Summary
השמדת תאים ספציפיים בעובר היא כלי רב עוצמה לחקר אינטראקציות תאיות המעורבות בגורל התא. הפרוטוקול הנוכחי מתאר טכניקות לאבלציה בלייזר של תאים ממוקדים בעובר המוקדם של האצה החומה Saccharina latissima.
Abstract
ב Saccharina latissima, העובר מתפתח כמו יריעת תא חד שכבתית הנקראת למינה או הלהב. כל תא עובר קל לצפייה, ניתן להבחין בקלות בין שכניו לבין שכניו, וניתן לפגוע בו בנפרד. במשך עשרות שנים, אבלציה בלייזר שימשה לחקר התפתחות העוברים. כאן פותח פרוטוקול לאבלציה בלייזר ספציפי לתא עבור עוברים מוקדמים של האצה החומה S. latissima. העבודה המוצגת כוללת: (1) הכנת עוברי סכרינה , עם תיאור הפרמטרים הקריטיים, כולל תנאי תרבית, (2) הגדרות אבלציה בלייזר, ו-(3) ניטור הצמיחה שלאחר מכן של העובר המוקרן באמצעות מיקרוסקופיה של קיטועי זמן. בנוסף, מסופקים פרטים על התנאים האופטימליים להעברת העוברים מפלטפורמת ההדמיה בחזרה למעבדה, מה שיכול להשפיע עמוקות על התפתחות העוברים הבאים. אצות השייכות לסדר למינריאלס מציגות תבניות עובריות הדומות לסכרינה; כך ניתן להעביר פרוטוקול זה בקלות למינים אחרים בטקסון זה.
Introduction
אבלציה בלייזר משמשת כבר עשרות שנים לחקר התפתחות העוברים. הקרנת תאי עובר באמצעות קרן לייזר מאפשרת לעקוב אחר הפוטנציאל הרגנרטיבי והשינוי של שושלת התאים במהלך העובר ולחקור את ההשפעה של אבלציה ממוקדת על חלוקת התא ועל גורל התא. אורגניזמי המודל המשמשים בשיטות אבלציה בלייזר הם בדרך כלל בעלי חיים, כגון חרקים 1,2, נמטודות 3,4, בעלי חוליות 5,6, ולעיתים צמחים 7,8. בנוסף, נעשה שימוש בגישת מיקרו-אבלציה בלייזר על האצה החומה פוקוס בשנים 1994 ו-1998 כדי להדגים את תפקידו של דופן התא בפוטו-פולריזציה של העובר המוקדם 9,10.
אצות חומות שייכות לקבוצה Stramenopiles, שהתפצלה בשורש העץ האאוקריוטי לפני 1.6 מיליארד שנה. כתוצאה מכך, הם אינם תלויים מבחינה פילוגנטית באורגניזמים רב-תאיים אחרים, כגון בעלי חיים וצמחים11. Saccharina latissima שייך לסדר Laminariales, הידוע יותר בשם kelps, והם בין האורגניזמים הגדולים ביותר על פני כדור הארץ, המגיעים לגדלים של מעל 30 מ '. Saccharina sp. היא אצה גדולה המשמשת ליישומים רבים כגון מזון והזנה, והפוליסכרידים שלה מופקים לשימוש בתעשיות החקלאיות, הפרמקולוגיות והקוסמטיות ברחבי העולם12, 13. גידולו, בעיקר באסיה ולאחרונה באירופה, דורש הכנת עוברים במדגרות לפני שחרור צעירים בים הפתוח. כמו כל הקלפים, יש לו מחזור חיים דו-פאזי המורכב משלב גמטופיטי מיקרוסקופי, שבמהלכו גמטופיט הפלואידי גדל ומייצר גמטות להפריה, ופאזה מקרוסקופית דיפלואידית, שבה מתפתח להב מישורי גדול מתוך ההחזקה שלו המחובר לקרקעית הים או לסלעים. הספורופיט משחרר נבגים הפלואידים בבגרותם, ובכך משלים את מחזור החיים 14,15,16.
S. latissima מציג כמה תכונות מורפולוגיות מעניינות17. העובר שלו מתפתח כסדין מישורי חד-שכבתי 15,18,19 לפני שהוא רוכש מבנה רב שכבתי במקביל להופעתם של סוגי רקמות שונים. בנוסף, Laminariales היא אחת הטקסות היחידות של אצות חומות שהעוברים שלהן נשארים מחוברים לרקמה הגמטופיטית האימהית שלהן (Desmarestiales ו-Sporochnales עושים גםהם 15). תכונה זו מציעה את ההזדמנות לחקור את תפקידה של הרקמה האימהית בתהליך התפתחותי זה ולהשוות את מנגנוני הבקרה האימהיים באצות חומות עם אלה בבעלי חיים ובצמחים.
מאמר זה מציג את הפרוטוקול המלא הראשון לאבלציה בלייזר בעובר אצות מוקדם. פרוטוקול זה, הכולל טכניקה של UV ns-pulsed, גורם להרס ספציפי של תאי עובר בודדים כדי לחקור את תפקידם במהלך יצירת עוברים. ההליך מציע גישה אמינה לחקר אינטראקציות בין תאים וגורל התאים במהלך עוברי בלמינריאלס.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. הפקת סכרינה לטיסימה גמטופיטים
- לאסוף ספורופיטים בוגרים של S. latissima מהטבע כפי שתואר קודם לכן20,21. ודא שהספורופיטים שנבחרו נטולי אפיפיטים (אורגניזמים קטנים הנראים על פני השטח של הלהב) או טפילים פנימיים (המצויים באזורים הלבנים או בכתמים על הלהב).
- באמצעות אזמל, חותכים את החלק הכהה ביותר במרכז הלהב (רקמה פורייה המייצרתנבגים 22) ל-1-5 חתיכות מרובעות (1 סמ"ר), תוך הימנעות מכתמים מולבנים, אם קיימים.
- הסר את כל האפיפיטים הנותרים על ידי ניקוי עדין של החלקים החתוכים עם גב אזמל וכמה נייר סופג.
- הניחו את החלקים המנוקים בצלחת זכוכית מלאה במי ים טבעיים סטריליים (ראו טבלת חומרים) למשך 45 דקות כדי לשחרר נבגים בעקבות דו"ח22 שפורסם בעבר.
- הסר את חתיכות הלהב וסנן את מי הים דרך מסננת תאים של 40 מיקרומטר כדי להסיר פסולת או אורגניזמים לא רצויים.
- דיללו את הנבגים בתפיח לריכוז של 20-40 נבגים/מ"ל בצלחות פטרי מפלסטיק22.
- מקם את תמיסת הנבגים בארון תרבית (ראה טבלת חומרים) המוגדר עם תנאי התרבית האופטימליים (13 °C, 24 μE.m-2.s-1, photoperiod 16:8 L:D).
- אפשר לנבגים לנבוט ולהתפתח לגמטופיטים.
הערה: נביטת נבגים נראית לאחר יומיים בארון, וחלוקת התאים הראשונה של התאים הגמטופיטיים מתרחשת בדרך כלל בתוך 48 השעות הבאות. - החלף את מדיום הגדילה לאחר 5 ימים במי ים טבעיים מסוננים במיקרו מועשרים בתמיסת פרובסולי 0.5x (NSW1/2) (ראה טבלת חומרים).
הערה: כדי להימנע מחזרה על שלבים אלה, ניתן לבחור גמטופיטים ספציפיים של זכר ונקבה ולהפיץ אותם באופן וגטטיבי במשך מספר חודשים. הגמטופיטים נשארים וגטטיביים כאשר הם גדלים תחת אור אדום (4 μE.m-2.s-1 עם אורך גל של לפחות 580 ננומטר)23 באותם תנאי תרבית שתוארו לעיל (שלב 1.7).
2. פיצול ואינדוקציה של אוגנזה
- קציר גמטופיטים עם מגרד תאים.
- באמצעות מזיק פלסטיק קטן, יש לרסק את הגמטופיטים שנאספו בצינור 1.5 מ"ל לחתיכות בעלות 4-5 תאים.
- מלאו את הצינור ב-1 מ"ל NSW1/2 (שלב 1.9).
- מוסיפים 2.5 μL של תמיסת הגמטופיט המרוסק ל-3 מ"ל של מי ים טבעיים מועשרים בתמיסת פרובסולי 1x (NSW) ומניחים אותם בצלחת פטרי.
הערה: צלחת פטרי בגודל 25 מ"מ עם תחתית זכוכית מומלצת לטיפול קל יותר. - מניחים את הכלים המוכנים בארון תרבית ומשרים גמטוגנזה בטמפרטורה של 13 מעלות צלזיוס תחת אור לבן בעוצמה של 24 μE.m-2.s-1 (אור עמום, פוטופריוד 16:8 L:D).
הערה: ניתן לצפות במשחק הראשון (אוגוניה נקבה וארכיגוניה זכרית) לאחר 5 ימים. הזכר מסועף יתר על המידה עם תאים קטנים, והנקבה מורכבת מתאים גדולים יותר היוצרים חוטים ארוכים15,22. הביצים הראשונות נצפות כ-10 ימים לאחר מכן, והחלוקה הראשונה של זיגוטים מתרחשת בדרך כלל תוך היומיים הבאים. - שישה ימים לאחר התבוננות בביצים הראשונות, מעבירים את הכלים לתנאי אור לבן בהירים יותר: 50 μE.m-2.s-1, photoperiod 16:8 L:D, עדיין ב 13 °C (64 °F).
3. רכישת תמונה לבחירת עוברים לאבלציה ומעקב אחר גדילה לאחר מכן
- דמיינו את כל צלחת הפטרי כדי (מחדש) לאתר את העוברים שנבחרו במהלך שלב האבלציה (אין צורך להחזיר את המנה למיקרוסקופ העין) ולעקוב אחר ההתפתחות שלאחר מכן של העוברים שנבחרו.
הערה: השתמש במיקרוסקופ קונפוקלי של סריקת לייזר הפוכה (ראה טבלת חומרים) להדמיה (איור 1), ואבלציית הלייזר מתוארת בשלב 5. - מניחים את צלחת הפטרי על הבמה ומכוונים אותה עם סימן חזותי (למשל, ציירו קו עם סמן קבוע).
- השתמש במטרה של 10x/0.45 כדי להתמקד בעובר. רשום את המיקום של ארבע הנקודות הקרדינליות של צלחת פטרי.
- התחל את סריקת האריחים. רכשו תמונות משודרות/פלואורסצנטיות של כל צלחת פטרי ברזולוציה נמוכה: 256 x 256 פיקסלים, זמן השהייה של פיקסלים של 1.54 מיקרו-μs עם סריקה דו-כיוונית, וזום דיגיטלי של פי 0.6 באמצעות לייזר של 561 ננומטר ב-1.2% שידור.
הערה: זמן הסריקה של צלחת פטרי שלמה בגודל 2.5 ס"מ הוא כ-6 דקות עבור 225 אריחים (איור 2). כאן, לייזר 561 ננומטר שימש לשידור והדמיה פלואורסצנטית. האות הפלואורסצנטי נאסף בין 580 ל-720 ננומטר על הפוטומולטיפליירים הקונפוקליים (PMT) והאור שהועבר נאסף ב-PMT המועבר. לייזר 561 ננומטר יכול גם לפקח על כלורופיל בשלב זה, אבל זה מיותר כי זה רק עוזר להבחין את רעש האות ואת האורגניזמים כראוי. - שמור את תמונת סריקת האריחים והשאר אותה פתוחה בחלון התוכנה לרכישת תמונות (ראה טבלת חומרים).
- לשנות את המטרה, לא להסיר את צלחת פטרי.
הערה: מטרת המים 40x/1.2 הועברה לצד הבמה, כך שניתן היה להוסיף את מדיום הטבילה (מים) למטרה מבלי להזיז את צלחת הפטרי ממקומה הראשוני. - נווט בתמונת סריקת האריחים שנרכשה בעבר כדי לבחור את העובר המתאים. לאחר שזוהה עובר בתמונה זו, הזיזו את הבמה למיקום המדויק של העובר ורכשו תמונות מועברות/פלואורסצנטיות של אותו עובר ברזולוציה גבוהה.
הערה: הגדרות ברזולוציה גבוהה: 512 x 512 פיקסלים, 0.130 μm/pixel, זמן השהייה של 0.208 μs פיקסלים עם סריקה חד-כיוונית וזום דיגיטלי של 2x באמצעות לייזר 561 ננומטר ב-0.9% שידור. - הביאו את תמונת סריקת האריחים עבור כל עובר המועמד לאבלציה בלייזר (איור 2B) והמשיכו לשלב האבלציה של הלייזר.
4. כיול לייזר
- כייל את הלייזר וסנכרן את תוכנת רכישת התמונה עם תוכנת מנהל ההתקן לייזר במצב "לחץ ואש" ולייזר פועם של 355 ננומטר.
הערה: שלב זה חיוני כדי להבטיח סנכרון מושלם בין מיקום סמן העכבר בתוכנת מנהל ההתקן בלייזר (ראה טבלת חומרים) לבין המיקום בתמונה החיה של תוכנת הרכישה. - פתח את חבילת התוכנה של מנהל ההתקן בלייזר ולחץ על Live בחבילת התוכנה לרכישת תמונות.
- סנכרן את שתי חבילות התוכנה על-ידי לחיצה על התחל רכישה בחבילת התוכנה של מנהל התקן הלייזר. התמונה החיה מתועדת כעת גם בתוכנת מנהל ההתקן של לייזר UV.
- הגדר אזור עניין (AOI) על-ידי לחיצה על בחר לחצן בחר AOI ולחיצה על שולי התמונה (מימין, משמאל, למעלה ולמטה) בחבילת התוכנה לנהג לייזר UV.
הערה: לאחר שלב כיול זה, ההגדרות עבור גודל פיקסל, פורמט תמונה וזום בחבילת תוכנת הרכישה חייבות להישאר קבועות. - בחרו אזור ריק בצלחת והורידו את מפלס הבמה ל-20 מיקרומטר מתחת למישור המוקד לדוגמה כדי להתמקד בתחתית הזכוכית.
- הגדר את מסלולי לייזר האבלציה ולייזר ההדמיה על ידי לחיצה על התחל כיול ובחר כיול ידני.
- בחר עוצמת לייזר גבוהה מספיק כדי לראות נקודה שחורה במרכז התמונה החיה המתאימה לחור בכיסוי הזכוכית (כל התריסים חייבים להיות פתוחים).
- לחץ על נקודה שחורה מרכזית זו עם סמן העכבר ולחץ על 18 נקודות נוספות המוצעות על ידי התוכנה כדי להשלים את הליך היישור.
- בדוק את הכיול ב"מצב לחץ ואש " על אותו כיסוי.
הערה: כיול לייזר תלוי בפרמטרים של ההדמיה. לאחר כיול הלייזר, ודא שפרמטרי ההדמיה (כלומר, 512 x 512 פיקסלים, 0.130 μm/pixel, זמן השהייה של 0.208 μs pixel עם סריקה חד-כיוונית וזום דיגיטלי של 2x) לא השתנו.
5. אבלציה בלייזר
- בחר עובר בעל עניין. התחל הקלטה בהילוך מהיר בתוכנת רכישת התמונות.
- רכוש תמונות משודרות/פלואורסצנטיות עם מטרה של 40x/1.2 W ברזולוציה גבוהה (כלומר, 512 x 512 פיקסלים, 0.130 מיקרומטר/פיקסל, זמן השהייה של 1.54 μs פיקסלים עם סריקה חד-כיוונית וזום דיגיטלי של 2x באמצעות לייזר של 561 ננומטר ב-0.9% שידור). רכוש את הקלטת קיטועי הזמן במהירות המרבית.
- התרחקו מהאזור בתחילת ההקלטה של קיטועי הזמן. התקרב ל-AOI.
- השתמש בפונקציה "לחץ ואש" של תוכנת נהג הלייזר כדי להחיל את ההקרנה המזיקה על התא המעניין בעובר. השתמש בפרמטרים הבאים: 45% העברת לייזר (המתאימה למקסימום של 40 μW) ומשך זמן דופק של 1 אלפיות השנייה (שלב 4).
הערה: מומלץ להקליט וידאו במהלך צילום הלייזר. - מתחת ל-688 ננומטר, עקוב אחר פליטת כלורופלסטים אוטופלואורסצנטיים מהציטופלסמה.
- אם תוכן התא נשאר בתא, השתמש שוב בפונקציה "לחץ ואש" כדי להגדיל את גודל הפרצה בתא. חזור על הפעולה, תוך שמירה על מספר הזריקות למינימום עד שרוב תוכן התאים ישוחרר.
- יש להפסיק את רישום קיטועי הזמן לאחר שהעובר התייצב (כלומר, לא ניתן לזהות תנועה תוך-תאית נוספת (כ-1-5 דקות).
- עדכן את ההערה בתמונת סריקת האריחים, במידת הצורך.
6. מעקב אחר גדילת העוברים המוקרנים
הערה: הניטור מתבצע במשך מספר ימים.
- קבע את שיעור ההישרדות על ידי ניטור מספר העוברים המתפתחים לאחר אבלציה בלייזר והשווה אותם לאלה שמתים.
הערה: עוברים מסוימים מתים מיד לאחר אבלציה מסיבות שונות. שיעור תמותה גבוה ומהיר הוא בדרך כלל סימן לפרמטרים לא הולמים של לייזר או לחשיפה גבוהה/ארוכה יותר ללחץ במהלך הניסוי או ההובלה שלאחר מכן. - קבעו את עיכוב הגדילה על ידי מדידת אורך העוברים שנורים בלייזר מדי יום והשוואתו לעוברים שלמים.
הערה: קצב הצמיחה של אורגניזמים שנורים בלייזר הוא בדרך כלל איטי יותר מזה של אורגניזמים לא מטופלים. עם זאת, כמה הגדרות לייזר (לא מתאימות) יכולות לעכב את הצמיחה במשך יותר משבוע, עם צמיחה מתחדשת לאחר מכן. - גלה את הנזק הסמוך על ידי ניטור התגובה של תאים הסמוכים לתאים האבלים. במקרים מסוימים, דיכאון לאחר התפרצות עלול לגרום לתאים שכנים להתפוצץ.
- בדוק אם יש זיהומים בחיידקים. עקוב אחר הצמיחה של מיקרו-אצות וחיידקים במדיום. אם רמה יוצאת דופן של חיידקים נמצאים במנה, יש להשליך אותה ולחזור על הפרוטוקול משלב 2 או שלב 3.
הערה: לאחר אבלציה בלייזר, עוברי S. latissima פגומים כבר נמצאים בלחץ גבוה, ולחץ חיצוני נוסף יכול לגרום לתמותה מוגברת. התפרצויות חיידקיות או ויראליות אפשריות מכיוון שהעוברים שטופלו אינם יכולים לגדול בתנאים אקסניים. - בדוק את ההתפתחות הגלובלית של אורגניזמי הזריקה על ידי לימוד הפנוטיפ והבנת התפקיד בהתפתחות האזור הממוקד.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
גמטופיטים של S. latissima גודלו, וגמטוגנזה הושרה כדי לייצר זיגוטים ועוברים. 12 ימים לאחר אינדוקציה של גימטוגנזה, העוברים עברו אבלציה בלייזר. כאן, הניסוי נועד להעריך את תפקידם של תאים ספציפיים בהתפתחות הכוללת של עוברי S. latissima . התא האפיקלי ביותר, התא הבסיסי ביותר, והתאים החציוניים היו ממוקדים. לאחר סריקת אריחים, כל צלחת הפטרי (איור 2A), עובר בעל עניין, זוהתה כמועמדת מתאימה לירי בלייזר (איור 2B). תא מסוים של עובר זה נבחר, תקף ונורה עם קרן לייזר UV פועמת עם הספק לייזר מרבי של 40 μW (המקביל ל-45% מההספק המרבי של הציוד המשמש כאן) עבור 1 אלפיות השנייה (סרט 1). התא שחרר את תכולתו (כלורופלסטים וציטופלסמה). באופן מעניין, תאים סמוכים הגיבו להתפוצצות התא המוקרן על ידי התרחבות לתוך החלל הבין-תאי. מיקומם של העוברים המוקרנים נרשם לניטור מאוחר יותר במשך 10 ימים (איור 3). רוב העוברים המוקרנים המשיכו להתפתח אך הראו שינוי בגדילה (צורת העובר). יש לבצע ניתוח מפורט של השינויים המורפולוגיים לפני שניתן יהיה לייחס פונקציה מסוימת לכל תא מוקרן בשליטה על המנגנון ההתפתחותי הכולל.
לעומת זאת, עוברים נבדקו עם פרמטרים אחרים של לייזר (למשל, 33 אלפיות השנייה למשך הירי של 60%-80% הספק לייזר; סרט 2) הראה במהירות סימנים של לחץ חמור כגון הלבנת תאים, דהייה או שינויי צורה (עיגול). כמעט כל העוברים שנורו בדרך זו מתו תוך חמישה ימים לאחר הניסוי (איור 4).
איור 1: תצלום של מערך מיקרוסקופ האבלציה בלייזר. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: סריקת אריחים מבוארת של צלחת פטרי שלמה. ה-PMT של השידור שימש להשגת סריקת ברייטפילד. לאחר שאותר עובר בעל עניין, המשתמש לוחץ על מיקום העובר בסריקת האריחים, והתוכנה ממקמת את הבמה ישירות מעל העובר. (ב) לאחר מכן ניתן לבאר את סריקת האריחים באופן ספציפי כדי לאתר את העובר בשלבים הבאים, כדי לעקוב אחר העובר ולנטר אותו. כאן, התמונה מראה עובר המחובר לתחתית צלחת פטרי, אשר ניתן לאתר בקלות באמצעות לייזר 561 ננומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 3: סדרת הזמן של העובר הגדל S. latissima לאחר הקרנה. זה מוצג בסרט 1. אבלציה בלייזר של התא האפי ביותר של העובר לא הלבינה את התאים הסמוכים של העובר. הם המשיכו לגדול ולהתחלק, ויצרו עובר רגיל לאחר מספר ימים. התמונות צולמו כל 24 שעות, 2-9 ימים לאחר אבלציה. סרגל קנה המידה הוא 50 מיקרומטר והוא זהה עבור כל התמונות. D2-D9 מתאים ליום-2 עד יום-9. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 4: סדרת זמן של מוות עוברי S. latissima לאחר אבלציה בלייזר תוך שימוש בפרמטרים לא אופטימליים. חשיפת יתר להקרנה בלייזר יכולה בקלות להוביל לשיעורי תמותה גבוהים יותר של עובר המטרה וגם של השכנים. מוצגת סדרת זמן של העובר שצולם בסרט 2, כאשר הזמן שלאחר האבלציה מצוין מעל כל תמונה (3-6 ימים לאחר האבלציה). סרגל קנה המידה הוא 30 מיקרומטר והוא חל על כל תמונה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
סרט 1: אבלציה בלייזר של התא האפיקלי ביותר של עובר בעל 8 תאים של S. latissima. ההתמקדות הותאמה תחילה בעובר שנבחר מבין זר של ספורופיטים של סכרינה (בשדות שונים, תחילה רחבים, אחר כך צרים). התא האפי ביותר של העובר נורה לאחר מכן באמצעות 45% הספק לייזר עבור 1 ms. התא האפיקלי התפוצץ במהירות ושחרר את תכולתו. התאים הסמוכים, שהשתחררו מהטורגור של התא המתפרץ, מילאו את החלל הריק. לאחר 5 דקות, התא ותכולתו הפסיקו לזוז והגיעו למצב של שיווי משקל. הסרט הואץ 4 פעמים (מתמונה אחת לכל 632 אלפיות השנייה ל-6 fps). המעקב אחר התפתחות העובר מוצג באיור 3. אנא לחץ כאן כדי להוריד את הסרט הזה.
סרט 2: הלבנה משמעותית של תאים הסמוכים לתא פרץ הנגרמת על ידי הגדרות לייזר לא אופטימליות. שימוש בהספק לייזר של 60%-80% עבור 1 אלפיות השנייה או הספק לייזר של 45% עבור 10 אלפיות השנייה הביא להלבנה משמעותית של תאים סמוכים ולשיעור הישרדות נמוך בהרבה. ההגדרות המשמשות ללייזר אינן אמורות לגרום להלבנה או לנזק חלקי לתאים סמוכים. התוצאות הטובות ביותר הושגו על ידי הפחתת העוצמה ו/או משך פולס הלייזר, והתמקדות בנקודה הרחוקה ביותר מהתאים הסמוכים. כאן, התא האפיקלי ביותר של עובר בעל 4 תאים של S. latissima נורה (80% הספק לייזר, 1 אלפיות השנייה) (מבט לרוחב /עליון). הלבנת יתר של התאים התחתונים והרוחביים ניתנת לצפייה בקלות. ההתפתחות הבאה של העובר מוצגת באיור 4. אנא לחץ כאן כדי להוריד את הסרט הזה.
איור משלים 1: תרשים זרימה סכמטי של הפרוטוקול כולו. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
אבלציה מקומית בלייזר תאי מאפשרת אבלציה טמפורלית ומרחבית ברמת דיוק גבוהה. עם זאת, יעילותו עלולה להיפגע על ידי אי הנגישות של תאי המטרה; לדוגמה, כל התאים הם של עובר תלת מימדי. פרוטוקול זה פותח על העובר של אצה Saccharina latissima, אשר מפתחת למינה חד שכבתית שבה ניתן להבחין בקלות בין כל התאים ולהשמיד אותם בנפרד באמצעות קרן לייזר.
עוצמת לייזר ואורך גל
לייזר עם פולס fs NIR משמש בדרך כלל במחקרים התפתחותיים על בעלי חיים24,25. עם זאת, במקרה של אצות חומות כמו סכרינה, הלייזר לא יכול היה לפוצץ את התא מבלי לשרוף את כל העובר. תגובה זו עשויה להיות קשורה לפעילות הגבוהה של קוצרי האור של הכלורופלסט.
באמצעות שימוש בלייזר UV עם פולס ns לאבלציה, נבדקו שתי גישות: (1) שימוש בפולס בהספק גבוה בפרק זמן קצר או (2) שימוש בחשיפה נמוכה יותר ללייזר לאורך פרק זמן ארוך יותר. האנרגיה שמספק הלייזר, שילוב של כוח לייזר ומשך פולסים, משפיעה על האנרגיה המועברת לתא המוקרן. האנרגיה המועברת יכולה להשפיע גם על התאים הסובבים אותה על ידי השתקפות ו עקיפה. לכן, ההגדרות הנמוכות ביותר של שני הפרמטרים שנתנו תוצאות הניתנות לשחזור נבחרו כדי להפחית את כל ההשפעות הבטוחות הלא רצויות. הספק לייזר בין 25-40 μ W.cm-2 עם פולס של 1 אלפיות השנייה נראה אופטימלי. באמצעות פרמטרים אלה, ההשפעה של לייזר ה-UV הוכלה ברמה מקומית מאוד ללא הלבנה נראית לעין בתאים הסובבים אותה, אך יעילה מספיק כדי לגרום לתא המטרה להתפוצץ. פרמטרים אלה יושמו שוב ושוב ללא כל השפעה קטלנית ישירה על העוברים. זמני דופק ארוכים יותר או עוצמת לייזר גבוהה יותר גרמו להלבנה של התאים הסובבים או אפילו למוות של העובר, בעוד שערכים נמוכים יותר לא היו מספיקים כדי לשבור את דופן התא.
חומר אצות ותנאי תרבות
למרות שהיא מאפשרת ירי מדויק ברמה התת-תאית, טכניקה זו דורשת מהנסיין לטפל בארבעה גורמים קריטיים כדי לאפשר פרשנות אמינה של התוצאות. נקודות אלה חייבות להילקח בחשבון גם לפני וגם אחרי ניסוי אבלציה בלייזר.
הגורם הראשון שיש לטפל בו הוא צפיפות אוכלוסיית העוברים. צפיפות שלילית משפיעה על קצב הפיתוח של S. latissima26. צפיפויות נמוכות מספקות (1) יכולת חזרה טובה יותר של דופק מכיוון שנוכחותם של עוברים אחרים בנתיב הלייזר יכולה להפחית את כוחו, ו-(2) ניטור קל יותר של העוברים שנורו על ידי הלייזר, הגדלים מעט לאט יותר מעוברים שלמים; האחרון מכסה במהירות את העוברים הזרומים. הגורם הקריטי השני של פרוטוקול זה הוא הטמפרטורה שבה מתבצע הניסוי. קרן הלייזר עצמה מחממת את הדגימה, אך טמפרטורת החדר והסביבה המקומית של המיקרוסקופ מוסיפות לתנאי הטמפרטורה הכוללים שחוותה הדגימה, קרוב ל-18-22 מעלות צלזיוס. כאן, חדרו של המיקרוסקופ לא היה מקורר מכיוון שציוד זה משמש בעיקר לתאי בעלי חיים הסובלים מטמפרטורות סביבה. למרבה המזל, עוברי סכרינה היו מסוגלים לעמוד בטמפרטורות של 22 מעלות צלזיוס (9 מעלות צלזיוס גבוהות יותר מטמפרטורת התרבית האופטימלית של 13 מעלות צלזיוס) למשך עד 4 שעות. עם זאת, מכשירים המסייעים בשמירה על טמפרטורת סביבה נמוכה, כגון אוורור הולם או מחזיק לוחית קירור, יכולים לסייע בהפחתת הסיכון להשפעות שליליות על הישרדותם והתפתחותם של עוברי האצות. יתר על כן, התאקלמות איטית מראש של גמטופיטים ל -16 מעלות צלזיוס תחת אור אדום יכולה לעזור לעוברים לעמוד בעליות טמפרטורה במהלך תהליך האבלציה. שלישית, בנוסף לעלייה בטמפרטורה, נשלל מהעוברים מקור אור מתאים למשך הניסוי. יתר על כן, הכלורופלסטים עשויים להיות מולבנים חלקית על ידי לייזר 561 ננומטר. שימוש בהספק הנמוך ביותר האפשרי בלייזר של 561 ננומטר עוזר להפחית את האפקט הזה. רביעית, הובלה היא גם גורם קריטי שיש לקחת בחשבון מכיוון שציוד אבלציה בלייזר אינו זמין בכל המעבדות. יש להימנע מעלייה חדה בטמפרטורה ומתנועות או זעזועים חיצוניים כדי למנוע את התנתקותו, אובדן או מוות של חומר האצות. במידת האפשר, קופסאות ההובלה צריכות להיות מקוררות, עמידות בפני רעידות (למשל, קצף סופג זעזועים) ומצוידות באורות. מספר תיבות הובלה העומדות בדרישות אלה זמינות באופן מסחרי.
גם אם כל הגורמים הללו נשלטים ככל האפשר, עדיין עלול להיווצר לחץ סביבתי חלש אך בעל פוטנציאל משמעותי. יש לקחת בחשבון אפשרות זו בניתוח ובפענוח תגובת העובר לאבלציה בלייזר.
בנוסף לתנאים הסביבתיים שיש לשמור על יציבות לאורך כל הניסוי, מעקב אחר האורגניזמים המוקרנים לאורך כל שלב הניטור הוא גם אתגר. צמיחת העוברים השונים משנה את הנוף המקורי עם הזמן. אלא אם כן ניתן להקדיש מיקרוסקופ אוטומטי לניטור הניסוי, מעקב אחר העובר לאחר אבלציה בלייזר יכול בקלות להפוך לגוזל זמן רב וליצור כמויות גדולות של נתונים. הקלטות וידאו במהלך דופק האבלציה הראשוני בלייזר מומלצות מאוד כדי לעקוב אחר התגובה המיידית של העובר לדופק. לניטור מהיר זה של פגיעת הדופק יש חשיבות משמעותית מכיוון שבמקרים מסוימים, הדופק, כאשר הוא מכוון לאמצע התא, גרם לתא המטרה להתפוצץ במהירות, ככל הנראה בשל ההבדל בין פנים התא לבין המדיום (מי ים). כשהדליפה הייתה מהירה מדי, גם התאים השכנים התפוצצו. ירי על האזור הדיסטלי ביותר של התא הממוקד התגלה כדרך יעילה לאגור את אפקט הפיצוץ על כל התאים הסמוכים. דרך יעילה נוספת להימנע מהתפרצויות אלימות היא להגביר את האוסמולריות של המדיום עם סוכרוז27. עם זאת, ההבדל באוסמולריות נחוץ כדי לחסל את תוכן התא הממוקד. לפיכך, נדרשת שמירה על פוטנציאל אוסמולריות מספיק. במקרים בודדים, כלורופלסטים ותרכובות אחרות חסמו את הפתח שנוצר על ידי אבלציה בלייזר, מה שגרם לתאים להתאושש מזריקת הלייזר, והצמיחה התחדשה לאחר מספר ימים. פולסים נוספים המכוונים להסרת סתימת הפתח הוכיחו את עצמם כמספיקים כדי למנוע חסימה.
מגבלות
יש לבצע פשרה בין כוח הלייזר, שאמור להיות גבוה מספיק כדי לגרום לתאים לרוקן את תכולתם, לבין הישרדותם של התאים השכנים, אשר בעוברי אצות רגישים במיוחד ללחץ חום ולהלבנת תמונות. לכן, ניטור הדוק של התאים לאחר זריקת הלייזר הוא המפתח לשליטה בשלב זה ולוודא שתאי המטרה מתים. אחרת, הפרשנות של התאים הממוקדים על גורלם של התאים השכנים, ולכן ההתפתחות שלאחר מכן של העובר, יכולה להטעות.
תאים מנוקבים עם מחט עשויים להיראות כחלופה שבה תאי האצות לא יחוו עקת חום או אור. עם זאת, גישה זו תהיה מאתגרת מכיוון שתאי עוברי אצות חומים גדלים שקועים במי ים ואין להם מגע עם משטח מוצק כלשהו. דופן התא העבה והאלסטית מתנגדת לחדירת המחט גם כאשר שומרים על העובר במגע עם משטח זכוכית מוצק באמצעות מיקרומניפולטור במערכת מיקרו-איניג'קציה סטנדרטית.
לסיכום, פרוטוקול זה מתאר את ההליך הניסויי המלא ואת ההגדרות של אבלציה וניטור לייזר של עוברי אצות חומים ואת השלבים הקריטיים לניסוי מוצלח (איור משלים 1). גישה ייחודית זו היא שיטה מבטיחה לחקר אינטראקציות בין תאים וגורל התאים בעוברים המוקדמים של אצות חומות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
למחברים אין מה לחשוף.
Acknowledgments
מענק הדוקטורט של S.B. ממומן על ידי אזור ברטאן (מענק ARED מספר COH20020) ואוניברסיטת סורבון. מענק הדוקטורט I.T.is ממומן על ידי אזור ברטאן (מענק ARED מספר COH18020) ואוניברסיטת NMBU הנורווגית. פרויקט זה קיבל תמיכה כספית מה- CNRS באמצעות התוכניות הבין-תחומיות של MITI. MRic הוא חבר בתשתית הלאומית צרפת-הדמיה ביולוגית הנתמכת על ידי סוכנות המחקר הלאומית הצרפתית (ANR-10-INBS-04).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 25 mm glass bottom petri dish | NEST | 801001 | |
| Autoclaved sea water | - | Collected offshore near the Astan buoy (48°44.934 N 003°57.702 W) close to Roscoff, France, at a depth of 20 m. | |
| Cell scraper | MED 2 | 83.3951 | |
| Cell strainer 40 µm | Corning / Falcon | 352340 | |
| Culture cabinets | Snijders Scientific Plant Growth Cabinet ECD01 | Any other brand is suitable provided that the light intensity, the photoperiod and the temperature can be controlled. | |
| LSM 880 Zeiss confocal microscope | Carl Zeiss microscopy, Jena, Germany | Ablation and imaging were performed using a 40x/1.2 water objective | |
| Pellet pestles | Sigma Aldrich | Z359947 | Blue polypropylene (autoclavable) |
| Provasoli supplement | - | Recipe is available here: http://www.sb-roscoff.fr/sites/www.sb-roscoff.fr/files/documents/station-biologique-roscoff-preparation-du-provasoli-2040.pdf | |
| Pulsed 355 laser (UGA-42 Caliburn 355/25) | Rapp OptoElectronic, Wedel, Germany | ||
| Scalpel | Paramount | PDSS 11 | |
| SysCon software | Rapp OptoElectronic, Wedel, Germany | Laser-driver software | |
| ZEN software | Carl Zeiss microscopy, Jena, Germany | Imaging software, used together with the SysCon software; Black 2.3 version |
References
- Montell, D. J., Keshishian, H., Spradling, A. C. Laser ablation studies of the role of the Drosophila oocyte nucleus in pattern formation. Science. 254 (5029), New York, N.Y. 290-293 (1991).
- Shivakumar, P. C., Lenne, P. F. Laser ablation to probe the epithelial mechanics in drosophila. Methods In Molecular Biology. 1478, 241-251 (2016).
- Bargmann, C. I., Avery, L. Laser killing of cells in Caenorhabditis elegans. Modern Biological Analysis of an Organism. 48, 225-250 (1995).
- Fouad, A. D., Liu, A., Du, A., Bhirgoo, P. D., Fang-Yen, C. Thermal laser ablation with tunable lesion size reveals multiple origins of seizure-like convulsions in Caenorhabditis elegans. Scientific Reports. 11 (1), 5084 (2021).
- Johnson, C. S., Holzemer, N. F., Wingert, R. A. Laser ablation of the zebrafish pronephros to study renal epithelial regeneration. Journal of Visualized Experiments. (54), e2845 (2011).
- Mondia, J. P., Adams, D. S., Orendorff, R. D., Levin, M., Omenetto, F. G. Patterned femtosecond-laser ablation of Xenopus laevis melanocytes for studies of cell migration, wound repair, and developmental processes. Biomedical Optics Express. 2 (8), 2383-2391 (2011).
- Reinhardt, D., Frenz, M., Mandel, T., Kuhlemeier, C. Microsurgical and laser ablation analysis of leaf positioning and dorsoventral patterning in tomato. Development. 132 (1), 15-26 (2005).
- Berg, C., Hage, W., Weisbeek, P., Scheres, B. Laser ablation in Arabidopsis roots: a tool to study cell-to-cell communication. Cellular integration of signalling pathways in plant development. Proceedings of the NATO Advanced Study Institute. , https://eurekamag.com/research/003/488/003488317.php 237-250 (1998).
- Berger, F., Taylor, A., Brownlee, C. Cell fate determination by the cell wall in early fucus development. Science. 263 (5152), New York, N.Y. 1421-1423 (1994).
- Bouget, F. Y., Berger, F., Brownlee, C. Position dependent control of cell fate in the Fucus embryo: role of intercellular communication. Development. 125 (11), 1999-2008 (1998).
- Bringloe, T., et al. Phylogeny and evolution of the brown algae. Critical Reviews in Plant Sciences. 39 (4), 281-321 (2020).
- Saifullah, S., Olsen, Y., Surilayani, D., Handå, A. Carbohydrate of the brown seaweed, saccharina latissima: a review. Joint proceedings of the 2nd and the 3rd International Conference on Food Security Innovation (ICFSI 2018-2019). , 180-182 (2021).
- Zhang, X., Thomsen, M. Techno-economic and environmental assessment of novel biorefinery designs for sequential extraction of high-value biomolecules from brown macroalgae Laminaria digitata, Fucus vesiculosus, and Saccharina latissima. Algal Research. 60, 102499 (2021).
- Kanda, T. On the gametophytes of some japanese species of laminariales. Scientific papers of the Institute of Algological Research, Faculty of Science. 1 (2), Hokkaido Imperial University. 221-260 (1936).
- Fritsch, F. E. The structure and reproduction of the algae. Volume 2. , Cambridge University Press. Cambridge. (1945).
- Bartsch, I., et al. The genus Laminaria sensu lato : recent insights and developments. European Journal of Phycology. 43 (1), 1-86 (2008).
- Theodorou, I., Charrier, B. Chapter 2: Brown algae: ectocarpus and saccharina as experimental models for developmental biology. Handbook of Marine Model Organisms in Experimental Biology - Established and Emerging. Boutet, A., Schierwater, B. , Francis & Taylor Group, CRC Press. ISBN 9780367444471 485 (2021).
- Drew, G. H. The reproduction and early development of laminaria digitata and laminaria saccharina. Annals of Botany. 24 (1), 177-189 (1910).
- Yendo, K. The development of costaria, undaria, and laminaria. Annals of Botany. 25 (99), 691-715 (1911).
- Forbord, S., Steinhovden, K., Rød, K., Handå, A., Skjermo, J. Cultivation protocol for Saccharina latissima. Protocols for Macroalgae Research. Charrier, B., Wichard, T., Reddy, C. R. K. , CRC Press, Francis & Taylor Group. ISBN-10: 14986427. ISBN-13: 978-1498796422 37-59 (2018).
- Bartsch, I. Derivation of clonal stock cultures and hybridization of kelps. Protocols for Macroalgae Research. Charrier, B., Wichard, T., Reddy, C. R. K. , CRC Press, Francis & Taylor Group. ISBN-10: 149879627. ISBN-13: 978-1498796422 61-78 (2018).
- Theodorou, I., Opsahl-Sorteberg, H. -G., Charrier, B. Preparation of zygotes and embryos of the kelp saccharina latissima for cell biology approaches. Bio-protocol. 101, 4132 (2021).
- Lüning, K., Dring, M. J. Reproduction induced by blue light in female gametophytes of Laminaria saccharina. Planta. 104 (3), 252-256 (1972).
- de Medeiros, G., et al. Cell and tissue manipulation with ultrashort infrared laser pulses in light-sheet microscopy. Scientific Reports. 10 (1), 1942 (2020).
- Liang, X., Michael, M., Gomez, G. A. Measurement of mechanical tension at cell-cell junctions using two-photon laser ablation. Bio-protocol. 6 (24), 2068 (2016).
- Ebbing, A., Pierik, R., Bouma, T., Kromkamp, J. C., Timmermans, K. How light and biomass density influence the reproduction of delayed Saccharina latissima gametophytes (Phaeophyceae). Journal of Phycology. 56 (3), 709-718 (2020).
- Rabillé, H., Billoud, B., Tesson, B., Le Panse, S., Rolland, É, Charrier, B. The brown algal mode of tip growth: Keeping stress under control. PLoS Biology. 17 (1), 2005258 (2019).
