Summary
Embriyodaki spesifik hücrelerin yok edilmesi, hücre kaderinde yer alan hücresel etkileşimleri incelemek için güçlü bir araçtır. Mevcut protokol, kahverengi alg Saccharina latissima'nın erken embriyosundaki hedeflenen hücrelerin lazer ablasyonu için teknikleri açıklamaktadır.
Abstract
Saccharina latissima'da embriyo, lamina veya bıçak adı verilen tek katmanlı bir hücre tabakası olarak gelişir. Her embriyo hücresinin gözlemlenmesi kolaydır, komşularından kolayca ayırt edilebilir ve ayrı ayrı hedeflenebilir. Onlarca yıldır, lazer ablasyon embriyo gelişimini incelemek için kullanılmıştır. Burada, kahverengi alg S. latissima'nın erken embriyoları için hücreye özgü lazer ablasyon için bir protokol geliştirilmiştir. Sunulan çalışma şunları içerir: (1) kültür koşulları da dahil olmak üzere kritik parametrelerin bir açıklaması ile Saccharina embriyolarının hazırlanması, (2) lazer ablasyon ayarları ve (3) ışınlanmış embriyonun sonraki büyümesinin hızlandırılmış mikroskopi kullanılarak izlenmesi. Ek olarak, embriyoların görüntüleme platformundan laboratuvara geri taşınması için en uygun koşullar hakkında ayrıntılar sağlanır ve bu da sonraki embriyo gelişimini derinden etkileyebilir. Laminariales takımına ait algler, Saccharina'ya benzer embriyogenez kalıpları gösterir; Bu protokol, bu taksondaki diğer türlere kolayca aktarılabilir.
Introduction
Lazer ablasyon, embriyo gelişimini incelemek için onlarca yıldır kullanılmaktadır. Embriyo hücrelerinin bir lazer ışını ile ışınlanması, embriyogenez sırasında rejeneratif potansiyeli ve hücre soyunun modifikasyonunu izlemeyi ve hedeflenen ablasyonun hücre bölünmesi ve hücre kaderi üzerindeki etkisini araştırmayı mümkün kılar. Lazer ablasyon yöntemlerinde kullanılan model organizmalar tipik olarak böcekler1,2, nematodlar3,4, omurgalılar5,6 ve bazen debitkiler 7,8 gibi hayvanlardır. Ek olarak, 1994 ve 1998 yıllarında kahverengi alg Fucus üzerinde bir lazer mikro-ablasyon yaklaşımı, hücre duvarının erken embriyonun fotopolarizasyonundaki rolünü göstermek için kullanılmıştır 9,10.
Kahverengi algler, 1.6 milyar yıl önce ökaryotik ağacın kökünde ayrılan Stramenopiles grubuna aittir. Sonuç olarak, hayvanlar ve bitkiler gibi diğer çok hücreli organizmalardan filogenetik olarak bağımsızdırlar11. Saccharina latissima, daha yaygın olarak yosun olarak bilinen Laminariales takımına aittir ve dünyadaki en büyük organizmalar arasındadır, 30 m'nin üzerindeki boyutlara ulaşırlar. Saccharina sp., gıda ve yem gibi birçok uygulama için kullanılan büyük bir deniz yosunudur ve polisakkaritleri dünya çapında tarım, farmakolojik ve kozmetik endüstrilerinde kullanılmak üzere ekstrakte edilir12, 13. Özellikle Asya'da ve daha yakın zamanda Avrupa'da yetiştirilmesi, yavruları açık denizde serbest bırakmadan önce kuluçkahanelerde embriyoların hazırlanmasını gerektirir. Tüm kelpler gibi, bir haploid gametofitin büyüdüğü ve döllenme için gametler ürettiği mikroskobik bir gametofitik fazdan oluşan bifazik bir yaşam döngüsüne ve büyük bir düzlemsel bıçağın deniz tabanına veya kayalara tutturulmuş tutucusundan geliştiği diploid makroskopik bir sporofitik faza sahiptir. Sporofit, olgunlukta haploid sporları serbest bırakır, böylece yaşam döngüsü14,15,16'yı tamamlar.
S. latissima bazı ilginç morfolojik özellikler sunar17. Embriyosu, farklı doku tiplerinin ortaya çıkmasıyla çakışan çok katmanlı bir yapı elde etmeden önce tek katmanlı bir düzlemsel tabaka15,18,19 olarak gelişir. Ek olarak, Laminariales, embriyoları maternal gametofitik dokularına bağlı kalan kahverengi alglerin tek taksonlarından biridir (Desmarestiales ve Sporochnales de15). Bu özellik, maternal dokunun bu gelişimsel süreçteki rolünü inceleme ve kahverengi alglerdeki maternal kontrol mekanizmalarını hayvanlardaki ve bitkilerdeki mekanizmalarla karşılaştırma fırsatı sunar.
Bu makalede, erken bir kelp embriyosunda lazer ablasyon için ilk tam protokol sunulmaktadır. UV ns-pulsed tekniğini içeren bu protokol, embriyogenez sırasında kendi rollerini incelemek için bireysel embriyo hücrelerinin spesifik yıkımına neden olur. Prosedür, Laminariales'te embriyogenez sırasında hücre etkileşimlerini ve hücre kaderini araştırmak için güvenilir bir yaklaşım sunar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Saccharina latissima gametophytes üretimi
- S. latissima'nın olgun sporofitlerini daha önce tarif edildiği gibi vahşi doğadan toplayın20,21. Seçilen sporofitlerin epifitlerden (bıçağın yüzeyinde görülebilen küçük organizmalar) veya iç parazitlerden (ağartılmış alanlarda veya bıçaktaki lekelerde bulunur) bulunmadığından emin olun.
- Bir neşter kullanarak, bıçağın ortasındaki en koyu kısmı (verimli spor üreten doku22) 1-5 kare parçaya (1 cm²) kesin, varsa ağartılmış lekelerden kaçının.
- Kesilen parçaları bir neşterin arkası ve biraz emici kağıtla nazikçe temizleyerek kalan epifitleri çıkarın.
- Temizlenmiş parçaları, daha önce yayınlanan rapor22'yi takiben sporları serbest bırakmak için steril doğal deniz suyuyla dolu bir cam kaba (bakınız Malzeme Tablosu) 45 dakika boyunca yerleştirin.
- Bıçak parçalarını çıkarın ve kalıntıları veya istenmeyen organizmaları temizlemek için deniz suyunu 40 μm'lik bir hücre süzgecinden süzün.
- Filtrat içindeki sporları plastik Petri kaplarında 20-40 spor / mL konsantrasyonuna kadar seyreltin22.
- Spor çözeltisini, optimum kültür koşullarıyla (13 °C, 24 μE.m-2.s-1, fotoperiyot 16:8 L:D) yapılandırılmış bir kültür kabinine (bkz. Malzeme Tablosu) yerleştirin.
- Sporların çimlenmesine ve gametofitlere dönüşmesine izin verin.
NOT: Spor çimlenmesi kabinde 2 gün sonra görülebilir ve gametofitik hücrelerin ilk hücre bölünmesi genellikle takip eden 48 saat içinde gerçekleşir. - 5 gün sonra büyüme ortamını, 0,5x Provasoli çözeltisi (NSW1/2) ile zenginleştirilmiş mikro filtrelenmiş doğal deniz suyuyla değiştirin (bkz.
NOT: Bu adımların tekrarlanmasını önlemek için, belirli erkek ve dişi gametofitler seçilebilir ve birkaç ay boyunca vejetatif olarak çoğaltılabilir. Gametofitler, yukarıda açıklanan aynı kültür koşullarında kırmızı ışık altında (en az 580 nm dalga boyuna sahip 4 μE.m-2.s-1)23 yetiştirildiğinde vejetatif kalır (adım 1.7).
2. Oogenezin parçalanması ve indüksiyonu
- Gametofitleri bir hücre kazıyıcı ile hasat edin.
- Küçük bir plastik havane kullanarak, toplanan gametofitleri 1.5 mL'lik bir tüpte 4-5 hücreli parçalara ayırın.
- Tüpü 1 mL NSW1/2 ile doldurun (adım 1.9).
- 1x Provasoli çözeltisi (NSW) ile zenginleştirilmiş 3 mL doğal deniz suyuna 2,5 μL ezilmiş gametofit çözeltisi ekleyin ve bir Petri kabına yerleştirin.
NOT: Daha kolay kullanım için 25 mm, cam tabanlı Petri kabı önerilir. - Hazırlanan yemekleri bir kültür dolabına yerleştirin ve 24 μE.m-2.s-1 (loş ışık, fotoperiyot 16:8 L:D) şiddetinde beyaz ışık altında 13 °C'de gametogenezi indükleyin.
NOT: İlk gametangia (dişi oogonia ve erkek arkegoni) 5 gün sonra gözlemlenebilir. Erkek küçük hücrelerle hiper-dallıdır ve dişi uzun filamentler oluşturan daha büyük hücrelerden oluşur15,22. İlk yumurtalar ~ 10 gün sonra gözlenir ve zigotların ilk bölünmesi genellikle takip eden 2 gün içinde gerçekleşir. - İlk yumurtaları gözlemledikten altı gün sonra, bulaşıkları daha parlak beyaz ışık koşullarına aktarın: 50 μE.m-2.s-1, fotoperiyot 16: 8 L: D, hala 13 ° C'de.
3. Ablasyon için embriyo seçimi ve sonraki büyümenin izlenmesi için görüntü elde etme
- Ablasyon adımı sırasında seçilen embriyoları (yeniden) bulmak için tüm Petri kabını görüntüleyin (çanağı oküler mikroskopa geri döndürmeye gerek yoktur) ve seçilen embriyoların sonraki gelişimini izleyin.
NOT: Görüntüleme için ters çevrilmiş lazer taramalı konfokal mikroskop kullanın ( bkz. Malzeme Tablosu) (Şekil 1) ve lazer ablasyonu adım 5'te açıklanmıştır. - Petri kabını sahneye yerleştirin ve görsel bir işaretle yönlendirin (örneğin; kalıcı bir işaretleyici ile bir çizgi çizin).
- Bir embriyoya odaklanmak için 10x/0.45 hedefini kullanın. Petri kabının dört kardinal noktasının konumunu kaydedin.
- Kutucuk taramasını başlatın. Tüm Petri kabının iletimli/floresan görüntülerini düşük çözünürlükte elde edin: 256 x 256 piksel, çift yönlü tarama ile 1,54 μs piksel bekleme süresi ve %1,2 iletimde 561 nm lazer kullanarak 0,6x dijital yakınlaştırma.
NOT: 2,5 cm'lik bir Petri kabının tamamı için tarama süresi 225 karo için ~6 dakikadır (Şekil 2). Burada, iletim ve floresan görüntüleme için 561 nm lazer kullanıldı. Floresan sinyali, konfokal fotoçarpanlar (PMT) üzerinde 580-720 nm arasında toplandı ve iletilen ışık, iletilen PMT üzerinde toplandı. 561 nm lazer bu adımda klorofili de izleyebilir, ancak gereksizdir çünkü sadece sinyal gürültüsünü ve organizmaları doğru bir şekilde ayırt etmeye yardımcı olur. - Kutucuk tarama görüntüsünü kaydedin ve görüntü alma yazılımı penceresinde açık tutun (bkz.
- Hedefi değiştirin, Petri kabını çıkarmayın.
NOT: 40x/1.2 su hedefi, Petri kabını ilk konumundan hareket ettirmeden hedefe daldırma ortamının (su) eklenebilmesi için sahnenin yan tarafına taşındı. - Uygun embriyoyu seçmek için daha önce edinilen karo tarama görüntüsünde gezinin. Bu görüntüde bir embriyo tanımlandıktan sonra, sahneyi embriyonun tam konumuna getirin ve bu embriyonun iletilmiş / floresan görüntülerini yüksek çözünürlükte elde edin.
NOT: Yüksek çözünürlüklü ayarlar: 512 x 512 piksel, 0,130 μm/piksel, tek yönlü tarama ile 0,208 μs piksel bekleme süresi ve %0,9 iletimde 561 nm lazer kullanarak 2x dijital yakınlaştırma. - Lazer ablasyon için her embriyo adayı için karo tarama görüntüsüne açıklama ekleyin (Şekil 2B) ve lazer ablasyon adımına geçin.
4. Lazer kalibrasyonu
- Lazeri kalibre edin ve görüntü alma yazılımını "Click & Fire modu" ndaki lazer sürücüsü yazılımı ve darbeli 355 nm lazer ile senkronize edin.
NOT: Bu adım, fare imlecinin lazer sürücüsü yazılımındaki konumu ( bkz. Malzeme Tablosu) ile edinme yazılımının canlı görüntüsündeki konumu arasında mükemmel senkronizasyon sağlamak için çok önemlidir. - Lazer sürücüsü yazılım paketini açın ve görüntü alma yazılım paketinde Canlı'ya tıklayın.
- Lazer sürücüsü yazılım paketinde Edinmeyi başlat'a tıklayarak her iki yazılım paketini de senkronize edin. Canlı görüntü artık UV lazer sürücüsü yazılımına da kaydedilmektedir.
- AOI Seç düğmesine tıklayarak ve UV lazer sürücüsü yazılım paketindeki görüntünün kenarlarına (sağ, sol, üst ve alt) tıklayarak bir ilgi alanı (AOI) tanımlayın.
NOT: Bu kalibrasyon adımından sonra, edinme yazılım paketindeki piksel boyutu, görüntü formatı ve yakınlaştırma ayarları sabit kalmalıdır. - Çanak üzerinde boş bir alan seçin ve cam tabana odaklanmak için sahne alanının seviyesini numune odak düzleminin 20 μm altına indirin.
- Kalibrasyonu başlat'a tıklayarak ablasyon lazerini ve görüntüleme lazer yörüngelerini ayarlayın ve Manuel kalibrasyon'u seçin.
- Canlı görüntünün ortasında, cam kapak kapağındaki deliğe karşılık gelen siyah bir nokta görecek kadar yüksek bir lazer gücü seçin (tüm deklanşörler açık olmalıdır).
- Fare imleci ile bu merkezi siyah noktaya tıklayın ve hizalama prosedürünü tamamlamak için yazılım tarafından önerilen 18 ek noktaya tıklayın.
- Aynı kapak kapağındaki "Click & Fire modu"ndaki kalibrasyonu kontrol edin.
NOT: Lazer kalibrasyonu görüntüleme parametrelerine bağlıdır. Lazer kalibre edildikten sonra, görüntüleme parametrelerinin (yani, 512 x 512 piksel, 0,130 μm / piksel, tek yönlü tarama ve 2x dijital yakınlaştırma ile 0,208 μs piksel bekleme süresi) değişmediğinden emin olun.
5. Lazer ablasyon
- İlgilendiğiniz bir embriyoyu seçin. Görüntü alma yazılımında hızlandırılmış bir kayıt başlatın.
- Yüksek çözünürlükte 40x/1,2 W objektifle iletilmiş/floresan görüntüler elde edin (yani, 512 x 512 piksel, 0,130 μm/piksel, mono-yönlü tarama ile 1,54 μs piksel bekleme süresi ve %0,9 iletimde 561 nm lazer kullanarak 2x dijital yakınlaştırma). Hızlandırılmış kaydı maksimum hızda alın.
- Hızlandırılmış kaydın başlangıcında alanı uzaklaştırın. AOI'yi yakınlaştırın.
- Embriyodaki ilgili hücreye zararlı ışınlamayı uygulamak için lazer sürücüsü yazılımının "Click & Fire" işlevini kullanın. Aşağıdaki parametreleri kullanın:% 45 lazer iletimi (maksimum 40 μW'ye karşılık gelir) ve 1 ms darbe süresi (adım 4).
NOT: Lazer çekimi sırasında video kaydı önerilir. - 688 nm altında, otofloresan kloroplastların sitoplazmadan atılmasını izleyin.
- Hücre içeriği hücrede kalırsa, hücredeki ihlalin boyutunu artırmak için "Click & Fire" işlevini bir kez daha kullanın. Hücre içeriğinin çoğu serbest bırakılana kadar çekim sayısını minimumda tutarak tekrarlayın.
- Embriyo stabilize olduktan sonra hızlandırılmış kaydı durdurun (yani, başka hücre içi hareket tespit edilemez (~ 1-5 dakika).
- Gerekirse kutucuk tarama görüntüsündeki ek açıklamayı güncelleyin.
6. Işınlanmış embriyoların büyümesinin izlenmesi
NOT: İzleme birkaç gün boyunca gerçekleştirilir.
- Lazer ablasyondan sonra gelişen embriyo sayısını izleyerek hayatta kalma oranını belirleyin ve bunları ölenlerle karşılaştırın.
NOT: Bazı embriyolar ablasyondan hemen sonra çeşitli nedenlerle ölür. Yüksek ve hızlı bir ölüm oranı genellikle uygun olmayan lazer parametrelerinin veya deney veya sonraki taşıma sırasında strese daha yüksek / daha uzun süre maruz kalmanın bir işaretidir. - Her gün lazerle vurulan embriyoların uzunluğunu ölçerek ve bozulmamış embriyolarla karşılaştırarak büyüme gecikmesini belirleyin.
NOT: Lazerle vurulmuş organizmaların büyüme hızı genellikle tedavi edilmemiş organizmalarınkinden daha yavaştır. Bununla birlikte, bazı (uygunsuz) lazer ayarları bir haftadan fazla büyümeyi engelleyebilir ve bundan sonra büyüme devam eder. - Ablatlanmış hücrelere bitişik hücrelerin reaksiyonunu izleyerek bitişik hasarı bulun. Bazı durumlarda, patlama sonrası basınçsızlaştırma komşu hücrelerin patlamasına neden olabilir.
- Mikrop kontaminasyonlarını kontrol edin. Ortamdaki mikroalglerin ve bakterilerin büyümesini izleyin. Çanakta alışılmadık bir mikrop seviyesi varsa, atın ve protokolü adım 2 veya adım 3'ten tekrarlayın.
NOT: Lazer ablasyondan sonra, hasarlı S. latissima embriyoları zaten oldukça streslidir ve ek dış stres mortalitenin artmasına neden olabilir. Bakteriyel veya viral salgınlar mümkündür, çünkü tedavi edilen embriyolar aksenik koşullarda büyüyemez. - Fenotipi inceleyerek ve hedeflenen bölgenin gelişimindeki rolünü anlayarak atış organizmalarının küresel gelişimini kontrol edin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
S. latissima'nın gametofitleri yetiştirildi ve gametogenez, zigot ve embriyo üretmek için indüklendi. Gametogenezin indüksiyonundan on iki gün sonra, embriyolara lazer ablasyon uygulandı. Burada deney, S. latissima embriyolarının genel gelişiminde spesifik hücrelerin rolünü değerlendirmeyi amaçladı. En apikal hücre, en bazal hücre ve medyan hücreler hedef alındı. Karo taramasından sonra, ilgilenilen bir embriyo olan Petri kabının tamamı (Şekil 2A), lazer atışı için uygun bir aday olarak tanımlanmıştır (Şekil 2B). Bu embriyonun belirli bir hücresi, 1 ms için maksimum 40 μW lazer gücüne (burada kullanılan ekipman için maksimum gücün% 45'ine karşılık gelen) darbeli bir UV lazer ışını ile seçildi, hedeflendi ve vuruldu (Film 1). Hücre içeriğini serbest bıraktı (kloroplastlar ve sitoplazma). İlginç bir şekilde, bitişik hücreler, ışınlanmış hücrenin patlamasına, hücreler arası boşluğa genişleyerek yanıt verdi. Işınlanan embriyoların pozisyonu 10 gün boyunca daha sonraki izleme için kaydedildi (Şekil 3). Işınlanmış embriyoların çoğu gelişmeye devam etti, ancak büyüme değişikliği gösterdi (embriyo şekli). Genel gelişim mekanizmasını kontrol etmede ışınlanan her hücreye belirli bir fonksiyon atfedilmeden önce morfolojik değişikliklerin ayrıntılı bir analizinin yapılması gerekir.
Buna karşılık, embriyolar diğer lazer parametreleriyle test edilmiştir (örneğin; %60-%80 lazer gücünün çekim süresi için 33 ms; Film 2) hızlı bir şekilde hücre ağartması, solma veya şekil değişiklikleri (yuvarlama) gibi ciddi stres belirtileri gösterdi. Bu şekilde vurulan embriyoların neredeyse tamamı deneyden sonraki beş gün içinde öldü (Şekil 4).
Resim 1: Lazer ablasyon mikroskobu kurulumunun fotoğrafı. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Resim 2: Bütün bir Petri kabının açıklamalı karo taraması. (A) Lazer ablasyon için kullanılan tüm Petri kabının karo taraması. İletim PMT'si parlak alan taraması elde etmek için kullanıldı. İlgilenilen bir embriyo bulunduktan sonra, kullanıcı embriyonun karo taramasındaki konumuna tıklar ve yazılım aşamayı doğrudan embriyonun üzerine yerleştirir. (B) Karo taraması daha sonra embriyoyu sonraki adımlarda bulmak, embriyoyu izlemek ve izlemek için özel olarak açıklama eklenebilir. Burada, görüntü Petri kabının dibine tutturulmuş ve 561 nm lazer kullanılarak kolayca bulunabilen bir embriyoyu göstermektedir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Işınlama sonrası büyüyen S. latissima embriyosunun zaman serisi. Bu, Film 1'de gösterilir. Embriyonun en apikal hücresinin lazer ablasyonu, embriyonun bitişik hücrelerini ağartmadı. Birkaç gün sonra normal bir embriyo oluşturarak büyümeye ve bölünmeye devam ettiler. Görüntüler her 24 saatte bir, ablasyondan 2-9 gün sonra çekildi. Ölçek çubuğu 50 μm'dir ve tüm fotoğraflar için aynıdır. D2-D9, gün-2'den gün-9'a karşılık gelir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: Suboptimal parametreler kullanılarak lazer ablasyon sonrası S. latissima embriyo ölümünün zaman serileri. Lazer ışınlamasına aşırı maruz kalmak, hedef embriyonun ve ayrıca komşu embriyonun daha yüksek ölüm oranlarına kolayca yol açabilir. Film 2'de çekilen embriyonun bir zaman serisi, her fotoğrafın üzerinde belirtilen ablasyondan sonraki süre (ablasyondan 3-6 gün sonra) ile gösterilir. Ölçek çubuğu 30 μm'dir ve her fotoğraf için geçerlidir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Film 1: S. latissima'nın 8 hücreli embriyosunun en apikal hücresinin lazerle ablasyonu. Odak noktası ilk önce bir buket Saccharina sporofiti arasından seçilen embriyo üzerinde ayarlandı (farklı alanlarda, önce geniş, sonra dar). Embriyonun en apikal hücresi daha sonra 1 ms için% 45 lazer gücü kullanılarak vuruldu. Apikal hücre hızla patladı ve içeriğini serbest bıraktı. Patlama hücresinin turgorundan kurtulan bitişik hücreler boş alanı doldurdu. 5 dakika sonra, hücre ve içeriği hareket etmeyi bırakmış ve denge durumuna ulaşmıştır. Film 4 kez hızlandırıldı (632 ms'de 1 görüntüden 6 fps'ye). Embriyo gelişiminin takibi Şekil 3'te gösterilmiştir. Bu Filmi indirmek için lütfen tıklayınız.
Film 2: Optimal olmayan lazer ayarlarının neden olduğu bir patlama hücresine bitişik hücrelerin önemli ölçüde ağartılması. 1 ms için% 60-% 80'lik bir lazer gücü veya 10 ms için% 45'lik bir lazer gücü kullanmak, bitişik hücrelerin önemli ölçüde ağartılmasına ve çok daha düşük bir hayatta kalma oranına neden oldu. Lazer için kullanılan ayarlar beyazlatmaya veya bitişik hücrelere kısmi hasara neden olmamalıdır. En iyi sonuçlar, lazer darbesinin gücünü ve / veya süresini azaltarak ve bitişik hücrelerden en uzak noktayı hedefleyerek elde edildi. Burada, 4 hücreli bir S. latissima embriyosunun en apikal hücresivurulur (% 80 lazer gücü, 1 ms) (yanal / üstten görünüm). Alt ve lateral hücrelerin aşırı ağartılması kolayca gözlemlenebilir. Embriyonun sonraki gelişimi Şekil 4'te gösterilmiştir. Bu Filmi indirmek için lütfen tıklayınız.
Ek Şekil 1: Tüm protokolün şematik akış şeması. Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Lokal hücresel lazer ablasyon, yüksek hassasiyetle zamansal ve mekansal ablasyona izin verir. Bununla birlikte, etkinliği hedef hücrelerin erişilememesi nedeniyle engellenebilir; örneğin, tüm hücreler üç boyutlu bir embriyoya aittir. Bu protokol, tüm hücrelerin bir lazer ışını ile ayrı ayrı kolayca ayırt edilebileceği ve yok edilebileceği tek katmanlı bir lamina geliştiren alg Saccharina latissima'nın embriyosu üzerinde geliştirilmiştir.
Lazer gücü ve dalga boyu
NIR fs darbeli lazer, hayvanlar üzerinde yapılan gelişimsel çalışmalarda yaygın olarak kullanılmaktadır24,25. Bununla birlikte, Saccharina gibi kahverengi algler söz konusu olduğunda, lazer tüm embriyoyu yakmadan hücreyi patlatamazdı. Bu reaksiyon, kloroplast hafif biçerdöverlerin yüksek aktivitesi ile ilgili olabilir.
Ablasyon için ns-pulsed UV lazer kullanılarak, iki yaklaşım test edildi: (1) kısa bir süre boyunca yüksek güçlü bir darbe kullanarak veya (2) daha uzun bir süre boyunca daha düşük bir lazer maruziyeti kullanarak. Lazer gücü ve darbe süresinin bir kombinasyonu olan lazer tarafından verilen enerji, ışınlanmış hücreye verilen enerjiyi etkiler. Verilen enerji, çevredeki hücreleri yansıma ve kırınım yoluyla da etkileyebilir. Bu nedenle, tekrarlanabilir sonuçlar veren iki parametrenin en düşük ayarları, istenmeyen yan etkileri azaltmak için seçilmiştir. 1 ms'lik bir darbe ile 25-40 μ W.cm-2 arasındaki lazer gücünün optimal olduğu ortaya çıktı. Bu parametreleri kullanarak, UV lazerin etkisi, çevredeki hücrelerde gözle görülür bir ağartma olmadan, ancak hedef hücrenin patlamasına neden olacak kadar etkili olan çok yerel bir seviyede tutuldu. Bu parametreler embriyolar üzerinde doğrudan ölümcül bir etki olmaksızın tekrar tekrar uygulandı. Daha uzun nabız süreleri veya daha yüksek lazer gücü, çevredeki hücrelerin ağartılmasına ve hatta embriyonun ölümüne neden olurken, daha düşük değerler hücre duvarını kırmak için yetersizdi.
Alg materyali ve kültür koşulları
Hücre altı düzeyde hassas çekime izin vermesine rağmen, bu teknik, sonuçların güvenilir bir şekilde yorumlanmasına izin vermek için deneycinin dört kritik faktörü ele almasını gerektirir. Bu noktalar lazer ablasyon deneyinden önce ve sonra dikkate alınmalıdır.
Ele alınması gereken ilk faktör embriyo popülasyon yoğunluğudur. Negatif kalabalık, S. latissima26'nın gelişme hızını etkiler. Düşük yoğunluklar, (1) lazer yolundaki diğer embriyoların varlığı gücünü azaltabileceği için daha iyi nabız tekrarlanabilirliği sağlar ve (2) sağlam embriyolardan biraz daha yavaş büyüyen lazer tarafından vurulan embriyoların daha kolay izlenmesi; ikincisi hızlı bir şekilde vurulmuş embriyoları kaplar. Bu protokolün ikinci kritik faktörü, deneyin gerçekleştirildiği sıcaklıktır. Lazer ışınının kendisi numuneyi ısıtır, ancak odanın sıcaklığı ve mikroskobun yerel ortamı, numunenin yaşadığı genel sıcaklık koşullarına 18-22 ° C'ye yakın bir sıcaklık katkıda bulunur. Burada, mikroskopun odası soğutulmamıştır, çünkü bu ekipman esas olarak ortam sıcaklıklarını tolere eden hayvan hücreleri için kullanılır. Neyse ki, Saccharina embriyoları 4 saate kadar 22 ° C (13 ° C'lik optimal kültür sıcaklığından 9 ° C daha yüksek) sıcaklıklara dayanabildi. Bununla birlikte, yeterli havalandırma veya soğutma plakası tutucu gibi düşük bir ortam sıcaklığının korunmasına yardımcı olan cihazlar, alg embriyolarının hayatta kalması ve gelişimi üzerinde olumsuz etki riskini azaltmaya yardımcı olabilir. Ayrıca, gametofitlerin kırmızı ışık altında 16 ° C'ye yavaş yavaş önceden alıştırılması, embriyoların ablasyon işlemi sırasında sıcaklık artışlarına dayanmasına yardımcı olabilir. Üçüncüsü, sıcaklıktaki artışa ek olarak, embriyolar deney süresince uygun bir ışık kaynağından mahrum bırakılır. Ayrıca, kloroplastlar 561 nm lazer tarafından kısmen ağartılabilir. 561 nm lazerde mümkün olan en düşük gücü kullanmak bu etkiyi azaltmaya yardımcı olur. Dördüncüsü, lazer ablasyon ekipmanı tüm laboratuvarlarda bulunmadığından nakliye de dikkate alınması gereken kritik bir faktördür. Alg materyalinin yerinden çıkmasını, kaybolmasını veya ölümünü önlemek için sıcaklık artışlarından ve dış hareketlerden veya şoklardan kaçınılmalıdır. Mümkün olduğunda, taşıma kutularının soğutulması, titreşime dayanıklı (örneğin, şok emici köpük) ve ışıklarla donatılması gerekir. Bu gereksinimleri karşılayan çeşitli taşıma kutuları ticari olarak temin edilebilir.
Tüm bu faktörler mümkün olduğunca kontrol edilse bile, zayıf ancak potansiyel olarak önemli çevresel stres hala ortaya çıkabilir. Bu olasılık, lazer ablasyona embriyo yanıtının analiz edilmesinde ve yorumlanmasında göz önünde bulundurulmalıdır.
Deney boyunca sabit tutulması gereken çevresel koşullara ek olarak, izleme adımı boyunca ışınlanmış organizmaların izlenmesi de bir zorluktur. Farklı embriyoların büyümesi zamanla orijinal manzarayı değiştirir. Deneyi izlemek için otomatik bir mikroskop tahsis edilemediği sürece, lazer ablasyondan sonra embriyoyu takip etmek kolayca zaman alıcı hale gelebilir ve büyük miktarda veri üretebilir. İlk lazer ablasyon darbesi sırasındaki video kayıtları, embriyonun nabza anında tepkisini izlemek için şiddetle tavsiye edilir. Nabız etkisinin bu hızlı izlenmesi büyük önem taşımaktadır, çünkü bazı durumlarda, nabız, hücrenin ortasına hedeflendiğinde, büyük olasılıkla hücrenin içi ile ortam (deniz suyu) arasındaki ozmolarite farkı nedeniyle, hedef hücrenin hızla patlamasına neden olmuştur. Sızıntı çok hızlı olduğunda, komşu hücreler de patladı. Hedeflenen hücrenin en distal bölgesine ateş etmek, bitişik hücreler üzerindeki patlama etkisini tamponlamanın etkili bir yolu olduğunu kanıtladı. Şiddetli patlamalardan kaçınmanın bir başka etkili yolu, sakaroz27 ile ortamın ozmolaritesini arttırmaktır. Bununla birlikte, ozmolaritedeki fark, hedeflenen hücrenin içeriğini ortadan kaldırmak için gereklidir. Bu nedenle, yeterli ozmolarite potansiyelinin korunması gerekir. Birkaç durumda, kloroplastlar ve diğer bileşikler lazer ablasyonu tarafından yapılan açıklığı engelledi, bu da lazer atışından hücrelerin iyileşmesine ve birkaç gün sonra büyümenin devam etmesine neden oldu. Açıklığın tıkanmasını açmaya yönelik ek darbeler, tıkanıklığı önlemek için yeterli olduğunu kanıtladı.
Sınırlama
Hücrelerin içeriklerini boşaltmasını sağlayacak kadar yüksek olması gereken lazer gücü ile alg embriyolarında ısı stresine ve fotobeyazlatmaya karşı özellikle hassas olan komşu hücrelerin hayatta kalması arasında bir denge kurulmalıdır. Bu nedenle, lazer atışından sonra hücrelerin yakından izlenmesi, bu adımı kontrol etmenin ve hedef hücrelerin ölmesini sağlamanın anahtarıdır. Aksi takdirde, hedeflenen hücrelerin komşu hücrelerin kaderi ve dolayısıyla embriyonun müteakip gelişimi hakkındaki yorumu yanıltıcı olabilir.
Bir iğne ile hücreleri delmek, alg hücrelerinin herhangi bir ısı veya ışık stresi yaşamayacağı bir alternatif gibi görünebilir. Bununla birlikte, bu yaklaşım zor olacaktır, çünkü kahverengi alg embriyo hücreleri deniz suyuna batırılmış olarak büyür ve herhangi bir katı yüzeyle teması yoktur. Kalın ve elastik hücre duvarı, standart bir mikroenjeksiyon sisteminde bir mikromanipülatör kullanarak embriyoyu katı, cam bir yüzeyle temas halinde tutarken bile iğne penetrasyonuna karşı direnç gösterir.
Özetle, bu protokol lazer ablasyonu ve kahverengi alg embriyolarının izlenmesi için tam deneysel prosedürü ve ayarları ve başarılı bir deney için kritik adımları açıklamaktadır (Ek Şekil 1). Bu eşsiz yaklaşım, kahverengi alglerin erken embriyolarında hücre etkileşimlerini ve hücre kaderini incelemek için umut verici bir yöntemdir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların açıklayacak hiçbir şeyleri yoktur.
Acknowledgments
SB'nin doktora hibesi, Bretagne Bölgesi (ARED hibe numarası COH20020) ve Sorbonne Université tarafından finanse edilmektedir. I.T.is doktora hibesi, Bretagne Bölgesi (ARED hibe numarası COH18020) ve Norvegian NMBU Üniversitesi tarafından finanse edilmektedir. Bu proje, MITI disiplinlerarası programları aracılığıyla CNRS'den finansal destek almıştır. MRic, Fransız Ulusal Araştırma Ajansı (ANR-10-INBS-04) tarafından desteklenen ulusal altyapı France-BioImaging üyesidir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 25 mm glass bottom petri dish | NEST | 801001 | |
| Autoclaved sea water | - | Collected offshore near the Astan buoy (48°44.934 N 003°57.702 W) close to Roscoff, France, at a depth of 20 m. | |
| Cell scraper | MED 2 | 83.3951 | |
| Cell strainer 40 µm | Corning / Falcon | 352340 | |
| Culture cabinets | Snijders Scientific Plant Growth Cabinet ECD01 | Any other brand is suitable provided that the light intensity, the photoperiod and the temperature can be controlled. | |
| LSM 880 Zeiss confocal microscope | Carl Zeiss microscopy, Jena, Germany | Ablation and imaging were performed using a 40x/1.2 water objective | |
| Pellet pestles | Sigma Aldrich | Z359947 | Blue polypropylene (autoclavable) |
| Provasoli supplement | - | Recipe is available here: http://www.sb-roscoff.fr/sites/www.sb-roscoff.fr/files/documents/station-biologique-roscoff-preparation-du-provasoli-2040.pdf | |
| Pulsed 355 laser (UGA-42 Caliburn 355/25) | Rapp OptoElectronic, Wedel, Germany | ||
| Scalpel | Paramount | PDSS 11 | |
| SysCon software | Rapp OptoElectronic, Wedel, Germany | Laser-driver software | |
| ZEN software | Carl Zeiss microscopy, Jena, Germany | Imaging software, used together with the SysCon software; Black 2.3 version |
References
- Montell, D. J., Keshishian, H., Spradling, A. C. Laser ablation studies of the role of the Drosophila oocyte nucleus in pattern formation. Science. 254 (5029), New York, N.Y. 290-293 (1991).
- Shivakumar, P. C., Lenne, P. F. Laser ablation to probe the epithelial mechanics in drosophila. Methods In Molecular Biology. 1478, 241-251 (2016).
- Bargmann, C. I., Avery, L. Laser killing of cells in Caenorhabditis elegans. Modern Biological Analysis of an Organism. 48, 225-250 (1995).
- Fouad, A. D., Liu, A., Du, A., Bhirgoo, P. D., Fang-Yen, C. Thermal laser ablation with tunable lesion size reveals multiple origins of seizure-like convulsions in Caenorhabditis elegans. Scientific Reports. 11 (1), 5084 (2021).
- Johnson, C. S., Holzemer, N. F., Wingert, R. A. Laser ablation of the zebrafish pronephros to study renal epithelial regeneration. Journal of Visualized Experiments. (54), e2845 (2011).
- Mondia, J. P., Adams, D. S., Orendorff, R. D., Levin, M., Omenetto, F. G. Patterned femtosecond-laser ablation of Xenopus laevis melanocytes for studies of cell migration, wound repair, and developmental processes. Biomedical Optics Express. 2 (8), 2383-2391 (2011).
- Reinhardt, D., Frenz, M., Mandel, T., Kuhlemeier, C. Microsurgical and laser ablation analysis of leaf positioning and dorsoventral patterning in tomato. Development. 132 (1), 15-26 (2005).
- Berg, C., Hage, W., Weisbeek, P., Scheres, B. Laser ablation in Arabidopsis roots: a tool to study cell-to-cell communication. Cellular integration of signalling pathways in plant development. Proceedings of the NATO Advanced Study Institute. , https://eurekamag.com/research/003/488/003488317.php 237-250 (1998).
- Berger, F., Taylor, A., Brownlee, C. Cell fate determination by the cell wall in early fucus development. Science. 263 (5152), New York, N.Y. 1421-1423 (1994).
- Bouget, F. Y., Berger, F., Brownlee, C. Position dependent control of cell fate in the Fucus embryo: role of intercellular communication. Development. 125 (11), 1999-2008 (1998).
- Bringloe, T., et al. Phylogeny and evolution of the brown algae. Critical Reviews in Plant Sciences. 39 (4), 281-321 (2020).
- Saifullah, S., Olsen, Y., Surilayani, D., Handå, A. Carbohydrate of the brown seaweed, saccharina latissima: a review. Joint proceedings of the 2nd and the 3rd International Conference on Food Security Innovation (ICFSI 2018-2019). , 180-182 (2021).
- Zhang, X., Thomsen, M. Techno-economic and environmental assessment of novel biorefinery designs for sequential extraction of high-value biomolecules from brown macroalgae Laminaria digitata, Fucus vesiculosus, and Saccharina latissima. Algal Research. 60, 102499 (2021).
- Kanda, T. On the gametophytes of some japanese species of laminariales. Scientific papers of the Institute of Algological Research, Faculty of Science. 1 (2), Hokkaido Imperial University. 221-260 (1936).
- Fritsch, F. E. The structure and reproduction of the algae. Volume 2. , Cambridge University Press. Cambridge. (1945).
- Bartsch, I., et al. The genus Laminaria sensu lato : recent insights and developments. European Journal of Phycology. 43 (1), 1-86 (2008).
- Theodorou, I., Charrier, B. Chapter 2: Brown algae: ectocarpus and saccharina as experimental models for developmental biology. Handbook of Marine Model Organisms in Experimental Biology - Established and Emerging. Boutet, A., Schierwater, B. , Francis & Taylor Group, CRC Press. ISBN 9780367444471 485 (2021).
- Drew, G. H. The reproduction and early development of laminaria digitata and laminaria saccharina. Annals of Botany. 24 (1), 177-189 (1910).
- Yendo, K. The development of costaria, undaria, and laminaria. Annals of Botany. 25 (99), 691-715 (1911).
- Forbord, S., Steinhovden, K., Rød, K., Handå, A., Skjermo, J. Cultivation protocol for Saccharina latissima. Protocols for Macroalgae Research. Charrier, B., Wichard, T., Reddy, C. R. K. , CRC Press, Francis & Taylor Group. ISBN-10: 14986427. ISBN-13: 978-1498796422 37-59 (2018).
- Bartsch, I. Derivation of clonal stock cultures and hybridization of kelps. Protocols for Macroalgae Research. Charrier, B., Wichard, T., Reddy, C. R. K. , CRC Press, Francis & Taylor Group. ISBN-10: 149879627. ISBN-13: 978-1498796422 61-78 (2018).
- Theodorou, I., Opsahl-Sorteberg, H. -G., Charrier, B. Preparation of zygotes and embryos of the kelp saccharina latissima for cell biology approaches. Bio-protocol. 101, 4132 (2021).
- Lüning, K., Dring, M. J. Reproduction induced by blue light in female gametophytes of Laminaria saccharina. Planta. 104 (3), 252-256 (1972).
- de Medeiros, G., et al. Cell and tissue manipulation with ultrashort infrared laser pulses in light-sheet microscopy. Scientific Reports. 10 (1), 1942 (2020).
- Liang, X., Michael, M., Gomez, G. A. Measurement of mechanical tension at cell-cell junctions using two-photon laser ablation. Bio-protocol. 6 (24), 2068 (2016).
- Ebbing, A., Pierik, R., Bouma, T., Kromkamp, J. C., Timmermans, K. How light and biomass density influence the reproduction of delayed Saccharina latissima gametophytes (Phaeophyceae). Journal of Phycology. 56 (3), 709-718 (2020).
- Rabillé, H., Billoud, B., Tesson, B., Le Panse, S., Rolland, É, Charrier, B. The brown algal mode of tip growth: Keeping stress under control. PLoS Biology. 17 (1), 2005258 (2019).
