En minimalt invasiv, hurtig rygmarvslateral hemisektionsteknik til modellering af åbne rygmarvsskader hos rotter

Summary

Her beskriver vi en ny, hurtig teknik, der modellerer åben rygmarvsskade hos rotter, der eliminerer laminektomi. Lateral hemisektion udføres under visning gennem et mikroskop. Teknikken er alsidig og kan også bruges i livmoderhals-, thorax- og lændehvirvelområderne i rygmarven hos andre dyr.

Abstract

Åbne rygmarvsskadeteknikker, modellering, laceration-lignende skader er tidskrævende og invasive, fordi de involverer laminektomi. Denne nye teknik eliminerer laminektomi ved at fjerne to spinøse processer og løfte og derefter vippe den kaudale hvirvelbue. Det kirurgiske område åbner op uden behov for laminektomi. Lateral hemisektion udføres derefter med direkte synlig kontrol under et mikroskop. Traumet minimeres og kræver kun et lille knoglesår.

Denne teknik har flere fordele: den er hurtigere og derfor mindre byrde for dyret, og knoglesåret er mindre. Fordi laminektomien elimineres, er der mindre chance for uønsket skade på rygmarven, og der er ingen knoglesplinter, der kan forårsage problemer (knoglesplinter indlejret i rygmarven kan forårsage hævelse og sekundær skade). Rygsøjlen forbliver intakt. Hovedbegrænsningen er, at hemisektionen kun kan udføres i de intervertebrale rum.

Resultaterne viser, at denne teknik kan udføres meget hurtigere end den traditionelle kirurgiske tilgang ved hjælp af laminektomi (11 min vs. 35 min). Denne teknik kan være nyttig for forskere, der arbejder med dyremodeller af åben rygmarvsskade, da den er bredt tilpasningsdygtig og ikke kræver yderligere specialiseret instrumentering.

Introduction

Rygmarvsskader (SCI'er) er desværre udbredte skader hos mennesker. SCI'er kan kompliceres på forskellige måder, for eksempel ved infektioner, og det er klinisk vigtigt at studere disse skader¹. Fordi der ikke er nogen enkelt, bestemt kur mod SCI'er, er dyremodeller stadig nødvendige for at fremme forskernes forståelse og fremme mulige behandlinger ^2,3. Selvom lukkede skader oftest modelleres (kompression og kontusion), er det klinisk vigtigt at forstå flænger, som kun kan modelleres i åbne skader⁴. Åbne sårmodeller ved hjælp af transektion eller hemisektion kan bruges til at demonstrere en mere præcis lokalisering af et sår sammenlignet med lukkede skademodeller på grund af skadens art (kontusion vs. kirurgisk snit). Eksperimenter med åbne sår kan kaste lys over mere specifikke neuronale skader på en kontrolleret, pålidelig og replikerbar måde⁵. Den fuldstændige eller delvise transsektion af rygmarven er en meget anvendt åben sårteknik og kan ses detaljeret i artiklen af Brown og Martinez⁶.

Ved undersøgelse af åben rygmarvsskade hos rotter præsenterede flere dyr problemer, der opstod fra operationen: knoglesplinter fra laminektomien blev indlejret i rygmarven og forårsagede hævelse; det større knoglesår havde brug for lang tid til at helbrede; Operationen tog for lang tid. En alternativ kirurgisk teknik blev udviklet for at eliminere disse problemer. Målet var at udvikle en hurtigere teknik, der er mere skånsom for dyret. Denne nyudviklede teknik er meget hurtigere end traditionelle SCI-teknikker. Den kirurgiske tilgang er minimalt invasiv, hvilket resulterer i et mindre knoglesår, samtidig med at problemer som følge af laminektomi elimineres.

Alle åbne sårteknikker involverer åbning af dura⁷. Flere nylige undersøgelser har undersøgt forskellige, nyudviklede teknikker med det formål at forbedre de tidligere metoder ^8,9. Selvom åbningen af dura ikke kan udelukkes ved hjælp af denne nye teknik, forårsager det et mindre sår på duraen, samtidig med at det giver en pålidelig, kontrolleret skade på rygmarven. Ved at konsultere litteraturen om rygmarvsskadeteknikker forsøgte mange forfattere at minimere operationstiden ved at implementere mindre ændringer i den oprindelige teknik¹⁰. Laminektomi er altid en del af disse kirurgiske procedurer, selvom det er tidskrævende og kræver, at der laves et større knoglesår⁶. Denne kirurgiske teknik kan være passende for forskere, der bruger åbne sårrygmarvsskademodeller, specifikt komplet transsektion eller lateral hemisektion udført i de intervertebrale rum (figur 1).

Protocol

Alle dyreforsøg blev udført i overensstemmelse med EU-direktivet (2010/63/EU) og blev godkendt af den dyreetiske komité under Ungarns nationale kontor for fødevarekædesikkerhed (PEI/001/2894-11/2014). Alle gældende institutionelle og statslige bestemmelser vedrørende etisk brug af dyr blev fulgt under denne undersøgelse.

1. Forberedelse før operationen

1. Steriliser alle instrumenter, der anvendes under proceduren (se materialetabellen), og desinficer overfladerne, hvor arbejdet skal udføres før proceduren.
2. Injicer en enkeltdosis subkutane antibiotika profylaktisk.
   BEMÆRK: Se materialetabellen for antibiotikadoseringsdetaljer.
3. Lad dyrene være i operationsstuen i 1 time for at akklimatisere dem og mindske deres stress før operationen.
4. Bedøv rotten via en intramuskulær injektion af en kombination af ketamin og xylazin (ketamin 80 mg/kg legemsvægt (lgv) og xylazin 8 mg/kg legemsvægt).
   BEMÆRK: Ud over anæstesigiver k-etamin-xylazin-kombinationen tilstrækkelig analgesi til denne procedure. Analgesiregimet kan ændres i henhold til de institutionelle retningslinjer for brug af dyr.
5. Hold rotten varm under proceduren ved hjælp af et opvarmet bord eller infrarødt lys og hold øjnene fugtige under hele anæstesien ved hjælp af oftalmisk salve (genanvend efter behov).
6. Fastgør dyret på operationsbordet ved hjælp af kirurgisk tape på for- og bagpoterne og halen, og afhængigt af skadestedet, også på nakken. Placer om nødvendigt rotten i en stereotaksisk ramme for at stabilisere den under operationen.
7. Brug steril kirurgisk sutur til at placere en løkke omkring rottens øverste fortænder og fiksere dette på kanten af operationsbordet.
8. Træk tungen sidelæns ud for luftvejsstyring.
9. Barber pelsen på bagsiden, mindst 2 cm i hver retning, hvor snittet skal laves.
10. Desinficere huden på det kirurgiske område mindst tre gange ved hjælp af en povidon-jodopløsning og sterilt gasbind. Vær særlig omhyggelig med at suge pelsen omkring området. Fastgør det kirurgiske sted med en steril gardin.
11. Vurder anæstesiens tilstrækkelighed, inden du placerer det første snit ved at klemme tæerne og halen af dyret. Fortsæt med at overvåge tilstrækkeligheden af anæstesi under hele proceduren.

2. Kirurgi

1. Placer hudsnittet ved hjælp af et skalpelblad 20. For at åbne det kirurgiske område skal du placere et 2-2,5 cm langt snit langs rygsøjlen og skære gennem alle lag af huden. Placer dette snit parallelt med rygsøjlen ved hjælp af L1-hvirvlen som midtpunkt, så den strækker sig ~ 1 cm i både kranial og kaudale retning langs rygsøjlen.
2. Mobiliser siderne af såret ved at skære gennem bindevævet omkring musklerne.
3. Placer to parallelle snit langs rygsøjlen, der trænger ind i periosteum. Placer snittene lige ved siden af rygmarvsprocesserne på begge sider, der spænder over afstanden mellem Th13 og L1 hvirvlerne.
4. Disseker musklerne, der er fastgjort til hvirvlerne, ved hjælp af et raspatorium, indtil alle rygmarvsbåndene er synlige. Sæt en retraktor på plads.
5. Fjern rygmarvsprocesserne i den 13. brysthvirvel og den 1. lændehvirvel ved hjælp af tandbentang for at visualisere hele det kirurgiske område^. Kontroller derefter proceduren ved at se et forstørret (4x-16x forstørrelse) mikroskopisk billede.
6. Brug sterilt gasbind til at kontrollere blødning under hele proceduren, når det er nødvendigt.
7. Løft forsigtigt resten af L1-rygsøjleprocesserne og løft L1-hvirvelbuen. Afskær ligamentum flavum for at få adgang til rygmarven. Hæv de kaudale rygmarvsprocesser yderligere, hvilket giver adgang til spinal dura mater, som også er afskåret. Tip de kaudale spinalprocesser i kranial retning for at visualisere pia mater.
8. Se gennem pia mater for den bageste median vene, der viser midterlinjen af rygsøjlen.
9. Brug venen som en retningsbestemt bisektor til at placere et snit ved hjælp af en mikrokirurgisk skalpel, mens venen skånes. Placer snittet under venen i tværplanet gennem rygmarvens anteroposterior diameter. Afskær halvdelen af rygmarven ved at flytte bladet sideværts væk fra midterlinjen.
   BEMÆRK: Snittet er ensidigt på højre side ved det 4^. lændesegment.
10. Prøv at placere snittet for at undgå at skære den forreste rygmarvsarterie. Sørg for, at der ikke påføres overtryk på rygsøjlen, når rygmarven skæres for at skåne den forreste rygmarvsarterie på den ventrale side af rygmarven.

Figur 1: Illustration, der viser trinene i den nye åbne SCI-teknik i rotter. A) De blottede ryghvirvler. (B) Spinal processer fjernet (Th13 og L1). C) L1-hvirvlens løftede og vippede ryghvirvelbue. (D) Hemisektion udført på højre side, med hemisected rygmarv vist separat, zoomet ind. Klik her for at se en større version af denne figur.

11. Luk ikke dura mater direkte under sårlukning. Tæt sutur (sutur størrelse 4-0) musklerne langs rygsøjlen processer, indirekte lukker det lille sår på dura mater.
12. Luk det dorsale bindevævslag med suturer.
13. Til sidst sutur huden omkring snitstedet.

3. Postkirurgisk pleje og opfølgning

1. Lad dyrene vågne i deres bure. Hold dyret/dyrene varme ved hjælp af en varmelampe ud over det temperaturstyrede rum. Lad ikke rotterne være alene, når de vågner efter operationen, og sæt dem ikke sammen med andre rotter i samme bur.
2. Overvåg deres respirationsfrekvens mindst hvert 10. minut, indtil de er helt vågne. Anvend om nødvendigt blid stimulering (f.eks. Gnid hovedet) for at hjælpe deres opvågnen fra anæstesi.
3. Når dyrene er opmærksomme og tilstrækkeligt aktive, skal du transportere dem sikkert tilbage til dyrehuset.
4. Hold rotterne under nøje overvågning i de første 24 timer efter operationen. Efter de første 24 timer efter operationen kontrolleres dyrene mindst to gange om dagen indtil forsøgets afslutning, og der overvåges for tegn på angst.
5. Vurder dem grundigt en gang om dagen for tegn på nød ved hjælp af den relevante institutionelle dyrevelfærdsprotokol, og vær særlig omhyggelig med at kontrollere deres sår for tegn på infektion og betændelse.
   BEMÆRK: Stress og infektion påvirker dyrenes velfærd og resultatet af forsøg.
6. Administrer antibiotika subkutant hver dag indtil afslutningen af forsøgene. Hold dyrene i sterile bure, et dyr pr. bur, og giv mad og vand ad libitum, det samme som før. Ved forsøgets afslutning (eller hvis der observeres alvorlige bivirkninger i forsøgsperioden) aflives dyrene humant i overensstemmelse med den relevante institutionelle dyrevelfærdsprotokol.
   BEMÆRK: Her blev dyrene aflivet (i en dyb søvn induceret af kombinationen af ketamin-xylazin) ved først at administrere en fysiologisk saltvandsperfusion (1/3 ml / g bw) efterfulgt af en 4% paraformaldehydperfusion (1 ml / g bw).

Representative Results

Efter hemisektionen viser rotterne lammelse i det ipsilaterale bagben (in vivo bevis for vellykket hemisektion). Grundig prøveevaluering kan kun udføres efter fjernelse af rygmarven (se figur 2, hvor den fjernede rygmarv kan ses fra både ventral og dorsal side).

Figur 2: Ventral og dorsal visning af den fjernede rygmarv efter hemisektion. Hele den fjernede rygmarv set fra den ventrale side (A) og den dorsale side (B) vist side om side. Klik her for at se en større version af denne figur.

For det første analyseres den fjernede rygmarv i sin helhed under et mikroskop ved hjælp af 4x-16x forstørrelse (for at evaluere graden og præcisionen af skaden). Prøven analyseres derefter yderligere ved hjælp af histologi, hvor skadestedet kan ses mere detaljeret. Hæmatoxylin og eosin (H&E) plet blev brugt til at forberede prøverne (figur 3).

Figur 3: Histologisk prøve, der viser hemisektion. Histologisk prøve farvet ved hjælp af hæmatoxylin og eosin, der viser hemisektionen, set under et mikroskop (16x forstørrelse). Vægtstang = 1 mm. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figur 2 og figur 3 viser, at snittet er helt acceptabelt i længde og placering. Kvaliteten af prøverne var mindst lige så god som dem, der blev opnået fra dyr, hvis rygmarv blev halveret ved hjælp af den traditionelle kirurgiske tilgang med laminektomi (for en detaljeret beskrivelse af den traditionelle kirurgiske metode, se ⁶). Billederne er ikke kvalitativt forskellige fra resultatet af enhver anden kirurgisk tilgang, selvom denne teknik er hurtigere, og der ikke er nogen laminektomi.

Resultaterne viser, at denne teknik kan udføres meget hurtigere end den traditionelle kirurgiske tilgang ved hjælp af laminektomi (11 min vs. 35 min). Rygmarven udsættes i 10-15 s med denne metode sammenlignet med mindst 3,5 minutter ved hjælp af laminektomi (indtil lukning af dura). Afslutningsvis er denne nye minimalt invasive SCI-metode uden laminektomi meget hurtigere og kræver ingen yderligere specialiseret instrumentering.

Discussion

Denne minimalt invasive rygmarvsskadeteknik blev udviklet, da man studerede rygmarvsskadede rotter, og holdet stod over for problemer som følge af selve operationen (knoglesplinter fra laminektomien, der forårsager kompression og beskadigelse af rygmarven, kirurgi tager for lang tid, langsom heling af et stort knoglesår). Ved at eliminere laminektomi blev proceduren meget hurtigere (11 min vs. 35 min), strukturen i rygsøjlen forblev intakt, knoglesåret var meget mindre, og der var ingen knoglesplinter, der kunne beskadige rygmarven.

Fjernelsen af de spinøse processer kan ikke elimineres, fordi fjernelsen af den øvre (kraniale) spinøse proces er nødvendig for at vippe den nedre (kaudale) spinøse proces bagud. Fjernelsen af den nedre spinøse proces forbedrer i høj grad rygmarvens synlighed, hvilket letter hemisektion.

Hemisektionen er den mest kritiske del af protokollen. Her udføres hemisektionen frihånd, selvom dette ikke er en forudsætning. Et stereotaksisk instrument kan bruges i stedet. Rotten kan også placeres i en stereotaksisk ramme for at stabilisere dyret under operation⁶. Dette trin kræver kun en lille ændring i teknikken skitseret her. Dette kan også være nyttigt, hvis nogen med ringe erfaring udfører proceduren.

Denne nye teknik er ekstremt alsidig. Her blev proceduren udført ved L4 lændehvirvelsegmentet (L1 hvirvel); Det kan dog bruges i andre segmenter af rygmarven, der er skræddersyet til de specifikke behov i selve eksperimentet (denne teknik er også blevet brugt i thorax- og livmoderhalsområderne). Det kunne også let justeres til at gennemføre en komplet transsektion af rygmarven i stedet for en hemisektion. Løft af rygsøjlen tillader direkte inspektion af den givne del af rygmarven. Således kan en lille skive af rygmarvsvæv også fjernes for at sikre fuldstændig transsektion.

Brugen af denne nye teknik er ikke begrænset til rotter, men kan også anvendes på andre arter, der bruges til at modellere rygmarvsskader (f.eks. Mus, svin, hunde). Hovedbegrænsningen ved denne teknik er, at fordi hemisektionen (eller transsektionen) kun kan udføres i intervertebrale rum, er den ikke egnet til dem, der specifikt har brug for, at snittet placeres i hvirveldyrene. Desuden, fordi det er en åben sårteknik, er den ikke optimal til modellering af kontusioner eller kompressionsskader.

Denne teknik kan imidlertid være det ideelle valg til at studere åben SCI, da hemisektionen (eller transektionen) udføres præcist og let kan reproduceres. Spinal veje kan også studeres med færre artefakter, da rygsøjlen forbliver intakt. Det kan være særligt nyttigt, når man studerer minimalt invasive terapeutiske tilgange. Ved hjælp af denne teknik kan opmærksomheden udelukkende være på behandlingen i stedet for på mulige bivirkninger af operationen¹¹.

Afslutningsvis kræver denne nye, minimalt invasive teknik hverken nyt udstyr eller dyre indstillinger, da kun udstyr, der er let tilgængeligt i laboratorier, der arbejder med dyr, anvendes. Det kan let tilpasses de specifikke behov i en given undersøgelse (skadested, hemi- eller transsektion, dyretype). Det er også let at lære. Derfor kan denne ændring være af interesse for forskere, der arbejder med åbne SCI-dyremodeller.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Augmentin (1,000 mg/200 mg powder)	GlaxoSmithKline, UK		One-time dose of s.c. antibiotics prophylactically (10 mg of amoxicillin and 2 mg clavulanic acid; Augmentin 1,000 mg/200 mg powder). Every day following surgery, 10 mg of amoxicillin and 2 mg of clavulanic acid (Augmentin 1,000 mg/200 mg powder) per day per animal
Betadine	EGIS, Hungary		Disinfect the skin of the surgical area using a povidone-iodine solution
Calypsol (50 mg/mL)	Richter Gedeon, Hungary		Anesthesia: combination of ketamine 80 mg/kg and xylazine 8 mg/kg intramuscularly
CP XYLAZIN 2% (20 mg/mL)	Produlab Pharma B.V., the Netherlands		Anesthesia: combination of ketamine 80 mg/kg and xylazine 8 mg/kg intramuscularly
Dental bone forceps	Dentech, Hungary	BS 0127	Remove the spinous processes of the 13th thoracic vertebra and the 1st lumbar vertebra using dental bone forceps
dental surgical micromotor	W&H, Austria	MF-TECTORQUE	Using a dental surgical micromotor, a laminectomy is performed at the L1 vertebra
optical microscope	Zeiss, Germany	OPMI19-FC	Control the procedure by viewing an enlarged (16x magnification) microscopic image
physiological saline solution (0.9% NaCl)	Fresenius Kabi, Germany		Keep the rat's eyes moist throughout the entire anesthesia using physiological saline solution drops (reapply as necessary)
raspatorium	Dentech, Hungary	FK 1164	Dissect the muscles attached to the vertebrae with the aid of a raspatorium, until all the spinal ligaments are visible.
retractor	Dentech, Hungary	RT 1253
scalpel	Dentech, Hungary	BB 173
scalpel	Dentech, Hungary	BB 184
scalpel blade 12	B. Braun, Germany	12
scalpel blade 20	B. Braun, Germany	20
sterile cut gauze 10 x 10 cm	Sterilux, Hartmann, Germany
sutures (monofilament, synthetic; absorbable and nonabsorbable), size: 4-0	B. Braun, Germany
tweezer (13 cm)	Dentech, Hungary	BD 1555
tweezer (delicate tissue forceps)	Dentech, Hungary	BD 1670