Summary
Dette arbeidet beskriver utviklingen av fleksible interdigiterte elektroder for implementering i 3D hjernesvulstmodeller, nemlig in vitro-kultur, i ovo-modell og in vivo murine modell. Den foreslåtte metoden kan brukes til å evaluere effekten av pulserende elektriske felt på svulster på forskjellige nivåer av kompleksitet.
Abstract
Glioblastom er vanskelig å utrydde med standard onkologiske terapier på grunn av sin høye grad av invasivitet. Bioelektriske behandlinger basert på pulserende elektriske felt (PEF) er lovende for forbedring av behandlingseffektiviteten. Imidlertid er de avhengige av stive elektroder som forårsaker akutt og kronisk skade, spesielt i bløtvev som hjernen. I dette arbeidet ble fleksibel elektronikk brukt til å levere PEF til svulster, og den biologiske responsen ble evaluert med fluorescerende mikroskopi. Interdigitated gullelektroder på et tynt, gjennomsiktig parylen-C-substrat ble belagt med den ledende polymeren PEDOT: PSS, noe som resulterte i en konformbar og biokompatibel enhet. Effektene av PEF på svulster og deres mikromiljø ble undersøkt ved hjelp av ulike biologiske modeller. Først ble monolayers av glioblastomceller dyrket på toppen av elektrodene for å undersøke fenomener in vitro. Som et mellomliggende trinn ble det utviklet en in ovo-modell der konstruerte tumorsfæroider ble podet i den embryonale membranen til en vaktel. På grunn av fraværet av et immunsystem førte dette til svært vaskulariserte svulster. På dette tidlige utviklingsstadiet har embryoer ikke noe immunsystem, og svulster blir ikke gjenkjent som fremmedlegemer. Dermed kan de utvikle seg raskt mens de utvikler sine egne fartøy fra det eksisterende embryovaskulære systemet, som representerer en verdifull 3D-kreftmodell. Til slutt ble fleksibel elektrodelevering av PEF evaluert i en komplett organisme med et funksjonelt immunsystem, ved hjelp av en syngen, ortograft (intrakraniell) musemodell. Tumor sfæroider ble podet inn i hjernen til transgene multifluorescerende mus før implantasjon av fleksible organiske elektrodeenheter. Et forseglet kranialvindu muliggjorde multifotonavbildning av svulsten og dens mikromiljø under behandling med PEF over en periode på flere uker.
Introduction
Glioblastoma multiforme (GBM) er en svært invasiv svulst og derfor vanskelig å utrydde med standardbehandlinger som reseksjon, strålebehandling og kjemoterapi. Til tross for multimodal behandling er prognosen fortsatt svært dårlig, og de fleste pasientene opplever sykdomsprogresjon innen 1 år etter diagnose 1,2. Nylig har utviklingen av bioelektriske behandlinger vist stort potensial for å forbedre eksisterende terapier. Disse terapiene bruker levering av pulserende elektriske felt (PEF), vanligvis i en enkelt behandlingsøkt, for å forstyrre cellulær membranintegritet og mikromiljøet til svulster. Denne cellemembranforstyrrelsen, også kjent som elektroporering, kan være reversibel eller irreversibel avhengig av elektrisk feltintensitet og antall pulser. Irreversibel elektroporering (IRE) brukes som en ikke-termisk vevsablasjonsteknikk der elektriske pulser forårsaker dødelig skade på cellulære membraner som fører til celledød3. Reversibel elektroporering brukes i elektrokjemoterapi (ECT), en etablert teknikk som består av levering av PEF i kombinasjon med kjemoterapimedisiner for å øke legemiddelopptaket i kreftceller4. Videre viste nyere studier kalsiumelektroporering som et alternativ til ECT med høy effektivitet for kreftbehandling, noe som også er billig og induserer færre bivirkninger5. Til tross for disse lovende fremskrittene, brukes PEF vanligvis ved hjelp av stive, metalliske elektroder som er kjent for å forårsake skade på bløtvev6. Hjernen er spesielt følsom for slike invasive enheter der det mekaniske misforholdet induserer betennelse og astroglial arrdannelse7.
I denne sammenheng presenteres et fleksibelt PEF-leveringssystem i kombinasjon med 3D-modeller av glioblastomtumorer, fra mikrofabrikasjon til en murinmodell. Konforme elektroder er laget med standard tynnfilmmikrofabrikasjonsprosesser, inkludert bruk av myke og biokompatible materialer som parylen-C, gull og PEDOT: PSS 8,9. En interdigitated elektrode design brukes til å dekke et stort overflateareal samtidig opprettholde tilstrekkelig gjennomsiktighet for avbildning mellom elektrodefingrene10. For tumormodellen produseres 3D-sfæroider av glioblastomceller som uttrykker en genetisk kodet fluorescensreporter ved hjelp av en variant av væskeoverlegget 96-brønnplatemetoden11. Sfæroidene er podet inn i chorioallantoic membranen til et vaktelembryo, noe som resulterer i en in ovo-modell som har blitt mye brukt til å studere angiogenese eller legemiddeltoksikologi12,13. Tumorer kan podes og vaskulariseres av embryoets vaskulatur i fravær av et immunsystem på dette stadiet av embryonal utvikling12. Fleksible elektroder plasseres deretter på toppen av den vaskulariserte svulsten for å studere effekten av PEF-levering på sfæroid og dens vaskulatur. Til slutt undersøkes disse effektene på en komplett levende organisme, inkludert tumormikromiljø og immunsystem, ved å implantere konstruerte sfæroider i hjerneparenkymet av murine modeller14. Fleksible elektroder plasseres på toppen av innføringsstedet, og kraniotomien er forseglet med et glassvindu, noe som tillater gjentatt to-foton avbildning over flere uker.
Disse metodene vil være nyttige for folk som er interessert i ulike domener som spenner fra mikroelektronikkteknikk til onkologiske applikasjoner. Mikrofabrikasjonsprotokollen kan brukes og tilpasses for alle bruksområder som krever tynnfilmmetallelektroder belagt med PEDOT: PSS. Videre vil de biologiske modellene utviklet for evaluering av antitumor elektriske behandlinger være av generell interesse for undersøkelsen av differensiering av cellulær, vaskulær og immunrespons mot implanterte materialer.
Protocol
Alle forsøksprosedyrer ble utført i samsvar med fransk lovgivning og i samsvar med Det europeiske fellesskaps rådsdirektiv av 24. november 1986 (86/609/EØF) om stell og bruk av forsøksdyr. Forskningen på dyr ble godkjent av Direction Départementale des Services Vétérinaires des Bouches-du-Rhône og godkjent av den etiske komiteen i Provence Cote D'Azur (Apafis # 22689-2019100414103054).
1. Mikrofabrikasjon av fleksibel enhet (figur 1)
- Rengjøring av glasslysbildene
- Sonikere glass glir i 2% såpeoppløsning i 15 minutter. Skyll dem med vann.
- Sonikere igjen i en blanding av 80% ren aceton og 20% ren isopropanol i 15 minutter.
FORSIKTIG: Disse løsemidlene er skadelige og brannfarlige. Bruk personlig verneutstyr (PPE) og håndter dem under en avtrekkshette. - Skyll lysbildene med isopropanol og tørk med en luftpistol.
NOTAT: Forsikre deg om at aceton ikke tørker på underlagene under hele prosessen.
- Gullelektrodemønster (Figur 1A)
- Deponer et 3 μm lag parylen-C (PaC) med et parylenavsetningssystem (figur 1Aa).
- Plasser de rengjorte glasslysbildene i avsetningskammeret. Spray såpe på kjøleren, la den tørke, og sett den inn i den angitte kaldfellen til avsetningssystemet. Dette anti-limet gjør det enkelt å fjerne PaC fra kjøleren etter avsetningen.
FORSIKTIG: PaC er irriterende og utgjør en helsefare. Bruk hansker mens du håndterer den. - Vei 6 g PaC i en aluminiumsbåt og legg den i ovnen. Fjern maskinen (P = 10 mTorr) og start avsetningen med følgende parametere: TChiller = -100 °C, TFurnace = 690 °C, TVaporizer = 175 °C ogT-kammer = 135 °C.
- Når avsetningen er ferdig og temperaturen på fordamperen er under 40 °C, slår du av kjøleren, fordamperen og ovnen. Luft maskinen og samle prøvene.
- Plasser de rengjorte glasslysbildene i avsetningskammeret. Spray såpe på kjøleren, la den tørke, og sett den inn i den angitte kaldfellen til avsetningssystemet. Dette anti-limet gjør det enkelt å fjerne PaC fra kjøleren etter avsetningen.
- Aktiver overflaten av prøvene ved oksygenplasmabehandling i 30 s (100 W, 50 sccm).
- Spinnbelegg de plasmabehandlede prøvene med en negativ fotoresist ved 1000 x g i 40 s. Legg prøvene på en kokeplate ved 110 °C i 2 minutter (figur 1Ab).
FORSIKTIG: Fotoresistløsningen er brannfarlig og forårsaker irritasjon; Bruk PPE og håndter det under en avtrekkshette. - Plasser et i-linjefilter i strålelinjen til UV-bredbåndskontaktreguleringen og eksponer fotoresisten gjennom en maske som har den interdigiterte elektrodedesignen (figur 1Ac).
MERK: Interdigitated elektroder med et gap på 50 eller 250 μm ble designet ved hjelp av en layoutredigerer og fotomasker ble bestilt fra et selskap som produserer polyester fotomasker ved laser photoplotting. - Stek prøvene ovenfor ved 110 °C på en kokeplate i 3 min og la dem avkjøles til romtemperatur i 5 minutter. Senk prøvene i en metallionefri utvikler i 3 minutter for å fjerne den ikke-eksponerte fotoresisten. Skyll prøvene med vann og tørk dem med en luftpistol (figur 1Ad).
FORSIKTIG: Utviklerløsningen er irriterende; Bruk PPE og håndtak under en avtrekkshette. - Aktiver overflaten av prøvene ved oksygenplasmabehandling i 60 s (100 W, 50 sccm).
- Deponer et 20 nm vedheftslag av krom og et 300 nm lag gull med en termisk fordamper som følger (figur 1Ae).
- Luft fordampermaskinen og klem prøvene (vendt ned) på den øvre runde platen med metallskruer. Fyll de dedikerte diglene, henholdsvis med krom og gull. Forsegle og evakuer maskinen for å nå et trykk under 5·10-6 Torr. Start rotasjonen av prøveholderen.
- Velg smeltedigelen som inneholder krom og øk strømmen sakte gjennom den til en avsetningshastighet på 0,2 Å·s-1 er nådd. Åpne lukkeren og vent til 20 nm krom er avsatt. Lukk lukkeren og trapp sakte ned strømmen til 0 mA.
- Velg smeltedigelen som inneholder gull og øk strømmen sakte gjennom den til en avsetningshastighet på 0,2 Å·s-1 er nådd. Åpne lukkeren for å fordampe gull, vent til 10 nm gull er avsatt, og øk deretter avsetningshastigheten til 1,5 Å·s-1 til ca. 300 nm er avsatt. Lukk lukkeren og sakte rampe ned strømmen til 0 mA.
- La prøvene kjøle seg ned til romtemperatur i 15 min etter avsetning. Stopp rotasjonen av prøveholderen, luft ut maskinen og samle prøvene.
- Fordyp prøvene i et beger med aceton. Plasser begeret på en risteplate satt til 110 o / min i 15 minutter for å løfte av fotoresisten. Skyll prøvene med isopropanol og tørk dem med en luftpistol (figur 1Af).
- Aktiver overflaten av prøvene ved oksygenplasmabehandling i 30 s (100 W, 50 sccm).
- Monter et 3 μm isolasjonslag av PaC med et parylenavsetningssystem (se trinn 1.2.1) (figur 1Ag).
- Deponer et 3 μm lag parylen-C (PaC) med et parylenavsetningssystem (figur 1Aa).
- Disposisjonsåpning (figur 1B)
- Spinnbelegg prøvene med en positiv fotoresist ved 600 x g i 35 s. Legg den på en kokeplate ved 110 °C i 2 minutter (figur 1Ba).
FORSIKTIG: Fotoresistløsningen er brannfarlig og forårsaker irritasjon; Bruk PPE og håndtak under en avtrekkshette. - Forsikre deg om at det ikke er noe i-line-filter i strålelinjen til UV-bredbåndskontaktreguleringen, og eksponer fotoresisten gjennom en maske som har omrisset av enheten med en UV-bredbåndskontaktregulering (figur 1Bb).
- Fordyp prøvene i en metallionefri utvikler i 4 minutter for å fjerne den eksponerte fotoresisten. Skyll prøvene med vann og tørk dem med en luftpistol (figur 1Bc).
- Etse omrisset gjennom de to lagene av PaC med en reaktiv ionetser (160 W, 22 min, O2: 50 sccm, CF4: 10 sccm) (figur 1Bd).
- Fjern den gjenværende fotoresisten med aceton, skyll med isopropanol og tørk prøvene med en luftpistol.
- Spinnbelegg prøvene med en positiv fotoresist ved 600 x g i 35 s. Legg den på en kokeplate ved 110 °C i 2 minutter (figur 1Ba).
- PEDOT:PSS-belegg (figur 1C)
- Spinnbelegg en 2 % såpeoppløsning ved 70 x g i 35 s (figur 1Ca).
- Monter et 3 μm offerlag av PaC med et parylenavsetningssystem (se trinn 1.2.1) (figur 1Cb).
- Spin-coat positiv fotoresist ved 600 x g i 35 s. Legg prøvene på en kokeplate ved 110 °C i 2 minutter (figur 1Cc).
- Forsikre deg om at det ikke er noe i-line-filter i strålelinjen til UV-bredbåndskontaktreguleringen, og eksponer fotoresisten gjennom en maske som har den aktive overflaten til elektrodene (figur 1Cd).
- Fordyp prøvene i en metallionefri utvikler i 4 minutter for å fjerne den eksponerte fotoresisten. Skyll prøvene med vann og tørk dem med en luftpistol (figur 1Ce).
- Ets PaC med en reaktiv ionetser for å åpne den aktive overflaten av elektrodene (160 W, 24 min, O2: 50 sccm, CF4: 10 sccm). Kontroller med mikroskop at det ikke er gjenværende PaC på den aktive overflaten (figur 1Cf).
- Fjern den gjenværende fotoresisten med aceton, skyll med isopropanol og tørk prøvene med en luftpistol.
- Aktiver overflaten av prøvene ved hjelp av oksygenplasmabehandling i 90 s (100 W, 50 sccm).
- Bland en kommersiell dispersjon av kjemisk polymerisert PEDOT: PSS med 5 vol% etylenglykol (EG) og 0,1 vol% dodecylbenzensulfonsyre (DBSA). Sonikere i 15 min. Tilsett 1 vekt% av (3-glycydyloxypropyl) trimetylsiloksan (GOPS) og sonicate i 5 minutter. Filtrer løsningen gjennom et 1,2 μm filter.
FORSIKTIG: EG er irriterende og utgjør en helsefare. DBSA er irriterende og etsende. GOPS er etsende. Bruk egnet personlig verneutstyr og håndter disse kjemikaliene under en avtrekkshette.
MERK: Det totale volumet avhenger av antall prøver. For 10 standard glasslysbilder, klargjør minst 20 ml som tilsvarer følgende mengder: 18,78 ml PEDOT: PSS, 1 ml EG, 20 μL DBSA og 200 μL GOPS. - Spinn fire lag med PEDOT: PSS-løsning ved 150 x g i 35 s. Etter avsetning av hvert lag, stek prøvene ved 110 °C i 60 s på en kokeplate og avkjøl dem til romtemperatur i 5 minutter før du snurrer neste lag (figur 1Cg).
- Fjern offerlaget med PaC ved å senke prøvene i vann (figur 1Ch).
- Stek prøvene ved 140 °C i 1 time.
- Dypp prøvene i avionisert vann i 30 minutter for å fjerne gjenværende såpe og forbindelser med lav molekylvekt i PEDOT: PSS-filmen og for å løsne prøver fra glasssubstratet (figur 1Ci).
- Tilkoblinger og emballasje (figur 1D)
- Legg et tynt lag akrylmaling på en polyimidfilm som er belagt med kobber (figur 1Da). Bruk en aerosol for å oppnå et homogent lag med maling (figur 1Db).
- Lag mønster av akrylmalingen med en laser (75 kHz, 7 W, 1 laserpass, 400 mm·s-1) for å oppnå to rektangulære kontaktputer (5 mm x 15 mm; 1,5 mm mellomrom) (figur 1Dc).
- Fukt kobberet med mettet 30 % (w/v) jernklorid (FeCl3) i vann i 15 minutter ved 40 °C (figur 1Dd).
FORSIKTIG: FeCl3 er irriterende og etsende; Håndter den med hansker under en avtrekkshette. - Strip akrylmalingen med aceton ved å gni den litt med en klut (figur 1De).
- Klipp den mønstrede polyimidfilmen i rektangulære former (15 mm x 30 mm) med en laser (15 kHz, 10 W, 30 laserpasseringer, 130 mm·s-1) (figur 1Df).
- Dispenser sølvpasta med en treakset dispenseringsmaskin ved et trykk på tre bar med en nål på 330 μm diameter (5 m·min-1) (figur 1Dg).
FORSIKTIG: Sølvpasta er irriterende; håndtak med hansker. - Juster og fest PaC-sonden med polyimidfilmen under et kikkertmikroskop ved hjelp av pinsett (figur 1Dh).
MERK: Justeringsmerker kan mønstres i trinn 1.5.2 for å lette sondens plassering på kontaktputene. - Stekes ved 140 °C i 2 timer i ovnen.
- Plasser en 1 cm2 polyimidbeskyttelsestape på kontaktputene (figur 1Di).
- Dypp grensesnittet der PaC-sonden og polyimidfilmen er koblet til i PDMS (figur 1Dj).
- Stek den i 2 timer ved 50 °C.
- Fjern beskyttelsesbåndet for å åpne kontaktplatene (figur 1Dk).
MERK: Mikrofabrikasjon av in vitro-enheter er lik, men trinn 1.2.1, 1.3 og 1.5må hoppes over.
2. Generering av glioblastom GCaMP6f stabil cellelinje
- Lentivirus produksjon
- I en 75 cm² kolbe dyrker man en HEK 293T-avledet cellelinje optimalisert for lentivirusproduksjon i 10 ml Dulbeccos modifiserte ørnemedium (DMEM) inneholdende 4,5 g· L-1 av glukose, L-glutamin, natriumpyruvat og natriumbikarbonat og supplert med 10% tetracyklinfritt føtal bovint serum (FBS), 100 enheter·ml-1 penicillin og 100 μg·mL-1 streptomycin i minst 3 dager inntil 80% sammenløp.
- Fjern mediet fra kolben. Skyll forsiktig cellene med 10 ml fosfatbufret saltvann (PBS).
- Tilsett 1 ml 0,25 % trypsin/EDTA-oppløsning og inkuber kolben i 5 minutter ved 37 °C.
FORSIKTIG: Trypsin / EDTA-løsning utgjør en helsefare; Bruk PPE og håndtak under en avtrekkshette. - Tilsett 8 ml kulturmedium. Skyll cellesuspensjonen forsiktig.
- Tell cellene og plate 4 x 106 celler i en petriskål i 8 ml kulturmedium.
- Neste dag, fortynn 25 μg av plasmidet som inneholder genet GCaMP6f og en seleksjonsmarkør som gir resistens mot puromycin i et totalt volum på 600 μL vann. Legg det til et rør av transfeksjonsreagens. Vortex i 10 s ved 3000 o / min og inkuber røret ved romtemperatur i 10 minutter for å tillate produksjon av nanopartikler.
- Tilsett innholdet i røret dråpevis på kulturen til HEK 293 T-celler og rock forsiktig for hånd. Inkuber celler ved 37 °C i minst 4 timer.
- Bytt ut mediet som inneholder nanopartikkelkomplekser med ferske medier og returner cellene ved 37 °C.
- Tre dager senere, samle supernatanten og sentrifugen ved 500 x g i 10 minutter for å fjerne cellulært rusk. Samle væskefasen som inneholder virale partikler.
MERK: Virusproduksjonen i supernatanten kan bekreftes ved hjelp av en kvantitativ lentiviral titertest og kan lagres ved -80 °C i minst 2 år.
- Glioblastom celler transduksjon
- I en 75 cm² kolbe, dyrkning av glioblastomceller i 10 ml DMEM inneholdende 1 g · L-1 av glukose, L-glutamin, natriumpyruvat og natriumbikarbonat og supplert med 10% tetracyklinfri FBS, 100 enheter · ml-1 penicillin og 100 μg · ml-1 streptomycin i minst 4 dager.
- Kast mediet og legg til supernatanten oppnådd i trinn 2.1.9 på målcellene.
- Tilsett 5 μg·mL-1 heksadimetrinbromid i mediet for å forbedre transduksjonen. Inkuber i 6 timer ved 37 °C. Bytt ut mediet med 10 ml friskt medium.
FORSIKTIG: Heksadimetrinbromid er irriterende. Håndter det med hansker.
- Generering av en stabil cellelinje
- To til tre dager etter transduksjon, tilsett 10 ml DMEM inneholdende 1 g · L-1 av glukose, L-glutamin, natriumpyruvat og natriumbikarbonat, 10% FBS, 100 enheter · ml -1 penicillin, 100 μg · ml-1 av streptomycin og supplert med puromycin for å drepe de ikke-transducerte cellene. Kultur celler i dette mediet i minst 3 dager.
FORSIKTIG: Puromycin er en irriterende; Håndter det med hansker.
MERK: Følsomheten til celler for puromycin må testes før transduksjon ved dyrking av celler i deres anbefalte medium som inneholder forskjellige konsentrasjoner av puromycin. En dag senere, sjekk cellene med et mikroskop. Velg tilstrekkelig konsentrasjon der flertallet av cellene er døde, men få er fortsatt i live, for å sikre at antibiotika ikke er for giftig og kan drepe de transfekterte cellene også. - Fjern mediet og skyll cellene med 10 ml PBS.
- Tilsett 1 ml 0,25 % av en trypsin/EDTA-løsning og inkuber kolben i 5 minutter ved 37 °C.
- Tilsett 8 ml kulturmedium. Skyll cellesuspensjonen forsiktig.
- Samle 100 μL cellesuspensjon og måle cellekonsentrasjonen med en celleteller. Aspirer 50 μL cellesuspensjon i en håndholdt automatisert celleteller med en 60 μm sensor.
- Frø 1 celle/brønn i en 96-brønns plate. For eksempel, for en konsentrasjon på 1 x 10 3 celler per ml, tilsett 1 / (1 x 103), dvs. 0, 001 ml cellesuspensjon per brønn. Frø hver brønn for å øke sjansene for suksess. Komplett med dyrkningsmedium for å nå et totalt volum på 200 μL per brønn.
- En dag senere, finn hver brønn som inneholder en celle og kontroller dens fluorescens (λexc = 490 nm og λem = 530 nm). Merk brønnene som bare inneholder en transfektet celle. Fortsett veksten i noen dager til brønnen er nesten sammenflytende.
- Kast mediet og skyll cellene med 200 μL PBS. Tilsett 100 μL 0,25% Trypsin / EDTA-løsning og inkuber 96-brønnplaten i 5 minutter ved 37 ° C.
- Tilsett 100 μL medium og skyll cellesuspensjonen forsiktig. Overfør cellesuspensjonen i en petriskål. Tilsett 5 ml medium og la cellene vokse i noen dager til petriskålen er nesten sammenflytende.
- Kast mediet og skyll cellene med 5 ml PBS. Tilsett 1 ml 0,25 % trypsin/EDTA-oppløsning og rug petriskålen i 5 minutter ved 37 °C.
- Tilsett 6 ml medium og skyll cellesuspensjonen forsiktig. Overfør cellesuspensjonen til en T25-kolbe. Fortsett veksten i noen dager til kolben er nesten sammenflytende.
- Kast mediet og skyll cellene med 5 ml PBS. Tilsett 1 ml med 0,25 % trypsin/EDTA-oppløsning og inkuber T25-kolben i 5 minutter ved 37 °C. Tilsett 7 ml DMEM inneholdende 1 g · L-1 av glukose, L-glutamin, natriumpyruvat og natriumbikarbonat, og supplert med 10% FBS, 100 enheter · ml-1 penicillin og 100 μg · ml-1 streptomycin. Skyll cellesuspensjonen forsiktig.
- Del cellesuspensjonen til fire T25-kolber (2 ml per kolbe) og tilsett 5 ml medium til hver kolbe. La cellene vokse i noen dager til kolbene er nesten sammenflytende.
- Gjenta trinn 2.3.12 for tre kolber og behold siste kolbe i trinn 3.1.3. Overfør cellesuspensjonen i et 15 ml konisk rør og sentrifuge ved 150 x g i 5 minutter. Kast supernatanten og resuspender cellepelleten i 900 μL. Bland cellene forsiktig for å opprettholde en homogen cellesuspensjon.
- Overfør cellesuspensjonen til hetteglass med kryogen oppbevaring. Tilsett 100 μL dimetylsulfoksid. Sett kryovialene ved -80 °C over natten. Overfør frosne celler til flytende nitrogen for videre eksperimenter.
MERK: Transfeksjonens effektivitet kan vurderes ved å tilsette 5 μM ionomycin kalsiumsalt i mediet og kontrollere den induserte økningen av fluorescens under et fluorescensmikroskop (λexc = 490 nm og λem = 530 nm).
- To til tre dager etter transduksjon, tilsett 10 ml DMEM inneholdende 1 g · L-1 av glukose, L-glutamin, natriumpyruvat og natriumbikarbonat, 10% FBS, 100 enheter · ml -1 penicillin, 100 μg · ml-1 av streptomycin og supplert med puromycin for å drepe de ikke-transducerte cellene. Kultur celler i dette mediet i minst 3 dager.
3.3D modeller
- Sfæroid kultur
- Lag en oppløsning av 1 % (w/v) agarose i avionisert (DI) vann.
- Tilsett 100 g agarosepulver i 100 ml DI-vann og varm oppløsningen i en mikrobølgeovn til alt pulveret er oppløst. Rør oppløsningen regelmessig for å unngå klumper. Autoklav oppløsningen i 20 minutter ved 120 °C.
- Når den er hentet fra autoklaven, tilsett forsiktig 75 μL agaroseoppløsning per brønn i en 96-brønnsplate. Legg den på siden av brønnen for å danne en menisk, noe som resulterer i en ikke-adherent rund bunn. La den stivne i 15 min ved romtemperatur.
- Løsne cellene (trinn 2.3.12) fra kolben oppnådd i trinn 2.3.14.
- Legg til 10.000 celler per brønn av glioblastomceller og fullfør for å nå et totalt volum på 150 μL per brønn med DMEM inneholdende 1 g · L-1 av glukose, L-glutamin, natriumpyruvat og natriumbikarbonat, og supplert med 10% føtalt bovint serum (FBS), 100 enheter · ml -1 penicillin og 100 μg · ml-1 streptomycin.
- Inkuber celler ved 37 °C uten å flytte platen i 3 dager. Deretter bytter du ut halvparten av mediet med ferske medier hver 2. dag med en flerkanalspipett inntil videre eksperimenter. Hold pipettespissen i den øvre delen av brønnen for å unngå skade på agarose eller sfæroid selv.
MERK: Størrelsen på sfæroidene avhenger av antall celler som er sådd og cellelinjen, så den må tilpasses avhengig av forsøkene.
- Lag en oppløsning av 1 % (w/v) agarose i avionisert (DI) vann.
- In-ovo-modellen
- Legg befruktede egg av japansk vaktel (C. japonica) i en inkubator (37 ° C og 57% fuktighet) på skuffer med en automatisk rotator som gjør egg hver 2. Denne dagen regnes som embryonal dag (ED) 0.
- Vask veiebåter i plast ved å plassere dem i 70 % (w/v) etanol. Ta ut veiebåtene og tørk dem under en avtrekkshette.
MERK: Fra dette punktet utføres ikke eksperimenter under sterile forhold. Imidlertid er det nødvendig med rene forhold for å unngå utvikling av mugg på embryoene. - På ED3, åpne eggene forsiktig med en pinsett med tynne spisser forvasket med 70% (w / v) etanol. Hell embryoet i en plastveiebåt, dekk det til med en annen veiebåt og legg det i en standard fuktet inkubator ved 37 °C i 3 dager.
- På ED6, gjør et lite snitt i chorioallantoic membran (CAM) med en 23 G nål.
- Bruk en pipette, plasser en 7-dagers sfæroid på snittet, og returner embryoet til inkubatoren i 3 dager, til videre eksperimenter.
MERK: Et fluorescerende fargestoff kan injiseres i øyet til embryoet for å visualisere blodårene. - På dagen for forsøket, plasser den fleksible sonden på toppen av den vaskulariserte svulsten ved hjelp av en mikromanipulator.
- Den in vivo modell
MERK: Denne delen av protokollen er tilpasset fra den som tidligere er publisert i referanse14. Voksne flerfargede fluorescerende AMU-Neuroinflam-mus (B6.Cg-Tg(Thy1-CFP)23Jrs(Ly6a-EGFP)G5Dzk(Itgax-EYFP)1Mnz/FD) ble brukt; disse musene presenterer merking av en underpopulasjon av Thy1+ nevroner ved transgen ekspresjon av ECFP, merking av perifer LyzM+ inflammatoriske celler ved transgen ekspresjon av EGFP og merking av en subtype mikroglia som uttrykker EYFP under kontroll av Cd11c+. Kort fortalt blir dyrene lett bedøvet med 1,5 % isofluran i 2 minutter før eventuell behandling eller injeksjon. Før operasjonen bedøves dyrene med ketamin (120 mg/kg; IP) og Xylazin (12 mg/kg; IP). Deretter påføres 3% Lidokain gel lokalt for å lindre smerter i ørene forbundet med fiksering av stereotaktisk støtte. Deretter administreres 0,25% bupivakainoppløsning til operasjonsstedet for å lindre eventuelle smerter på grunn av kraniotomi. Når musen var klargjort for kirurgi, ble en kraniotomi på 4 mm diameter utført i henhold til referanse14. Med en 26 G nål ble det laget et hull i dura-materen midt i kraniotomien og tumorsfæroiden ble injisert med injeksjonssystemet beskrevet i referanse14. I tillegg, som beskrevet her, ble en fleksibel elektrode plassert på GCamp6 eller DsRed uttrykkende tumor spheroid før kraniotomi ble forseglet med et glassvindu.- Plasser en dråpe Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (DPBS) slik at den dekker kraniotomien. Plasser den fleksible elektroden på dråpen DPBS, og plasser forsiktig baksiden av sonden med kontaktputer på musens rygg (figur 4B).
MERK: Bruk sterile hansker og en "kun spiss"-teknikk. Bytt hansker hvis en ikke-steril overflate er i kontakt. Gi termisk støtte under denne prosedyren. - Berør DPBS-dråpen med et lite stykke papir for å absorbere DPBS til sonden kan ligge flatt på dura og følge krumningen i hjernen. Sørg for at et lite lag med DPBS forblir under elektrodene uten å rømme fra siden av elektroden. Dette sikrer en barriere mot limspillover under de neste trinnene.
MERK: Steriliser alt utstyr før bruk. - Legg en liten dråpe silikonlim på sonden og dekk den med et 5 mm rundt dekselglass. Skyv glassdekselet ned til silikonet er jevnt fordelt og avstanden mellom glassdekselet og sonden er minimal. Skyv dekselglasset ned i ytterligere 30 sekunder slik at silikon kan stivne.
- For å feste dekselglasset, påfør raskt superlim på sidene og skyv det ned til limet herder til faststoff.
- Bruk en tannpirker til å påføre superlim på sondens hals og pass på at superlimet trekkes under nakken for å gi stabil støtte til det.
- Dekk skallen med dental sement for å bygge en kronisk hette. Vær spesielt forsiktig så du bare dekker kantene på glassdekselet.
- Løft baksiden av sonden og påfør sement under sondens hals. Hvil sonden på sementen før den herder. Skyv sondens hals forsiktig ned med butt tang slik at overflaten er på samme nivå som dekselglasset og ikke i veien for mikroskopmålet under forsøket.
- Dekk toppen av sondehalsen med ikke mer enn 1,5 mm tannsementlag for å oppnå et fast grep om sonden. Bygg en sementbrønn som presenterer en 1,5 mm rygg i en avstand på 1-2 mm rundt dekkglasset for å lage et basseng for nedsenkningsvæsken for to-foton avbildning (figur 4C).
- Etter at sementen har herdet, påfør buprenorfin postkirurgiske analgetika (0,05 mg/kg, 0,1 ml per 10 g kroppsvekt subkutant) og hold dyret i en varm atmosfære til det våkner. Dette inkluderer nærhet til en infrarød lyspære, samt innpakning av dyret i et papirhåndkle.
MERK: Plasser et termometer på musens nivå for å overvåke temperaturen. - Karakteriser impedansen i 1-10 kHz-området ved hjelp av en potensiostat.
- La dyret komme seg fra operasjonen i minst 10 dager. Administrer antiinflammatoriske legemidler umiddelbart etter operasjonen og fortsett å overvåke dyrets tilstand for å gi passende postoperativ analgesi.
- Plasser en dråpe Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (DPBS) slik at den dekker kraniotomien. Plasser den fleksible elektroden på dråpen DPBS, og plasser forsiktig baksiden av sonden med kontaktputer på musens rygg (figur 4B).
4. Levering og avbildning av pulserende elektriske felt (PEF)
- Plasser prøvene under et fluorescensmikroskop. Når det gjelder 3D-modeller, kan svulster bare observeres fra toppen.
MERK: For in ovo-modellen ble eksperimenter utført under et epifluorescensmikroskop (men er også mulig med et to-foton mikroskop), mens eksperimenter på in vivo-modellen ble utført under et to-foton mikroskop (figur 6). - Koble en pulsgenerator til kontaktplatene på enhetene ved hjelp av pogo pin-kontakter (in vitro) eller krokodilleklemmer (i ovo og in vivo) (figur 4A). Still inn de ønskede parametrene (antall pulser, spenning, pulsvarighet, frekvens) og bruk PEF ved å kjøre generatoren (figur 4A). Mål fluorescens samtidig for å observere effekten av PEFene i sanntid.
Representative Results
Denne protokollen tillater applikasjonen til to glioblastommodeller der et fleksibelt PEF-leveringssystem er integrert. Etter mikrofabrikasjons- og pakketrinn karakteriseres fleksible elektroder i saltoppløsning ved elektrokjemisk impedansspektroskopi (EIS) for å vurdere og validere ytelsen. PEDOT: PSS-belagte elektroder viser de typiske kapasitive og resistive dominerte regionene atskilt med en avskjæringsfrekvens, mens de ubelagte elektrodene bare viser kapasitiv oppførsel (figur 2).
En variant av væskeoverleggsplatemetoden 96-brønns brukes til å dyrke 3D-svulster laget av transfekterte glioblastomceller som stabilt uttrykker en fluorescerende intracellulær kalsiumreporter. Veksten av sfæroidene kan observeres med et lysfeltmikroskop (figur 3; ED 0). Minst 2 eller 3 dager er nødvendig for å oppnå sfæriske og tette sfæroider, avhengig av cellelinjen og antall celler som seedes.
I in ovo-modellen er sfæroider podet i chorioallantoic membranen til et vaktelembryo (figur 3; ED 6). Transplantatets suksess kan vurderes ved fluorescensmikroskopi noen dager senere, da levende celler har intracellulært kalsium og dermed er fluorescerende (figur 3; ED 9). Vaskulariseringen av svulsten kan observeres under et fluorescensmikroskop ved å injisere et fluorescerende fargestoff i blodkarene (figur 3; ED9). Imidlertid kan det ikke alltid være mulig å visualisere blodkarene inne i svulsten, da sfæroiden er veldig tett. De fleksible interdigitaliserte elektrodene er plassert på toppen av den vaskulariserte svulsten (figur 3; ED 9) og koblet til en pulsgenerator. Sonden må plasseres forsiktig for å unngå blødning av embryoet; Ellers kan det fluorescerende fargestoffet spre seg, noe som hindrer enhver observasjon ved avbildning. Korrekt levering av pulsen til det biologiske miljøet kan verifiseres ved å måle strømmen som går gjennom kretsen. Avbildning av disse i ovo-modeller tillater sanntidsovervåking av effekten av PEF på det intracellulære kalsiumet i en 3D-glioblastomtumor, samt vasokonstriksjonen indusert på svulstens vaskulatur, og unngår påvirkning av andre celletyper, inkludert immunsystemet15.
Studien av PEF-effekten på glioblastom kan også utføres i en mer komplett og prediktiv modell. Faktisk består in vivo-modellen beskrevet ovenfor14 av poding av en 3D glioblastomtumor i hjerneparenkymen til en mus (figur 4). Injeksjonsstedet til svulsten er plugget av en tverrbundet dextrangelhemi-perle, for å rekapitulere de fysiologiske biofysiske begrensningene under veksten av svulsten. Selv om det er beskrevet i referanse14, er det verdt å understreke at det er kritisk viktig at dextran hemi-perlen er nøyaktig limt til dura materen; Ellers kan svulsten rømme gjennom den åpne dura og helt dekke hjernen, noe som gjør avbildningen umulig. For enhver kronisk avbildning utgjør vevsinnvekst som finner sted når kranialvinduet helbreder, en alvorlig barriere, da det nye vevet ikke er gjennomsiktig og gjør bildene tåkete eller ikke-brukbare. Derfor, etter å ha satt inn og limt hemi-perlen, må sideveggene til det åpne kranialvinduet forsegles med et tynt lag superlim omhyggelig plassert rundt hulromsveggen, uten å la superlimet gli eller strømme på duraen. Når den fleksible sonden er plassert på toppen av tumorinjeksjonsstedet, kan ingen bobler holde seg under sonden, av to grunner. For det første kan ikke avbildningen fortsette når bobler er til stede. For det andre tjener bobler som isolatorer, og endrer dermed de elektriske stimuleringsegenskapene. Etter å ha tatt forholdsregler beskrevet ovenfor, er kraniotomien forseglet med et glassvindu sementert til skallen for å tillate kronisk avbildning over uker. Siden svulsten består av GCaMP eller DsRed uttrykkende celler, kan injeksjonen bekreftes med et fluorescensmikroskop. Den elektrokjemiske impedansen til elektrodene må måles for å validere ytelsen etter implantasjon. Sammenlignet med impedansen i saltoppløsning forventes en økning av impedansen in vivo ved frekvenser over 100 Hz på grunn av tilstedeværelsen av et biologisk miljø (figur 5). Vaskularisert nevral parenkym og tumorinfiltrasjon kan observeres og karakteriseres gjennom det transparente substratet over uker ved tofotonmikroskopi (figur 6). Bruk av transgene dyr som uttrykker fluorescerende proteiner i celler av interesse (immunceller og nevroner) kan for eksempel tillate demonstrasjon av den minimale inflammatoriske prosessen indusert av elektrodeimplantasjon alene (figur 6A) eller vise tilstedeværelse av mikroglia og monocytter 26 dager etter implantasjon av en PEF-stimulert elektrode implantert på toppen av en voksende GBM-tumor (figur 6B1 ). I sistnevnte tilfelle ble det funnet både perifere monocyttavledede celler og hjerneresidente mikrogliaceller rundt og inne i svulsten (figur 6B2). På dagen for PEF-levering kan kontaktputene til de fleksible elektrodene kobles til pulsgeneratoren, direkte under to-fotonmikroskopet. Samlet sett kan denne modellen brukes til å undersøke effekten av bioelektriske behandlinger over tid ved bruk av ulike typer celler involvert i hjernesvulstutvikling, opp til en dybde på rundt 500 μm.
Figur 1: Mikrofabrikasjon av fleksible elektroder . (A) Gullelektrodemønster og Parylen C-substrat. (B) Disposisjon åpning. (C) PEDOT: PSS belegg. (D) Tilkoblinger og emballasje. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Elektrokjemisk impedansspektroskopi av fleksible gullelektroder og PEDOT: PSS-belagte kalde elektroder i en saltoppløsning. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Inovo-modellen av glioblastom. ED 0: Sfæroid observert med et lysfeltmikroskop. ED 3: Skall mindre kultur av et vaktelembryo 3 dager etter åpning. ED 6: Tumor implantert i CAM observert med et lysfeltmikroskop. ED 9: Fleksibel enhet plassert på vaskularisert svulst (svulst i grønt og blodkar i rødt). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: In vivo-applikasjonen . (A) Skjema for in vivo eksperimenter. (B) Sondeplassering før påføring av dekkglass og akrylharpiks. (C) Fullført sondeimplantasjon. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 5: Elektrokjemisk impedansspektroskopi av fleksible gullelektroder i en saltoppløsning sammenlignet med en implantert sonde. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 6: Intravital multispektral to-foton avbildning gjennom elektroder . (A) Flislagt bilde av den sunne hjerneoverflaten i en kontroll multifluorescerende AMU-Neuroinflam mus 3 dager etter elektrodeimplantasjon. Cyan viser dendritisk arborisering av lag 5 pyramidale nevroner, grønn viser rekrutterte granulocytter og monocytter, og gul viser aktiverte mikroglia og dendrittiske celler. Rosa viser infrarød diffusjon på grunn av varmeakkumulering. (B1) Lignende bilde som i A , men 26 dager etter tumor sfæroid implantasjon 200 μm dypt inne i cortex umiddelbart etterfulgt av elektrode implantasjon. Legg merke til akkumulering av grønne og gule immunceller. (B2) Lignende bilde som i B1 , men 100 μm under overflaten av elektrodene. Legg merke til tilstedeværelsen av blå neuronal dendritisk arborisering i periferien av selve den røde tumormassen infiltrert av gule mikroglia og dendritiske celler. Dypblå viser et andre harmonisk signal fra peritumoralt kollagen. (B3) Zoomet visning av B2 som viser tilstedeværelse av interneuron somas (indikert med piler) i nærheten av svulsten. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Discussion
Tilnærmingen beskrevet i dette arbeidet gjør det mulig for hjernesvulstmodeller med et integrert PEF-leveringssystem å studere effekten av PEF på ulike nivåer av biologisk organisasjon. Mikrofabrikasjonsprotokollen består av standard tynnfilmprosesser, som gir en stor grad av frihet i elektrodedesign som kan tilpasses den spesifikke applikasjonen. Noen ganger kan et ekstra termisk glødningstrinn være nyttig på slutten av fabrikasjonen, for å redusere bøyning av elektrodene som oppstod under produksjonen.
Bruken av en stabil glioblastomcellelinje som uttrykker en fluorescerende kalsiumindikator, unngår alle komplikasjoner knyttet til fargestofflevering og retensjon, spesielt i 3D-svulster som er svært tette16. Faktisk observeres et høyt uttrykksnivå over en lang periode sammenlignet med standard kjemiske fluorescerende kalsiumindikatorer17. Denne protokollen kan brukes på forskjellige cellelinjer, da den vanligvis brukes til avbildning av nevral aktivitet11. Her ble humane og murine cellelinjer brukt (U87 og Gl261 for implantasjon i henholdsvis immundefekte eller immunkompetente mus). Faktisk viste nyere studier at U87-cellelinjen er forskjellig fra de opprinnelige cellene, da mange mutasjoner ble ervervet over år med cellekultur, noe som påvirket eksperimentell reprodusering18. Metoden som brukes til fremstilling av 3D-svulster er høy gjennomstrømning, reproduserbar, og tillater generering av sfæroider av en bestemt størrelse avhengig av cellelinjen, antall celler ved såing og tidspunktet for vekst19. Imidlertid er disse sfæroider tette, noe som gir en ulempe ved avbildning i kjernen av svulsten.
In ovo-modellen er nyttig som en første tilnærming for å studere effekten av PEF på 3D-svulster og deres vaskulatur, uten interaksjoner med andre celletyper som er tilstede i hjernen. Denne modellen er billig, rask, høy gjennomstrømning og reiser færre etiske problemer enn dyremodeller. Det er viktig å opprettholde embryoets integritet gjennom hele forsøket, da det kan påvirke overlevelsen og kvaliteten på avbildningen. Spesiell forsiktighet må tas mens du åpner vaktelegget, for å unngå skade på den embryonale membranen. Transplantatet og plasseringen av de fleksible elektrodene må også utføres nøye, for å unngå blødninger som kan drepe embryoet. Injeksjon av fluorescerende fargestoff i blodkarene tillater samtidig visualisering av tumorcellene og vaskularisering med fluorescensmikroskopi. Den intraokulære injeksjonen må utføres nøye for å unngå at fargestoff lekker inn i den embryonale væsken, noe som kan forårsake en gjenværende fluorescens i bakgrunnen som forringer kvaliteten på avbildningen. Denne modellen kan også brukes til å følge legemiddelopptak, da det gir tilgang til sirkulasjonssystemet. Imidlertid er eksperimenter begrenset av embryoets 12-dagers overlevelsestid, og tillater dermed 7 dagers observasjon, noe som er betydelig kortere enn in vivo-modellen 21.
In vivo hjernesvulstmodellen kan overvåkes i 4 til 5 uker før dyr når et etisk eksperimentelt endepunkt bestemt av et plutselig vekttap på 20%. Det tolereres godt og forblir på plass hvis elektrodens forbindelseshale ikke er for lang. Ellers har dyr en tendens til å skrape vippekontakten, som til slutt kan bli revet, og dermed forhindre påfølgende tilkobling til stimulatoren. Denne 4-ukers perioden er likevel verdifull for å dekke de ulike stadiene av glioblastomutvikling. Ved sammenligning av tumorcelletetthetene i samme volum av interesse ved forskjellige tidsintervaller, kan utviklingen av tumorvekstkinetikken observeres. Spesielt ble det observert økt tumorvekst på tidspunktet for immunbryteren22. En lignende studie i nærvær av en stimulerende elektrode ville informere om effekten av PEF på tumorproliferasjonshastighet og tumorfølsomhet for immuneliminering. I forhold til i ovo-modellen kan in vivo-modellen ses som en verdifull preklinisk modell for å studere virkningen av immunceller på tumorprogresjon og deres bidrag til den terapeutiske effekten av PEF. Denne protokollen er tilpasset fra en tidligere artikkel med tillegg av en fleksibel elektrodeanordning på svulsten før du plasserer et kranialvindu14. Både akutt og kronisk bioelektrisk behandling av svulster kan karakteriseres ved direkte og påfølgende observasjoner med to-foton mikroskopi gitt at innledende stimulering forventes å indusere celledød og å utløse varig dysregulering av immunresponsen.
Tilkoblingene til den fleksible sonden er lett tilgjengelige under to-foton mikroskopet. Elektriske stimuleringsparametere kan dermed justeres i sanntid basert på den observerte effekten på nevralvevet og / eller de målrettede cellene, på samme måte som en lege ville utføre intervensjonsprosedyrer mens han observerte MR- eller CT-bilder av pasienten. En siste vurdering er viktigheten av forsiktig forsegling av elektroden på hjernen med superlim og silikonlim for å forhindre vevsvekst.
Avslutningsvis representerer protokollen beskrevet her en innovativ modell for å studere effekten av PEF-terapi med fleksible organiske polymerelektroder for glioblastomtumormodeller. De to modellene viser forskjellige nivåer av kompleksitet slik at cellulære, vaskulære eller immuneffekter kan skilles for en bedre forståelse av virkningsmekanismene. Konforme, overfladiske elektroder reduserer den iatrogene skaden samtidig som de muliggjør forstyrrelse av tumormikromiljøet, utløser vasokonstriksjon eller dysregulering av intracellulært kalsium15.
Disclosures
Forfatterne erklærer at de ikke har noen konkurrerende økonomiske interesser.
Acknowledgments
Arbeidet rapportert her ble støttet av det franske nasjonale forskningsbyrået (ANR-18-CE19-0029). Forfatterne takker S.M. Bardet for hennes bidrag til genereringen av en stabil GCaMP6f cellelinje og D. O'Connor for hennes hjelp med in ovo-modellen .
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| (3-Glycidyloxypropyl)trimethoxysilane | Sigma | 440167 | GOPS |
| 0.25% Trypsin-EDTA (1X) | Gibco | 25200-056 | |
| 4-Dodecylbenzenesulfonic acid | Sigma | 44198 | DBSA |
| 96-well plate | Falcon | 353075 | |
| Acetone | Technic | 530 | |
| Acrylic resin | Fischer scientific | NC1455685 | |
| agarose | Sigma | A9539 | |
| autoclave | Tuttnauer | 3150 EL | |
| AZ 10XT | Microchemicals | Positive photoresist | |
| AZ 826 MIF Developer | Merck | 10056124960 | Metal-ion-free developer for the negative photoresist |
| AZ Developer | Merck | 10054224960 | Metal-ion-free developer for the positive photoresist |
| AZ nLof 2070 | Microchemicals | Negative photoresist | |
| Buprenorphine | Axience | ||
| Carprofen | Rimadyl | ||
| Centrifuge Sorvall Legend X1R | Thermo Scientific | 75004260 | |
| CMOS camera Prime 95B | Photometrics | ||
| CO2 incubator HERAcell 150i | Thermo scientific | ||
| DAC board | National Instruments | USB 6259 | |
| Déco spray Pébéo | Cultura | 3167860937307 | Black acrylic paint |
| Dextran Texas Red 70.000 | Thermofisher | D1830 | |
| Die bonding paste "Epinal" | Hitachi | EN-4900GC | Silver paste |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma | D2438 | |
| Dispensing machine | Tianhao | TH-2004C | |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium + GlutaMAX™-I | Gibco | 10567-014 | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium | Sigma | D6429 | |
| Egg incubator COUVAD'OR 160 | lafermedemanon.com | ||
| Ethylene glycol | Carl Roth | 6881.1 | |
| Fertilized eggs of Japanese quail | Japocaille | ||
| Fetal Bovine Serum | VWR | S181BH | |
| Flask | Greiner | 658170 | |
| Fluorescence macroscope | Leica MZFLIII | ||
| Gl261 | DSMZ | ACC 802 | |
| Gold pellets - Dia 3 mm x 6 mm th | Neyco | ||
| Handheld automated cell counter | Millipore | PHCC00000 | |
| Heating and drying oven | Memmert | UF110 | |
| Hexadimethrine Bromide Sequa-brene | Sigma | S2667 | |
| hot plate Delta 6 HP 350 | Süss Microtec | ||
| Illumination system pE-4000 | CoolLed | ||
| Infrared tunable femtosecond laser (Maï-Taï) | Spectra Physics (USA) | ||
| Ionomycin calcium salt | Sigma | I3909 | |
| Kapton tape SCOTCH 92 33x19 | 3M | Polyimide protection tape | |
| Lab made pulse generator | |||
| Labcoter 2 Parylene Deposition system PDS 2010 | SCS | ||
| Lenti-X 293 T cell line | Takara Bio | 63218 | HEK 293T-derived cell line optimized for lentivirus production |
| Lenti-X GoStix Plus | Takara Bio | 631280 | Quantitative lentiviral titer test |
| Mask aligner MJB4 | Süss Microtec | ||
| Micro-90 Concentrated cleaning solution | International Products | M9050-12 | |
| Microscope slides 76 x 52 x 1 mm | Marienfeld | 1100420 | |
| Needles 30G | BD Microlance 3 | 304000 | |
| PalmSens4 potentiostat | PalmSens | ||
| parylene-c : dichloro-p-cyclophane | SCS | 300073 | |
| PCB Processing Tanks | Mega Electronics | PA104 | |
| PEDOT:PSS Clevios PH 1000 | Heraeus | ||
| penicillin / streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| Petri dish | Falcon | 351029 | |
| pGP-CMV-GCaMP6f | Addgene | 40755 | plasmid |
| Phosphate Buffer Saline solution | Thermofisher | D8537 | |
| Plasma treatment system PE-100 | Plasma Etch | ||
| PlasmaLab 80 Reactive Ion Etcher | Oxford Instruments | ||
| Plastic mask | Selba | ||
| Plastic weigh boat 64 x 51 x 19 mm | VWR | 10770-454 | |
| Poly-dimethylsiloxane: SYLGARD 184 Silicone Elastomer Kit | Dow chemicals | 1673921 | |
| Polyimide copper film 60 µm (Kapton) | Goodfellow | IM301522 | |
| Propan-2-ol | Technic | 574 | |
| Protolaser S | LPKF | ||
| puromycin | Gibco | A11103 | |
| Round cover glass 5 mm diameter | Fischer scientific | 50-949-439 | |
| Scepter Sensors - 60 µm | Millipore | PHCC60050 | |
| Silicone adhesive Kwik-Sil | World Precision Instruments | ||
| spin coater | Süss Microtec | ||
| Spin Coater | Laurell | WS-650 | |
| Super glue | Office depot | ||
| tetracycline-free fœtal bovine Serum | Takara Bio | 631105 | |
| Thermal evaporator Auto 500 | Boc Edwards | ||
| Two-photon microscope | Zeiss LSM 7MP | ||
| U87-MG | ATCC | HTB-14 | Human glioblastoma cells |
| Ultrasonic cleaner | VWR | ||
| Vortex VTX-3000L | LMS | VTX100323410 | |
| Xfect single shots reagent | Takara Bio | 631447 | Transfection reagent |
References
- Koshy, M., et al. Improved survival time trends for glioblastoma using the SEER 17 population-based registries. Journal of Neuro-Oncology. 107 (1), 207-212 (2012).
- Davis, M. E. Glioblastoma: Overview of disease and treatment. Clinical Journal of Oncology Nursing. 20, 5 Suppl 2-8 (2016).
- Edd, J. F., Horowitz, L., Davalos, R. V., Mir, L. M., Rubinsky, B. In vivo results of a new focal tissue ablation technique: irreversible electroporation. IEEE transactions on Bio-Medical Engineering. 53 (7), 1409-1415 (2006).
- Breton, M., Mir, L. M. Microsecond and nanosecond electric pulses in cancer treatments. Bioelectromagnetics. 33 (2), 106-123 (2012).
- Frandsen, S. K., et al. Direct therapeutic applications of calcium electroporation to effectively induce tumor necrosis. Cancer Research. 72 (6), 1336-1341 (2012).
- Lee, J. H., Kim, H., Kim, J. H., Lee, S. -H. Soft implantable microelectrodes for future medicine: prosthetics, neural signal recording and neuromodulation. Lab on a Chip. 16 (6), 959-976 (2016).
- Lee, H., Bellamkonda, R. V., Sun, W., Levenston, M. E. Biomechanical analysis of silicon microelectrode-induced strain in the brain. Journal of Neural Engineering. 2 (4), 81-89 (2005).
- Fattahi, P., Yang, G., Kim, G., Abidian, M. R. A review of organic and inorganic biomaterials for neural interfaces. Advanced Materials. 26 (12), 1846-1885 (2014).
- Lecomte, A., Degache, A., Descamps, E., Dahan, L., Bergaud, C. In vitro and in vivo biostability assessment of chronically-implanted Parylene C neural sensors. Sensors and Actuators B: Chemical. 251, 1001-1008 (2017).
- Dijk, G., Ruigrok, H. J., O'Connor, R. P. PEDOT:PSS-coated stimulation electrodes attenuate irreversible electrochemical events and reduce cell electropermeabilization. Advanced Materials Interfaces. 8 (19), 2100214 (2021).
- Chen, T. -W., et al. Ultra-sensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity. Nature. 499 (7458), 295-300 (2013).
- Ribatti, D. Chapter 5 Chick embryo chorioallantoic membrane as a useful tool to study angiogenesis. International Review of Cell and Molecular Biology. 270, 181-224 (2008).
- Valdes, T. I., Kreutzer, D., Moussy, F. The chick chorioallantoic membrane as a novel in vivo model for the testing of biomaterials. Journal of Biomedical Materials Research. 62 (2), 273-282 (2002).
- Ricard, C., Stanchi, F., Rougon, G., Debarbieux, F. An orthotopic glioblastoma mouse model maintaining brain parenchymal physical constraints and suitable for intravital two-photon microscopy. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (86), e51108 (2014).
- Lefevre, M. C. Integrating flexible electronics for pulsed electric field delivery in a vascularized 3D glioblastoma model. npj Flexible Electronics. 5, 19 (2021).
- Perry, J. L., Ramachandran, N. K., Utama, B., Hyser, J. M. Use of genetically-encoded calcium indicators for live cell calcium imaging and localization in virus-infected cells. Methods. 90, 28-38 (2015).
- Blömer, U., et al. Highly efficient and sustained gene transfer in adult neurons with a lentivirus vector. Journal of Virology. 71 (9), 6641-6649 (1997).
- Lenting, K., Verhaak, R., ter Laan, M., Wesseling, P., Leenders, W. Glioma: experimental models and reality. Acta Neuropathologica. 133 (2), 263-282 (2017).
- Hickman, J. A., et al. Three-dimensional models of cancer for pharmacology and cancer cell biology: Capturing tumor complexity in vitro/ex vivo. Biotechnology Journal. 9 (9), 1115-1128 (2014).
- Tay, S. L. M., Heng, P. W. S., Chan, L. W. The CAM-LDPI method: a novel platform for the assessment of drug absorption. Journal of Pharmacy and Pharmacology. 64 (4), 517-529 (2012).
- Kundeková, B., Máčajová, M., Meta, M., Čavarga, I., Bilčík, B. Chorioallantoic Membrane Models of Various Avian Species: Differences and Applications. Biology. 10 (4), 301 (2021).
- Ricard, C., et al. Phenotypic dynamics of microglial and monocyte-derived cells in glioblastoma-bearing mice. Scientific Reports. 6 (1), 26381 (2016).
