Summary
Настоящий протокол описывает долгосрочное непрерывное измерение почечного кровотока у сознательных крыс и одновременную регистрацию артериального давления с помощью имплантированных катетеров (заполненных жидкостью или с помощью телеметрии).
Abstract
Почки играют решающую роль в поддержании гомеостаза жидкостей организма. Регуляция почечного кровотока (RBF) имеет важное значение для жизненно важных функций фильтрации и метаболизма в функции почек. Многие острые исследования были проведены на анестезированных животных для измерения RBF в различных условиях для определения механизмов, ответственных за регуляцию перфузии почек. Однако по техническим причинам не удалось измерить RBF непрерывно (24 ч/сут) у неограниченных неанестезированных крыс в течение длительных периодов времени. Эти методы позволяют непрерывно определять RBF в течение многих недель, а также одновременно регистрировать артериальное давление (АД) с помощью имплантированных катетеров (заполненных жидкостью или с помощью телеметрии). Мониторинг RBF осуществляется с крысами, помещенными в круговую клетку для крыс с сервоконтролем, которая обеспечивает неограниченное движение крысы на протяжении всего исследования. В то же время предотвращается запутывание кабелей от проточного зонда и артериальных катетеров. Крысы сначала оснащаются ультразвуковым зондом потока на левой почечной артерии и артериальным катетером, имплантированным в правую бедренную артерию. Они направляются подкожно к затылку горловины и подключаются к расходомеру и датчику давления, соответственно, для измерения RBF и BP. После хирургической имплантации крысы немедленно помещаются в клетку, чтобы восстановиться в течение как минимум одной недели и стабилизировать записи ультразвукового зонда. Сбор мочи также возможен в этой системе. Хирургические и послеоперационные процедуры для непрерывного мониторинга демонстрируются в этом протоколе.
Introduction
Почки составляют всего 0,5% от массы тела, но богаты кровотоком, получая 20%-25% от общего сердечного выброса1. Регуляция почечного кровотока (RBF) занимает центральное место в функции почек, жидкости организма и электролитного гомеостаза. Важность регуляции притока крови к почкам хорошо иллюстрируется существенным увеличением RBF в оставшейся почке после односторонней нефрэктомии 2,3,4 и снижением RBF, которое происходит при почечной недостаточности 5,6,7. Происходят ли такие изменения в RBF в ответ на изменения функции почек или снижение функции из-за снижения RBF, было сложно установить у анестезированных хирургически подготовленных животных или людей. Требуются временные исследования, в которых события могут быть определены до и после определенного изменения и наблюдаться у одного и того же животного во время прогрессирования событий. В исследованиях на животных и людях RBF оценивался косвенно по клиренсу пара-аминогиповой кислоты (ЛАГ)8,9,10, а в более позднее время с помощью методов визуализации, таких какультразвук 9,11,12, МРТ 4,13 и ПЭТ-КТ14,15 которые дают полезные снимки каждой почки и которые могут следить за прогрессированием заболевания. Трудно оценить RBF у мелких животных с помощью ультразвука или МРТ без анестезии. Было невозможно непрерывно измерять RBF в сознательных условиях у одной и той же крысы в течение длительных периодов времени.
Таким образом, в настоящем протоколе разработаны методы, позволяющие проводить одновременные непрерывные измерения RBF со скоростью 24 ч/день, которые были объединены с методами непрерывного измерения артериального давления для свободно движущихся крыс, как описано ранее 16,17,18,19,20,21 . Эта технология позволяет проводить временную оценку RBF в различных моделях крыс для изучения причинно-следственных связей при различных почечных расстройствах в будущем.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Протокол одобрен Медицинским колледжем висконсинского институционального ухода за животными и их использования. Для экспериментов использовались чувствительные к соли крысы Даля (самцы и самки), возраст ~8 недель, 200-350 г.
1. Подготовка животных
- Установите в комнате для животных камеру реагирования на движение для крысы, модуль периваскулярного потока, шприцевой насос, записывающее устройство и программное обеспечение (см. Таблицу материалов).
- Поместите крыс в клетку, чтобы ознакомиться с окружающей средой, пищей и системой водоснабжения, по крайней мере, за неделю до операции. Голодайте крыс за день до операции, потому что высокое содержание желудка может помешать размещению проточного зонда в левую почечную артерию и может вызвать аспирацию трахеи.
- Соедините 5 см полиуретановой трубки (внутренний диаметр 0,30 мм и наружный диаметр 0,64 мм) с концом 90 см полиуретановой трубки (внутренний диаметр 0,64 мм и наружный диаметр 1,02 мм) с цементом ПВХ для изготовления бедренного артериального катетера (см. Таблицу материалов).
- Стерилизуйте катетеры стерилизатором окиси этилена, проточный зонд с 2,5% глутаровым альдегидом и хирургические инструменты в паровом автоклаве. Протрите хирургические столы, микроскопию и свет 1% гипохлорита натрия.
2. Хирургия
- Поместите зонд RBF, выполнив следующие действия.
- Обезболивают крыс 2,0%-2,5% изофлурана до такой степени, что крысы не реагируют на болевой раздражитель. Поместите его на хирургический стол при 37 °C и введите 0,09 мг/кг бупренорфина SR и 15 мг/кг цефазолина (см. Таблицу материалов) перед операцией.
- Побрейте весь живот с помощью электрического клипера и области на затылке вокруг7-го шейного позвонка, где катетер и поток доказывают, что провода выйдут.
- После бритья протрите область 70% этанолом, 10% повидон-йодом и снова 70% этанолом.
- Поместите крысу в положение лежа. Сделайте разрез на 1 см с помощью скальпеля на затылке и левой боку. Затем выполняют тупое рассечение гемостатическими щипцами и очищают подкожное пространство от бокового разреза до задней части шеи.
- Пропустите проточный зонд через этот подкожный туннель от шейки до бокового разреза с помощью гемостатических щипцов.
- Поместите крысу в лежачее положение. Сделайте разрез брюшной полости средней линии 4-5 см.
- Рассекните область вокруг почечной артерии изогнутым пинцетом, чтобы обнажить пространство, достаточное для размещения зонда потока (см. Таблицу материалов). Затем тупо проколоть левой квадратной поясничной мышцы гемостатическими щипцами и втянуть головку проточного зонда в брюшную полость.
- Зацепите кончик проточного зонда к левой почечной артерии и подключите его к расходомеру (см. Таблицу материалов). Добавьте немного геля вокруг наконечника зонда, и значение расхода появится на расходомере.
ПРИМЕЧАНИЕ: Хотя это зависит от размера крысы, течение около 3-5 мл / мин будет наблюдаться у крысы весом 230 г. - Приклейте сетку из полиэфирного волокна, прикрепленную к зонду тканевым клеем к брюшной стенке, и держите до высыхания и склеивания (~1-2 мин). Как только поток будет на месте, отсоедините проточный зонд от расходомера и накройте брюшную полость пропитанной физиологическим раствором марлей и перейдите к этапу введения катетера.
- Вставьте бедренный катетер, выполнив следующие действия.
ПРИМЕЧАНИЕ: Способ введения заполненного жидкостью катетера аналогичен обычным установкам телеметрии. Хотя телеметрия является предпочтительной, артериальный катетер позволяет контролировать давление и отбирать кровь у сознательной крысы.- Сначала заполните катетер физиологическим раствором и зажмите его сосудистыми щипцами, прежде чем сделать разрез кожи 1 см, используя скальпель на левом бедре, чтобы рассечь и обнажить бедренную артерию. При блокировании потока на проксимальной стороне бедренной артерии нитью вводят катетер.
- Промыть небольшим количеством физиологического раствора, заглушить нержавеющей проволокой соответствующего размера и связать катетер нитью, чтобы зафиксировать его.
- Как только лигатура будет связана вокруг катетера, создайте подкожный туннель, используя троакар из нержавеющей стали от бедра до задней части шеи, чтобы привести катетер в область шеи. Закрепите его 3-0 шелковыми швами, помещенными в трапециевидную мышцу.
- Зашить зонд.
- Поверните крысу в положение лежа и сшите круговую петлю проточного зонда подкожно по бокам. Зашить разрез на боку и шее хирургическим швом 4-0 (см. Таблицу материалов).
- Прикрепите кожную пуговицу к проточному зонду и зашить его шелком 3-0 в задней части шеи.
- Снова подключите проточный зонд к расходомеру, поверните крысу обратно в дорсальное положение, чтобы проверить RBF, и внесите окончательные корректировки проточного зонда, чтобы оптимизировать его положение на почечной артерии.
- Наконец, зашить мышцу 3-0 шелком и кожу 4-0 хирургическим швом.
3. Восстановление животного
- После тщательного наблюдения, пока крысы полностью не оправятся от анестезии, верните крыс в систему клетки реагирования на движение, подключите проточный зонд к расходомеру крови и обеспечьте период восстановления около недели для стабилизации зонда и измерения потока.
ПРИМЕЧАНИЕ: Запись не обязательно должна быть выполнена в течение этого периода. - Вводят 3% гепаринизированный физиологический раствор непрерывно на протяжении всего исследования из артериального катетера со скоростью 100 мкл/ч для предотвращения свертывания крови.
- Когда течение стабилизируется через 5-6 дней, установите калибровку расходомера для измерения кровотока при 0-20 мл/мин и начните непрерывную запись RBF.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Показаны данные о среднем артериальном давлении (рисунок 1A) и данные кровотока (рисунок 1B) от репрезентативного самца крысы, чувствительной к соли Дали. Чувствительные к соли крысы Даля содержатся в колонии и разводятся в Медицинском колледже Висконсина. Операция была сделана в возрасте 8 недель, а масса тела на момент операции составляла 249 г. Крыс кормили диетой 0,4% NaCl, и диета была изменена на диету 4% NaCl в возрасте 10 недель. Измерения продолжались в течение 3 недель на диете NaCl 4%, и эксперимент был прекращен в возрасте 13 недель. Данные отображаются со средним значением минуты. Явная суточная разница наблюдалась в среднем артериальном давлении и кровотоке. В то время как кровяное давление увеличивается при диете с высоким содержанием соли, кровоток имеет тенденцию уменьшаться, а не увеличиваться, что свидетельствует о повышенном сосудистом сопротивлении почек.
Рисунок 1: Репрезентативные данные об артериальном давлении и кровотоке. Среднее артериальное давление (мм рт.ст.) (А) и почечный кровоток (мл/мин) (В) показаны со средним значением минуты. LS: диета с низким содержанием соли (0,4% NaCl), HS: диета с высоким содержанием соли (4% NaCl). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Настоящий протокол описывает метод, который использует коммерчески доступные инструменты для непрерывной регистрации RBF и артериального давления в течение многих недель. Кроме того, моча может быть собрана с помощью устройства, описанного в шаге 1.1. Он также может быть использован для оценки метаболитов в моче и, когда имплантируется артериальный катетер, забор крови для анализа.
Традиционно измерения RBF были получены остро у хирургически подготовленных анестезированных животных или оценены по клиренсу ЛАГ. Однако было показано, что различные анестетики и хирургия22,23 изменяют почечный кровоток и артериальное давление. Исследования на людях показали, что изофлуран снижает клиренс ЛАГ с 476,8-243,3 мл / мин и клиренс инулина с 88,0 до 55,7 мл / мин, соответственно8. Тиобарбитал является анестетиком, который широко используется для критических исследований крыс. Тем не менее, сообщается, что выработкаH2O2 в митохондриях почечной коры увеличивается через 90 мин после анестезии тиобарбиталом24, что может повлиять на кровоток. Измерения на неанестезированных и ненапряженных животных были бы гораздо предпочтительнее для многих экспериментальных исследований. Метод измерения RBF путем имплантации проточного зонда был продемонстрирован на собаках25 и крысах26. Эта работа также установила способ измерения RBF у крыс в лаборатории.
Применение методов, описанных в этой презентации, может решить многие вопросы, связанные с последовательными событиями после данного стимула. Неанестезированная инструментальная модель крыс позволяет определять как немедленные, так и хронические реакции на препарат и долгосрочные последствия различных раздражителей, которые могут возникнуть во время развития гипертонии.
Операция включает в себя минимальную кровопотерю с почти 100% выживаемостью при некоторой тренировке. Проточные зонды могут быть повторно использованы после промывки с протеазой, содержащей анионное моющее средство, и стерилизации после 4-недельного эксперимента. Однако пластиковое покрытие будет постепенно портиться и после нескольких применений потребует ремонта. Кожная кнопка в следующем месте, где катетеры выходят, представляет собой наиболее значительную потенциальную проблему, поскольку она уязвима для инфекции, раздражения и царапин, если ее не тщательно очистить и не продезинфицировать. Однако, если это становится рыхлым, его можно быстро восстановить под анестезией.
Критическим этапом процедуры является операция, и может потребоваться некоторое время, чтобы освоить технику. Однако, как только это будет достигнуто, неанестезетизированные хронические исследования могут быть продуктивно проведены с минимальными проблемами. Оперировать крыс можно по 200-350 г независимо от штамма или пола. Эксперименты на крысах разных размеров и животных также возможны с использованием проточных зондов разных размеров, уже подготовленных производителями.
Однако есть ограничения и конкретные вопросы, на которые нужно обратить внимание. Во-первых, операция должна проводиться с использованием стерилизованных инструментов, катетеров и проточных зондов, насколько это возможно, чтобы свести к минимуму послеоперационные инфекции. Во-вторых, поскольку операция обширна и требует более часа, перед получением «контрольных» измерений для исследования должен быть обеспечен достаточно длительный период восстановления. Этот период в нашей лаборатории обычно длится от 7-10 дней. В-третьих, илеус (окклюзия или паралич кишечника) был проблемой в некоторых случаях, представляя собой послеоперационное осложнение. Это можно предотвратить, избегая воздействия на кишечник (например, держать завернутым во влажную марлю) во время процедуры и избегать закрытия брюшного разреза до тех пор, пока связь не будет хорошо высушена. Важно избегать воздействия кишечника на почечную артерию во время операции и следить за тем, чтобы кишечник не скручивался при наложении швов. В-четвертых, следует признать, что RBF будет увеличиваться пропорционально увеличению массы почек. Это необходимо учитывать в исследованиях, при которых почечная гипертрофия возникает после удаления контралатеральной почки. В-пятых, у нас есть опыт измерения RBF только на срок до месяца, и мы не пытались продлить измерения за пределы этого периода. Поскольку почти во всех случаях все работало хорошо в течение этого периода, исследования, вероятно, могут быть продлены на много недель. Наконец, краткое слово о параллельных измерениях артериального давления: используются имплантированные заполненные жидкостью катетеры с разбавленным гепарином для поддержания проходимости 24 ч / день и имплантированные телеметрические устройства. Каждый из них имеет свои преимущества и недостатки в зависимости от экспериментальной конструкции и потребностей. Например, забор крови из артериального катетера возможен, если выбран катетерный метод, а для метода телеметрии не требуется гепаринизация. Тем не менее, оба хорошо послужили нам во время долгосрочных измерений RBF и BP.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторам нечего раскрывать.
Acknowledgments
Это исследование было поддержано грантами на научные исследования (P01 HL116264, RO1 HL137748). Авторы хотели бы поблагодарить Терезу Курт за ее советы и помощь в поддержании экспериментальной среды в качестве руководителя лаборатории.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1RB probe | Transonic | 1RB | ultrasonic flow probe |
| Betadine | Avrio Health | povidone-iodine | |
| Buprenorphine SR-LAB | ZooPharm | Buprenorphine | |
| Cefazolin | APOTEX | NDC 60505 | Cefazolin |
| Crile Hemostats | Fine Surgical Instruments | 13004-14 | Hemostats for blunt dissection |
| Isoflurane | Piramal | NDC 66794 | Isoflurane |
| Medium Clear PVC cement | Oatey | PVC cement | |
| Mersilene polyester fiber mesh | Ethicon | polyester fiber mesh | |
| MetriCide28 | Metrex | SKU 10-2805 | 2.5% glutaraldehyde |
| Micro-Renathane 0.025 x 0.012 | Braintree Scientific | MRE 025 | use for catheter |
| MINI HYPE-WIPE | Current Technologies | #9803 | 1% sodium hypochlorite |
| Oatey Medium Clear PVC Cement | Oatey | #31018 | PVC cement |
| PHD2000 syringe pump | Harvard apparatus | 71-2000 | syringe pump |
| Ponemah software | DSI | recording software | |
| Precision 3630 Tower | Dell | Computer for recording | |
| Raturn Stand-Alone System | BASi | MD-1407 | a movement response caging system |
| RenaPulse High Fidelity Pressure Tubing 0.040 x 0.025 | Braintree Scientific | RPT 040 | use for catheter |
| Silicone cuff | Transonic | AAPC102 | skin button |
| Surgical lubricant sterile bacteriostatic | Fougera | 0168-0205-36 | gell for flow probe |
| Tergazyme | Alconox | protease contained anionic detergent | |
| TS420 Perivascular Flow Module | Transonic | TS420 | perivascular flow module |
| Vetbond | 3M | 1469SB | tissue adhesive |
| WinDaq software | DATAQ | recording software |
References
- Chonchol, M., Smogorzewski, M., Stubbs, J., Yu, A. Brenner & Rector's The Kidney. 11, Elsevier Inc. Philadelphia, PA. (2019).
- Chen, J. -K., et al. Phosphatidylinositol 3-kinase signaling determines kidney size. Journal of Clinical Investigation. 125 (6), 2429-2444 (2015).
- Sigmon, D. H., Gonzalez-Feldman, E., Cavasin, M. A., Potter, D. L., Beierwaltes, W. H. Role of nitric oxide in the renal hemodynamic response to unilateral nephrectomy. Journal of the American Society of Nephrology. 15 (6), 1413-1420 (2004).
- Romero, C. A., et al. Noninvasive measurement of renal blood flow by magnetic resonance imaging in rats. American Journal of Physiology-Renal Physiology. 314 (1), 99-106 (2018).
- Basile, D. P., Anderson, M. D., Sutton, T. A.
- Regan, M. C., Young, L. S., Geraghty, J., Fitzpatrick, J. M. Regional renal blood flow in normal and disease states. Urological Research. 23 (1), 1-10 (1995).
- Ter Wee, P. M. Effects of calcium antagonists on renal hemodynamics and progression of nondiabetic chronic renal disease. Archives of Internal Medicine. 154 (11), 1185 (1994).
- Mazze, R. I., Cousins, M. J., Barr, G. A. Renal effects and metabolism of isoflurane in man. Anesthesiology. 40 (6), 536-542 (1974).
- Corrigan, G., et al. PAH extraction and estimation of plasma flow in human postischemic acute renal failure. American Journal of Physiology-Renal Physiology. 277 (2), 312-318 (1999).
- Laroute, V., Lefebvre, H. P., Costes, G., Toutain, P. -L. Measurement of glomerular filtration rate and effective renal plasma flow in the conscious beagle dog by single intravenous bolus of iohexol and p-aminohippuric acid. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 41 (1), 17-25 (1999).
- Wei, K., et al. Quantification of renal blood flow with contrast-enhanced ultrasound. Journal of the American College of Cardiology. 37 (4), 1135-1140 (2001).
- Cao, W., et al. Contrast-enhanced ultrasound for assessing renal perfusion impairment and predicting acute kidney injury to chronic kidney disease progression. Antioxidants & Redox Signaling. 27 (17), 1397-1411 (2017).
- Markl, M., Frydrychowicz, A., Kozerke, S., Hope, M., Wieben, O.
- Juillard, L., et al. Dynamic renal blood flow measurement by positron emission tomography in patients with CRF. American Journal of Kidney Diseases. 40 (5), 947-954 (2002).
- Juárez-Orozco, L. E., et al. Imaging of cardiac and renal perfusion in a rat model with 13N-NH3 micro-PET. The International Journal of Cardiovascular Imaging. 31 (1), 213-219 (2015).
- Mori, T., Cowley, A. W. Role of pressure in angiotensin II-induced renal injury. Hypertension. 43 (4), 752-759 (2004).
- Mori, T., et al. High perfusion pressure accelerates renal injury in salt-sensitive hypertension. Journal of the American Society of Nephrology. 19 (8), 1472-1482 (2008).
- Polichnowski, A. J., Cowley, A. W. Pressure-induced renal injury in angiotensin II versus norepinephrine-induced hypertensive rats. Hypertension. 54 (6), 1269-1277 (2009).
- Polichnowski, A. J., Jin, C., Yang, C., Cowley, A. W. Role of renal perfusion pressure versus angiotensin II renal oxidative stress in angiotensin II-induced hypertensive rats. Hypertension. 55 (6), 1425-1430 (2010).
- Evans, L. C., et al. Increased perfusion pressure drives renal T-cell infiltration in the dahl salt-sensitive rat. Hypertension. 70 (3), 543-551 (2017).
- Shimada, S., et al. Renal perfusion pressure determines infiltration of leukocytes in the kidney of rats with angiotensin II-induced hypertension. Hypertension. 76 (3), 849-858 (2020).
- Cousins, M. J., Mazze, R. I. Anaesthesia, surgery and renal function: Immediate and delayed effects. Anaesthesia and Intensive Care. 1 (5), 355-373 (1973).
- Cousins, M. J., Skowronski, G., Plummer, J. L.
- Schiffer, T. A., Christensen, M., Gustafsson, H., Palm, F. The effect of inactin on kidney mitochondrial function and production of reactive oxygen species. PLOS ONE. 13 (11), 0207728 (2018).
- Evans, R. G., et al. Chronic renal blood flow measurement in dogs by transit-time ultrasound flowmetry. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 38 (1), 33-39 (1997).
- Bell, T. D., DiBona, G. F., Biemiller, R., Brands, M. W. Continuously measured renal blood flow does not increase in diabetes if nitric oxide synthesis is blocked. American Journal of Physiology-Renal Physiology. 295 (5), 1449-1456 (2008).
