de embryo's helpen temperatuurpieken tijdens het ablatieproces te weerstaan. Ten derde worden de embryo's, naast de temperatuurstijging, beroofd van een geschikte lichtbron voor de duur van het experiment. Bovendien kunnen de chloroplasten gedeeltelijk worden gebleekt door de 561 nm-laser. Het gebruik van het laagst mogelijke vermogen op de 561 nm laser helpt dit effect te verminderen. Ten vierde is transport ook een kritische factor om rekening mee te houden, omdat laserablatieapparatuur niet in alle laboratoria beschikbaar is. Temperatuurpieken en externe bewegingen of schokken moeten worden vermeden om te voorkomen dat het algenmateriaal losraakt, verliest of sterft. Waar mogelijk moeten de transportboxen gekoeld, trillingsbestendig (bijv. schokabsorberend schuim) en uitgerust met verlichting zijn. Verschillende transportboxen die aan deze eisen voldoen, zijn in de handel verkrijgbaar.
Zelfs als al deze factoren zoveel mogelijk worden gecontroleerd, kan er nog steeds zwakke maar potentieel significante omgevingsstress optreden. Deze mogelijkheid moet worden overwogen bij het analyseren en interpreteren van de embryorespons op laserablatie.
Naast de omgevingsomstandigheden die gedurende het hele experiment stabiel moeten worden gehouden, is het ook een uitdaging om de bestraalde organismen tijdens de monitoringstap bij te houden. De groei van de verschillende embryo's verandert het oorspronkelijke landschap in de loop van de tijd. Tenzij een geautomatiseerde microscoop kan worden gewijd aan het monitoren van het experiment, kan het volgen van het embryo na laserablatie gemakkelijk tijdrovend worden en grote hoeveelheden gegevens genereren. Video-opnames tijdens de initiële laserablatiepuls worden ten zeerste aanbevolen om de onmiddellijke reactie van het embryo op de pols te volgen. Deze snelle monitoring van de pulsimpact is van groot belang omdat in sommige gevallen de puls, wanneer gericht op het midden van de cel, ervoor zorgde dat de doelcel snel barstte, hoogstwaarschijnlijk als gevolg van het verschil in osmolariteit tussen het binnenste van de cel en het medium (zeewater). Wanneer de lekkage te snel ging, barstten ook de naburige cellen. Schieten op het meest distale gebied van de beoogde cel bleek een efficiënte manier om het burst-effect op aangrenzende cellen te bufferen. Een andere efficiënte manier om gewelddadige uitbarstingen te voorkomen, is door de osmolariteit van het medium te verhogen met sucrose27. Het verschil in osmolariteit is echter noodzakelijk om de inhoud van de beoogde cel te elimineren. Het handhaven van voldoende osmolariteitspotentiaal is dus vereist. In enkele gevallen belemmerden chloroplasten en andere verbindingen de opening die door de laserablatie werd gemaakt, wat resulteerde in cellen die herstelden van de laseropname, met groei die na een paar dagen werd hervat. Extra pulsen gericht op het ontstoppen van de opening bleken voldoende om obstructie te voorkomen.
Beperkingen
Er moet een afweging worden gemaakt tussen laservermogen, dat hoog genoeg moet zijn om de cellen hun inhoud te laten legen, en de overleving van de naburige cellen, die in algenembryo's bijzonder gevoelig zijn voor hittestress en fotobleaching. Daarom is nauwlettende monitoring van de cellen na het laserschot de sleutel tot het beheersen van deze stap en ervoor te zorgen dat de doelcellen dood zijn. Anders kan de interpretatie van de gerichte cellen over het lot van de naburige cellen, en dus de daaropvolgende ontwikkeling van het embryo, misleidend zijn.
Het doorprikken van cellen met een naald lijkt een alternatief waarbij de algencellen geen hitte of lichte stress zouden ervaren. Deze aanpak zou echter een uitdaging zijn omdat bruine algenembryocellen ondergedompeld in zeewater groeien en geen contact hebben met een vast oppervlak. De dikke en elastische celwand is bestand tegen het binnendringen van naalden, zelfs wanneer het embryo in contact blijft met een vast, glazen oppervlak met behulp van een micromanipulator in een standaard micro-injectiesysteem.
Samenvattend beschrijft dit protocol de volledige experimentele procedure en instellingen voor de laserablatie en monitoring van bruine algenembryo's en de kritieke stappen voor een succesvol experiment (aanvullende figuur 1). Deze unieke aanpak is een veelbelovende methode voor het bestuderen van celinteracties en celbestemming in de vroege embryo's van bruine algen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
S.B.'s PhD-beurs wordt gefinancierd door Region Bretagne (ARED-subsidienummer COH20020) en Sorbonne Université. I.T.is PhD-beurs wordt gefinancierd door Region Bretagne (ARED-subsidienummer COH18020) en de Norvegian NMBU University. Dit project heeft financiële steun ontvangen van het CNRS via de MITI interdisciplinaire programma's. MRic is lid van de nationale infrastructuur France-BioImaging ondersteund door het Franse nationale onderzoeksagentschap (ANR-10-INBS-04).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 25 mm glass bottom petri dish | NEST | 801001 | |
| Autoclaved sea water | - | Collected offshore near the Astan buoy (48°44.934 N 003°57.702 W) close to Roscoff, France, at a depth of 20 m. | |
| Cell scraper | MED 2 | 83.3951 | |
| Cell strainer 40 µm | Corning / Falcon | 352340 | |
| Culture cabinets | Snijders Scientific Plant Growth Cabinet ECD01 | Any other brand is suitable provided that the light intensity, the photoperiod and the temperature can be controlled. | |
| LSM 880 Zeiss confocal microscope | Carl Zeiss microscopy, Jena, Germany | Ablation and imaging were performed using a 40x/1.2 water objective | |
| Pellet pestles | Sigma Aldrich | Z359947 | Blue polypropylene (autoclavable) |
| Provasoli supplement | - | Recipe is available here: http://www.sb-roscoff.fr/sites/www.sb-roscoff.fr/files/documents/station-biologique-roscoff-preparation-du-provasoli-2040.pdf | |
| Pulsed 355 laser (UGA-42 Caliburn 355/25) | Rapp OptoElectronic, Wedel, Germany | ||
| Scalpel | Paramount | PDSS 11 | |
| SysCon software | Rapp OptoElectronic, Wedel, Germany | Laser-driver software | |
| ZEN software | Carl Zeiss microscopy, Jena, Germany | Imaging software, used together with the SysCon software; Black 2.3 version |
References
- Montell, D. J., Keshishian, H., Spradling, A. C. Laser ablation studies of the role of the Drosophila oocyte nucleus in pattern formation. Science. 254 (5029), New York, N.Y. 290-293 (1991).
- Shivakumar, P. C., Lenne, P. F. Laser ablation to probe the epithelial mechanics in drosophila. Methods In Molecular Biology. 1478, 241-251 (2016).
- Bargmann, C. I., Avery, L. Laser killing of cells in Caenorhabditis elegans. Modern Biological Analysis of an Organism. 48, 225-250 (1995).
- Fouad, A. D., Liu, A., Du, A., Bhirgoo, P. D., Fang-Yen, C. Thermal laser ablation with tunable lesion size reveals multiple origins of seizure-like convulsions in Caenorhabditis elegans. Scientific Reports. 11 (1), 5084 (2021).
- Johnson, C. S., Holzemer, N. F., Wingert, R. A. Laser ablation of the zebrafish pronephros to study renal epithelial regeneration. Journal of Visualized Experiments. (54), e2845 (2011).
- Mondia, J. P., Adams, D. S., Orendorff, R. D., Levin, M., Omenetto, F. G. Patterned femtosecond-laser ablation of Xenopus laevis melanocytes for studies of cell migration, wound repair, and developmental processes. Biomedical Optics Express. 2 (8), 2383-2391 (2011).
- Reinhardt, D., Frenz, M., Mandel, T., Kuhlemeier, C. Microsurgical and laser ablation analysis of leaf positioning and dorsoventral patterning in tomato. Development. 132 (1), 15-26 (2005).
- Berg, C., Hage, W., Weisbeek, P., Scheres, B. Laser ablation in Arabidopsis roots: a tool to study cell-to-cell communication. Cellular integration of signalling pathways in plant development. Proceedings of the NATO Advanced Study Institute. , https://eurekamag.com/research/003/488/003488317.php 237-250 (1998).
- Berger, F., Taylor, A., Brownlee, C. Cell fate determination by the cell wall in early fucus development. Science. 263 (5152), New York, N.Y. 1421-1423 (1994).
- Bouget, F. Y., Berger, F., Brownlee, C. Position dependent control of cell fate in the Fucus embryo: role of intercellular communication. Development. 125 (11), 1999-2008 (1998).
- Bringloe, T., et al. Phylogeny and evolution of the brown algae. Critical Reviews in Plant Sciences. 39 (4), 281-321 (2020).
- Saifullah, S., Olsen, Y., Surilayani, D., Handå, A. Carbohydrate of the brown seaweed, saccharina latissima: a review. Joint proceedings of the 2nd and the 3rd International Conference on Food Security Innovation (ICFSI 2018-2019). , 180-182 (2021).
- Zhang, X., Thomsen, M. Techno-economic and environmental assessment of novel biorefinery designs for sequential extraction of high-value biomolecules from brown macroalgae Laminaria digitata, Fucus vesiculosus, and Saccharina latissima. Algal Research. 60, 102499 (2021).
- Kanda, T. On the gametophytes of some japanese species of laminariales. Scientific papers of the Institute of Algological Research, Faculty of Science. 1 (2), Hokkaido Imperial University. 221-260 (1936).
- Fritsch, F. E. The structure and reproduction of the algae. Volume 2. , Cambridge University Press. Cambridge. (1945).
- Bartsch, I., et al. The genus Laminaria sensu lato : recent insights and developments. European Journal of Phycology. 43 (1), 1-86 (2008).
- Theodorou, I., Charrier, B. Chapter 2: Brown algae: ectocarpus and saccharina as experimental models for developmental biology. Handbook of Marine Model Organisms in Experimental Biology - Established and Emerging. Boutet, A., Schierwater, B. , Francis & Taylor Group, CRC Press. ISBN 9780367444471 485 (2021).
- Drew, G. H. The reproduction and early development of laminaria digitata and laminaria saccharina. Annals of Botany. 24 (1), 177-189 (1910).
- Yendo, K. The development of costaria, undaria, and laminaria. Annals of Botany. 25 (99), 691-715 (1911).
- Forbord, S., Steinhovden, K., Rød, K., Handå, A., Skjermo, J. Cultivation protocol for Saccharina latissima. Protocols for Macroalgae Research. Charrier, B., Wichard, T., Reddy, C. R. K. , CRC Press, Francis & Taylor Group. ISBN-10: 14986427. ISBN-13: 978-1498796422 37-59 (2018).
- Bartsch, I. Derivation of clonal stock cultures and hybridization of kelps. Protocols for Macroalgae Research. Charrier, B., Wichard, T., Reddy, C. R. K. , CRC Press, Francis & Taylor Group. ISBN-10: 149879627. ISBN-13: 978-1498796422 61-78 (2018).
- Theodorou, I., Opsahl-Sorteberg, H. -G., Charrier, B. Preparation of zygotes and embryos of the kelp saccharina latissima for cell biology approaches. Bio-protocol. 101, 4132 (2021).
- Lüning, K., Dring, M. J. Reproduction induced by blue light in female gametophytes of Laminaria saccharina. Planta. 104 (3), 252-256 (1972).
- de Medeiros, G., et al. Cell and tissue manipulation with ultrashort infrared laser pulses in light-sheet microscopy. Scientific Reports. 10 (1), 1942 (2020).
- Liang, X., Michael, M., Gomez, G. A. Measurement of mechanical tension at cell-cell junctions using two-photon laser ablation. Bio-protocol. 6 (24), 2068 (2016).
- Ebbing, A., Pierik, R., Bouma, T., Kromkamp, J. C., Timmermans, K. How light and biomass density influence the reproduction of delayed Saccharina latissima gametophytes (Phaeophyceae). Journal of Phycology. 56 (3), 709-718 (2020).
- Rabillé, H., Billoud, B., Tesson, B., Le Panse, S., Rolland, É, Charrier, B. The brown algal mode of tip growth: Keeping stress under control. PLoS Biology. 17 (1), 2005258 (2019).
