Summary
Ødeleggelsen av spesifikke celler i embryoet er et kraftig verktøy for å studere cellulære interaksjoner involvert i celle skjebne. Denne protokollen beskriver teknikker for laserablasjon av målrettede celler i det tidlige embryoet til den brune algen Saccharina latissima.
Abstract
I Saccharina latissima utvikler embryoet seg som et monolags celleark kalt lamina eller bladet. Hver embryocelle er lett å observere, lett å skille fra sine naboer, og kan målrettes individuelt. I flere tiår har laserablasjon blitt brukt til å studere embryoutvikling. Her ble det utviklet en protokoll for cellespesifikk laserablasjon for tidlige embryoer av brunalgen S. latissima. Det presenterte arbeidet inkluderer: (1) fremstilling av Saccharina embryoer, med en beskrivelse av de kritiske parametrene, inkludert kulturforhold, (2) laserablasjonsinnstillingene og (3) overvåking av den påfølgende veksten av det bestrålte embryoet ved hjelp av time-lapse mikroskopi. I tillegg er det gitt detaljer om de optimale forholdene for transport av embryoene fra bildeplattformen tilbake til laboratoriet, noe som kan påvirke påfølgende embryoutvikling dypt. Alger som tilhører ordenen Laminariales viser embryogenesemønstre som ligner på Saccharina; denne protokollen kan dermed enkelt overføres til andre arter i dette taksonet.
Introduction
Laserablasjon har blitt brukt i flere tiår for å studere embryoutvikling. Bestråling av embryoceller med laserstråle gjør det mulig å overvåke det regenerative potensialet og modifikasjonen av cellelinjen under embryogenese og undersøke virkningen av målrettet ablasjon på celledeling og celle skjebne. Modellorganismene som brukes i laserablasjonsmetoder er typisk dyr, som insekter 1,2, nematoder 3,4, virveldyr 5,6 og av og til planter 7,8. I tillegg ble en lasermikroablasjonsmetode brukt på den brune algen Fucus i 1994 og 1998 for å demonstrere celleveggens rolle i fotopolariseringen av det tidligeembryoet 9,10.
Brune alger tilhører gruppen Stramenopiles, divergert ved roten av det eukaryote treet for 1,6 milliarder år siden. Som et resultat er de fylogenetisk uavhengige av andre multicellulære organismer, som dyr og planter11. Saccharina latissima tilhører ordenen Laminariales, mer kjent som kelps, og de er blant de største organismene på jorden, og når størrelser på over 30 m. Saccharina sp. er en stor tang som brukes til mange bruksområder som mat og fôr, og dens polysakkarider ekstraheres for bruk i landbruks-, farmakologiske og kosmetiske næringer over hele verden12, 13. 13. Dyrkingen, hovedsakelig i Asia og mer nylig i Europa, krever fremstilling av embryoer i klekkerier før utsetting av ungdyr i åpent hav. Som alle kelps har den en bifasisk livssyklus sammensatt av en mikroskopisk gametofytisk fase, hvor en haploid gametofyt vokser og produserer gameter for befruktning, og en diploid makroskopisk sporadisk fase, hvor et stort planblad utvikler seg fra sin holdfast festet til havbunnen eller bergarter. Sporofytten frigjør haploide sporer ved modenhet, og fullfører dermed livssyklusen 14,15,16.
S. latissima presenterer noen interessante morfologiske trekk17. Embryoet utvikler seg som et monolags planark 15,18,19 før det får en flerlagsstruktur som sammenfaller med fremveksten av forskjellige vevstyper. I tillegg er Laminariales en av de eneste taxa av brune alger hvis embryoer forblir festet til deres mors gametofytiske vev (Desmarestiales og Sporochnales gjør også15). Denne funksjonen gir muligheten til å studere rollen som morsvev i denne utviklingsprosessen og sammenligne mors kontrollmekanismer i brune alger med de i dyr og planter.
Denne artikkelen presenterer den første komplette protokollen for laserablasjon i et tidlig tarembryo. Denne protokollen som involverer UV ns-pulserende teknikk resulterer i spesifikk ødeleggelse av individuelle embryoceller for å studere deres respektive roller under embryogenese. Prosedyren gir en pålitelig tilnærming for å undersøke celleinteraksjoner og celle skjebne under embryogenese i Laminariales.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Produksjon av Saccharina latissima gametofytter
- Samle modne sporofytter av S. latissima fra naturen som tidligere beskrevet20,21. Forsikre deg om at de valgte sporofyttene er blottet for epifytter (små organismer synlige på bladets overflate) eller interne parasitter (funnet i blekede områder eller flekker på bladet).
- Bruk en skalpell til å kutte den mørkeste delen i midten av bladet (fruktbart sporeproduserende vev22) i 1-5 kvadratiske stykker (1 cm²), og unngå blekede flekker, hvis de er til stede.
- Fjern eventuelle gjenværende epifytter ved å rengjøre de kuttede bitene forsiktig med baksiden av en skalpell og litt absorberende papir.
- Legg de rensede bitene i en glassfat fylt med sterilt naturlig sjøvann (se materialtabell) i 45 minutter for å frigjøre sporer etter tidligere publisert rapport22.
- Fjern bladstykkene og filtrer sjøvannet gjennom en 40 μm cellesil for å fjerne rusk eller uønskede organismer.
- Fortynn sporene i filtratet til en konsentrasjon på 20-40 sporer/ml i petriskåler av plast22.
- Plasser sporeløsningen i et kulturskap (se Materialtabell) konfigurert med optimale kulturforhold (13 °C, 24 μE.m-2.s-1, fotoperiode 16:8 L:D).
- La sporene spire og utvikle seg til gametofytter.
MERK: Spore spiring er synlig etter 2 dager i skapet, og den første celledelingen av gametofytiske celler skjer vanligvis innen følgende 48 timer. - Erstatt vekstmediet etter 5 dager med mikrofiltrert naturlig sjøvann beriket med en 0,5x Provasoli-oppløsning (NSW1/2) (se materialtabell).
MERK: For å unngå å gjenta disse trinnene, kan spesifikke mannlige og kvinnelige gametofytter velges og vegetativt forplantes i flere måneder. Gametofyttene forblir vegetative når de dyrkes under rødt lys (4 μE.m-2.s-1 med en bølgelengde på minst 580 nm)23 under de samme kulturforholdene beskrevet ovenfor (trinn 1.7).
2. Fragmentering og induksjon av oogenese
- Høst gametofytter med en celleskraper.
- Ved hjelp av en liten plastpestle, knus de oppsamlede gametofyttene i et 1,5 ml rør i 4-5-cellers stykker.
- Fyll slangen med 1 ml NSW1/2 (trinn 1.9).
- Tilsett 2,5 μL av den knuste gametofyttoppløsningen i 3 ml naturlig sjøvann beriket med 1x Provasoli-løsning (NSW) og legg dem i en petriskål.
MERK: En 25 mm petriskål med glassbunn anbefales for enklere håndtering. - Plasser de tilberedte rettene i et kulturskap og induser gametogenese ved 13 °C under hvitt lys med en intensitet på 24 μE.m-2.s-1 (svakt lys, fotoperiode 16:8 L:D).
MERK: Den første gametangia (kvinnelig oogonia og mannlig archegonia) kan observeres etter 5 dager. Hannen er hyperforgrenet med små celler, og hunnen består av større celler som danner lange filamenter15,22. De første eggene blir observert ~ 10 dager senere, og den første delingen av zygoter skjer vanligvis innen de følgende 2 dagene. - Seks dager etter å ha observert de første eggene, overfør oppvasken til lysere hvite lysforhold: 50 μE.m-2.s-1, fotoperiode 16: 8 L: D, fortsatt ved 13 ° C.
3. Bildeopptak for valg av embryoer for ablasjon og overvåking av påfølgende vekst
- Se for deg hele petriskålen for å (re)lokalisere embryoene som ble valgt under ablasjonstrinnet (du trenger ikke å returnere parabolen til det okulære mikroskopet) og overvåke den påfølgende utviklingen av de valgte embryoene.
MERK: Bruk et omvendt laserskanningskonfokalmikroskop (se materialtabell) for avbildning (figur 1), og laserablasjonen er beskrevet i trinn 5. - Plasser petriskålen på scenen og orienter den med et visuelt merke (f.eks. tegn en strek med en permanent markør).
- Bruk 10x/0.45-målet for å fokusere på et embryo. Registrer posisjonen til de fire kardinalpunktene i petriskålen.
- Start flisskanningen. Skaff deg overførte/fluorescerende bilder av hele petriskålen ved lav oppløsning: 256 x 256 piksler, en pikseltid på 1,54 μs med toveis skanning og en digital zoom på 0,6x ved hjelp av en 561 nm laser ved 1,2 % overføring.
MERK: Skannetiden for en hel 2,5 cm petriskål er ~6 min for 225 fliser (figur 2). Her ble 561 nm laser brukt til overføring og fluorescensavbildning. Fluorescenssignalet ble samlet mellom 580–720 nm på de konfokale fotomultiplikatorene (PMT) og det overførte lyset ble samlet inn på den overførte PMT. 561 nm laser kan også overvåke klorofyll på dette trinnet, men det er unødvendig fordi det bare bidrar til å skille signalstøyen og organismene riktig. - Lagre flisskanningsbildet og hold det åpent i vinduet for bildeinnhentingsprogramvare (se Materialtabell).
- Endre målet, ikke fjern petriskålen.
MERK: Vannmålet 40x/1.2 ble flyttet til siden av scenen slik at nedsenkingsmediet (vann) kunne tilsettes målet uten å flytte petriskålen fra utgangsposisjonen. - Naviger gjennom det tidligere anskaffede flisskanningsbildet for å velge riktig embryo. Når et embryo er identifisert på dette bildet, flytt scenen til den nøyaktige posisjonen til embryoet og få overførte / fluorescerende bilder av det embryoet ved høy oppløsning.
MERK: Innstillinger med høy oppløsning: 512 x 512 piksler, 0,130 μm/piksel, 0,208 μs piksel oppholdstid med monoretningsskanning og 2x digital zoom ved hjelp av en 561 nm laser ved 0,9 % overføring. - Kommenter flisskanningsbildet for hver embryokandidat for laserablasjon (figur 2B) og fortsett til laserablasjonstrinnet.
4. Laserkalibrering
- Kalibrer laseren og synkroniser bildeopptaksprogramvaren med laserdriverprogramvaren i "Click &Fire mode" og en pulserende 355 nm laser.
MERK: Dette trinnet er avgjørende for å sikre perfekt synkronisering mellom musepekerens posisjon i laserdriverprogramvaren (se Materialtabell) med posisjonen i live-bildet av anskaffelsesprogramvaren. - Åpne programvarepakken for laserdriveren og klikk på Live i programvarepakken for bildeinnhenting.
- Synkroniser begge programvarepakkene ved å klikke på Start anskaffelse i programvarepakken for laserdriveren. Live-bildet er nå også registrert i UV-laserdriverprogramvaren.
- Definer et interesseområde (AOI) ved å klikke på Velg AOI-knappen og klikke på kantene av bildet (høyre, venstre, topp og bunn) i programvarepakken UV-laserdriver.
MERK: Etter dette kalibreringstrinnet må innstillingene for pikselstørrelse, bildeformat og zoom i programvarepakken for innhenting forbli konstante. - Velg et tomt område på fatet og senk nivået på scenen til 20 μm under prøvefokalplanet for å fokusere på glassbunnen.
- Still inn ablasjonslaser- og bildelaserbanene ved å klikke på Start kalibrering og velg Manuell kalibrering.
- Velg en lasereffekt som er høy nok til å se en svart prikk i midten av det levende bildet som tilsvarer hullet i glassdekselet (alle skodder må være åpne).
- Klikk på denne sentrale svarte prikken med musepekeren og klikk på 18 ekstra prikker foreslått av programvaren for å fullføre justeringsprosedyren.
- Kontroller kalibreringen i "Click &Fire mode" på samme coverlip.
MERK: Laserkalibrering avhenger av bildeparametrene. Når laseren er kalibrert, må du kontrollere at bildeparametrene (dvs. 512 x 512 piksler, 0,130 μm/piksel, 0,208 μs piksel oppholdstid med monoretningsskanning og 2x digital zoom) ikke er endret.
5. Laserablasjon
- Velg et embryo av interesse. Start et timelapse-opptak i bildeinnhentingsprogramvaren.
- Skaff deg overførte/fluorescensbilder med et mål på 40x/1,2 W ved høy oppløsning (dvs. 512 x 512 piksler, 0,130 μm/piksel, 1,54 μs piksel oppholdstid med monoveis skanning og 2x digital zoom ved hjelp av en 561 nm laser ved 0,9 % overføring). Skaff deg time-lapse-opptaket med maksimal hastighet.
- Zoom ut av området i begynnelsen av time-lapse-opptaket. Zoom inn på AOI.
- Bruk "Click &Fire" -funksjonen til laserdriverprogramvaren for å bruke den skadelige bestrålingen på cellen av interesse i embryoet. Bruk følgende parametere: 45 % laseroverføring (tilsvarer maksimalt 40 μW) og 1 ms pulstidsvarighet (trinn 4).
MERK: Videoopptak under laserfotografering anbefales. - Under 688 nm, overvåke utstøting av autofluorescerende kloroplaster fra cytoplasma.
- Hvis celleinnholdet forblir i cellen, bruk "Click &Fire" -funksjonen en gang til for å øke størrelsen på bruddet i cellen. Gjenta, hold antall skudd til et minimum til det meste av celleinnholdet er utgitt.
- Stopp time-lapse-opptaket etter at embryoet har stabilisert seg (dvs. ingen ytterligere intracellulær bevegelse kan oppdages (~ 1-5 min).
- Oppdater merknaden på flisskanningsbildet om nødvendig.
6. Overvåking av veksten av bestrålte embryoer
MERK: Overvåkingen foregår over flere dager.
- Bestem overlevelsesraten ved å overvåke antall embryoer som utvikler seg etter laserablasjon og sammenlign dem med de som dør.
MERK: Noen embryoer dør umiddelbart etter ablasjon av ulike årsaker. En høy og rask dødelighet er vanligvis et tegn på upassende laserparametere eller høyere / lengre eksponering for stress under eksperimentet eller påfølgende transport. - Bestem vekstforsinkelsen ved å måle lengden på laserskuddsembryoene hver dag og sammenligne den med intakte embryoer.
MERK: Vekstraten til laserskuddorganismer er generelt langsommere enn for ubehandlede organismer. Imidlertid kan noen (upassende) laserinnstillinger hemme veksten i mer enn en uke, med vekst gjenopptas etter det. - Finn ut den tilstøtende skaden ved å overvåke reaksjonen av celler ved siden av de ablerte cellene. I noen tilfeller kan trykkavlastning etter utbrudd føre til at naboceller brister.
- Sjekk for mikrobe forurensninger. Overvåk veksten av mikroalger og bakterier i mediet. Hvis det er et uvanlig nivå av mikrober i parabolen, kast det og gjenta protokollen fra trinn 2 eller trinn 3.
MERK: Etter laserablasjon er skadede S. latissima-embryoer allerede svært stresset, og ytterligere eksternt stress kan føre til økt dødelighet. Bakterielle eller virale utbrudd er mulige fordi de behandlede embryoene ikke kan vokse under akseniske forhold. - Sjekk den globale utviklingen av skuddorganismene ved å studere fenotypen og forstå rollen i utviklingen av den målrettede regionen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Gametofytter av S. latissima ble dyrket, og gametogenese ble indusert til å produsere zygoter og embryoer. Tolv dager etter induksjonen av gametogenese gjennomgikk embryoene laserablasjon. Her hadde eksperimentet som mål å vurdere rollen til spesifikke celler i den generelle utviklingen av S. latissima-embryoer . Den mest apikale cellen, den mest basale cellen og mediancellene ble målrettet. Etter flisskanning ble hele petriskålen (figur 2A), et embryo av interesse, identifisert som en egnet kandidat for laserfotografering (figur 2B). En spesifikk celle i dette embryoet ble valgt, målrettet og skutt med en pulserende UV-laserstråle med maksimalt 40 μW lasereffekt (tilsvarende 45% av maksimal effekt for utstyret som brukes her) i 1 ms (film 1). Cellen frigjorde innholdet (kloroplaster og cytoplasma). Interessant nok reagerte tilstøtende celler på sprengningen av den bestrålte cellen ved å utvide seg inn i det intercellulære rommet. Posisjonen til de bestrålte embryoene ble registrert for påfølgende overvåking over 10 dager (figur 3). De fleste av de bestrålte embryoene fortsatte å utvikle seg, men viste vekstendring (embryoform). En detaljert analyse av de morfologiske endringene må utføres før en bestemt funksjon kan tilskrives hver bestrålt celle for å kontrollere den overordnede utviklingsmekanismen.
I motsetning til dette testet embryoer med andre laserparametere (f.eks. 33 ms for opptaksvarigheten på 60% -80% lasereffekt; Film 2) viste raskt tegn på alvorlig stress som cellebleking, falming eller formendringer (avrunding). Nesten alle embryoer skutt på denne måten døde innen fem dager etter forsøket (figur 4).
Figur 1: Fotografi av laserablasjonsmikroskopoppsettet. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Annotert flisskanning av en hel petriskål. (A) Flisskanning av hele petriskålen som brukes til laserablasjon. Overføringen PMT ble brukt til å oppnå en brightfield scan. Når et embryo av interesse er lokalisert, klikker brukeren på embryoets posisjon i flisskanningen, og programvaren plasserer scenen rett over embryoet. (B) Flisskanningen kan deretter kommenteres spesifikt for å finne embryoet i de påfølgende trinnene, for å spore og overvåke embryoet. Her viser bildet et embryo festet til bunnen av petriskålen, som enkelt kan lokaliseres ved hjelp av 561 nm laser. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Tidsserier for det voksende S. latissima-embryoet etter bestråling. Dette vises i Film 1. Laserablasjon av den mest apikale cellen i embryoet bleket ikke de tilstøtende cellene i embryoet. De fortsatte å vokse og dele seg, og dannet et normalt embryo etter noen dager. Bilder ble tatt hver 24. time, 2-9 dager etter ablasjon. Skalalinjen er 50 μm og er den samme for alle bilder. D2-D9 tilsvarer dag-2 til dag-9. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Tidsserier for S. latissima embryodød etter laserablasjon ved bruk av suboptimale parametere. Overeksponering for laserbestråling kan lett føre til høyere dødsrater for målembryoet og også de nærliggende. En tidsserie av embryoet tatt i film 2 vises, med tiden etter ablasjon angitt over hvert bilde (3-6 dager etter ablasjon). Skala bar er 30 μm og gjelder for hvert bilde. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Film 1: Laserablasjon av den mest apikale cellen i et 8-cellers embryo av S. latissima. Fokuset ble først justert på embryoet valgt blant en bukett Saccharina sporofytter (på forskjellige felt, først brede, deretter smale). Den mest apikale cellen i embryoet ble deretter skutt med 45% laserkraft i 1 ms. Den apikale cellen brøt raskt og frigjorde innholdet. De tilstøtende cellene, frigjort fra turgor av burstcellen, fylte det tomme rommet. Etter 5 minutter har cellen og dens innhold sluttet å bevege seg og har nådd en tilstand av likevekt. Filmen har blitt akselerert 4 ganger (fra 1 bilde per 632 ms til 6 fps). Oppfølging av embryoutvikling er vist i figur 3. Vennligst klikk her for å laste ned denne filmen.
Film 2: Betydelig bleking av celler ved siden av en burst-celle forårsaket av suboptimale laserinnstillinger. Bruk av en lasereffekt på 60%-80% for 1 ms eller en lasereffekt på 45% for 10 ms resulterte i betydelig bleking av tilstøtende celler og en mye lavere overlevelsesrate. Innstillingene som brukes til laseren, skal ikke forårsake bleking eller delvis skade på tilstøtende celler. De beste resultatene ble oppnådd ved å redusere effekten og/ eller varigheten av laserpulsen, og målrette mot punktet lengst fra de tilstøtende cellene. Herskytes den mest apikale cellen i et 4-cellers embryo av S. latissima (80% lasereffekt, 1 ms) (lateral / toppvisning). Overbleaching av nedre og laterale celler er lett observerbar. Den påfølgende utviklingen av embryoet er vist i figur 4. Vennligst klikk her for å laste ned denne filmen.
Supplerende figur 1: Skjematisk flytskjema for hele protokollen. Vennligst klikk her for å laste ned denne filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Lokal cellulær laserablasjon muliggjør tidsmessig og romlig ablasjon med høy presisjon. Effektiviteten kan imidlertid hindres av manglende tilgjengelighet av målceller; for eksempel er alle cellene av et tredimensjonalt embryo. Denne protokollen ble utviklet på embryoet til algen Saccharina latissima, som utvikler en monolags lamina der alle celler lett kan skilles og ødelegges individuelt med en laserstråle.
Laserkraft og bølgelengde
NIR fs-pulserende laser brukes ofte i utviklingsstudier på dyr24,25. Men når det gjelder brune alger som Saccharina, kunne laseren ikke sprenge cellen uten å brenne hele embryoet. Denne reaksjonen kan være relatert til den høye aktiviteten til kloroplastlyshøsterne.
Ved hjelp av den ns-pulserende UV-laseren for ablasjon ble to tilnærminger testet: (1) ved hjelp av en høy effektpuls over en kort periode eller (2) ved bruk av en lavere lasereksponering over en lengre periode. Energien som leveres av laseren, en kombinasjon av laserkraft og pulsvarighet, påvirker energien som leveres til den bestrålte cellen. Den leverte energien kan også påvirke de omkringliggende cellene ved refleksjon og diffraksjon. Derfor ble de laveste innstillingene av de to parameterne som ga reproduserbare resultater valgt for å redusere eventuelle uønskede sikkerhetseffekter. Lasereffekt mellom 25-40 μ W.cm-2 med en puls på 1 ms så ut til å være optimal. Ved hjelp av disse parametrene ble effekten av UV-laseren inneholdt på et svært lokalt nivå uten synlig bleking i de omkringliggende cellene, men effektiv nok til å få målcellen til å sprekke. Disse parametrene ble gjentatte ganger brukt uten noen direkte dødelig effekt på embryoene. Lengre pulstider eller høyere laserkraft forårsaket bleking av de omkringliggende cellene eller til og med død av embryoet, mens lavere verdier ikke var tilstrekkelige til å bryte celleveggen.
Algemateriale og kulturforhold
Selv om det muliggjør presis fotografering på subcellulært nivå, krever denne teknikken at eksperimentøren adresserer fire kritiske faktorer for å tillate pålitelig tolkning av resultatene. Disse punktene må vurderes både før og etter laserablasjonseksperimentet.
Den første faktoren å ta opp er embryo befolkningstetthet. Negativ trengsel påvirker utviklingshastigheten til S. latissima26. Lav tetthet gir (1) bedre pulsrepeterbarhet fordi tilstedeværelsen av andre embryoer i laserbanen kan redusere kraften, og (2) enklere overvåking av embryoene skutt av laseren, som vokser litt langsommere enn intakte embryoer; sistnevnte dekker raskt skuddembryoene. Den andre kritiske faktoren i denne protokollen er temperaturen der eksperimentet utføres. Selve laserstrålen varmer opp prøven, men temperaturen i rommet og det lokale miljøet i mikroskopet bidrar til de generelle temperaturforholdene som prøven opplever, nær 18-22 °C. Her ble mikroskopets rom ikke nedkjølt fordi dette utstyret hovedsakelig brukes til dyreceller som tåler omgivelsestemperaturer. Heldigvis var Saccharina-embryoer i stand til å motstå temperaturer på 22 ° C (9 ° C høyere enn den optimale kulturtemperaturen på 13 ° C) i opptil 4 timer. Imidlertid kan enheter for å opprettholde en lav omgivelsestemperatur, for eksempel tilstrekkelig ventilasjon eller en kjøleplateholder, bidra til å redusere risikoen for bivirkninger på overlevelse og utvikling av algeembryoene. Videre kan langsom pre-akklimatisering av gametofytter til 16 ° C under rødt lys hjelpe embryoene til å motstå temperaturpigger under ablasjonsprosessen. For det tredje, i tillegg til temperaturøkningen, blir embryoene fratatt en passende lyskilde i løpet av forsøket. Videre kan kloroplastene delvis blekes av 561 nm laseren. Bruk av lavest mulig effekt på 561 nm laser bidrar til å redusere denne effekten. For det fjerde er transport også en kritisk faktor å ta hensyn til fordi laserablasjonsutstyr ikke er tilgjengelig i alle laboratorier. Temperaturpigger og eksterne bevegelser eller støt bør unngås for å forhindre algematerialets løsrivelse, tap eller død. Når det er mulig, må transportboksene oppbevares i kjøleskap, være vibrasjonsbestandige (f.eks. støtabsorberende skum) og utstyrt med lys. Flere transportkasser som oppfyller disse kravene er kommersielt tilgjengelige.
Selv om alle disse faktorene kontrolleres så mye som mulig, kan det fortsatt oppstå svak, men potensielt betydelig miljøbelastning. Denne muligheten må vurderes ved analyse og tolkning av embryoresponsen på laserablasjon.
I tillegg til miljøforholdene som må holdes stabile gjennom hele forsøket, er det også en utfordring å holde oversikt over de bestrålte organismene gjennom hele overvåkingstrinnet. Veksten av de forskjellige embryoene endrer det opprinnelige landskapet over tid. Med mindre et automatisert mikroskop kan være dedikert til å overvåke eksperimentet, kan det lett bli tidkrevende å følge embryoet etter laserablasjon og generere store mengder data. Videoopptak under den første laserablasjonspulsen anbefales på det sterkeste for å spore embryoets umiddelbare reaksjon på pulsen. Denne raske overvåkingen av pulspåvirkningen er av betydelig betydning fordi pulsen i noen tilfeller, når den ble målrettet mot midten av cellen, førte til at målcellen brister raskt, mest sannsynlig på grunn av forskjellen i osmolaritet mellom cellens indre og mediet (sjøvann). Når lekkasjen var for rask, sprakk også nabocellene. Skyting på den mest distale regionen av den målrettede cellen viste seg å være en effektiv måte å buffere burst-effekten på noen tilstøtende celler. En annen effektiv måte å unngå voldelige utbrudd på er å øke osmolariteten til mediet med sukrose27. Forskjellen i osmolaritet er imidlertid nødvendig for å eliminere innholdet i den målrettede cellen. Dermed er det nødvendig å opprettholde tilstrekkelig osmolaritetspotensial. I noen få tilfeller hindret kloroplaster og andre forbindelser åpningen laget av laserablasjonen, noe som resulterte i at celler gjenopprettet fra laserskuddet, med vekst gjenopptatt etter noen dager. Ytterligere pulser rettet mot å lukke åpningen viste seg å være tilstrekkelig til å forhindre obstruksjon.
Begrensninger
Det må gjøres en avveining mellom laserkraft, som skal være høy nok til å få cellene til å tømme innholdet, og overlevelsen til nabocellene, som i algeembryoer er spesielt følsomme for varmestress og fotobleking. Derfor er nøye overvåking av cellene etter laserskuddet nøkkelen til å kontrollere dette trinnet og sikre at målcellene er døde. Ellers kan tolkningen av de målrettede cellene på skjebnen til nabocellene, og dermed den etterfølgende utviklingen av embryoet, være misvisende.
Punktering av celler med en nål kan synes å være et alternativ der algecellene ikke vil oppleve varme eller lett stress. Imidlertid vil denne tilnærmingen være utfordrende fordi brune algembryoceller vokser nedsenket i sjøvann og ikke har kontakt med noen solid overflate. Den tykke og elastiske celleveggen motstår nåletrenetrering selv når embryoet holdes i kontakt med en solid glassoverflate ved hjelp av en mikromanipulator i et standard mikroinjeksjonssystem.
Oppsummert beskriver denne protokollen den komplette eksperimentelle prosedyren og innstillingene for laserablasjon og overvåking av brune algeembryoer og de kritiske trinnene for et vellykket eksperiment (supplerende figur 1). Denne unike tilnærmingen er en lovende metode for å studere celleinteraksjoner og celle skjebne i de tidlige embryoene av brune alger.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
S.B.s ph.d.-stipend er finansiert av Region Bretagne (ARED-stipendnummer COH20020) og Sorbonne Université. I.T.is ph.d.-stipend finansieres av Region Bretagne (ARED-stipendnummer COH18020) og NMBU-universitetet. Dette prosjektet har mottatt økonomisk støtte fra CNRS gjennom MITI tverrfaglige programmer. MRic er medlem av den nasjonale infrastrukturen France-BioImaging støttet av det franske nasjonale forskningsbyrået (ANR-10-INBS-04).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 25 mm glass bottom petri dish | NEST | 801001 | |
| Autoclaved sea water | - | Collected offshore near the Astan buoy (48°44.934 N 003°57.702 W) close to Roscoff, France, at a depth of 20 m. | |
| Cell scraper | MED 2 | 83.3951 | |
| Cell strainer 40 µm | Corning / Falcon | 352340 | |
| Culture cabinets | Snijders Scientific Plant Growth Cabinet ECD01 | Any other brand is suitable provided that the light intensity, the photoperiod and the temperature can be controlled. | |
| LSM 880 Zeiss confocal microscope | Carl Zeiss microscopy, Jena, Germany | Ablation and imaging were performed using a 40x/1.2 water objective | |
| Pellet pestles | Sigma Aldrich | Z359947 | Blue polypropylene (autoclavable) |
| Provasoli supplement | - | Recipe is available here: http://www.sb-roscoff.fr/sites/www.sb-roscoff.fr/files/documents/station-biologique-roscoff-preparation-du-provasoli-2040.pdf | |
| Pulsed 355 laser (UGA-42 Caliburn 355/25) | Rapp OptoElectronic, Wedel, Germany | ||
| Scalpel | Paramount | PDSS 11 | |
| SysCon software | Rapp OptoElectronic, Wedel, Germany | Laser-driver software | |
| ZEN software | Carl Zeiss microscopy, Jena, Germany | Imaging software, used together with the SysCon software; Black 2.3 version |
References
- Montell, D. J., Keshishian, H., Spradling, A. C. Laser ablation studies of the role of the Drosophila oocyte nucleus in pattern formation. Science. 254 (5029), New York, N.Y. 290-293 (1991).
- Shivakumar, P. C., Lenne, P. F. Laser ablation to probe the epithelial mechanics in drosophila. Methods In Molecular Biology. 1478, 241-251 (2016).
- Bargmann, C. I., Avery, L. Laser killing of cells in Caenorhabditis elegans. Modern Biological Analysis of an Organism. 48, 225-250 (1995).
- Fouad, A. D., Liu, A., Du, A., Bhirgoo, P. D., Fang-Yen, C. Thermal laser ablation with tunable lesion size reveals multiple origins of seizure-like convulsions in Caenorhabditis elegans. Scientific Reports. 11 (1), 5084 (2021).
- Johnson, C. S., Holzemer, N. F., Wingert, R. A. Laser ablation of the zebrafish pronephros to study renal epithelial regeneration. Journal of Visualized Experiments. (54), e2845 (2011).
- Mondia, J. P., Adams, D. S., Orendorff, R. D., Levin, M., Omenetto, F. G. Patterned femtosecond-laser ablation of Xenopus laevis melanocytes for studies of cell migration, wound repair, and developmental processes. Biomedical Optics Express. 2 (8), 2383-2391 (2011).
- Reinhardt, D., Frenz, M., Mandel, T., Kuhlemeier, C. Microsurgical and laser ablation analysis of leaf positioning and dorsoventral patterning in tomato. Development. 132 (1), 15-26 (2005).
- Berg, C., Hage, W., Weisbeek, P., Scheres, B. Laser ablation in Arabidopsis roots: a tool to study cell-to-cell communication. Cellular integration of signalling pathways in plant development. Proceedings of the NATO Advanced Study Institute. , https://eurekamag.com/research/003/488/003488317.php 237-250 (1998).
- Berger, F., Taylor, A., Brownlee, C. Cell fate determination by the cell wall in early fucus development. Science. 263 (5152), New York, N.Y. 1421-1423 (1994).
- Bouget, F. Y., Berger, F., Brownlee, C. Position dependent control of cell fate in the Fucus embryo: role of intercellular communication. Development. 125 (11), 1999-2008 (1998).
- Bringloe, T., et al. Phylogeny and evolution of the brown algae. Critical Reviews in Plant Sciences. 39 (4), 281-321 (2020).
- Saifullah, S., Olsen, Y., Surilayani, D., Handå, A. Carbohydrate of the brown seaweed, saccharina latissima: a review. Joint proceedings of the 2nd and the 3rd International Conference on Food Security Innovation (ICFSI 2018-2019). , 180-182 (2021).
- Zhang, X., Thomsen, M. Techno-economic and environmental assessment of novel biorefinery designs for sequential extraction of high-value biomolecules from brown macroalgae Laminaria digitata, Fucus vesiculosus, and Saccharina latissima. Algal Research. 60, 102499 (2021).
- Kanda, T. On the gametophytes of some japanese species of laminariales. Scientific papers of the Institute of Algological Research, Faculty of Science. 1 (2), Hokkaido Imperial University. 221-260 (1936).
- Fritsch, F. E. The structure and reproduction of the algae. Volume 2. , Cambridge University Press. Cambridge. (1945).
- Bartsch, I., et al. The genus Laminaria sensu lato : recent insights and developments. European Journal of Phycology. 43 (1), 1-86 (2008).
- Theodorou, I., Charrier, B. Chapter 2: Brown algae: ectocarpus and saccharina as experimental models for developmental biology. Handbook of Marine Model Organisms in Experimental Biology - Established and Emerging. Boutet, A., Schierwater, B. , Francis & Taylor Group, CRC Press. ISBN 9780367444471 485 (2021).
- Drew, G. H. The reproduction and early development of laminaria digitata and laminaria saccharina. Annals of Botany. 24 (1), 177-189 (1910).
- Yendo, K. The development of costaria, undaria, and laminaria. Annals of Botany. 25 (99), 691-715 (1911).
- Forbord, S., Steinhovden, K., Rød, K., Handå, A., Skjermo, J. Cultivation protocol for Saccharina latissima. Protocols for Macroalgae Research. Charrier, B., Wichard, T., Reddy, C. R. K. , CRC Press, Francis & Taylor Group. ISBN-10: 14986427. ISBN-13: 978-1498796422 37-59 (2018).
- Bartsch, I. Derivation of clonal stock cultures and hybridization of kelps. Protocols for Macroalgae Research. Charrier, B., Wichard, T., Reddy, C. R. K. , CRC Press, Francis & Taylor Group. ISBN-10: 149879627. ISBN-13: 978-1498796422 61-78 (2018).
- Theodorou, I., Opsahl-Sorteberg, H. -G., Charrier, B. Preparation of zygotes and embryos of the kelp saccharina latissima for cell biology approaches. Bio-protocol. 101, 4132 (2021).
- Lüning, K., Dring, M. J. Reproduction induced by blue light in female gametophytes of Laminaria saccharina. Planta. 104 (3), 252-256 (1972).
- de Medeiros, G., et al. Cell and tissue manipulation with ultrashort infrared laser pulses in light-sheet microscopy. Scientific Reports. 10 (1), 1942 (2020).
- Liang, X., Michael, M., Gomez, G. A. Measurement of mechanical tension at cell-cell junctions using two-photon laser ablation. Bio-protocol. 6 (24), 2068 (2016).
- Ebbing, A., Pierik, R., Bouma, T., Kromkamp, J. C., Timmermans, K. How light and biomass density influence the reproduction of delayed Saccharina latissima gametophytes (Phaeophyceae). Journal of Phycology. 56 (3), 709-718 (2020).
- Rabillé, H., Billoud, B., Tesson, B., Le Panse, S., Rolland, É, Charrier, B. The brown algal mode of tip growth: Keeping stress under control. PLoS Biology. 17 (1), 2005258 (2019).
