Summary
La distruzione di cellule specifiche nell'embrione è un potente strumento per studiare le interazioni cellulari coinvolte nel destino cellulare. Il presente protocollo descrive le tecniche per l'ablazione laser di cellule bersaglio nell'embrione precoce dell'alga bruna Saccharina latissima.
Abstract
In Saccharina latissima, l'embrione si sviluppa come un foglio cellulare monostrato chiamato lamina o lama. Ogni cellula embrionale è facile da osservare, facilmente distinguibile dai suoi vicini e può essere presa di mira individualmente. Per decenni, l'ablazione laser è stata utilizzata per studiare lo sviluppo degli embrioni. Qui è stato sviluppato un protocollo per l'ablazione laser cellulare specifica per i primi embrioni dell'alga bruna S. latissima. Il lavoro presentato comprende: (1) la preparazione di embrioni di Saccharina , con una descrizione dei parametri critici, comprese le condizioni di coltura, (2) le impostazioni di ablazione laser e (3) il monitoraggio della successiva crescita dell'embrione irradiato utilizzando la microscopia time-lapse. Inoltre, vengono forniti dettagli sulle condizioni ottimali per il trasporto degli embrioni dalla piattaforma di imaging al laboratorio, che possono influenzare profondamente il successivo sviluppo dell'embrione. Le alghe appartenenti all'ordine Laminariales mostrano modelli di embriogenesi simili a Saccharina; questo protocollo può quindi essere facilmente trasferito ad altre specie in questo taxon.
Introduction
L'ablazione laser è stata utilizzata per decenni per studiare lo sviluppo dell'embrione. L'irradiazione delle cellule embrionali con un raggio laser consente di monitorare il potenziale rigenerativo e la modifica del lignaggio cellulare durante l'embriogenesi e studiare l'impatto dell'ablazione mirata sulla divisione cellulare e sul destino cellulare. Gli organismi modello utilizzati nei metodi di ablazione laser sono tipicamente animali, come insetti 1,2, nematodi 3,4, vertebrati 5,6 e occasionalmente piante 7,8. Inoltre, un approccio di micro-ablazione laser è stato utilizzato sull'alga marrone Fucus nel 1994 e nel 1998 per dimostrare il ruolo della parete cellulare nella fotopolarizzazione dell'embrione precoce 9,10.
Le alghe brune appartengono al gruppo Stramenopiles, divergente alla radice dell'albero eucariotico 1,6 miliardi di anni fa. Di conseguenza, sono filogeneticamente indipendenti da altri organismi multicellulari, come animali e piante11. Saccharina latissima appartiene all'ordine Laminariales, più comunemente noto come alghe, e sono tra i più grandi organismi sulla terra, raggiungendo dimensioni di oltre 30 m. Saccharina sp. è una grande alga utilizzata per molte applicazioni come alimenti e mangimi, e i suoi polisaccaridi sono estratti per l'uso nelle industrie agricole, farmacologiche e cosmetiche in tutto il mondo12, 13. La sua coltivazione, principalmente in Asia e più recentemente in Europa, richiede la preparazione di embrioni negli incubatoi prima di rilasciare il novellame in mare aperto. Come tutte le alghe, ha un ciclo di vita bifasico composto da una fase gametofita microscopica, durante la quale un gametofito aploide cresce e produce gameti per la fecondazione, e una fase sporofita macroscopica diploide, in cui una grande lama planare si sviluppa dalla sua tenuta attaccata al fondo marino o alle rocce. Lo sporofito rilascia spore aploidi alla maturità, completando così il ciclo di vita 14,15,16.
S. latissima presenta alcune interessanti caratteristiche morfologiche17. Il suo embrione si sviluppa come un foglio planare monostrato 15,18,19 prima di acquisire una struttura multistrato che coincide con l'emergere di diversi tipi di tessuto. Inoltre, Laminariales è uno dei pochi taxa di alghe brune i cui embrioni rimangono attaccati al loro tessuto gametofito materno (Desmarestiales e Sporochnales fanno anche15). Questa caratteristica offre l'opportunità di studiare il ruolo del tessuto materno in questo processo di sviluppo e confrontare i meccanismi di controllo materno nelle alghe brune con quelli negli animali e nelle piante.
Questo articolo presenta il primo protocollo completo per l'ablazione laser in un embrione di alghe precoce. Questo protocollo che coinvolge la tecnica UV ns-pulsed provoca la distruzione specifica di singole cellule embrionali per studiare i loro rispettivi ruoli durante l'embriogenesi. La procedura offre un approccio affidabile per studiare le interazioni cellulari e il destino cellulare durante l'embriogenesi nei Laminariales.
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Protocol
1. Produzione di Saccharina latissima gametophytes
- Raccogliere sporofite mature di S. latissima dallo stato selvatico come precedentemente descritto20,21. Assicurarsi che gli sporofiti selezionati siano privi di epifite (piccoli organismi visibili sulla superficie della lama) o parassiti interni (che si trovano nelle aree sbiancate o macchie sulla lama) .
- Utilizzando un bisturi, tagliare la parte più scura al centro della lama (tessuto fertile che produce spore22) in 1-5 pezzi quadrati (1 cm²), evitando eventuali macchie sbiancate, se presenti.
- Rimuovere eventuali epifite rimanenti pulendo delicatamente i pezzi tagliati con il retro di un bisturi e un po 'di carta assorbente.
- Mettere i pezzi puliti in un piatto di vetro pieno di acqua di mare naturale sterile (vedi Tabella dei materiali) per 45 minuti per rilasciare spore dopo il rapporto22 precedentemente pubblicato.
- Rimuovere i pezzi della lama e filtrare l'acqua di mare attraverso un filtro cellulare da 40 μm per rimuovere detriti o organismi indesiderati.
- Diluire le spore nel filtrato ad una concentrazione di 20-40 spore/mL in piastre di Petri di plastica22.
- Posizionare la soluzione di spore in un armadio di coltura (vedere Tabella dei materiali) configurato con le condizioni di coltura ottimali (13 °C, 24 μE.m-2.s-1, fotoperiodo 16:8 L:D).
- Lascia che le spore germoglino e si sviluppino in gametofiti.
NOTA: La germinazione delle spore è visibile dopo 2 giorni nell'armadio e la prima divisione cellulare delle cellule gametofite di solito avviene entro le seguenti 48 ore. - Sostituire il terreno di coltura dopo 5 giorni con acqua di mare naturale microfiltrata arricchita con una soluzione provasoli 0,5x (NSW1/2) (vedi Tabella dei materiali).
NOTA: Per evitare di ripetere questi passaggi, è possibile selezionare specifici gametofiti maschili e femminili e propagarli vegetativamente per diversi mesi. I gametofiti rimangono vegetativi se coltivati sotto luce rossa (4 μE.m-2.s-1 con una lunghezza d'onda di almeno 580 nm)23 nelle stesse condizioni di coltura sopra descritte (fase 1.7).
2. Frammentazione e induzione dell'oogenesi
- Raccogli gametofiti con un raschietto cellulare.
- Usando un piccolo pestello di plastica, schiacciare i gametofiti raccolti in un tubo da 1,5 ml in pezzi a 4-5 celle.
- Riempire il tubo con 1 mL NSW1/2 (passo 1.9).
- Aggiungere 2,5 μL della soluzione di gametofita frantumata in 3 mL di acqua di mare naturale arricchita con 1x soluzione di Provasoli (NSW) e metterli in una capsula di Petri.
NOTA: una capsula di Petri con fondo di vetro da 25 mm è consigliata per una più facile manipolazione. - Mettere i piatti preparati in un armadietto di coltura e indurre la gametogenesi a 13 °C sotto luce bianca con un'intensità di 24 μE.m-2.s-1 (luce fioca, fotoperiodo 16:8 L:D).
NOTA: La prima gametangia (oogonia femminile e archegonia maschile) può essere osservata dopo 5 giorni. Il maschio è iper-ramificato con piccole cellule, e la femmina è composta da cellule più grandi che formano lunghi filamenti15,22. Le prime uova vengono osservate ~ 10 giorni dopo e la prima divisione degli zigoti di solito avviene entro i successivi 2 giorni. - Sei giorni dopo aver osservato le prime uova, trasferire i piatti in condizioni di luce bianca più brillante: 50 μE.m-2.s-1, fotoperiodo 16:8 L:D, ancora a 13 °C.
3. Acquisizione di immagini per la selezione degli embrioni per l'ablazione e il monitoraggio della crescita successiva
- Immagine dell'intera capsula di Petri per (ri)localizzare gli embrioni selezionati durante la fase di ablazione (non è necessario restituire il piatto al microscopio oculare) e monitorare il successivo sviluppo degli embrioni selezionati.
NOTA: utilizzare un microscopio confocale a scansione laser invertita (vedere Tabella dei materiali) per l'imaging (Figura 1) e l'ablazione laser è descritta nel passaggio 5. - Posiziona la capsula di Petri sul palco e orientala con un segno visivo (ad esempio, disegna una linea con un pennarello permanente).
- Usa l'obiettivo 10x/0.45 per concentrarti su un embrione. Registrare la posizione dei quattro punti cardinali della capsula di Petri.
- Avviare la scansione dei riquadri. Acquisisci immagini trasmesse/fluorescenti dell'intera capsula di Petri a bassa risoluzione: 256 x 256 pixel, un tempo di permanenza in pixel di 1,54 μs con scansione bidirezionale e uno zoom digitale di 0,6x utilizzando un laser a 561 nm con trasmissione dell'1,2%.
NOTA: il tempo di scansione per un'intera capsula di Petri da 2,5 cm è di ~ 6 minuti per 225 tessere (Figura 2). Qui, il laser a 561 nm è stato utilizzato per la trasmissione e l'imaging a fluorescenza. Il segnale di fluorescenza è stato raccolto tra 580-720 nm sui fotomoltiplicatori confocali (PMT) e la luce trasmessa è stata raccolta sul PMT trasmesso. Il laser a 561 nm può anche monitorare la clorofilla in questa fase, ma non è necessario perché aiuta solo a distinguere correttamente il rumore del segnale e gli organismi. - Salvare l'immagine di scansione dei riquadri e tenerla aperta nella finestra del software di acquisizione delle immagini (vedere Tabella dei materiali).
- Cambia l'obiettivo, non rimuovere la capsula di Petri.
NOTA: l'obiettivo acqua 40x/1.2 è stato spostato sul lato dello stadio in modo che il mezzo di immersione (acqua) potesse essere aggiunto all'obiettivo senza spostare la capsula di Petri dalla sua posizione iniziale. - Naviga attraverso l'immagine di scansione delle tessere acquisita in precedenza per selezionare l'embrione appropriato. Una volta che un embrione è stato identificato su questa immagine, spostare lo stadio nella posizione esatta dell'embrione e acquisire immagini trasmesse / fluorescenti di quell'embrione ad alta risoluzione.
NOTA: impostazioni ad alta risoluzione: 512 x 512 pixel, 0,130 μm/pixel, 0,208 μs pixel di tempo di permanenza con scansione monodirezionale e zoom digitale 2x utilizzando un laser a 561 nm con trasmissione dello 0,9%. - Annotare l'immagine di scansione delle tessere per ogni embrione candidato all'ablazione laser (Figura 2B) e procedere alla fase di ablazione laser.
4. Calibrazione laser
- Calibrare il laser e sincronizzare il software di acquisizione delle immagini con il software del driver laser nella modalità "Click & Fire" e un laser pulsato a 355 nm.
NOTA: questo passaggio è fondamentale per garantire una perfetta sincronizzazione tra la posizione del cursore del mouse nel software del driver laser (vedere Tabella dei materiali) con la posizione nell'immagine live del software di acquisizione. - Aprire il pacchetto software laser-driver e fare clic su Live nel pacchetto software di acquisizione immagini.
- Sincronizzare entrambi i pacchetti software facendo clic su Avvia acquisizione nel pacchetto software laser-driver. L'immagine dal vivo viene ora registrata anche nel software del driver laser UV.
- Definisci un'area di interesse (AOI) facendo clic sul pulsante Scegli AOI e facendo clic sui bordi dell'immagine (destra, sinistra, in alto e in basso) nel pacchetto software del driver laser UV.
NOTA: dopo questa fase di calibrazione, le impostazioni per la dimensione dei pixel, il formato dell'immagine e lo zoom nel pacchetto software di acquisizione devono rimanere costanti. - Selezionare un'area vuota sul piatto e abbassare il livello dello stadio a 20 μm sotto il piano focale del campione per mettere a fuoco il fondo di vetro.
- Impostare il laser di ablazione e le traiettorie laser di imaging facendo clic su Avvia calibrazione e scegliere Calibrazione manuale.
- Selezionare una potenza laser sufficientemente alta da vedere un punto nero al centro dell'immagine dal vivo corrispondente al foro nel coperchio di vetro (tutte le persiane devono essere aperte).
- Clicca su questo punto nero centrale con il cursore del mouse e clicca su 18 punti aggiuntivi proposti dal software per completare la procedura di allineamento.
- Controllare la calibrazione nella "modalità Click & Fire" sullo stesso coverslip.
NOTA: la calibrazione laser dipende dai parametri di imaging. Una volta calibrato il laser, assicurarsi che i parametri di imaging (ad esempio, 512 x 512 pixel, 0,130 μm / pixel, 0,208 μs pixel tempo di permanenza con scansione monodirezionale e zoom digitale 2x) non siano cambiati.
5. Ablazione laser
- Seleziona un embrione di interesse. Avviare una registrazione time-lapse nel software di acquisizione delle immagini.
- Acquisire immagini trasmesse/fluorescenza con un obiettivo 40x/1,2 W ad alta risoluzione (cioè 512 x 512 pixel, 0,130 μm/pixel, 1,54 μs pixel dwell time con scansione monodirezionale e zoom digitale 2x utilizzando un laser a 561 nm con trasmissione allo 0,9%). Acquisisci la registrazione time-lapse alla massima velocità.
- Eseguire lo zoom indietro dell'area all'inizio della registrazione time-lapse. Ingrandire l'AOI.
- Utilizzare la funzione "Click & Fire" del software laser-driver per applicare l'irradiazione dannosa sulla cellula di interesse nell'embrione. Utilizzare i seguenti parametri: trasmissione laser al 45% (corrispondente a un massimo di 40 μW) e durata dell'impulso di 1 ms (fase 4).
NOTA: si consiglia la registrazione video durante la ripresa laser. - Sotto 688 nm, monitorare l'espulsione di cloroplasti autofluorescenti dal citoplasma.
- Se il contenuto della cella rimane nella cella, utilizzare nuovamente la funzione "Click & Fire" per aumentare le dimensioni della violazione nella cella. Ripetere, mantenendo il numero di scatti al minimo fino a quando la maggior parte del contenuto della cella non è stata rilasciata.
- Interrompere la registrazione del time-lapse dopo che l'embrione si è stabilizzato (cioè, non è possibile rilevare ulteriori movimenti intracellulari (~ 1-5 min).
- Aggiornare l'annotazione sull'immagine di scansione dei riquadri, se necessario.
6. Monitoraggio della crescita degli embrioni irradiati
NOTA: il monitoraggio viene effettuato per diversi giorni.
- Determinare il tasso di sopravvivenza monitorando il numero di embrioni che si sviluppano dopo l'ablazione laser e confrontarli con quelli che muoiono.
NOTA: Alcuni embrioni muoiono immediatamente dopo l'ablazione per vari motivi. Un tasso di mortalità elevato e rapido è di solito un segno di parametri laser inappropriati o di un'esposizione più alta / più lunga allo stress durante l'esperimento o il successivo trasporto. - Determinare il ritardo di crescita misurando la lunghezza degli embrioni sparati al laser ogni giorno e confrontandolo con embrioni intatti.
NOTA: Il tasso di crescita degli organismi laser-shot è generalmente più lento di quello degli organismi non trattati. Tuttavia, alcune impostazioni laser (inappropriate) possono inibire la crescita per più di una settimana, con la crescita che riprende dopo. - Scopri il danno adiacente monitorando la reazione delle cellule adiacenti alle cellule ablate. In alcuni casi, la depressurizzazione post-scoppio può causare lo scoppio delle cellule vicine.
- Verificare la presenza di contaminazioni da microbi. Monitorare la crescita di microalghe e batteri nel mezzo. Se nel piatto è presente un livello insolito di microbi, scartarlo e ripetere il protocollo dal passaggio 2 o dal passaggio 3.
NOTA: Dopo l'ablazione laser, gli embrioni di S. latissima danneggiati sono già molto stressati e ulteriori stress esterni possono causare un aumento della mortalità. Focolai batterici o virali sono possibili perché gli embrioni trattati non possono crescere in condizioni astoniche. - Controllare lo sviluppo globale degli organismi shot studiando il fenotipo e comprendendo il ruolo nello sviluppo della regione bersaglio.
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Representative Results
I gametofiti di S. latissima sono stati coltivati e la gametogenesi è stata indotta a produrre zigoti ed embrioni. Dodici giorni dopo l'induzione della gametogenesi, gli embrioni sono stati sottoposti ad ablazione laser. Qui, l'esperimento mirava a valutare il ruolo di cellule specifiche nello sviluppo complessivo degli embrioni di S. latissima . La cellula più apicale, la cellula più basale e le cellule mediane sono state prese di mira. Dopo la scansione delle piastrelle, l'intera capsula di Petri (Figura 2A), un embrione di interesse, è stata identificata come un candidato adatto per la ripresa laser (Figura 2B). Una cellula specifica di questo embrione è stata scelta, presa di mira e sparata con un raggio laser UV pulsato con un massimo di 40 μW di potenza laser (corrispondente al 45% della potenza massima per l'apparecchiatura utilizzata qui) per 1 ms (Film 1). La cellula ha rilasciato il suo contenuto (cloroplasti e citoplasma). È interessante notare che le cellule adiacenti hanno risposto allo scoppio della cellula irradiata espandendosi nello spazio intercellulare. La posizione degli embrioni irradiati è stata registrata per un successivo monitoraggio nell'arco di 10 giorni (Figura 3). La maggior parte degli embrioni irradiati ha continuato a svilupparsi, ma ha mostrato alterazioni della crescita (forma dell'embrione). Un'analisi dettagliata dei cambiamenti morfologici deve essere intrapresa prima che una funzione specifica possa essere attribuita a ciascuna cellula irradiata nel controllo del meccanismo generale di sviluppo.
Al contrario, gli embrioni sono stati testati con altri parametri laser (ad esempio, 33 ms per la durata di ripresa del 60% -80% di potenza laser; Film 2) ha mostrato rapidamente segni di forte stress come sbiancamento cellulare, sbiadimento o cambiamenti di forma (arrotondamento). Quasi tutti gli embrioni uccisi in questo modo sono morti entro cinque giorni dall'esperimento (Figura 4).
Figura 1: Fotografia del set-up del microscopio ad ablazione laser. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Scansione delle piastrelle annotate di un'intera capsula di Petri. (A) Scansione delle piastrelle dell'intera capsula di Petri utilizzata per l'ablazione laser. La trasmissione PMT è stata utilizzata per ottenere una scansione a campo luminoso. Una volta individuato un embrione di interesse, l'utente fa clic sulla posizione dell'embrione nella scansione delle piastrelle e il software posiziona lo stadio direttamente sull'embrione. (B) La scansione delle piastrelle può quindi essere annotata specificamente per localizzare l'embrione nelle fasi successive, per tracciare e monitorare l'embrione. Qui, l'immagine mostra un embrione attaccato al fondo della capsula di Petri, che può essere facilmente localizzato utilizzando il laser a 561 nm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Serie temporale dell'embrione di S. latissima in crescita dopo irradiazione. Questo è mostrato nel Filmato 1. L'ablazione laser della cellula più apicale dell'embrione non ha sbiancato le cellule adiacenti dell'embrione. Hanno continuato a crescere e dividersi, formando un embrione normale dopo pochi giorni. Le immagini sono state scattate ogni 24 ore, 2-9 giorni dopo l'ablazione. La barra della scala è di 50 μm ed è la stessa per tutte le foto. D2-D9 corrisponde al giorno-2 al giorno-9. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Serie temporale della morte embrionale di S. latissima dopo ablazione laser utilizzando parametri non ottimali. La sovraesposizione all'irradiazione laser può facilmente portare a tassi di mortalità più elevati dell'embrione bersaglio e anche di quelli vicini. Viene mostrata una serie temporale dell'embrione girato nel filmato 2, con il tempo dopo l'ablazione indicato sopra ogni foto (3-6 giorni dopo l'ablazione). La barra della scala è di 30 μm e si applica a ciascuna foto. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Film 1: Ablazione laser della cellula più apicale di un embrione a 8 cellule di S. latissima. L'attenzione è stata prima regolata sull'embrione selezionato tra un bouquet di sporofite di Saccharina (in campi diversi, prima larghi, poi stretti). La cellula più apicale dell'embrione è stata quindi colpita utilizzando il 45% di potenza laser per 1 ms. La cellula apicale scoppiò rapidamente e rilasciò il suo contenuto. Le celle adiacenti, liberate dal turgore della cella burst, riempivano lo spazio vuoto. Dopo 5 minuti, la cellula e il suo contenuto hanno smesso di muoversi e hanno raggiunto uno stato di equilibrio. Il filmato è stato accelerato 4 volte (da 1 immagine per 632 ms a 6 fps). Il follow-up dello sviluppo embrionale è mostrato nella Figura 3. Clicca qui per scaricare questo film.
Filmato 2: Sbiancamento significativo delle cellule adiacenti a una cellula scoppiata causato da impostazioni laser non ottimali. L'utilizzo di una potenza laser del 60% -80% per 1 ms o di una potenza laser del 45% per 10 ms ha comportato un significativo sbiancamento delle cellule adiacenti e un tasso di sopravvivenza molto più basso. Le impostazioni utilizzate per il laser non devono causare sbiancamento o danni parziali alle cellule adiacenti. I migliori risultati sono stati ottenuti riducendo la potenza e/o la durata dell'impulso laser e prendendo di mira il punto più lontano dalle celle adiacenti. Qui vienesparata la cellula più apicale di un embrione a 4 cellule di S. latissima (80% di potenza laser, 1 ms) (vista laterale/dall'alto). Il superamento delle cellule inferiori e laterali è facilmente osservabile. Il successivo sviluppo dell'embrione è mostrato nella Figura 4. Clicca qui per scaricare questo film.
Figura 1 supplementare: Diagramma di flusso schematico dell'intero protocollo. Fare clic qui per scaricare questo file.
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Discussion
L'ablazione laser cellulare locale consente l'ablazione temporale e spaziale con un alto livello di precisione. Tuttavia, la sua efficienza può essere ostacolata dalla non accessibilità delle cellule bersaglio; ad esempio, tutte le cellule sono di un embrione tridimensionale. Questo protocollo è stato sviluppato sull'embrione dell'alga Saccharina latissima, che sviluppa una lamina monostrato in cui tutte le cellule possono essere facilmente distinte e distrutte individualmente con un raggio laser.
Potenza e lunghezza d'onda del laser
Il laser a impulsi NIR fs è comunemente usato negli studi sullo sviluppo su animali24,25. Tuttavia, nel caso di alghe brune come Saccharina, il laser non poteva far scoppiare la cellula senza bruciare l'intero embrione. Questa reazione può essere correlata all'elevata attività delle raccoglitrici leggere cloroplasto.
Utilizzando il laser UV ns-pulsed per l'ablazione, sono stati testati due approcci: (1) utilizzando un impulso ad alta potenza per un breve periodo di tempo o (2) utilizzando un'esposizione laser inferiore per un periodo di tempo più lungo. L'energia fornita dal laser, una combinazione di potenza del laser e durata dell'impulso, influisce sull'energia fornita alla cellula irradiata. L'energia erogata può anche influenzare le cellule circostanti per riflessione e diffrazione. Pertanto, sono state selezionate le impostazioni più basse dei due parametri che hanno fornito risultati riproducibili per ridurre eventuali effetti collaterali indesiderati. La potenza del laser tra 25-40 μ W.cm-2 con un impulso di 1 ms sembrava essere ottimale. Utilizzando questi parametri, l'effetto del laser UV è stato contenuto a un livello molto locale senza sbiancamento visibile nelle cellule circostanti, ma abbastanza efficiente da causare lo scoppio della cellula bersaglio. Questi parametri sono stati ripetutamente applicati senza alcun effetto letale diretto sugli embrioni. Tempi di impulso più lunghi o una maggiore potenza laser causavano lo sbiancamento delle cellule circostanti o addirittura la morte dell'embrione, mentre valori più bassi erano insufficienti per rompere la parete cellulare.
Condizioni materiali e di coltura delle alghe
Sebbene consenta riprese precise a livello subcellulare, questa tecnica richiede allo sperimentatore di affrontare quattro fattori critici per consentire un'interpretazione affidabile dei risultati. Questi punti devono essere considerati sia prima che dopo l'esperimento di ablazione laser.
Il primo fattore da affrontare è la densità della popolazione embrionale. L'affollamento negativo influisce sul tasso di sviluppo di S. latissima26. Basse densità forniscono (1) una migliore ripetibilità dell'impulso perché la presenza di altri embrioni nel percorso laser può diminuirne la potenza e (2) un monitoraggio più facile degli embrioni sparati dal laser, che crescono leggermente più lentamente degli embrioni intatti; quest'ultimo copre rapidamente gli embrioni sparati. Il secondo fattore critico di questo protocollo è la temperatura alla quale viene effettuato l'esperimento. Il raggio laser stesso riscalda il campione, ma la temperatura della stanza e l'ambiente locale del microscopio si aggiungono alle condizioni di temperatura complessive sperimentate dal campione, vicino a 18-22 ° C. Qui, la stanza del microscopio non è stata refrigerata perché questa apparecchiatura viene utilizzata principalmente per le cellule animali che tollerano le temperature ambientali. Fortunatamente, gli embrioni di Saccharina sono stati in grado di resistere a temperature di 22 °C (9 °C superiori alla temperatura di coltura ottimale di 13 °C) per un massimo di 4 ore. Tuttavia, i dispositivi per aiutare a mantenere una bassa temperatura ambiente, come un'adeguata ventilazione o un supporto per piastre di raffreddamento, possono aiutare a mitigare il rischio di effetti avversi sulla sopravvivenza e sullo sviluppo degli embrioni algali. Inoltre, una lenta pre-acclimatazione delle gametofite a 16 °C sotto la luce rossa può aiutare gli embrioni a resistere ai picchi di temperatura durante il processo di ablazione. In terzo luogo, oltre all'aumento della temperatura, gli embrioni sono privati di una fonte di luce adeguata per tutta la durata dell'esperimento. Inoltre, i cloroplasti possono essere parzialmente sbiancati dal laser a 561 nm. L'utilizzo della potenza più bassa possibile sul laser a 561 nm aiuta a ridurre questo effetto. In quarto luogo, il trasporto è anche un fattore critico da tenere in considerazione perché le apparecchiature di ablazione laser non sono disponibili in tutti i laboratori. I picchi di temperatura e i movimenti esterni o gli urti devono essere evitati per prevenire lo spostamento, la perdita o la morte del materiale algale. Quando possibile, le scatole di trasporto devono essere refrigerate, resistenti alle vibrazioni (ad esempio, schiuma ammortizzante) e dotate di luci. Diverse scatole di trasporto che soddisfano questi requisiti sono disponibili in commercio.
Anche se tutti questi fattori sono controllati il più possibile, può comunque verificarsi uno stress ambientale debole ma potenzialmente significativo. Questa possibilità deve essere considerata nell'analisi e nell'interpretazione della risposta embrionale all'ablazione laser.
Oltre alle condizioni ambientali che devono essere mantenute stabili durante l'esperimento, anche tenere traccia degli organismi irradiati durante tutta la fase di monitoraggio è una sfida. La crescita dei diversi embrioni cambia il paesaggio originale nel tempo. A meno che un microscopio automatizzato non possa essere dedicato al monitoraggio dell'esperimento, seguire l'embrione dopo l'ablazione laser può facilmente richiedere molto tempo e generare grandi quantità di dati. Le registrazioni video durante l'impulso di ablazione laser iniziale sono altamente raccomandate per tracciare la reazione immediata dell'embrione all'impulso. Questo rapido monitoraggio dell'impatto dell'impulso è di notevole importanza perché in alcuni casi, l'impulso, quando mirato al centro della cellula, ha causato la rapida esplosione della cellula bersaglio, molto probabilmente a causa della differenza di osmolarità tra l'interno della cellula e il mezzo (acqua di mare). Quando la perdita era troppo veloce, anche le cellule vicine scoppiavano. Sparare nella regione più distale della cellula bersaglio si è rivelato un modo efficace per tamponare l'effetto burst su qualsiasi cellula adiacente. Un altro modo efficace per evitare scoppi violenti è aumentare l'osmolarità del mezzo con saccarosio27. Tuttavia, la differenza di osmolarità è necessaria per eliminare il contenuto della cellula bersaglio. Pertanto, è necessario mantenere un potenziale di osmolarità sufficiente. In alcuni casi, cloroplasti e altri composti hanno ostruito l'apertura prodotta dall'ablazione laser, che ha portato le cellule a riprendersi dal colpo laser, con la crescita che riprende dopo pochi giorni. Ulteriori impulsi diretti a sbloccare l'apertura si sono rivelati sufficienti per prevenire l'ostruzione.
Limitazioni
Un compromesso deve essere raggiunto tra la potenza del laser, che dovrebbe essere abbastanza alta da far svuotare il loro contenuto alle cellule vicine, che negli embrioni algali sono particolarmente sensibili allo stress termico e al fotosbiancamento. Pertanto, un attento monitoraggio delle cellule dopo il colpo laser è la chiave per controllare questo passaggio e garantire che le cellule bersaglio siano morte. Altrimenti, l'interpretazione delle cellule bersaglio sul destino delle cellule vicine, e quindi il successivo sviluppo dell'embrione, può essere fuorviante.
La perforazione delle cellule con un ago può sembrare un'alternativa in cui le cellule algali non subirebbero alcun calore o stress leggero. Tuttavia, questo approccio sarebbe impegnativo perché le cellule embrionali algali marroni crescono immerse nell'acqua di mare e non hanno alcun contatto con alcuna superficie solida. La parete cellulare spessa ed elastica resiste alla penetrazione dell'ago anche quando si mantiene l'embrione a contatto con una superficie solida e di vetro utilizzando un micromanipolatore in un sistema di microiniezione standard.
In sintesi, questo protocollo descrive la procedura sperimentale completa e le impostazioni per l'ablazione laser e il monitoraggio degli embrioni algali marroni e le fasi critiche per un esperimento di successo (Figura supplementare 1). Questo approccio unico è un metodo promettente per studiare le interazioni cellulari e il destino cellulare nei primi embrioni di alghe brune.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
La borsa di dottorato di S.B. è finanziata dalla Regione Bretagne (numero di sovvenzione ARED COH20020) e dall'Università della Sorbona. I.T.is borsa di dottorato è finanziata dalla Regione Bretagna (numero di sovvenzione ARED COH18020) e dall'Università norvegese NMBU. Questo progetto ha ricevuto un sostegno finanziario dal CNRS attraverso i programmi interdisciplinari miti. MRic è membro dell'infrastruttura nazionale France-BioImaging sostenuta dall'Agenzia Nazionale Francese per la Ricerca (ANR-10-INBS-04).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 25 mm glass bottom petri dish | NEST | 801001 | |
| Autoclaved sea water | - | Collected offshore near the Astan buoy (48°44.934 N 003°57.702 W) close to Roscoff, France, at a depth of 20 m. | |
| Cell scraper | MED 2 | 83.3951 | |
| Cell strainer 40 µm | Corning / Falcon | 352340 | |
| Culture cabinets | Snijders Scientific Plant Growth Cabinet ECD01 | Any other brand is suitable provided that the light intensity, the photoperiod and the temperature can be controlled. | |
| LSM 880 Zeiss confocal microscope | Carl Zeiss microscopy, Jena, Germany | Ablation and imaging were performed using a 40x/1.2 water objective | |
| Pellet pestles | Sigma Aldrich | Z359947 | Blue polypropylene (autoclavable) |
| Provasoli supplement | - | Recipe is available here: http://www.sb-roscoff.fr/sites/www.sb-roscoff.fr/files/documents/station-biologique-roscoff-preparation-du-provasoli-2040.pdf | |
| Pulsed 355 laser (UGA-42 Caliburn 355/25) | Rapp OptoElectronic, Wedel, Germany | ||
| Scalpel | Paramount | PDSS 11 | |
| SysCon software | Rapp OptoElectronic, Wedel, Germany | Laser-driver software | |
| ZEN software | Carl Zeiss microscopy, Jena, Germany | Imaging software, used together with the SysCon software; Black 2.3 version |
References
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