Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Rutinmässig insamling av högupplösta kryo-EM-dataset med 200 KV transmissionselektronmikroskop

Published: March 16, 2022 doi: 10.3791/63519
Automatic Translation
*1, *2, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 3
1Materials and Structural Analysis Division, Thermo Fisher Scientific, 2Max Planck Institute of Biochemistry, Molecular Structural Biology, 3Materials and Structural Analysis Division, Thermo Fisher Scientific
* These authors contributed equally

Summary

Högupplösta kryo-EM-kartor över makromolekyler kan också uppnås genom att använda 200 kV TEM-mikroskop. Detta protokoll visar de bästa metoderna för att ställa in exakta optiska inriktningar, datainsamlingsscheman och urval av bildområden som alla är väsentliga för framgångsrik insamling av högupplösta dataset med hjälp av en 200 kV TEM.

Abstract

Kryoelektronmikroskopi (kryo-EM) har etablerats som en rutinmässig metod för bestämning av proteinstruktur under det senaste decenniet och tar en ständigt ökande andel av publicerade strukturdata. De senaste framstegen inom TEM-teknik och automatisering har ökat både hastigheten på datainsamlingen och kvaliteten på förvärvade bilder samtidigt som den minskar den nödvändiga kompetensnivån för att erhålla kryo-EM-kartor vid sub-3 Å-upplösningar. Medan de flesta av sådana högupplösta strukturer har erhållits med hjälp av toppmoderna 300 kV kryo-TEM-system, kan högupplösta strukturer också erhållas med 200 kV kryo-TEM-system, särskilt när de är utrustade med ett energifilter. Dessutom minskar automatiseringen av mikroskopjusteringar och datainsamling med bedömning av bildkvalitet i realtid systemets komplexitet och säkerställer optimala mikroskopinställningar, vilket resulterar i ökat utbyte av högkvalitativa bilder och övergripande genomströmning av datainsamling. Detta protokoll visar implementeringen av de senaste tekniska framstegen och automatiseringsfunktionerna på ett 200 kV kryoöverföringselektronmikroskop och visar hur man samlar in data för rekonstruktion av 3D-kartor som är tillräckliga för de novo atommodellbyggnad. Vi fokuserar på bästa praxis, kritiska variabler och vanliga problem som måste beaktas för att möjliggöra rutinmässig insamling av sådana högupplösta kryo-EM-dataset. Särskilt följande viktiga ämnen granskas i detalj: i) automatisering av mikroskopinriktningar, ii) val av lämpliga områden för datainsamling, iii) optimala optiska parametrar för datainsamling av hög kvalitet, hög genomströmning, iv) energifilterjustering för nollförlustavbildning och v) datahantering och kvalitetsbedömning. Tillämpning av bästa praxis och förbättring av uppnåelig upplösning med hjälp av ett energifilter kommer att demonstreras på exemplet apo-ferritin som rekonstruerades till 1,6 Å och Thermoplasma acidophilum 20S proteasom rekonstruerad till 2,1-Å upplösning med hjälp av en 200 kV TEM utrustad med ett energifilter och en direktelektrondetektor.

Introduction

Bestämning av proteinstruktur är avgörande för att förstå molekylär arkitektur, funktion och reglering av proteinkomplex som är involverade i viktiga cellulära processer, såsom cellmetabolism, signaltransduktion eller värdpatogeninteraktioner. Kryoelektronmikroskopi (kryo-EM) har framstått som en kraftfull teknik som kan lösa 3D-strukturen hos många proteiner och deras komplex som var för utmanande för de traditionella strukturteknikerna, såsom röntgendiffraktion och NMR-spektroskopi. Särskilt har kryo-EM visat sig vara den metod som valts för membranproteiner, som inte lätt kan kristalliseras eller framställas i tillräckliga mängder för de traditionella strukturteknikerna, och gett nya insikter i strukturen och funktionen hos viktiga cellulära receptorer och jonkanaler 1,2,3,4,5 . Senast har kryo-EM spelat en viktig roll i kampen mot Covid-19-pandemin genom att bestämma mekanismen för SARS-CoV-2-infektion på molekylär nivå, vilket belyste ursprunget till Covid-19-sjukdomen och utgjorde grunden för den snabba utvecklingen av effektiva vacciner och terapier 6,7,8,9,10.

Vanligtvis används avancerade 300 kV transmissionselektronmikroskop (TEM) för högupplöst strukturbestämning av biomolekyler genom kryo-EM-enpartikelanalys (SPA) för att avslöja deras konformation och interaktioner. Nyligen nådde SPA-tekniken en ny gräns när det gemensamma riktmärket kryo-EM-prov apo-ferritin rekonstruerades vid atomupplösning (1,2 Å)11,12 med hjälp av en 300 kV TEM utrustad med kallfältsemissionspistolen (E-CFEG), en direktelektrondetektor och ett energifilter. Vid denna upplösning var det möjligt att entydigt lösa positioner för enskilda atomer i strukturen, konformation av enskilda aminosyrasidokedjor samt vätebindning och andra interaktioner, vilket öppnar nya möjligheter för strukturbaserad läkemedelsupptäckt av nya mål och optimering av befintliga läkemedelskandidater.

Mellanklass 200 kV TEM-mikroskop används ofta för provscreening och provoptimering före slutlig högupplöst datainsamling med hjälp av avancerade TEM-mikroskop, särskilt vid större kryo-EM-anläggningar. Vanligtvis kan avbildade prover lösas i upplösningsområdet 3-4 Å som är tillräckligt för att flytta till en avancerad 300 kV TEM för slutlig datainsamling. Följaktligen är datainsamling med hjälp av 200 kV TEM ofta inte ytterligare optimerad för högsta möjliga upplösningsresultat. Dessutom kan många intressanta biologiska frågor redan besvaras och publiceras vid dessa resolutioner eftersom alla aminosyras sidokedjor redan är lösta, och beläggningen av ligandbindningsställen kan också bestämmas på ett tillförlitligt sätt13. Det har redan visats att 200 kV TEM kan nå upplösningar utöver 3 Å för många prover 14,15,16,17,18. Bilder tagna med 200 kV uppvisar i sig högre kontrast av avbildade partiklar, vilket till och med kan underlätta mer exakt initial inriktning av partiklarna trots mer dämpad signal vid hög upplösning jämfört med 300 kV TEM-bilder. Det är viktigt att notera att den uppnådda upplösningen av rekonstruerade kryo-EM-kartor också begränsas av strukturell flexibilitet och konformationsheterogenitet hos avbildade prover, vilket påverkar både 200 kV och 300 kV rekonstruktioner. Faktum är att mycket fler kryo-EM-rekonstruktioner som erhölls med 300 kV-systemen löstes i upplösningsområdet 3-4 Å än vid högreupplösningar 19. Eftersom 200 kV TEM-mikroskop är mindre komplexa och passar in i mindre rum, representerar dessa mikroskop ett bra, billigare alternativ för strukturbestämning av biologiska makromolekyler med kryo-EM samtidigt som automatisering av långa datainsamlingar från flera prover lagrade i mikroskop autoloader-systemet bevaras.

Insamling av kryo-EM-dataset för högupplöst strukturbestämning kräver noggrann anpassning av mikroskopoptiken. Kolonninriktningar fortsätter systematiskt från elektronkällan ner till kondensorlinssystemet, objektivlinsen och energifiltret med en elektrondetektor. Den fullständiga sekvensen av justeringar krävs vanligtvis inte. Vid behov guidas användaren via halvautomatiska procedurer med en korrekt beskrivning av varje steg i ett kontextmedvetet hjälpfönster under hela justeringsproceduren i mikroskopets användargränssnitt (kontrollpanelen för direkta justeringar). När mikroskopet är helt inriktat förblir elektronoptiken stabil och inriktningarna behöver inte ändras på minst några månader. Endast de känsligaste justeringarna, till exempel parallell belysning av provplanet, objektiv astigmatism och komafri justering, måste förfinas precis innan insamlingen av varje datauppsättning påbörjas. Kvaliteten på insamlade data kan sedan övervakas under datainsamling med hjälp av olika mjukvarupaket, såsom EPU Quality Monitor, cryoSPARC Live20, Relion21, Scipion22, WARP23 eller Appion24.

Förutom noggranna anpassningar av mikroskopet är den höga kvaliteten på välrenade prover med minimal konformations- och kompositionell heterogenitet också en förutsättning för insamling av högupplösta dataset och lösning av högupplösta strukturer. Mer information om typiska protokoll, frekventa utmaningar och möjliga lösningar finns i andra recensioner tillägnad detta ämne 25,26,27. I huvudsak är det viktigt att hitta områden på ett visst kryo-EM-nät som har tillräckligt tunn is för att bevara högupplöst information, och enskilda partiklar fördelas tätt vid slumpmässiga orienteringar utan överlappningar. Typiska kryo-EM-nät har emellertid ojämn istjocklek, och det är därför viktigt att hitta och välja de optimala områdena för avbildning. Olika sätt att uppskatta istjockleken på nätet finns i programvarupaket avsedda för automatiserad insamling av kryo-EM-dataset, såsom EPU 2, Leginon28 eller SerialEM29.

Tillkomsten av snabba och känsliga direkta elektrondetektorer möjliggjorde insamling av bilder i många fraktioner som filmer som möjliggjorde kompensation av strålinducerade rörelser och resulterade i en betydande ökning av kvaliteten och kvantiteten av data som används vid bildbehandling och slutlig 3D-rekonstruktion30. Samtidigt ger automatisering och datainsamling med högt dataflöde enorma datamängder med tusentals bilder/filmer som utgör utmaningar för datalagring och åtkomst. Den antagna modellen med stora kryo-EM-anläggningar som betjänar tiotals till hundratals användare kräver särskilt organiserad datahantering med korrekt spårning och datadelning i etablerade kryo-EM-rörledningar31,32.

Denna studie beskriver ett protokoll för rutinmässig insamling av högupplösta kryo-EM-dataset med hjälp av 200 kV Glacios TEM-mikroskop. Nödvändiga anpassningar av mikroskopoptiken beskrivs tillsammans med förfaranden för utvärdering av kryo-EM-prover och val av lämpliga områden för högupplöst datainsamling. Organisationen av insamlade data och relaterade metadata med provinformation demonstreras i Athena - en datahanteringsplattform som underlättar granskningen av provinformation och insamlade data. Med hjälp av musens apo-ferritinprov var det möjligt att uppnå en 3D-rekonstruktion vid 1,6 Å upplösning13. Med hjälp av det beskrivna protokollet rekonstruerade vi också 3D-densitetskartan över 20S-proteasomen från Thermoplasma acidophilum vid 2,1 Å-upplösning.

Protocol

Alla steg i protokollet beskrivs för 200 kV Glacios TEM-system (nedan kallat 200 kV TEM) utrustat med Selectris-X-energifiltret (nedan kallat energifilter) och Falcon 4-detektorn (nedan kallad direktelektrondetektor). Protokollstegen är specifika för EPU-programmet, som är standardprogramvaran för SPA-datainsamling som är förinstallerad på varje Glacios-system. Protokollstegen nedan motsvarar EPU version 2.14 och små ändringar förväntas när du använder en annan EPU-version. Förutsättningarna för detta protokoll är: i) pistol- och kolonnjusteringarna är väl inriktade, ii) EM-kalibreringarna är korrekta och iii) EPU-autofunktionerna är korrekt kalibrerade.

1. Ladda rutnät i mikroskopet

OBS: TEM på 200 kV som används i detta experiment kan rymma upp till 12 autogrids (dvs. konventionella TEM-galler klippta i en speciell patron) i en kassett som laddas inuti mikroskopets autoloader och ständigt hålls vid temperaturer under -170 ° C för att förhindra provförvittring.

  1. Sätt i autogrids i Autoloader-kassetten under flytande kväveförhållanden.
  2. Sätt i kassetten med autogrids i en vätske-kvävekyld överföringskapsel.
  3. Sätt in kapseln i mikroskopet och klicka på Dock-knappen i mikroskopgränssnittet för att ladda kassetten från kapseln till mikroskopets autoladdare.
  4. Klicka på knappen Inventering för att kontrollera närvaron av autogrids i den laddade kassetten.
  5. Klicka på knapparna Ladda och Lossa för att infoga autogrids i kolumnen för TEM-avbildning .

2. Ställa in ett projekt i en datahanteringsplattform (valfritt)

OBS: Exempelinformation och insamlade data kan organiseras i den tillhandahållna datahanteringsplattformen som möjliggör lagring av strukturerad data för alla anslutna instrument. Ett projekt kan skapas för vilket alla arbetsflödessteg kan definieras för att fånga bilder och metadata på ett organiserat sätt för granskning och export.

  1. Starta datahanteringsportalprogrammet och logga in med ett användarnamn och lösenord.
  2. I den vänstra panelen i portalgränssnittet klickar du på knappen Lägg till projekt för att skapa ett nytt projekt eller klickar på en knapp för ett befintligt projekt i listan nedan för att öppna ett projekt.
  3. Klicka på knappen Lägg till experiment för att skapa ett nytt experiment i det öppnade projektet.
  4. Fyll i beskrivningen i panelen Metadata för det nya experimentet och klicka på knappen Lägg till arbetsflöde för att skapa ett nytt arbetsflöde i experimentet (t.ex. Enpartikelanalys).
  5. Du kan också klicka på knappen Lägg till steg i mittpanelen för att skapa ett skräddarsytt arbetsflöde eller lägga till ytterligare steg i det fördefinierade SPA-arbetsflödet (figur 1 och figur 2).
    OBS: Stegen kan representera provberedning, provkarakterisering med biokemitekniker, provförglasning, screening av kryo-EM-nät, datainsamlingssessioner och dataanalys.
  6. Du kan också fylla i beskrivningar i anteckningarna för varje steg, som kan innehålla bilder och foton.
  7. Skapa ett datauppsättningssteg i arbetsflödet och välj datauppsättningstypen som EPU.
    OBS: Detta gör det möjligt för analysprogramvaran att placera alla resultatdata / metadata på rätt plats i datahanteringsportalen automatiskt under datainsamling och exportera data automatiskt till önskad destination samtidigt som man behåller en fullständig registrering av alla steg och dataöverföring.
  8. Fyll i mallar om prov- och EM-rutnäten i steget Biokemi och associera varje rutnät med ett prov (observera att ett prov kan associeras med flera rutnät).
  9. Associera kombinationer av exempelrutnät i metadataavsnittet i steget Datauppsättning .

3. Ställ in bildförinställningar och bildskiftkalibreringar i analysprogramvaran

  1. Ställ in bildparametrar för enskilda bildlägen enligt tabell 1. Överväganden för valet av specifika inställningar beskrivs i detalj i avsnittet Diskussion.
  2. Ställ in parallell belysning för den valda förstoringen i analysprogramvarans datainsamlingsförinställning
    OBS: Det finns bara en inställning av C2-linsen för parallell belysning av provet vid den givna SPOT-storleken (dvs. förinställda styrkor hos C1-linsen) på 2-kondensor-TEM-system, såsom 200 kV TEM som används i denna studie. Elektrondosraten per ytenhet (e-/Å2/s) kan därför endast justeras genom att ändra SPOT-storleksinställningarna och justera C2-styrkan (strålintensiteten) enligt stegen nedan.
    1. Flytta till ett område med stöd kolfolie och tunn eller ingen is.
    2. Välj objektivöppningen på 100 μm eller 70 μm i menyn Bländare i TEM-användargränssnittet.
    3. Tryck på diffraktionsknappen på kontrollpanelerna för att växla till diffraktionsläget.
    4. Sätt i den fluorescerande skärmen och ändra FluCam-läget till Hög upplösning.
    5. Flytta den centrala diffraktionsplatsen till en kant av bländaren. Om bländarkanten inte syns ökar du kameralängden (med förstoringsknappen).
    6. Vrid försiktigt på Focus-ratten på kontrollpanelen för att sätta bakfokusplanet i fokus. Bakfokalplanet är fokuserat när bländarkanten är synligt skarp.
    7. Minska känsligheten hos FluCam till den lägsta nivån och flytta den centrala diffraktionsplatsen till mitten av FluCam.
    8. Minimera storleken på den centrala platsen med hjälp av intensitetsratten på kontrollpanelen.
    9. Dra tillbaka objektivöppningen i TEM-användargränssnittet och växla tillbaka till bildläget.
    10. Klicka på knappen Hämta i analysprogramvaran för att spara inställningarna i förinställningen Datainsamling.
  3. Justera elektrondosraten i förinställningen datainsamling som är optimal för den använda detektorn:
    1. Flytta till ett tomt område på gallret (t.ex. en rutnätskvadrat med trasig kolfolie)
    2. Klicka på knappen Mät dos i analysprogramvaran för att mäta elektrondosraten.
    3. Ändra SPOT-storleken för att uppnå optimal dosrat. När det gäller den direkta elektrondetektorn som används i detta protokoll används vanligtvis en dosrat på 4-5 e-/pixel/s för högupplöst datainsamling. Detta motsvarar vanligtvis SPOT-storleken 4-6.
    4. Kontrollera och justera parallell belysning vid den nya SPOT-storleksinställningen enligt beskrivningen ovan.
    5. Välj alternativet EER under Fraktioner för att använda EER-läget på direktelektrondetektorn33.
    6. Klicka på knappen Hämta i analysprogramvaran för att spara inställningarna i förinställningen Datainsamling.
    7. Byt till autofokusförinställningen och tryck på Knappen Hämta för att spara belysningsinställningarna för fokusering. Ändra exponeringstiden manuellt till 1 s och binningsläge 2.
    8. Byt till Thon Rings-förinställningen och tryck på Get-knappen för att spara belysningsinställningarna för den här förinställningen. Ändra exponeringstiden manuellt till 1–2 s och binningsläge 2.
    9. Byt till zero loss-förinställningen och tryck på Get-knappen för att spara belysningsinställningarna för den här förinställningen. Ändra exponeringstiden manuellt till 0,5 s och binningsläge 4.
  4. Kalibrera bildförskjutningar mellan de inställda optiska inställningarna enligt beskrivningen i analysprogramvaruhandboken med hjälp av kalibreringsuppgiften Image Shift på fliken Förberedelse (kompletterande figur 1).

Tabell 1: Typiska bildinställningar för högupplöst datainsamling med hjälp av en 200 kV kryo-TEM utrustad med ett energifilter och en direktelektrondetektor. Inställningarna visas för varje optisk förinställning som används för att konfigurera automatisk datainsamling (avsnitt 3 i protokollet). Dessa inställningar är specifika för 200 kV TEM-mikroskopet och direktelektrondetektorn som används i denna studie. Klicka här för att ladda ner denna tabell.

4. Nätkartläggning och urval av bästa kryo-EM-nät för datainsamling

  1. Välj fliken Atlas och klicka på knappen Ny session för att öppna en ny session.
  2. Fyll i detaljer som sessionsnamn och datalagringsplats och klicka på Apply-knappen för att öppna ett nytt screeninguppgiftsfönster , som visar en lista över alla rutnät i Autoloader-inventeringen. Du kan också redigera namnen på rutnäten.
  3. Markera rutnäten av intresse genom att markera en kryssruta bredvid motsvarande rutnätsnummer.
  4. Klicka på Start-knappen för att starta en helautomatisk samling atlaser över alla valda rutnät.
  5. När samlingen är klar klickar du på rutnätsetiketter för att granska de förvärvade atlaserna.
    OBS: Enskilda rutnätsrutor klassificeras enligt deras relativa istjocklek, som baseras på relativ gråskalevärdebedömning i varje atlas. De klassificerade rutnätsrutorna visas i olika färgscheman som kan användas för att styra valet av datainsamlingsområden. Ett rutnät som produceras med en Vitrobot Mk IV visar vanligtvis en istjockleksgradient över hela nätet, vilket kan bidra till att identifiera den ideala istjockleken för datainsamling. Ett optimalt rutnät bör innehålla så lite överföringsisförorening som möjligt och uppvisa tillräckligt med obrutna och sprickfria rutnätsrutor (figur 3). Rutnät med lämplig isfördelning kan undersökas ytterligare för att bedöma fördelningen av partiklar i is vid hög förstoring (dvs. densitet och orientering av enskilda partiklar).
  6. Klicka på knappen Ladda prov i toppmenyn för att infoga ett valt rutnät med lämplig isfördelning i mikroskopkolumnen.
  7. Välj fliken Atlas , högerklicka på en lämplig rutnätsruta i atlasbilden och välj alternativet Flytta scen hit från rullgardinsmenyn för att flytta scenen till rutnätsrutan.
  8. Välj fliken Autofunktioner för att ställa in rutnätskvadraten till den eucentriska höjden. Byt till den eucentriska höjdförinställningen , klicka på autofunktionen Auto-Eucentric by Beam Tilt i mitten av den valda rutnätsrutan och klicka på Start-knappen .
  9. Byt till Grid Square-förinställningen och hämta en bild. Flytta scenen till ett hål med is och ingen eller minimal förorening med ett högerklick och alternativet Flytta scenen här .
  10. Byt till förinställningen Hål/Eucentrisk höjd och hämta en bild. Flytta scenen till ett kolområde bredvid hålet av intresse genom att högerklicka och alternativet Flytta scen här .
  11. Klicka på autofunktionen Autofokus och ställ in värden för Önskad defokus till 0 μm och Iterera till -2 μm. Byt till autofokusförinställningen och klicka på Start-knappen .
  12. Välj fliken Förberedelse igen och växla till förinställningen Hål/Eucentrisk höjd . På den tidigare förvärvade hålbilden väljer du ett intresseområde i hålet och flyttar scenen till denna position genom att högerklicka och välja alternativet Flytta steg här .
  13. Byt till datainsamlingsförinställningen och ställ in väntetiden efter strålskiftet till 0,5 s och väntetiden efter steg flyttas till 20 s. Skaffa en bild med defokus mellan -3 μm och -5 μm för att öka kontrasten med låg upplösning för bättre visualisering av enskilda partiklar.
  14. Du kan också upprepa steg 4.7-4.13 för att avbilda partiklar i olika hål och olika rutnätsrutor med olika istjocklekar efter behov.
  15. När det lämpligaste rutnätet för högupplöst datainsamling har identifierats och valts klickar du på knappen Läs in exempel i den översta menyn för att läsa in det valda rutnätet i TEM.
    OBS: Alternativt, om mer information behövs och / eller automatisering av denna screeningprocess önskas, utför avsnitt 5.

5. Ställa in en datainsamlingssession i programvaran för analys av enstaka partiklar

OBS: Om du använder guldfolienäten kanske förfining av objektiv astigmatism och koma-anpassningar (avsnitt 6) inte fungerar tillförlitligt. Det rekommenderas att ladda ett kolfolienät eller tvärgaller EM-rutnät och utföra dessa slutliga justeringar innan du ställer in datainsamling.

  1. Välj fliken EPU och klicka på knappen Skapa session för att skapa en ny session i den vänstra panelen. Välj alternativet Ny session om du vill använda aktuella optiska förinställningar eller alternativet Nytt från inställningar för att läsa in tidigare exporterade sessionsinställningar.
  2. Fyll i sessionsnamn och datalagringsplats.
    OBS: Den här platsen kommer att användas för att spara integrerade bilder och metadata från datainsamlingssessionen i en undermapp med sessionsnamnet. Även om dessa data inte tar upp en betydande mängd lagringsutrymme, rekommenderas att spara dessa data på Falcon avlasta datalagring av DMP-servern eftersom EER-kameraramarna alltid lagras i rotkatalogen för denna datalagring i en katalog med sessionsnamnet.
  3. Välj den manuella typen av session för att ha kontroll över valet av enskilda hål i rutnätsrutor som valts för datainsamling senare i protokollet.
  4. Välj läget Snabbare förvärv om du vill använda AFIS (AFIS) (aberration-free image shifting) för datainsamling för att minska stegrörelser mellan enskilda hål, minska den totala provavdriften och öka dataflödet för datainsamling utan att bildkvaliteten försämras.
  5. Välj standardformatet mrc för sparade integrerade bilder.
  6. Ange det använda rutnätet och dess typ. Detta protokoll använde R-1.2 / 1.3 UltraAufoil för apo-ferritin och R-2/1 Quantifoil-nätet för 20S-proteasomen. Välj Quantifoil under Specimen carrier och R1.2/1.3 eller 2/1 under Quantifoil Type.
  7. VALFRITT: Klicka på Athena Login-knappen i det nedre högra hörnet för att använda EPU Quality Monitor (EQM).
    1. Ange inloggningsuppgifter i webbläsarens popup-fönster för att aktivera inställningsavsnittet i översikten Sessionsinställningar .
    2. Klicka på knappen Välj i inställningsavsnittet och bläddra efter den tidigare skapade datauppsättningen (protokollavsnitt 2) för att associera den med den aktuella datainsamlingen. Aktivera kryssrutan Aktivera kvalitetsövervakare .
  8. Klicka på knappen Apply för att skapa en ny session.
    OBS: Den här åtgärden öppnar nya uppgifter i menyn till vänster. När som helst under sessionen, om vissa detaljer är felaktiga, är det möjligt att återgå till sessionsinställningsuppgiften , ändra/ uppdatera detaljerna och klicka på Apply igen för att uppdatera sessionen.
  9. Välj uppgiften Square Selection i den vänstra panelen för att visa den insamlade atlasen i rutnätet.
  10. Alternativt kan du dubbelklicka på någon kakel i atlasen för att se en bild av högre kvalitet för att bättre bedöma iskvaliteten i rutnätsrutorna. Dubbelklicka igen på bilden för att återgå till rutnätsatlasen.
  11. Identifiera rutnätsrutor med följande egenskaper (figur 4): (i) Stödfolien i rutnätskvadraten är intakt utan skador, (ii) Glasartad tunn is i foliehål (hålen verkar ljusare än stödkolfolien), (iii) Så lite kristallin isförorening (svarta fläckar) i rutnätstorget som möjligt, (iv) Minimal ljusstyrka över rutnätstorget och inom enskilda foliehål.
    OBS: Med de förinställningar som valts och med ett bra rutnät kan 200 kV cryo TEM som används i denna studie avbilda med en hastighet av ~ 200-300 filmer / h. Med det i åtanke väljer du så många rutor som behövs, eller lägger till fler senare genom att återgå till kvadratvalsuppgiften beroende på hur mycket mikroskoptid som är tillgänglig. Som referens samlades 3000 filmer in för att uppnå 1,6 Å upplösning av apo-ferritin.
  12. Välj rutnätsrutor för datainsamling antingen i den fullständiga atlasen eller i högkvalitativa panelbilder
    1. Högerklicka på en rutnätsruta av intresse och välj alternativet Välj i snabbmenyn
    2. Alternativt kan du hålla ned Ctrl-tangenten på tangentbordet och vänsterklicka på önskade rutnätsrutor
    3. Omvänt högerklickar du och avmarkerar eller håller ned Skift-tangenten och vänsterklickar för att ta bort rutor
    OBS: Nästa steg är avgörande för att säkerställa att datainsamling resulterar i en högupplöst rekonstruktion. Börja välja hål i rutnätet med ett tunt islager. Högerklicka på den här rutnätsrutan och välj alternativet Välj hål för att påbörja uppgiften Hålval .
  13. Välj uppgiften Hålval i den vänstra panelen för att välja hål i de valda rutnätsrutorna.
  14. Klicka på den auto-eucentriska knappen för att automatiskt flytta till den första valda rutnätskvadraten, justera den eucentriska höjden och få en rutnätsbild för att hitta foliehål.
  15. Klicka på knappen Hitta hål för att hitta foliehål i bilden.
    OBS: Om hålsökning inte fungerade bra (dvs. det finns antingen hoppade hål eller felaktigt stora hål i bilden), kontrollera att korrekta värden matades in i posten Quantifoil Type i sessioninställningsuppgiften och hitta hål igen. Om hålen fortfarande inte hittas korrekt klickar du på knappen Mät hålstorlek för att ställa in håldiametern och avståndet manuellt och hitta hål igen.
  16. Klicka på knappen Ta bort hål nära rutnätsknappen för att avmarkera hål nära rutnätsstänger.
  17. Justera gränserna i isfiltrets ljusstyrke histogram (längst ned till höger i programvarufönstret) för att ta bort alla hål med för tjock is (med vänster gränslinje) samt alla tomma hål (med höger gränslinje) som visas i figur 4.
    OBS: För förfining kan specifika intensitetsvärden också anges i motsvarande textrutor bredvid knappen Apply .
  18. Du kan också använda markeringsborsten för att förfina valet av hål manuellt: Vänsterklicka och dra borsten för att avmarkera oönskade hål. Håll ned Ctrl-tangenten och vänsterklicka för att kunna välja foliehål igen. Håll ned Skift-tangenten och bläddra med mushjulet för att justera borststorleken.
  19. Välj ett hål för att ställa in och testa en datainsamlingsmall som kommer att användas upprepade gånger under datainsamlingen: Högerklicka på ett hål i rutnätets fyrkantiga bild och välj alternativet Flytta scen till plats.
  20. Välj uppgiften Malldefinition i den vänstra panelen.
  21. Välj hål / eucentrisk förinställning och klicka på knappen Skaffa för att få en bild.
  22. Klicka på knappen Sök och mitthål för att centrera ett hål i bilden.
  23. Ange värden för Delay After Image Shift till 0,5 s (standard) och Delay After Stage Shift till 20 s.
    OBS: Eftersom parallellstråldiametern är fixerad på 200 kV kryo-TEM-systemet som används i denna studie och vanligtvis motsvarar 1,6-1,7 μm med en 50-μm bländare, kan endast 1 bild förvärvas per hål med R-1,2 / 1,3 rutnät och 2 bilder per hål (nära motsatta kanter) med hjälp av R-2/1 eller R-2/2 rutnät. Observera att storleken på de inställda förvärvsområdena på skärmen inte motsvarar den faktiska stråldiametern. Bildskalefältet kan användas för att uppskatta ett lämpligt placeringsavstånd.
  24. Välj knappen Lägg till förvärvsområde och klicka på bilden för att välja platsen i det centrerade hålet där bildförvärv med hög förstoring kommer att tas från.
  25. Välj knappen Lägg till autofokusområde och klicka på bilden för att välja platsen på stödfolien bredvid det centrerade hålet där bildautofokus ska utföras.
    OBS: Strålstorleken för fokusering är 1,6-1,7 μm och bör placeras lika långt från angränsande hål på kol.
  26. Klicka på det gröna förvärvsområdet för att ställa in en sekvens av defokusvärden i Defocus List i den övre delen av programvarufönstret. Ange den högsta defokuseringen som först för att förbättra visualiseringen av partiklar i en testkörning av följande mallkörningsuppgift .
  27. Klicka på det blå autofokusområdet för att ställa in autofokusspecifika inställningar i samma område:
    1. Välj alternativet Efter centrering för att autofokusera i början av varje AFIS-kluster.
    2. Välj alternativet Objektiv för snabbare autofokusering och minskad stegdrift.
  28. Välj uppgiften Mallkörning och klicka på knappen Kör.
    1. Observera enskilda steg i datainsamlingsproceduren (centrera hålet, autofokus i det valda området och bildförvärv i de inställda områdena) och kontrollera kvaliteten på avbildade partiklar i den slutliga högförstoringsbilden.
    2. Klicka på FFT-knappen längst ned till höger i bildfönstret med hög förstoring för att kontrollera FFT-bilden och visuellt bedöma om Thon-ringar visar flera svängningar och sträcker sig till hög upplösning i FFT-bilden.
  29. Om mallkörningen har slutförts klickar du på knappen Förbered alla rutor i uppgiften Hålval för att få datainsamlingen inställd automatiskt i alla andra valda rutnätsrutor enligt de använda inställningarna i den här första rutnätsrutan.

6. Slutliga mikroskopjusteringar innan datainsamlingen påbörjas

OBS: För att uppnå bästa högupplösta resultat bör de mest känsliga justeringarna göras exakt i samma inställningar som datainsamlingsläget i datainsamlingsprogramvaran och strax innan den faktiska datainsamlingen påbörjas. Dessa inriktningar bör göras i en position med tunt stödkol i gallret, tillräckligt långt från alla gallerstänger och inriktade på eucentrisk höjd.

  1. Välj uppgiften Mallkörning , skaffa en ny bild och flytta med scenen till ett rent område på kolfolie genom att högerklicka och välj menyalternativet Flytta scen här.
  2. Välj fliken Autofunktioner och ställ in Önskad defokusering på 0 μm och Iterera till -2 μm. Byt till autofokusförinställningen och klicka på Start-knappen för att köra autofokusfunktionen.
  3. Sätt ner den fluorescerande skärmen och öppna menyn för direkta justeringar i TEM-användargränssnittet.
  4. För bästa resultat kan erfarna användare verifiera pivotpunktsinriktningar: Välj uppgiften nP Beam Tilt pp X i menyn Direct Alignments och överlappa maximalt de studsande strålarna med hjälp av multifunktionsknapparna på kontrollpanelerna. Upprepa för np Beam Tilt pp Y-uppgiften .
  5. Klicka på EF-knappen i den fluorescerande skärmkameramenyn för att visa en grön cirkel som indikerar energifiltrets ingångsöppning och centrera strålen över den gröna cirkeln.
    OBS: Se till att Turbopumpen är stoppad innan du fortsätter; vibrationer från den minskar antalet synliga thonringar och orsakar ofta att de automatiska funktionerna misslyckas.
  6. Gå tillbaka till programvarufönstret och välj fliken Autofunktioner i menyraden.
  7. Välj uppgiften Autostigmate , växla till Thon Ring-förinställningen och tryck på Start-knappen . Observera processen för att se till att (i) bilderna som tas är på kol, (ii) Thon-ringarna är tydligt synliga och (iii) den beräknade CTF-passformen (prickade linjer) är väl placerade vid Thon-ringminima (kompletterande figur 2).
  8. Välj Autocoma-uppgiften och tryck på Start-knappen . Observera processen för att se till att bilderna som tas är på kol och att Thon-ringarna är tydligt synliga och att de beräknade passningarna (prickade linjer) är väl placerade vid Thon-ringminima. Zooma in i varje Thon-ringbild med musens rullningshjul (kompletterande figur 3).
    OBS: Om mikroskopet är utrustat med ett energifilter bör energifilterinställning göras som en del av justeringssekvensen för att centrera filterslitsen till nollförlusttoppen och för att korrigera eventuella snedvridningar i energifiltrets prisma (steg 6.9-6.14). Dessa justeringar bör göras vid ett tomt område av rutnätet, till exempel inuti en trasig rutnätskvadrat.
  9. Öppna Sherpa UI och välj applikationen Energifilter (kompletterande figur 4).
  10. Ställ in kameran på EF-Falcon, bin 4x, exponeringstid 0,2 s i fönstret Inställningar .
  11. Klicka på centerknappen i alternativet Nollförlust för att centrera nollförlustfilterslitsen.
  12. Klicka på knappen Tune i alternativet Isochromaticity (kompletterande figur 4).
  13. Klicka på Tune Förstorification and Tune Distortions i alternativet Geometriska och kromatiska distorsioner (Kompletterande figur 5, kompletterande figur 6)
  14. Om resultaten inte ligger inom angivna specifikationer och visas i röd färg i utdatarapporten itererar du justeringarna från steg 6.11 igen.
    OBS: Även om den direkta elektrondetektorns förstärkningsreferens kan vara stabil över månader, bör en ny förstärkningsreferens tas med hjälp av Falcon 4 Reference Image Manager om bilder av tomma områden inte visar enhetlig intensitet men uppvisar ränder eller andra distinkta egenskaper. Alternativt kan du beräkna en Fast Fourier Transform (FFT) av en sådan bild och se till att inga linjer är synliga.
  15. I programvarufönstret väljer du fliken Förberedelse och växlar till förinställningen Datainsamling .
  16. Ställ in dosinställningen på 40 e-/Å2 och klicka på knappen Mät dosraten .
  17. Gå till fliken EPU , välj uppgiften Automatiserad förvärv och kontrollera eventuellt funktionen Auto Zero Loss . Klicka på knappen Starta körning för att starta helautomatisk datainsamling.

7. Övervakning och optimering av datakvaliteten under datainsamlingen

OBS: Medan datainsamling pågår kan insamlade data övervakas med hjälp av EQM via datahanteringsportalen. EQM utför rörelsekorrigering och CTF-bestämning i farten och visar resultaten i portalen. Användaren kan sedan bedöma kvaliteten på enskilda förvärv, se grafer på olika kvalitetsindikatorer, filtrera bort oönskade förvärv och exportera data till sin slutliga lagring antingen i farten eller som ett batchjobb.

  1. Navigera till datauppsättningen som analysprogramvaran placerar data till med hjälp av en webbläsare.
  2. I datauppsättningsöversikten visar förvärvskort information om rörelsekorrigering och CTF-bestämning i ett grafiskt format. Klicka på enskilda kort för att få mer information.
  3. Aktivera DataViz-panelen för att visa aggregerade diagram från den fullständiga datauppsättningen som visar defokuserings-, astigmatism- och CTF-konfidensintervallet per förvärv (kompletterande bild 7).
  4. Använd filtren ovanpå panelen för att endast välja de data som ligger inom det begärda defokuseringsområdet, har astigmatism nära noll och CTF kan bestämmas upp till den angivna (mål) upplösningen. När filtren har ställts in trycker du på knappen Apply för att endast visa valda data i datauppsättningens översiktsfönster.
  5. När de flesta av de förvärvade bilderna ligger inom de aställda kriterierna låter du datainsamlingssessionen fortsätta att slutföras. Om bara en mycket liten del av de förvärvade bilderna uppfyller de inställda kriterierna, konfigurera antingen om inställningarna för analysprogramvaran, flytta till ett annat område i provet (tryck på knappen Nästa rutnätsruta i analysprogramvaran) eller stoppa datainsamlingen.

Representative Results

Datahanteringsportalen ger effektiv, strukturerad lagring av insamlade bilder, data och metadata från flera experimentella arbetsflöden i en enda programvaruplattform. Varje definierat experiment i ett skapat projekt består av ett arbetsflöde med kunddefinierade steg för att samla in exempelinformation, insamlade data och relaterade metadata utan några begränsningar för att ge maximal flexibilitet och användbarhet för eventuella experiment och alla användningsfall (Figur 1, Figur 2). Datahanteringsportalen har också en labbanteckningsfunktionalitet för att illustrera arbetsflödessteg, inklusive bildbehandling med mellanliggande resultat, som tillsammans kan associeras med ett projekt och ge en så fullständig post som möjligt för analys och skapande av rapporter och publikationer.

Figure 1
Bild 1: Exempel på möjlig organisering av data och metadata i datahanteringsplattformen. Varje projekt kan bestå av flera experiment, såsom kryo-EM eller massspektroskopi (dvs. protokollsteg 2.3). Varje experiment kan innehålla flera användardefinierade arbetsflöden (dvs. protokollsteg 2.5), var och en bestående av flera konfigurerbara steg (dvs. protokollsteg 2.7). Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 2
Bild 2: Visa i ett öppnat projektarbetsflöde i datahanteringsplattformen. Bilden visar associerade metadata och anteckningar till det öppnade steget i arbetsflödet. Det vänstra fältet med ikoner ger snabb åtkomst till olika alternativ och menyer på datahanteringsplattformen. Den vänstra panelen innehåller en lista över sparade arbetsflöden (visas endast ett sparat arbetsflöde "Exp2_ApoF_EFTEM_Grid7") och en blå knapp för att lägga till ett nytt arbetsflöde. Den centrala panelen visar enskilda steg i det öppnade arbetsflödet, som visas för SPA arbetsflödet här. Den blå knappen uppe till höger kan lägga till ytterligare ett steg i det öppnade arbetsflödet. Den högra panelen innehåller utrymme för antingen inspelade metadata eller användarindataAnteckningar i arbetsflödet, som kan innehålla text, tabeller och bilder. Olika formateringsalternativ för texten är tillgängliga. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Cryo-EM-galler som produceras med traditionella sänkfrysningsanordningar, såsom Vitrobot, visar vanligtvis en gradient av istjocklek över gallerytan. Vissa galler kan också skadas (böjas) efter manuell hantering och/eller klippning i en autogrid-ringbärare. Figur 3 visar exempel på olika rutnät som visas i Atlasöversikten. Gallret med tjock is eller skada bör uteslutas från vidare undersökning.

Figure 3
Figur 3: Galleri över olika rutnät som ses i Atlasöversikten. (A) Ett dåligt rutnät med tjock is, (B) ett böjt rutnät med dålig is och isförorening, (C) ett acceptabelt rutnät med god isgradient, (D) ett typiskt rutnät med bra tunn is och liten isgradient. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Valet av rutnätsrutor utan skador och optimal istjocklek är avgörande för att samla in högupplösta datamängder. Istjockleken kan variera även på nivån för enskilda rutnätsrutor, och det är därför viktigt att endast välja hål med optimalt tunn is från varje vald rutnätskvadrat. Figur 4 visar en lämplig rutnätsruta med intakt folie och tunn is i mitten. Den visade rutnätskvadraten är bra för att ställa in ett filter för automatiserat urval av hål med tunn is i alla valda rutnätsrutor eftersom den innehåller en rad olika istjockleringar samt tomma hål utan is, vilket är extremt användbart för att ställa in ett lämpligt intensitetsområde i isfiltret i hålvalsuppgiften.

Figure 4
Figur 4: Ett exempel på rutnätskvadrat med en gradient av istjocklek, från tomma rutnätsrutor i mitten och tjock is nära rutnätstängerna. Filtret för iskvalitet kan användas för att välja intervallet av intensiteter inuti hål med den ideala istjockleken som följaktligen väljs i rutnätstorget (hålen med grönt överlägg). Klicka här för att se en större version av denna figur.

Benchmark-resultat med hjälp av det beskrivna protokollet erhölls med hjälp av provet av mus apo-ferritin (apoF) från Kikkawa-gruppen11. ApoF är ett mycket α-spiralformat protein som bildar en mycket stabil oktaedrisk bur. Den höga stabiliteten och den höga symmetrin gör apoF till ett optimalt prov för högupplöst kryo-EM-avbildning och bildbehandling. ApoF har därför blivit ett standardprov för att bedöma prestanda för kryo-EM-instrument 11,12,13. En fryst alikvot innehållande 15 mg/ml renat apoF-prov tinades på is och klarades genom centrifugering vid 10 000 x g i 10 minuter. Supernatanten späddes till 5 mg/ml med 20 mM HEPES pH 7,5, 150 mM NaCl. 3 μL av det utspädda provet applicerades på ett glödurladdat R-1,2/1,3, 300 mesh guldnät i 30 s. Därefter blottades gallret i 5 s innan det sjönk frysning i flytande etan kyld av flytande kväve. Störtdykningsfrysning utfördes med hjälp av ett helautomatiskt förglasningssystem vid 100 % luftfuktighet och 4 °C. Alla rutnät klipptes i autogrids och laddades i en 200 kV Cryo-TEM. Cirka 3000 filmer samlades in med en genomströmning på 300 filmer/h. Data bearbetades med hjälp av metoderna som beskrivits11 med följande modifieringar: i) Relion 4-betaversion användes istället för Relion 3.1, ii) automatiserad partikelplockning gjordes med 2D-klassmedelvärde av tidigare apoF-rekonstruktioner som referenser, och iii) den ursprungliga 3D-modellen genererades från den tidigare apoF-rekonstruktionen lågpasserad till 15-Å-upplösning. Optikgruppering gjordes inte för denna datauppsättning eftersom den använda AFIS-proceduren34 har visat sig effektivt och tillförlitligt minimera strållutningsinducerade fasförskjutningar som inte begränsar datakvaliteten för att rekonstruera 3D-kartor vid de rapporterade upplösningarna. 3D-förfining efter Bayesiansk polering och CTF-förfining ledde till 1,68 Å upplösningskarta. Upplösningen förbättrades ytterligare med Ewaldsfärkorrigering vilket resulterade i en 1,63 Å upplösningskarta. Översikten över datainsamlings- och bearbetningsparametrar visas i tabell 2, och den slutliga rekonstruerade densitetskartan visas i figur 5, med Fourier Shell Correlation (FSC) -kurvan som visas i kompletterande figur 8.

Tabell 2: Parametrar för datainsamling och bildbehandling som används för 3D-rekonstruktion av apo-ferritin. Klicka här för att ladda ner denna tabell.

Figure 5
Figur 5: Cryo-EM-rekonstruktion av apo-ferritin. (Vänster panel) 3D-rendering av den rekonstruerade apoF cryo-EM-kartan med 1,6 Å upplösning. (Höger panel) Detaljerad bild av den rekonstruerade kartan på nivån av enskilda aminosyras sidokedjor. Tätheten av aminosyras sidokedjor är väl upplöst, och atommodellen kan entydigt byggas inom denna karta. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Effekter och fördelar med att använda ett energifilter i SPA-rekonstruktionerna utvärderades med användning av den prokaryota 20S-proteasomen isolerad från T. acidophilum. Den prokaryota 20S-proteasomen har också använts som ett standard kryo-EM-prov eftersom det representerar den stabila katalytiska kärnan i proteasomkomplexet med D7-symmetrin. Grids framställdes genom tillsats av 4,5 μL av det renade T. acidophilum 20S proteasomprovet på ett glödurladdat 200-mesh R2/1 kopparnät. Proverna förglasades i en flytande etan/propanblandning med hjälp av ett helautomatiskt förglasningssystem inställt på 4 °C och 100 % fuktighet med en fläckkraft på 20 och en fläcktid på 4,5 s.

Tre olika dataset samlades in från samma kryo-EM-rutnät med liknande rutnätsrutor med en annan slitsbredd på energifiltret i ordningen: i) slits helt öppen (ingen slits införd), ii) 20 eV slits och iii) 10 eV slits. Rutnätsrutorna valdes med hjälp av ett iskvalitetsfilter i analysprogramvaran. Alla andra parametrar för datainsamling och databehandling behölls desamma. Dataset samlades in i 15 timmar med totalt 4000 filmer och bearbetades med hjälp av metoderna som beskrivs11 med relion 3.1 med modifieringen att Laplacian-of-Gaussian partikelplockningsalgoritm användes för att producera initiala 2D-klassmedelvärde för referensbaserad partikelplockning från de fullständiga dataseten. Samma antal (102 200) slumpmässigt utvalda partiklar valdes och användes för den slutliga iterationen och 3D-rekonstruktionen av varje dataset. Databehandlingsvariabler beskrivs i tabellen (tabell 3) nedan för att uppnå den slutliga rekonstruerade EM-densitetskartan som visas i figur 6 med FSC-kurvan som visas i tilläggsfigur 9. Optikgruppering och Ewald-sfärkorrigering gjordes inte heller för dessa dataset.

Tabell 3: Parametrar för datainsamling och bildbehandling som används för 3D-rekonstruktion av proteasomen T. acidophilum 20S. Klicka här för att ladda ner denna tabell.

Tabell 4: Sammanfattning av uppnådd upplösning och B-faktor för kryo-EM-rekonstruktioner av T. acidophilum 20S-proteasomen med hjälp av dataset med olika energislitsbredd. Klicka här för att ladda ner denna tabell.

Figure 6
Figur 6: Effekt av energifiltrering på kryo-EM-bilder. (A) Cryo-EM-bilder vid olika defokusvärden som samlats in med eller utan 10 eV-slits. (B) Översikt över 20S proteasomkryo-EM-kartan med segmenterade underenheter. (C) Zoomvy på 20S proteasomkarta med en monterad atommodell. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Kompletterande figur 1: Kalibrering av bildförskjutningsuppgift (gul ellips) för att justera bildförskjutningar mellan olika optiska förinställningar (röda ellipser) i analysprogramvaran, med hjälp av en kristall av sexkantig is som är synlig i hela förstoringsområdet mellan 100x och 165 000x. (Överst) Kalibrering mellan förinställningarna Datainsamling och Hål/Eucentrisk höjd, (mitten) kalibrering mellan förinställningarna Hål/Eucentrisk höjd och Rutnätskvadrat, (nedre) kalibrering mellan förinställningarna Rutnätskvadrat och Atlas. Klicka här för att ladda ner den här filen.

Kompletterande figur 2: Autostigmate funktion i analysprogramvara (gul ellips). (Vänster bild) Förvärvad bild. (Höger bild) Fourieröverföring av den förvärvade bilden som visar koncentriska Thon-ringar och deras CTF-passform som visas i radiella balkar. Klicka här för att ladda ner den här filen.

Kompletterande figur 3: Användargränssnitt för Autokomfunktionen i analysprogramvara (gul ellips) för komajustering. Bildpanelen visar Fourier-överföringsbilder som förvärvats vid olika strållutningar och deras CTF-passningar som används för beräkning av koma. Klicka här för att ladda ner den här filen.

Kompletterande figur 4: Användargränssnitt för inställning av energifilter. Exempel på en bra tunnningsrapport om energifiltrets isokromaticitet med alla parametrar (visas i grön text) inom specifikationerna. Klicka här för att ladda ner den här filen.

Kompletterande figur 5: Användargränssnitt för inställning av energifilter. Exempel på bra justeringsrapport om energifilterförstoringsförvrängningar med alla parametrar (visas i grön text) inom specifikationerna. Klicka här för att ladda ner den här filen.

Kompletterande figur 6: Användargränssnitt för inställning av energifilter. Exempel på bra inställning av energifiltrets kromatiska distorsioner med alla parametrar (visas i grön text) inom specifikationerna. Klicka här för att ladda ner den här filen.

Kompletterande figur 7: DataViz-panelen i EPU Quality Monitor med en översikt över datakvaliteten i en insamlad cryo-EM-dataset. Graferna med aggregerade data från alla insamlade bilder/filmer visar värden (punktdiagram) och fördelning (stapeldiagram) för utvalda kritiska kvalitetsindikatorer, såsom CTF-passformsförtroende (blå), defokus (orange) och astigmatism (grön). En delmängd av de insamlade bilderna/filmerna kan väljas genom att ställa in parameterfilter högst upp på DataViz-panelen. Efter att filtren har tillämpats kan utvalda bilder/filmer exporteras för vidare bearbetning i ett annat bildbehandlingspaket, till exempel Relion eller CryoSpark. Klicka här för att ladda ner den här filen.

Kompletterande figur 8: FSC-kurva för den slutliga rekonstruktionen av apoF till 1,6 Å upplösning, som rapporterats av Relion 4-beta. Den blå kurvan visar FSC av maskerade 3D-kartor från två oberoende raffinerade 3D-rekonstruktioner från två ömsesidigt exklusiva halvdataset. Enligt guldstandarden FSC vid 0,143 motsvarar upplösningen av den slutliga 3D-kartan rekonstruerad från hela datasetet 1,6 Å. Den orange kurvan visar FSC för de maskerade 3D-rekonstruktionerna med randomiserade faser. Det snabba fallet av FSC-kurvan indikerar att den använda masken inte bidrog till den observerade FSC för de ursprungliga rekonstruerade kartorna (blå kurva) utöver ~ 2 Å upplösning. Klicka här för att ladda ner den här filen.

Kompletterande figur 9: FSC-kurvor för den slutliga rekonstruktionen av T. acidophilum 20S proteasom med olika slitsbredder på energifiltret, som rapporterats av Relion 3.1. De blå kurvorna visar FSC för maskerade 3D-kartor från två oberoende förfinade rekonstruktioner från två halva dataset av varje dataset. Guldstandarden FSC vid 0,143 indikerar de uppnådda upplösningarna för de slutliga 3D-kartorna rekonstruerade från respektive fullständiga dataset (2,3 Å, 2,2 Å respektive 2,1 Å upplösning). De röda kurvorna visar FSC av maskerade kartor med slumpmässiga faser. Den snabba nedgången i de röda FSC-kurvorna indikerar att den använda masken inte bidrog till FSC för de ursprungliga rekonstruerade kartorna utöver ~ 3 Å upplösning. De gröna kurvorna visar FSC för omaskerade 3D-kartor, som påverkas av brus i hela den rekonstruerade 3D-volymen och därför sjunker tidigare än FSC för de maskerade 3D-kartorna. Klicka här för att ladda ner den här filen.

Tillgänglighet av data: Kryo-EM-densitetskartorna har deponerats i EM-databanken under anslutningsnummer: apoferritin: EMD 14173, EMPIAR-10973. 20S proteasom: EMD 14467, EMPIAR-10976.

Discussion

Det beskrivna protokollet förutsätter att optiken hos det använda TEM-mikroskopet är i ett väljusterat tillstånd. För TEM på 200 kV som används i detta protokoll görs, verifieras och sparas sådana kolumnjusteringar av en erfaren servicetekniker efter mikroskopinstallation eller någon betydande serviceintervention. Dessa justeringsinställningar kan återkallas när som helst i mikroskopets användargränssnitt. Användare kan använda direct alignment-procedurerna i mikroskopgränssnittet för att justera kritiska parametrar igen. Vissa inriktningar, såsom pistollutning och pistolförskjutning, är stabila och behöver inte justeras av användare dagligen. Kontroller och omjusteringar (om så krävs) av pistollutning och förskjutning av mikroskopövervakaren rekommenderas två gånger om året. Å andra sidan är vissa anpassningar kritiska och måste anpassas före varje datainsamling som beskrivs i protokollet ovan (såsom objektiv astigmatism och komafri anpassning). Om Autokoma-funktionen i analysprogramvaran inte konvergerar, bör justering av strålens lutningssvängpunkter och/eller rotationscentrum verifieras och justeras, och korrekt centrering av C2-bländaren bör bekräftas. Därefter bör Autostigmate-funktionen köras eftersom objektiva stigmatorer också används för komakorrigering. Dessa justeringar bör itereras tills både Autostigmate och Autocomafunctions lyckas med sin första iteration. Vid behov kan ett annat område väljas (t.ex. stödja kolfolie utan is), avbildad defokus justeras eller bildförvärvstiden ökas för att optimera signal-brusförhållandet i förvärvade bilder och synligheten för flera Thon-ringar i Fourier-transformen av de förvärvade bilderna.

Moderna kryo-EM-mikroskop genererar stora mängder data som ofta överstiger 1 TB per dataset för att uppnå högupplösta 3D-rekonstruktioner, särskilt för proteiner med låg symmetri. Cryo-EM-data och resultat kompletteras också vanligtvis med data och resultat från ortogonala metoder för att fullt ut förstå struktur-funktionsrelationer i varje vetenskapligt projekt. Organisering av insamlade data, deras överföring till en bildbehandlingspipeline och delning av en resulterande kryo-EM-rekonstruktion bland medarbetare ställer ytterligare krav på nya adoptörer av kryo-EM-metodik för att inrätta sin lokala IT-infrastruktur. Datahanteringsprogramvara, såsom Athena, underlättar centraliserad lagring av data som förvärvats av alla anslutna instrument eller program som drivs av en registrerad användare. Lagrade data och metadata är tillgängliga med ett enkelt webbläsargränssnitt för flera användare, som kan ha olika roller i projektet med olika åtkomsträttigheter (antingen som ägare, medarbetare eller tittare) baserat på deras inloggningsuppgifter och datadelningsdefinition i experimentkonfigurationen. Denna digitalisering av experimentella arbetsflöden ger möjlighet till data- och metadatadelning mellan medarbetare utan onödigt dubbelarbete och ökar produktiviteten och spårbarheten för använda arbetsflöden. Implementering av en allmän och anpassningsbar struktur av projekt, experiment och arbetsflöden i datahanteringsprogramvara är universell och möjliggör anpassning och integration av ortogonala experiment med hjälp av kompletterande metoder i en enda projektdatabas.

Valet av områden för datainsamling på ett kryo-EM-nät är avgörande för ett framgångsrikt förvärv av högupplösta dataset. Cryo-EM-galler som produceras med traditionella fallfrysningsanordningar, såsom Vitrobot (ett helautomatiserat förglasningssystem), kommer vanligtvis att visa en gradient av istjocklek över gallerytan (figur 4). Detta kan vara fördelaktigt eftersom gallret innehåller områden med olika istjocklekar; Områden med den ideala istjockleken för datainsamling måste dock identifieras enligt beskrivningen i protokollet ovan. Ett optimalt kryo-EM-nät bör innehålla så lite överföringsisförorening som möjligt och innehålla tillräckligt med rutnätsrutor med intakt hålig stödfolie. Insamling av data om rutnätsrutor som har sprickor eller trasiga områden rekommenderas inte eftersom insamlade bilder kommer att påverkas av betydligt starkare total drift vid belysning av en elektronstråle jämfört med rutnätsrutorna med intakt stödfolie. Överskott av kristallin is kan täppa till majoriteten av foliehålen och / eller störa autofokusering och sådana rutnätsrutor bör också undvikas. Rutnätsrutor med tunn is uppvisar vanligtvis stora glasytor och många ljusa foliehål som syns i en bild tagen med Atlas-förinställningen. Förekomsten av tjockare is nära gallerstänger är att förvänta sig och okritisk eftersom foliehål i dessa områden av rutnätstorget utesluts under hålvalsförfarandet. Närvaron av flera tomma hål i en rutnätskvadrat kan betyda att glasris i de omgivande hålen är extremt tunn och kan innehålla skadade partiklar eller inga partiklar alls. I allmänhet är det klokt att välja rutnätsrutor med olika istjocklekar vid olika regioner på nätet för inledande screening och bedömning för att förstå vilka områden som har de bästa förutsättningarna för högupplöst datainsamling och uppvisar den ideala partikeldensiteten och orienteringsfördelningen. För de apoF- och 20S-proteasomprover som används i denna studie innehåller områden med den tunnaste observerbara isen de bästa förutsättningarna för högupplöst avbildning av dessa prover.

När du väljer hål automatiskt i alla valda rutnätsrutor med hjälp av datainsamlingsprogramvaran rekommenderas det att utföra mallkörningsuppgift på ett representativt hål i varje rutnätsruta för att kontrollera och säkerställa att varken alltför tjocka eller alltför tunna eller oväntat icke-glasrutor valdes för datainsamling. Under datainsamlingen kan viktiga kvalitetsindikatorer för insamlade bilder, såsom bilddrift och CTF-montering, övervakas med EQM. Datainsamlingen kan sedan optimeras genom att hoppa över områden som ger bilder av dålig kvalitet. Bilder med högupplösta CTF-passningar kan dock fortfarande innehålla bilder med partiklar i några få föredragna riktningar eller partiklar denaturerade i ett för tunt islager. Partikelplockning i realtid och 2D-klassificering från insamlade bilder skulle ge ytterligare information om kvaliteten på strukturdata i avbildade partiklar och avslöja både föredragna orienteringar av intakta partiklar i is eller inkonsekvent struktur av (delvis) denaturerade partiklar. Beräkning av klassmedelvärde kan därför bidra till att ytterligare förfina lämpliga regioner för datainsamling, vilket redan har implementerats och visats i andra programvarupaket23,28.

Val av avbildningsinställningar för datainsamling, såsom förstoring, elektrondosrat och defokusområde, beror på flera kriterier, såsom målupplösning, proteinets storlek, provkoncentration, önskad mikroskopgenomströmning etc. För den direkta elektrondetektorkameran som användes i dessa experiment valdes elektrondosraten i intervallet 4-5 e-/pix/s genom att välja en lämplig SPOT-storlek och intensitet för att upprätthålla parallell belysning. Som visas i tabell 1 kan en annan SPOT-storlek användas i förinställningen Hål/Eucentrisk höjd för att säkerställa tillräckligt signal-brusförhållande i bilden för centrering av hål under datainsamling. Förstoringen bör väljas så att pixelstorleken är minst 2-3x mindre än målupplösningen för kryo-EM-rekonstruktionen. Den högre förstoringen (dvs. mindre pixelstorlek) används dock, det mindre synfältet fångas i bilder och det finns mindre partiklar per bild, vilket i slutändan leder till längre datainsamlingstid för att samla in bilder med tillräckligt med partiklar för att rekonstruera 3D-kartor till en hög upplösning. För apoF-provet använde vi pixelstorleken 0,43 Å eftersom vi hade tillräcklig provkoncentration för hög densitet av partiklar i bilder och riktade sub-2 Å upplösning av rekonstruktionen. För 20S-proteasomprovet använde vi pixelstorleken 0,68 Å för att täcka ett större synfält i förvärvade bilder. Typiskt för 200 kV TEM-mikroskop förvärvas kryo-EM-bilder i defokusområdet från 0,8 till 2,0 μm. Men med det förbättrade kontrast- och signalbrusförhållandet med hjälp av energifiltret kan datainsamlingar göras mycket närmare fokus för att bättre bevara högupplöst information i förvärvade bilder på grund av mindre avvikelser och motsvarande minskat sönderfall av CTF-kuvertfunktionen. Vi använder inte heller en objektiv bländare eftersom bländaren kan införa ytterligare bildavvikelser medan bildkontrasten redan är tillräckligt förbättrad genom att använda energifiltret. För apoF- och 20S-proteasomproverna använde vi defokusinställningarna på 0,5 μm, 0,7 μm och 0,9 μm. För mindre proteiner (<200 kDa) använde vi defokusinställningar på -0,5 μm, -0,7 μm och -0,9 μm för att förbättra partiklarnas kontrast och underlätta enklare partikelplockning och initial grov inriktning i 3D-förfiningssteget för 3D-rekonstruktion, vilket ledde till ~ 2,5 Å upplösning 3D-kartor (opublicerade resultat).

Vi har redan visat att avbildning med ett energifilter förbättrar signal-brusförhållandet (SNR) i kryo-EM-bilder som samlats in på de avancerade 300 kV TEM-mikroskopen11. Faktum är att när elektroner passerar genom ett prov uppstår två huvudtyper av interaktioner: i) Elastiskt spridda elektroner bibehåller sin energi och bidrar till bildbildning genom störningar i den icke-spridda infallande strålen via faskontrastmekanismen ii) oelastiskt spridda elektroner förlorar lite energi i provet och bidrar huvudsakligen till brus i bilder. Därför kan SNR förbättras avsevärt genom att filtrera de oelastiskt spridda elektronerna, som har lägre energi än den infallande strålen och elastiskt utspridda elektroner, med hjälp av en smal energislits. Det är dock viktigt att använda ett tillräckligt stabilt energifilter, såsom Selectris eller Selectris-X, för att kunna använda mycket smala (10 eV eller mindre) slitsar under lång (12+ timmar) automatiserad datainsamling av högupplösta kryoEM-dataset.

Cryo-EM-bilder som förvärvats med 200 kV TEM-mikroskop vid samma förhållanden som med 300 kV TEM-mikroskop uppvisar mindre SNR vid hög upplösning (särskilt <4 Å) på grund av snabbare sönderfall av CTF-kuvertfunktionerna. Följaktligen krävs ett högre antal partiklar (och därmed ett högre antal insamlade bilder) för att uppnå en viss upplösning vid användning av 200 kV TEM. Dessutom är skärpedjupet (10-25 nm i upplösningsområdet 2-3 Å) också cirka 20% mindre i 200 kV-bilder35, vilket innebär att mindre partiklar i isskiktet (vanligtvis 20-50 nm tjockt) kommer att vara helt i fokus och konstruktivt bidra till alla högupplösta funktioner i en beräknad 3D-rekonstruktion om inte defokusvärdena förfinas för varje partikel oberoende av varandra i de senare stadierna av 3D-rekonstruktionsproceduren. För större partiklar (såsom ikosaedriska virioner eller andra makromolekylära sammansättningar) kan partikelstorleken överstiga skärpedjupet vid höga upplösningar och införa fasfel på grund av plan approximation av Ewaldsfären i standard 3D-rekonstruktionsalgoritmerna36. Dessa fel kan förfinas av avancerade algoritmer som redan är implementerade i vanliga kryo-EM-bildbehandlingspaket 37,28,39. Eftersom Ewaldsfären har större krökning i 200 kV-data än 300 kV-data behövs Ewald-sfärkorrigeringen vid relativt lägre upplösningar och/eller för relativt mindre makromolekylära enheter vid användning av 200 kV TEM. Å andra sidan uppvisar 200 kV-bilder högre kontrast av partiklar i tunn is (20-50 nm) som är betydligt tunnare än 200-300 keV-elektronens genomsnittliga fria väg (220-280 nm). Den högre kontrasten bidrar till att förbättra den korrekta globala inriktningen av enskilda partiklar, särskilt för svagt spridda mindre proteiner vars struktur ännu inte är känd, och 3D-referensmodellen är ännu inte väl etablerad.

Här visade vi på exemplet med en 20S proteasom att bildkontrast och kvalitet på samma sätt kan förbättras med ett energifilter när man använder ett 200 kV TEM-mikroskop. Med samma antal partiklar rekonstruerades data som samlats in med hjälp av 20 eV-slitsen till 2,26 Å-upplösning jämfört med data som samlats in med den helt öppnade energislitsen som endast rekonstruerades till 2,34 Å-upplösning. Den bästa rekonstruktionen uppnåddes från data som samlats in med hjälp av 10 eV-slitsen som rekonstruerades till 2,14 Å upplösning. Dessa resultat är i överensstämmelse med den teoretiska förutsägelsen att filtrering av de olastiskt spridda elektronerna ökar SNR i insamlade bilder och underlättar högre upplösning i kryo-EM-rekonstruktioner från det givna antalet partiklar, som sammanfattas i tabell 4. Dessa resultat bekräftades ytterligare av B-faktorer beräknade från dessa dataset som indikerar högre kvalitet på bilderna i de energifiltrerade dataseten.

Vi kan därför dra slutsatsen att medan 300 kV TEM-mikroskop levererar högsta genomströmning och högsta möjliga upplösning i kryo-EM-rekonstruktioner, ger 200 kV TEM-mikroskop också högkvalitativa dataset för högupplösta kryo-EM-rekonstruktioner. Vi visade här att kvaliteten på förvärvade bilder, och därmed den totala tiden till struktur, kan förbättras ytterligare genom att använda 200 kV TEM utrustad med ett energifilter och en direktelektrondetektor. Det presenterade protokollet beskriver alla nödvändiga steg för hur man rutinmässigt kan erhålla högupplösta kryo-EM-data med hjälp av denna inställning och avslöja fina strukturella detaljer om makromolekylära 3D-strukturer, som är väsentliga för att förstå de viktigaste struktur-funktionsförhållandena i strukturbiologi och strukturbaserad läkemedelsdesign.

Disclosures

Sagar Khavnekar rapporterar inga intressekonflikter. De andra författarna är anställda vid Thermo Fisher Scientific, MSD-EM-divisionen.

Acknowledgments

Ingen.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
AutoGrid rings Thermo Fisher Scientific 1036173 Package of 100x AutoGrid rings for the standard EM grids.
C-Clip Thermo Fisher Scientific 1036171 Package of 100 clips that secure
the standard EM grids inside the AutoGrid rings.
Data Management Platform Thermo Fisher Scientific 1160939 Part of the Glacios base configuraiton; includes Athena Software
EPU Quality Monitor Thermo Fisher Scientific 1179770
EPU Software Thermo Fisher Scientific 1025080 Part of the Glacios base configuration
Ethane 3.5 Westfalen A06010110 Ethane gas used for making liquid ethane (puritiy at least N35, i.e. 99.95% vol)
Falcon 4 200kV Thermo Fisher Scientific 1166936 Direct electron detector
Glacios Thermo Fisher Scientific 1149551 200 kV TEM
GloQube Plus Glow Discharge System for TEM Grids and surface modification Quorum N/A also available via Thermo Fisher Scientific (PN 1160602)
QuantiFoil grids Quantifoil N/A R-2/1, 300 mesh; carbon foil grid
Relion MRC Laboratory of Molecular Biology N/A open source software:
https://relion.readthedocs.io/en/release-3.1/
Selectris with Falcon
4 for 200 kV		 Thermo Fisher Scientific 1191753 Energy filter
Selectris X with Falcon
4 for 200 kV		 Thermo Fisher Scientific 1191755 Energy filter
UltrAuFoil grids Quantifoil N/A R-1.2/1.2, 300 mesh; gold foil grids
Vitrobot Mk. IV Thermo Fisher Scientific 1086439 Automated vitrification system
Whatman 595 filter paper Thermo Fisher Scientific AA00420S

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Wang, J., Hua, T., Liu, Z. -J. Structural features of activated GPCR signaling complexes. Current Opinions in Structural Biology. 63, 82-89 (2020).
  2. Chen, S., Gouaux, E. Structure and mechanism of AMPA receptor - auxiliary protein complexes. Current Opinions in Structural Biology. 54, 104-111 (2019).
  3. Kühlbrandt, W. Structure and mechanisms of F-Type ATP synthases. Annual Review of Biochemistry. 88, 515-549 (2019).
  4. Laverty, D., et al. Cryo-EM structure of the human α1β3γ2 GABA A receptor in a lipid bilayer. Nature. 565 (7740), 516-520 (2019).
  5. Liu, F., Zhang, Z., Csanády, L., Gadsby, D. C., Chen, J. Molecular structure of the Human CFTR ion channel. Cell. 169 (1), 85-95 (2017).
  6. Wrapp, D., et al. Cryo-EM structure of the 2019-nCoV spike in the prefusion conformation. Science. 367 (6483), 1260-1263 (2020).
  7. Ke, Z., et al. Structures and distributions of SARS-CoV-2 spike proteins on intact virions. Nature. 588, 498-502 (2020).
  8. Yan, R., Zhang, Y., Li, Y., Xia, L., Guo, Y., Zhou, Q. Structural basis for the recognition of SARS-CoV-2 by full-length human ACE2. Science. 367 (6485), 1444-1448 (2020).
  9. Walls, A. C., Park, Y. -J., Tortorici, M. A., Wall, A., McGuire, A. T., Veesler, D. Structure, function, and antigenicity of the SARS-CoV-2 spike glycoprotein. Cell. 180, 281-292 (2020).
  10. Chiba, S., et al. Multivalent nanoparticle-based vaccines protect hamsters against SARS-CoV-2 after a single immunization. Communications Biology. 4 (1), 597 (2021).
  11. Nakane, T., et al. Single-particle cryo-EM at atomic resolution. Nature. 587, 152-156 (2020).
  12. Bai, X. C. Seeing atoms by single-particle Cryo-EM. Trends in Biochemical Sciences. 46 (4), 253-254 (2021).
  13. Koh, A., et al. High-resolution cryo-EM at 200kV enabled by Selectris-X and Falcon 4. Microscience Microscopy Congress 2021. , Abstract 212 (2021).
  14. Herzik, M. A., Wu, M., Lander, G. C. Achieving better-than-3-Å resolution by single-particle cryo-EM at 200 keV. Nature Methods. 14 (11), 1075-1078 (2017).
  15. Herzik, M. A., Wu, M., Lander, G. C. High-resolution structure determination of sub-100 kDa complexes using conventional cryo-EM. Nature Communications. 10 (1), 1032 (2019).
  16. Wu, M., Lander, G. C., Herzik, M. A. Sub-2 Angstrom resolution structure determination using single-particle cryo-EM at 200 keV. Journal of Structural Biology X. 4, 100020-100029 (2020).
  17. Mori, T., et al. C-Glycoside metabolism in the gut and in nature: Identification, characterization, structural analyses and distribution of C-C bond-cleaving enzymes. Nature Communications. 12 (1), 6294 (2021).
  18. Hamdi, F., et al. 2.7 Å cryo-EM structure of vitrified M. musculus H-chain apoferritin from a compact 200 keV cryo-microscope. PLoS One. 15 (5), 0232540 (2020).
  19. Abbott, S., et al. EMDB web resources. Current Protocols in Bioinformatics. 61 (1), 1-12 (2018).
  20. Punjani, A., Rubinstein, J. L., Fleet, D. J., Brubaker, M. A. CryoSPARC: algorithms for rapid unsupervised cryo-EM structure determination. Nature Methods. 14 (3), 290-296 (2017).
  21. Scheres, S. H. W. RELION: Implementation of a Bayesian approach to cryo-EM structure determination. Journal of Structural Biology. 180 (3), 519-530 (2012).
  22. Gómez-Blanco, J., et al. Using Scipion for stream image processing at Cryo-EM facilities. Journal of Structural Biology. 204 (3), 457-463 (2018).
  23. Tegunov, D., Cramer, P. Real-time cryo-electron microscopy data preprocessing with Warp. Nature Methods. 16 (11), 1146-1152 (2019).
  24. Lander, G. C., et al. Appion: an integrated, database-driven pipeline to facilitate EM image processing. Journal of Structural Biology. 166 (1), 95-102 (2009).
  25. Carragher, B., et al. Current outcomes when optimizing 'standard' sample preparation for single-particle cryo-EM. Journal of Microscopy. 276 (1), 39-45 (2019).
  26. Drulyte, I., et al. Approaches to altering particle distributions in cryo-electron microscopy sample preparation. Acta Crystallographica. Section D, Structural Biology. 74 (6), 560-571 (2018).
  27. Bloch, M., Santiveri, M., Taylor, N. M. I. Membrane protein Cryo-EM: Cryo-grid optimization and data collection with protein in detergent. Methods in Molecular Biology. 2127, 227-244 (2020).
  28. Cheng, A., et al. Leginon: New features and applications. Protein Science. 30 (1), 136-150 (2021).
  29. Schorb, M., et al. Software tools for automated transmission electron microscopy. Nature Methods. 16 (6), 471-477 (2019).
  30. Li, X., et al. Electron counting and beam-induced motion correction enable near-atomic-resolution single-particle cryo-EM. Nature Methods. 10 (6), 584-590 (2013).
  31. Alewijnse, B., et al. Best practices for managing large CryoEM facilities. Journal of Structural Biology. 199, 225-236 (2017).
  32. Baldwin, P. R., et al. Big data in cryoEM: automated collection, processing and accessibility of EM data. Current Opinion in Microbiology. 43, 1-8 (2018).
  33. Guo, H., et al. Electron-event representation data enable efficient cryoEM file storage with full preservation of spatial and temporal resolution. International Union of Crystallography Journal. 7, 860-869 (2020).
  34. Weis, F., Hagen, W. J. H. Combining high throughput and high quality for cryo-electron microscopy data collection. Acta Crystallographica. Section D, Structural Biology. 76 (8), 724-728 (2020).
  35. Zhou, H., Chiu, W. Determination of icosahedral virus structures by electron cryomicroscopy at subnanometer resolution. Advances in Protein Chemistry. 64, 93-124 (2005).
  36. DeRosier, D. J. Correction of high-resolution data for curvature of the Ewald sphere. Ultramicroscopy. 81 (2), 83-98 (2000).
  37. Wolf, M., DeRosier, D. J., Grigorieff, N. Ewald sphere correction for single-particle electron microscopy. Ultramicroscopy. 106 (4-5), 376-382 (2006).
  38. Leong, P. A., Yu, X., Hong Zhou, Z., Jensen, G. J. Correcting for the ewald sphere in high-resolution single-particle reconstructions. Methods in Enzymology. 482, 369-380 (2010).
  39. Zivanov, J., et al. New tools for automated high-resolution cryo-EM structure determination in RELION-3. eLife. 7, 42166 (2018).

Tags

Biokemi utgåva 181 kryo-EM hög upplösning struktur inriktningar datainsamling datahantering Glacios EPU energifilter
Rutinmässig insamling av högupplösta kryo-EM-dataset med 200 KV transmissionselektronmikroskop
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Koh, A., Khavnekar, S., Yang, W.,… More

Koh, A., Khavnekar, S., Yang, W., Karia, D., Cats, D., van der Ploeg, R., Grollios, F., Raschdorf, O., Kotecha, A., Němeček, D. Routine Collection of High-Resolution cryo-EM Datasets Using 200 KV Transmission Electron Microscope. J. Vis. Exp. (181), e63519, doi:10.3791/63519 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter