Summary
这项工作描述了用于在3D脑肿瘤模型中实现的柔性指间电极的开发，即 体外 培养， 卵子 模型和 体内 小鼠模型。所提出的方法可用于评估不同复杂程度的脉冲电场对肿瘤的影响。
Abstract
胶质母细胞瘤由于其高度的侵袭性而难以通过标准肿瘤学治疗根除。基于脉冲电场（PEF）的生物电处理有望提高处理效率。然而，它们依赖于导致急性和慢性损伤的刚性电极，特别是在大脑等软组织中。在这项工作中，使用柔性电子设备将PEF递送到肿瘤，并用荧光显微镜评估生物学反应。在薄而透明的Parylene-C基板上的叉指金电极涂有导电聚合物PEDOT：PSS，从而形成顺应且生物相容的器件。使用各种生物学模型研究了PEFs对肿瘤及其微环境的影响。首先，在电极顶部培养单层胶质母细胞瘤细胞以研究 体外现象。作为中间步骤，开发了一种 卵中 模型，其中工程肿瘤球体被移植到鹌鹑的胚胎膜中。由于缺乏免疫系统，这导致了高度血管化的肿瘤。在这个发育的早期阶段，胚胎没有免疫系统，肿瘤不被认为是异物。因此，他们可以快速发育，同时从现有的胚胎血管系统开发自己的血管，这代表了有价值的3D癌症模型。最后，使用同源直立移植（颅内）小鼠模型，在具有功能性免疫系统的完整生物体中评估PEF的柔性电极递送。在植入柔性有机电极装置之前，将肿瘤球状体移植到转基因多荧光小鼠的大脑中。密封的颅窗能够在数周内用PEFs治疗期间对肿瘤及其微环境进行多光子成像。
Introduction
多形性胶质母细胞瘤（GBM）是一种高度浸润的肿瘤，因此很难通过切除、放疗和化疗等标准治疗根除。尽管进行了多模式治疗，但预后仍然非常差，大多数患者在诊断后 1 年内出现疾病进展1，2。最近，生物电疗法的发展显示出改善现有疗法的巨大潜力。这些疗法使用脉冲电场（PEF）的传递，通常在一次治疗中，破坏细胞膜完整性和肿瘤的微环境。这种细胞膜破碎，也称为电穿孔，可以是可逆的，也可以是不可逆的，具体取决于电场强度和脉冲数。不可逆电穿孔（IRE）作为一种非热组织消融技术应用，其中电脉冲对细胞膜造成致命损伤，导致细胞死亡3。可逆电穿孔应用于电化学疗法（ECT），这是一种成熟的技术，包括将PEF与化疗药物联合使用以增强癌细胞的药物摄取4。此外，最近的研究表明，钙电穿孔作为ECT的替代品，对癌症治疗效率高，而且价格低廉，副作用更少5。尽管取得了这些有希望的进展，但PEF通常使用刚性的金属电极进行应用，已知这些电极会对软组织造成损害6。大脑对这种侵入性装置特别敏感，其中机械不匹配会引起炎症和星形胶质细胞瘢痕形成7。
在这种情况下，提出了一种灵活的PEF递送系统，结合胶质母细胞瘤肿瘤的3D模型，从微加工到小鼠模型。保形电极采用标准的薄膜微细加工工艺制成，包括使用柔软和生物相容性材料，如聚对二甲苯-C、金和 PEDOT：PSS8，9。叉指电极设计用于覆盖较大的表面积，同时保持足够的透明度，以便在电极手指10之间成像。对于肿瘤模型，使用液体覆盖96孔板方法11的变体产生表达遗传编码荧光报告基因的胶质母细胞瘤细胞的3D球状体。将球状体移植到鹌鹑胚胎的脉络膜尿囊膜中，产生卵 内 模型，该模型已被广泛用于研究血管生成或药物毒理学12，13。在胚胎发育的这个阶段，在没有免疫系统的情况下，肿瘤可以通过胚胎的脉管系统移植和血管化12。然后将柔性电极放置在血管化肿瘤的顶部，以研究PEF递送对球状体及其脉管系统的影响。最后，通过将工程球体植入小鼠模型的脑实质中，对完整的生物体（包括肿瘤微环境和免疫系统）研究了这些影响14。将柔性电极放置在插入部位的顶部，并用玻璃窗密封开颅术，允许在数周内重复双光子成像。
这些方法对于对从微电子工程到肿瘤学应用等各个领域感兴趣的人很有用。微细加工方案可用于和适用于任何需要涂有PEDOT：PSS的薄膜金属电极的应用。此外，为评估抗肿瘤电治疗而开发的生物学模型对于研究细胞、血管和免疫对植入材料的分化将具有普遍兴趣。
Protocol
所有实验程序均按照法国立法和1986年11月24日欧洲共同体理事会关于实验动物护理和使用的指令（86/609 / EEC）进行。对动物的研究得到了罗纳河畔布希斯服务部的授权，并得到了普罗旺斯蔚蓝海岸伦理委员会（Apafis # 22689-2019100414103054）的批准。
1. 柔性器件微细加工（图1）
- 清洁载玻片
- 在2%肥皂溶液中超声处理载玻片15分钟。用水冲洗。
- 在80%纯丙酮和20%纯异丙醇的混合物中再次超声处理15分钟。
注意：这些溶剂有害且易燃。穿戴个人防护装备 （PPE） 并在通风橱下处理。 - 用异丙醇冲洗载玻片并用气枪擦干。
注意：确保在整个过程中丙酮不会在基材上干燥。
- 金电极图案化（图 1A)
- 用聚对二甲苯沉积系统沉积3μm的Parylene-C（PaC）层（图1Aa）。
- 将清洁的载玻片放入沉积室中。将肥皂喷洒在冷却器上，使其干燥，然后将其插入沉积系统的指定冷阱中。这种防粘性有助于在沉积后轻松从冷却器中去除 PaC。
注意：PaC是一种刺激物，对健康构成危害。处理时戴手套。 - 在铝制舟中称取6克PaC并将其放入炉中。抽空机器（P = 10 mTorr）并使用以下参数开始沉积：T冷却 器= -100°C，T炉 = 690°C，T蒸发器 = 175°C，T室 = 135°C。
- 当沉积完成并且汽化器的温度低于40°C时，关闭冷却器，汽化器和炉子。放空机器并收集样品。
- 将清洁的载玻片放入沉积室中。将肥皂喷洒在冷却器上，使其干燥，然后将其插入沉积系统的指定冷阱中。这种防粘性有助于在沉积后轻松从冷却器中去除 PaC。
- 通过氧等离子体处理激活样品表面30秒（100W，50sccm）。
- 用负光刻胶以1，000 x g 旋转涂覆等离子体处理过的样品40秒。将样品置于110°C的热板上2分钟（图1Ab）。
注意：光刻胶溶液易燃，会引起刺激;穿戴个人防护装备并在通风橱下处理。 - 将i线滤光片放在紫外宽带接触对准器的光束线中，并通过具有指叉电极设计的掩模曝光光刻胶（图1Ac）。
注意：间隙为 50 或 250 μm 的叉指电极是使用布局编辑器设计的，光掩模是从一家通过激光光印生产聚酯光掩模的公司订购的。 - 将上述样品在110°C的热板上烘烤3分钟，然后冷却至室温5分钟。将样品浸入无金属离子显影剂中3分钟以去除未曝光的光刻胶。用水冲洗样品并用气枪干燥（图1Ad）。
注意：显影剂解决方案是一种刺激物;穿戴个人防护装备并在通风橱下处理。 - 通过氧等离子体处理激活样品表面60秒（100W，50sccm）。
- 用热蒸发器沉积20nm铬粘附层和300nm金层，如下所示（图1Ae）。
- 排气蒸发器机器，用金属螺钉将样品（面朝下）夹在上圆板上。分别用铬和金填充专用坩埚。密封并抽空机器，以达到低于5·10-6 托的压力。开始样品架的旋转。
- 选择含有铬的坩埚，慢慢增加通过它的电流，直到达到0.2 Å·s-1 的沉积速率。打开快门，等待 20 nm 的铬沉积。关闭快门并缓慢降低电流，直到 0 mA。
- 选择含有金的坩埚，慢慢增加通过它的电流，直到达到0.2 Å·s-1 的沉积速率。打开快门蒸发金，等到沉积10nm的金，然后将沉积速率增加到1.5 Å·s-1 ，直到沉积约300 nm。关闭快门，缓慢将电流逐渐降低至 0 mA。
- 沉积后让样品冷却至室温15分钟。停止样品架的旋转，排气机器，收集样品。
- 将样品浸入装有丙酮的烧杯中。将烧杯放在设置为110rpm的振动板上15分钟以抬起光刻胶。用异丙醇冲洗样品并用气枪干燥（图1Af）。
- 通过氧等离子体处理激活样品表面30秒（100W，50sccm）。
- 用聚对二甲苯沉积系统沉积3μm的PaC绝缘层（见步骤1.2.1）（图1Ag）。
- 用聚对二甲苯沉积系统沉积3μm的Parylene-C（PaC）层（图1Aa）。
- 轮廓开口（图1B）
- 用阳性光刻胶以600 x g 旋转涂覆样品35秒。将其置于110°C的热板上2分钟（图1Ba）。
注意：光刻胶溶液易燃，会引起刺激;穿戴个人防护装备并在通风橱下处理。 - 确保紫外宽带接触对准器的光束线中没有i线滤光片，并通过具有紫外宽带接触对准器的设备轮廓的掩模曝光光刻胶（图1Bb）。
- 将样品浸入无金属离子显影剂中4分钟以去除暴露的光刻胶。用水冲洗样品并用气枪干燥（图1Bc）。
- 用反应离子蚀刻机（160 W，22分钟，O2：50 sccm，CF4：10 sccm）通过两层PaC蚀刻轮廓（图1Bd）。
- 用丙酮去除剩余的光刻胶，用异丙醇冲洗，然后用气枪干燥样品。
- 用阳性光刻胶以600 x g 旋转涂覆样品35秒。将其置于110°C的热板上2分钟（图1Ba）。
- PEDOT：PSS涂层（图1C）
- 将2%肥皂溶液以70 x g 旋转涂覆35秒（图1Ca）。
- 用聚对二甲苯沉积系统沉积3μm牺牲层PaC（参见步骤1.2.1）（图1Cb）。
- 旋涂正光刻胶在600 x g 下旋转35秒。将样品置于110°C的热板上2分钟（图1Cc）。
- 确保紫外宽带接触对准器的光束线中没有i线滤光片，并通过具有电极活性表面的掩模曝光光刻胶（图1Cd）。
- 将样品浸入无金属离子显影剂中4分钟以去除暴露的光刻胶。用水冲洗样品并用气枪干燥（图1Ce）。
- 用反应离子蚀刻机蚀刻PaC以打开电极的活性表面（160 W，24分钟，O2：50 sccm，CF4：10 sccm）。用显微镜检查活性表面上没有残留的PaC（图1Cf）。
- 用丙酮去除剩余的光刻胶，用异丙醇冲洗并用气枪干燥样品。
- 使用氧等离子体处理激活样品表面90秒（100W，50sccm）。
- 将化学聚合的PEDOT：PSS的商业分散体与5体积%的乙二醇（EG）和0.1体积%的十二烷基苯磺酸（DBSA）混合。超声处理15分钟。加入1wt%（3-甘草酰氧基丙基）三甲基硅氧烷（GOPS）并超声处理5分钟。通过1.2μm过滤器过滤溶液。
注意：EG是一种刺激物，对健康构成危害。DBSA是一种刺激性和腐蚀性物质。GOPS具有腐蚀性。穿戴适当的个人防护装备，并在通风橱下处理这些化学品。
注意：总体积取决于样品数量。对于 10 张标准载玻片，准备至少 20 mL 对应于以下数量：18.78 mL PEDOT：PSS、1 mL EG、20 μL DBSA 和 200 μL GOPS。 - 将四层PEDOT：PSS溶液在150 x g 下旋转涂覆35秒。每层沉积后，将样品在110°C下在热板上烘烤60秒，并将它们冷却至室温5分钟，然后旋转下一层（图1Cg）。
- 通过将样品浸入水中来去除牺牲的PaC层（图1Ch）。
- 将样品在140°C烘烤1小时。
- 将样品浸入去离子水中30分钟，以除去PEDOT：PSS薄膜中剩余的肥皂和低分子量化合物，并将样品从玻璃基板上分离（图1Ci）。
- 连接和封装（图 1D）
- 在涂有铜的聚酰亚胺薄膜上沉积一层薄薄的丙烯酸涂料（图1Da）。使用气溶胶获得均匀的油漆层（图1Db）。
- 用激光（75 kHz，7 W，1 次激光通过，400 mm·s-1）对丙烯酸涂料进行图案化，以获得两个矩形接触垫（5 mm x 15 mm;1.5 mm间隙）（图1Dc）。
- 在40°C下用饱和的30%（w / v）氯化铁（FeCl3）在水中湿蚀铜15分钟（图1Dd）。
注意：氯化铁3 具有刺激性和腐蚀性;在通风橱下戴手套处理它。 - 用布轻轻擦拭丙烯漆，用丙酮剥离丙烯酸涂料（图1De）。
- 用激光（15 kHz，10 W，30 次激光通过，130 mm·s-1）将图案化的聚酰亚胺薄膜切割成矩形（15 mm x 30 mm）（图1Df）。
- 用三轴点胶机在三巴的压力下用直径为330μm的针头（5m·min-1）分配银浆（图1Dg）。
注意：银浆是一种刺激物;戴手套处理。 - 使用镊子在双目显微镜下将PaC探针与聚酰亚胺薄膜对齐并连接（图1Dh）。
注意： 可以在步骤 1.5.2 中对准标记进行图案化，以便于将探头定位在接触垫上。 - 在烤箱中在140°C烘烤2小时。
- 将 1 cm2 聚酰亚胺保护胶带放在接触垫上（图 1Di）。
- 浸入PDMS中连接PaC探针和聚酰亚胺薄膜的接口（图1Dj）。
- 在50°C下烘烤2小时。
- 取下保护胶带以打开接触垫（图1Dk）。
注意： 体外 设备的微细加工类似，但必须跳过步骤1.2.1，1.3和1.5。
2. 胶质母细胞瘤GCaMP6f稳定细胞系的产生
- 慢病毒生产
- 在 75 cm² 烧瓶中，在含有 4.5 g· 的 10 mL Dulbecco 改良鹰培养基 （DMEM） 中培养针对慢病毒生产优化的 HEK 293T 衍生细胞系葡萄糖、L-谷氨酰胺、丙酮酸钠和碳酸氢钠的L-1，并补充10%无四环素胎牛血清（FBS）、100单位·mL-1青霉素和100μg·mL-1链霉素至少3 d，直至80%汇合。
- 从烧瓶中取出培养基。用 10 mL 磷酸盐缓冲盐水 （PBS） 轻轻冲洗细胞。
- 加入1mL的0.25%胰蛋白酶/ EDTA溶液，并将烧瓶在37°C孵育5分钟。
注意：胰蛋白酶/EDTA溶液对健康构成危害;穿戴个人防护装备并在通风橱下处理。 - 加入 8 mL 培养基。轻轻冲洗细胞悬液。
- 计数细胞并在 8 mL 培养基中的培养皿中培养 4 x 106 个细胞。
- 第二天，在总体积为600μL的水中稀释25μg含有基因GCaMP6f和赋予嘌呤霉素抗性的选择标记的质粒。将其添加到转染试剂管中。以3，000rpm涡旋10秒，并在室温下孵育管10分钟以产生纳米颗粒。
- 将试管的内容物滴加到HEK 293 T细胞的培养物上，并用手轻轻摇动。将细胞在37°C孵育至少4小时。
- 用新鲜培养基替换含有纳米颗粒复合物的培养基，并在37°C下返回细胞。
- 三天后，收集上清液并以500× g 离心10分钟以除去细胞碎片。收集含有病毒颗粒的液相。
注意：可以使用定量慢病毒滴度测试确认上清液中的病毒产生，并且可以在-80°C下储存至少2年。
- 胶质母细胞瘤细胞转导
- 在75 cm²烧瓶中，将胶质母细胞瘤细胞培养在含有1 g·葡萄糖、L-谷氨酰胺、丙酮酸钠和碳酸氢钠的L-1，并补充10%无四环素FBS、100单位·mL-1青霉素和100μg·mL-1链霉素至少4天。
- 弃去培养基，在目标细胞上加入步骤2.1.9中获得的上清液。
- 在培养基中加入5 μg·mL-1 的六二甲基溴化物以提高转导效果。在37°C孵育6小时。 用 10 mL 新鲜培养基替换培养基。
注意：六二甲基溴化物是一种刺激物。戴手套处理。
- 生成稳定的细胞系
- 转导后2-3天，加入10 mL含1 g·葡萄糖L-1、L-谷氨酰胺、丙酮酸钠、碳酸氢钠、10%FBS、100单位·mL-1青霉素、100μg·mL-1链霉素，并补充嘌呤霉素杀死非转导细胞。在该培养基中培养细胞至少3天。
注意：嘌呤霉素是一种刺激物;戴手套处理。
注意：细胞对嘌呤霉素的敏感性必须在转导前通过在含有不同浓度嘌呤霉素的推荐培养基中培养细胞来测试。一天后，用显微镜检查细胞。选择大多数细胞死亡但少数细胞还活着的适当浓度，以确保抗生素不会毒性太大，并且也可能杀死转染的细胞。 - 取出培养基并用 10 mL PBS 冲洗细胞。
- 加入1mL的0.25%胰蛋白酶/ EDTA溶液，并将烧瓶在37°C孵育5分钟。
- 加入 8 mL 培养基。轻轻冲洗细胞悬液。
- 收集 100 μL 细胞悬液并使用细胞计数器测量细胞浓度。在带有 60 μm 传感器的手持式自动细胞计数仪中吸出 50 μL 细胞悬液。
- 在 96 孔板中接种 1 个细胞/孔。例如，对于浓度为1 x 10 3个细胞/mL，加入1 / （1 x 103），即每孔0.001mL细胞悬液。播种每一口井以增加成功的机会。用培养基完成，达到每孔 200 μL 的总体积。
- 一天后，找到每个含有一个细胞的孔并检查其荧光（λexc = 490 nm和λem = 530 nm）。标记仅包含一个转染细胞的孔。继续生长几天，直到井几乎汇合。
- 弃去培养基并用 200 μL PBS 冲洗细胞。加入 100 μL 0.25% 胰蛋白酶/EDTA 溶液，并将 96 孔板在 37 °C 下孵育 5 分钟。
- 加入 100 μL 培养基并轻轻冲洗细胞悬液。将细胞悬液转移到培养皿中。加入5mL培养基，让细胞生长几天，直到培养皿几乎汇合。
- 弃去培养基并用 5 mL PBS 冲洗细胞。加入1mL的0.25%胰蛋白酶/ EDTA溶液，并将培养皿在37°C孵育5分钟。
- 加入 6 mL 培养基并轻轻冲洗细胞悬液。将细胞悬液转移到T25烧瓶中。继续生长几天，直到烧瓶几乎汇合。
- 弃去培养基并用 5 mL PBS 冲洗细胞。加入1mL的0.25%胰蛋白酶/ EDTA溶液，并将T25烧瓶在37°C孵育5分钟。 加入7 mL含1 g·葡萄糖、L-谷氨酰胺、丙酮酸钠、碳酸氢钠L-1，并补充10%FBS、青霉素100单位·mL-1、链霉素100μg·mL-1。轻轻冲洗细胞悬液。
- 将细胞悬液分成四个T25烧瓶（每个烧瓶2mL），并向每个烧瓶中加入5mL培养基。让细胞生长几天，直到烧瓶几乎汇合。
- 对三个烧瓶重复步骤2.3.12，并在步骤3.1.3中保留最后一个烧瓶。将细胞悬液转移到 15 mL 锥形管中，并以 150 x g 离心 5 分钟。弃去上清液并将细胞沉淀重悬于900μL中。 轻轻混合细胞以保持均匀的细胞悬液。
- 将细胞悬液转移到低温储存瓶中。加入 100 μL 二甲基亚砜。将冷冻管在-80°C下过夜。将冷冻细胞转移到液氮中进行进一步实验。
注意：通过在培养基中加入5μM离聚霉素钙盐并在荧光显微镜下检查荧光的诱导增加（λexc = 490 nm和λem = 530 nm）可以评估转染的效率。
- 转导后2-3天，加入10 mL含1 g·葡萄糖L-1、L-谷氨酰胺、丙酮酸钠、碳酸氢钠、10%FBS、100单位·mL-1青霉素、100μg·mL-1链霉素，并补充嘌呤霉素杀死非转导细胞。在该培养基中培养细胞至少3天。
3.3D 型号
- 球状体培养
- 在去离子（DI）水中制备1%（w / v）琼脂糖溶液。
- 在100mL去离子水中加入100g琼脂糖粉末，并在微波炉中加热溶液，直到所有粉末溶解。定期搅拌溶液以避免结块。将溶液在120°C高压灭菌20分钟。
- 从高压釜中取出后，在 96 孔板中小心地每孔加入 75 μL 琼脂糖溶液。将其沉积在孔的侧面以形成弯月面，从而形成不粘附的圆底。让它在室温下凝固15分钟。
- 将细胞（步骤2.3.12）从步骤2.3.14中获得的烧瓶中分离。
- 每孔胶质母细胞瘤细胞加入 10，000 个细胞并完成，使用含有 1 g· 的 DMEM 达到每孔 150 μL 的总体积葡萄糖、L-谷氨酰胺、丙酮酸钠、碳酸氢钠L-1，并补充10%胎牛血清（FBS）、青霉素100单位·mL-1和链霉素100μg·mL-1。
- 在不移动板的情况下在37°C孵育细胞3天。然后，每2天用多通道移液管用新鲜培养基替换一半的培养基，直到进一步实验。将移液器尖端保持在孔的上部，以避免损坏琼脂糖或球体本身。
注意：球体的大小取决于接种的细胞数量和细胞系，因此必须根据实验进行调整。
- 在去离子（DI）水中制备1%（w / v）琼脂糖溶液。
- 卵中模型
- 将日本鹌鹑（C. japonica）的受精卵放入孵化器（37°C和57%湿度）的托盘上，自动旋转器每2小时翻转一次鸡蛋。这一天被认为是胚胎日（ED）0。
- 将塑料称重船放入 70% （w/v） 乙醇中清洗塑料称重船。取出称重船，在通风橱下干燥。
注意：从这一点开始，实验不在无菌条件下进行。然而，需要清洁的条件以避免胚胎上发霉。 - 在 ED3 上，使用镊子轻轻打开鸡蛋，镊子的细尖端用 70% （w/v） 乙醇预先清洗。将胚胎倒入塑料称量舟中，用另一称量船盖住，并将其置于37°C的标准加湿培养箱中3天。
- 在 ED6 上，用 23 G 针在脉络膜尿囊膜 （CAM） 上做一个小切口。
- 使用移液管，将7天的球体放在切口上，然后将胚胎放回培养箱3天，直到进一步实验。
注意：可以将荧光染料注射到胚胎的眼睛中以可视化血管。 - 在实验当天，使用显微操纵器将柔性探针放在血管化肿瘤的顶部。
- 这 in vivo 型
注意：协议的这一部分改编自之前在参考文献中发布的协议14.使用成年多色荧光AMU-神经蛋白脂小鼠（B6.Cg-Tg（Thy1-CFP）23Jrs（Ly6a-EGFP）G5Dzk（Itgax-EYFP）1Mnz / FD）;这些小鼠呈现Thy1亚群的标记+ 通过ECFP的转基因表达神经元，外周LyzM的标记+ 通过转基因表达EGFP和标记在Cd11c控制下表达EYFP的小胶质细胞亚型来刺激细胞+.简而言之，在任何治疗或注射之前，用1.5%异氟醚轻轻镇静动物2分钟。手术前，用氯胺酮（120mg / kg;IP）和甲苯噻嗪（12毫克/千克;知识产权）。然后，局部施用3%利多卡因凝胶以减轻与立体定向支持固定相关的耳朵疼痛。然后，将0.25%布比卡因溶液施用于手术部位以减轻开颅术引起的任何疼痛。一旦小鼠准备好手术，根据参考进行直径为4mm的开颅手术14.用26G针在开颅术中间的硬脑膜上开一个孔，并用参考文献中描述的注射系统注射肿瘤球状体14.此外，如此处所述，在用玻璃窗密封开颅术之前，将柔性电极放置在表达肿瘤球体的GCamp6或DsRed上。- 放置一滴Dulbecco的磷酸盐缓冲盐水（DPBS），使其覆盖开颅术。将柔性电极放在DPBS的液滴上，然后用接触垫轻轻地将探头的背面放在鼠标的背面（图4B）。
注意：使用无菌手套和“仅尖端”技术。如果接触非无菌表面，请更换手套。在此过程中提供热支持。 - 用一小张纸触摸DPBS液滴以吸收DPBS，直到探针可以平放在硬脑膜上并跟随大脑的曲率。确保一小层DPBS保留在电极下方，而不会从电极侧面逸出。这确保了在接下来的步骤中防止胶水溢出。
注意：使用前对所有设备进行消毒。 - 将一小滴硅胶粘合剂滴在探头上，并用 5 mm 圆形盖玻片覆盖。向下推盖玻片，直到硅胶均匀分布，盖玻片与探头之间的距离最小。将盖玻片再向下推 30 秒，使硅胶凝固。
- 要固定盖玻片，请快速在其侧面涂上强力胶并将其向下推，直到胶水固化为固体。
- 使用牙签在探头的颈部涂抹强力胶，注意将强力胶拉到颈部下方，为其提供稳定的支撑。
- 用牙科水泥覆盖颅骨以建立慢性帽。请特别注意仅遮盖盖板玻璃的边缘。
- 抬起探头的背面，在探头颈部下方涂上水泥。在固化之前将探针放在水泥上。在实验过程中，用钝钳轻轻向下推探头的颈部，使其表面与盖玻片的表面处于同一水平，并且不会妨碍显微镜物镜。
- 用不超过1.5毫米的牙科水泥层覆盖探头颈的顶部，以牢固地固定探头。在盖玻片周围 1-2 毫米的距离处建造一个水泥井，呈现一个 1.5 毫米的脊，为用于双光子成像的浸没液创建一个盆地（图 4C）。
- 水泥固化后，应用丁丙诺啡术后镇痛药（0.05 mg / kg，皮下注射每10g体重0.1mL），并将动物保持在温暖的气氛中，直到它醒来。这包括靠近红外灯泡以及用纸巾包裹动物。
注意：将温度计放在鼠标水平以监控温度。 - 使用恒电位仪表征 1-10 kHz 范围内的阻抗。
- 让动物从手术中恢复至少 10 天。手术后立即服用消炎药，并继续监测动物的状态，以提供适当的术后镇痛。
- 放置一滴Dulbecco的磷酸盐缓冲盐水（DPBS），使其覆盖开颅术。将柔性电极放在DPBS的液滴上，然后用接触垫轻轻地将探头的背面放在鼠标的背面（图4B）。
4. 脉冲电场 （PEF） 传输和成像
- 将标本置于荧光显微镜下。在3D模型的情况下，肿瘤只能从顶部观察。
注意：对于 卵内 模型，实验在落射荧光显微镜下进行（但也可以使用双光子显微镜），而 体内 模型的实验在双光子显微镜下进行（图6）。 - 使用弹簧针连接器（体外）或鳄鱼夹（卵 和 体内）（图4A）将脉冲发生器连接到设备的接触垫。设置所需的参数（脉冲数、电压、脉冲持续时间、频率）并通过运行发生器应用 PEF（图 4A）。同时测量荧光以实时观察PEF的影响。
Representative Results
该协议允许应用于两个胶质母细胞瘤模型，其中集成了灵活的PEF输送系统。在微细加工和封装步骤之后，通过电化学阻抗谱（EIS）在盐溶液中表征柔性电极，以评估和验证其性能。PEDOT：PSS涂层电极显示出典型的电容和电阻主导区域，由截止频率隔开，而未涂层电极仅显示电容行为（图2）。
液体覆盖96孔板方法的变体用于生长由转染的胶质母细胞瘤细胞组成的3D肿瘤，该细胞稳定表达荧光细胞内钙报告基因。可以用明场显微镜观察微球的生长（图3;ED 0）。至少需要 2 或 3 天才能获得球形和致密球状体，具体取决于细胞系和接种的细胞数量。
在 卵中 模型中，球状体被移植在鹌鹑胚胎的脉络膜尿囊膜中（图3;第6版）。几天后可以通过荧光显微镜评估移植的成功，因为活细胞具有细胞内钙，因此具有荧光（图3;第9版）。通过将荧光染料注入血管，可以在荧光显微镜下观察到肿瘤的血管化（图3;ED9）。然而，由于球体非常密集，可能并不总是能够可视化肿瘤内的血管。将柔性指间电极放置在血管化肿瘤的顶部（图3;ED 9）并连接到脉冲发生器。探针必须轻轻放置以避免胚胎出血;否则，荧光染料会扩散，从而阻碍任何成像观察。通过测量通过电路的电流，可以验证脉冲是否正确传递到生物环境。 在卵模型中对这些 进行成像可以实时监测PEF对3D胶质母细胞瘤肿瘤中细胞内钙的影响，以及对肿瘤脉管系统诱导的血管收缩，避免包括免疫系统在内的其他细胞类型的任何影响15。
PEF对胶质母细胞瘤的影响研究也可以在更完整和预测的模型中进行。实际上，上述14描述的体内模型包括在小鼠的脑实质中移植3D胶质母细胞瘤肿瘤（图4）。肿瘤的注射部位被交联的葡聚糖凝胶半珠堵塞，以概括肿瘤生长过程中的生理生物物理限制。尽管在参考文献14 中进行了描述，但值得再次强调的是，将葡聚糖半珠精确地粘合到硬脑膜上至关重要;否则，肿瘤可以通过开放的硬脑膜逸出并完全覆盖大脑，使成像变得不可能。对于任何慢性成像，颅窗愈合时发生的组织向内生长构成了严重的障碍，因为新组织是不透明的，并且使图像起雾或无法使用。因此，在插入和粘合半珠后，需要用一层薄薄的强力胶密封，精心放置在腔壁周围，不要让强力胶滑落或流到硬膜上。当柔性探针放置在肿瘤注射部位的顶部时，探针下方不会留下气泡，原因有两个。首先，当存在气泡时，成像无法进行。其次，气泡充当绝缘体，从而改变电刺激特性。采取上述预防措施后，用粘合在颅骨上的玻璃窗密封开颅术，以便在数周内进行慢性成像。由于肿瘤由GCaMP或DsRed表达细胞组成，因此可以用荧光显微镜确认注射。必须测量电极的电化学阻抗以验证植入后的性能。与盐溶液中的阻抗相比，由于生物环境的存在，预计体内阻抗在频率高于100 Hz时会增加（图5）。血管化神经实质和肿瘤浸润可以通过透明底物在数周内通过双光子显微镜观察和表征（图6）。例如，在感兴趣的细胞（免疫细胞和神经元）中使用表达荧光蛋白的转基因动物可以证明单独电极植入诱导的最小炎症过程（图6A），或者在植入生长的GBM肿瘤顶部的PEF刺激电极26天后显示小胶质细胞和单核细胞的存在（图6B1).在后一种情况下，在肿瘤周围和内部发现了外周单核细胞衍生细胞和脑驻留小胶质细胞（图6B2）。在PEF递送当天，柔性电极的接触垫可以直接在双光子显微镜下连接到脉冲发生器。总体而言，该模型可用于研究生物电治疗的效果，使用参与脑肿瘤发展的各种类型的细胞，深度可达约500μm。
图 1：柔性电极的微细加工 。 （A） 金电极图案和聚对二甲苯 C 基板。（二）大纲开口。（C）PEDOT：PSS涂层。（d） 连接和包装。请点击此处查看此图的大图。
图 2：柔性金电极和 PEDOT：PSS 涂层冷电极在盐溶液中的电化学阻抗谱。 请点击此处查看此图的大图。
图3：胶质母细胞瘤的 卵内 模型。 ED 0：用明场显微镜观察球体。ED 3：开封后3天对鹌鹑胚胎进行无壳培养。ED 6：用明场显微镜观察植入CAM中的肿瘤。ED 9：放置在血管化肿瘤上的柔性装置（绿色肿瘤和红色血管）。 请点击此处查看此图的大图。
图4： 体内 应用 。 （A） 体内 实验方案。（B）盖板玻璃和丙烯酸树脂应用前的探头放置。（C）探针植入完成。 请点击此处查看此图的大图。
图 5：盐溶液中柔性金电极与植入探针的电化学阻抗谱比较。 请点击此处查看此图的大图。
图 6：通过电极的活体多光谱双光子成像 。 （A）电极植入后3天对照多荧光AMU-Neuroinflam小鼠中健康大脑表面的平铺图像。青色显示第 5 层锥体神经元的树突状树状树化，绿色显示募集的粒细胞和单核细胞，黄色显示活化的小胶质细胞和树突状细胞。粉红色表示由于热量积聚引起的红外扩散。（地下一）与 A 相似的图像，但在肿瘤球状体植入皮层200μm后26天，紧接着进行电极植入。注意绿色和黄色免疫细胞的积累。（地下2层）图像与 B1 相似，但在电极表面以下100μm。注意红色肿瘤肿块本身被黄色小胶质细胞和树突状细胞浸润的外围存在蓝色神经元树突状树状树状化。深蓝色显示来自肿瘤周围胶原蛋白的二次谐波信号。（地下3层） B2 的放大视图显示肿瘤附近存在中间神经元体细胞（用箭头表示）。 请点击此处查看此图的大图。
Discussion
这项工作中描述的方法使具有集成PEF递送系统的脑肿瘤模型能够研究PEF在不同生物组织水平上的影响。微细加工方案由标准的薄膜工艺组成，这些工艺在电极设计中提供了很大的自由度，可以适应特定的应用。有时，在制造结束时，额外的热退火步骤可能很有用，以减少制造过程中发生的电极弯曲。
使用表达荧光钙指示剂的稳定胶质母细胞瘤细胞系可避免与染料递送和保留相关的所有并发症，特别是在非常致密的3D肿瘤中16。事实上，与标准化学荧光钙指示剂相比，在很长一段时间内观察到高表达水平17。该协议可以应用于各种细胞系，因为它通常用于成像神经活动11。在这里，使用人和鼠细胞系（U87和Gl261分别用于植入免疫缺陷或免疫功能正常的小鼠）。事实上，最近的研究表明，U87细胞系与原始细胞不同，因为许多突变是在多年的细胞培养中获得的，影响了实验重现性18。用于制备3D肿瘤的方法具有高通量，可重复性，并且允许根据细胞系，接种时的细胞数量和生长时间产生特定大小的球状体19。然而，这些球状体是致密的，这在肿瘤核心成像时是一个缺点。
卵内模型是研究PEF对3D肿瘤及其脉管系统影响的第一种方法，而不与大脑中存在的其他细胞类型相互作用。这种模型价格低廉，速度快，通量高，并且比动物模型引起的伦理问题更少。在整个实验过程中保持胚胎的完整性很重要，因为它可能会影响其存活和成像质量。打开鹌鹑蛋时必须特别小心，以免损坏胚胎膜。移植和柔性电极的放置也必须小心进行，以避免可能杀死胚胎的出血。在血管中注射荧光染料可以通过荧光显微镜同时观察肿瘤细胞和血管形成。必须小心进行眼内注射，以避免染料泄漏到胚胎液中，这可能会导致背景中残留荧光，从而降低成像质量。该模型也可用于跟踪药物摄取，因为它允许进入循环系统。然而，实验受到胚胎12天存活时间的限制，因此允许7天的观察，这明显短于体内模型21。
体内脑肿瘤模型可以在动物达到由突然减轻20%的体重确定的伦理实验终点之前监测4至5周。耐受性良好，如果电极的连接尾部不太长，则保持原位。否则，动物往往会刮擦翻转连接器，最终可能会被撕裂，从而阻止随后连接到刺激器。然而，这 4 周的时间对于涵盖胶质母细胞瘤发展的不同阶段很有价值。当在不同时间间隔比较相同感兴趣体积的肿瘤细胞密度时，可以观察到肿瘤生长动力学的演变。特别地，在免疫开关22时观察到增强的肿瘤生长。在存在刺激电极的情况下进行类似的研究将告知PEF对肿瘤增殖速率和肿瘤对免疫消除敏感性的影响。与卵内模型相比，体内模型可以被视为研究免疫细胞对肿瘤进展的影响及其对PEF治疗效果的贡献的有价值的临床前模型。该方案改编自前一篇文章，在放置颅窗14之前在肿瘤上增加了柔性电极装置。肿瘤的急性和慢性生物电治疗都可以通过双光子显微镜的直接和后续观察来表征，因为初始刺激有望诱导细胞死亡并引发免疫反应的持久失调。
柔性探头的连接在双光子显微镜下很容易接近。因此，可以根据观察到的对神经组织和/或靶细胞的影响实时调整电刺激参数，类似于医生在观察患者的MRI或CT图像时执行介入程序的方式。最后一个考虑因素是用强力胶和硅胶小心密封大脑上的电极以防止组织再生的重要性。
总之，这里描述的方案代表了一种创新模型，用于研究使用柔性有机聚合物电极进行PEF治疗胶质母细胞瘤肿瘤模型的效果。这两种模型表现出不同程度的复杂性，因此可以分离细胞，血管或免疫效应，以便更好地了解作用机制。适形的浅表电极可减少医源性损伤，同时破坏肿瘤微环境，引发血管收缩或细胞内钙失调15。
Disclosures
提交人声明，他们没有相互竞争的经济利益。
Acknowledgments
这里报告的工作得到了法国国家研究机构（ANR-18-CE19-0029）的支持。作者热烈感谢S.M. Bardet对产生稳定的GCaMP6f细胞系的贡献，并感谢D. O'Connor对 卵内 模型的帮助。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| (3-Glycidyloxypropyl)trimethoxysilane | Sigma | 440167 | GOPS |
| 0.25% Trypsin-EDTA (1X) | Gibco | 25200-056 | |
| 4-Dodecylbenzenesulfonic acid | Sigma | 44198 | DBSA |
| 96-well plate | Falcon | 353075 | |
| Acetone | Technic | 530 | |
| Acrylic resin | Fischer scientific | NC1455685 | |
| agarose | Sigma | A9539 | |
| autoclave | Tuttnauer | 3150 EL | |
| AZ 10XT | Microchemicals | Positive photoresist | |
| AZ 826 MIF Developer | Merck | 10056124960 | Metal-ion-free developer for the negative photoresist |
| AZ Developer | Merck | 10054224960 | Metal-ion-free developer for the positive photoresist |
| AZ nLof 2070 | Microchemicals | Negative photoresist | |
| Buprenorphine | Axience | ||
| Carprofen | Rimadyl | ||
| Centrifuge Sorvall Legend X1R | Thermo Scientific | 75004260 | |
| CMOS camera Prime 95B | Photometrics | ||
| CO2 incubator HERAcell 150i | Thermo scientific | ||
| DAC board | National Instruments | USB 6259 | |
| Déco spray Pébéo | Cultura | 3167860937307 | Black acrylic paint |
| Dextran Texas Red 70.000 | Thermofisher | D1830 | |
| Die bonding paste "Epinal" | Hitachi | EN-4900GC | Silver paste |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma | D2438 | |
| Dispensing machine | Tianhao | TH-2004C | |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium + GlutaMAX™-I | Gibco | 10567-014 | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium | Sigma | D6429 | |
| Egg incubator COUVAD'OR 160 | lafermedemanon.com | ||
| Ethylene glycol | Carl Roth | 6881.1 | |
| Fertilized eggs of Japanese quail | Japocaille | ||
| Fetal Bovine Serum | VWR | S181BH | |
| Flask | Greiner | 658170 | |
| Fluorescence macroscope | Leica MZFLIII | ||
| Gl261 | DSMZ | ACC 802 | |
| Gold pellets - Dia 3 mm x 6 mm th | Neyco | ||
| Handheld automated cell counter | Millipore | PHCC00000 | |
| Heating and drying oven | Memmert | UF110 | |
| Hexadimethrine Bromide Sequa-brene | Sigma | S2667 | |
| hot plate Delta 6 HP 350 | Süss Microtec | ||
| Illumination system pE-4000 | CoolLed | ||
| Infrared tunable femtosecond laser (Maï-Taï) | Spectra Physics (USA) | ||
| Ionomycin calcium salt | Sigma | I3909 | |
| Kapton tape SCOTCH 92 33x19 | 3M | Polyimide protection tape | |
| Lab made pulse generator | |||
| Labcoter 2 Parylene Deposition system PDS 2010 | SCS | ||
| Lenti-X 293 T cell line | Takara Bio | 63218 | HEK 293T-derived cell line optimized for lentivirus production |
| Lenti-X GoStix Plus | Takara Bio | 631280 | Quantitative lentiviral titer test |
| Mask aligner MJB4 | Süss Microtec | ||
| Micro-90 Concentrated cleaning solution | International Products | M9050-12 | |
| Microscope slides 76 x 52 x 1 mm | Marienfeld | 1100420 | |
| Needles 30G | BD Microlance 3 | 304000 | |
| PalmSens4 potentiostat | PalmSens | ||
| parylene-c : dichloro-p-cyclophane | SCS | 300073 | |
| PCB Processing Tanks | Mega Electronics | PA104 | |
| PEDOT:PSS Clevios PH 1000 | Heraeus | ||
| penicillin / streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| Petri dish | Falcon | 351029 | |
| pGP-CMV-GCaMP6f | Addgene | 40755 | plasmid |
| Phosphate Buffer Saline solution | Thermofisher | D8537 | |
| Plasma treatment system PE-100 | Plasma Etch | ||
| PlasmaLab 80 Reactive Ion Etcher | Oxford Instruments | ||
| Plastic mask | Selba | ||
| Plastic weigh boat 64 x 51 x 19 mm | VWR | 10770-454 | |
| Poly-dimethylsiloxane: SYLGARD 184 Silicone Elastomer Kit | Dow chemicals | 1673921 | |
| Polyimide copper film 60 µm (Kapton) | Goodfellow | IM301522 | |
| Propan-2-ol | Technic | 574 | |
| Protolaser S | LPKF | ||
| puromycin | Gibco | A11103 | |
| Round cover glass 5 mm diameter | Fischer scientific | 50-949-439 | |
| Scepter Sensors - 60 µm | Millipore | PHCC60050 | |
| Silicone adhesive Kwik-Sil | World Precision Instruments | ||
| spin coater | Süss Microtec | ||
| Spin Coater | Laurell | WS-650 | |
| Super glue | Office depot | ||
| tetracycline-free fœtal bovine Serum | Takara Bio | 631105 | |
| Thermal evaporator Auto 500 | Boc Edwards | ||
| Two-photon microscope | Zeiss LSM 7MP | ||
| U87-MG | ATCC | HTB-14 | Human glioblastoma cells |
| Ultrasonic cleaner | VWR | ||
| Vortex VTX-3000L | LMS | VTX100323410 | |
| Xfect single shots reagent | Takara Bio | 631447 | Transfection reagent |
References
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