Långsiktig kontinuerlig mätning av njurblodflödet hos medvetna råttor

Summary

Detta protokoll beskriver en långsiktig kontinuerlig mätning av njurblodflödet hos medvetna råttor och samtidigt registrering av blodtryck med implanterade katetrar (vätskefyllda eller genom telemetri).

Abstract

Njurarna spelar en avgörande roll för att upprätthålla homeostas av kroppsvätskor. Regleringen av njurblodflödet (RBF) är avgörande för de vitala funktionerna för filtrering och metabolism i njurfunktionen. Många akuta studier har utförts på bedövade djur för att mäta RBF under olika förhållanden för att bestämma mekanismer som är ansvariga för regleringen av njurperfusion. Av tekniska skäl har det dock inte varit möjligt att mäta RBF kontinuerligt (24 h/dag) hos ohämmade oestetiserade råttor under längre perioder. Dessa metoder möjliggör kontinuerlig bestämning av RBF under många veckor samtidigt som blodtrycket (BP) registreras med implanterade katetrar (vätskefyllda eller genom telemetri). RBF-övervakning utförs med råttor placerade i en cirkulär servokontrollerad råttbur som möjliggör råttans ohämmade rörelse under hela studien. Samtidigt förhindras trassel av kablar från flödessonden och arteriella katetrar. Råttor är först instrumenterade med en ultraljud flöde sond placering på vänster njurartär och en arteriell kateter implanteras i den högra lårbensartären. Dessa dirigeras subkutant till nacken och ansluts till flödesmätaren respektive tryckgivaren för att mäta RBF och BP. Efter kirurgisk implantation placeras råttor omedelbart i buret för att återhämta sig i minst en vecka och stabilisera ultraljudssondinspelningarna. Urinuppsamling är också möjlig i detta system. De kirurgiska och postkirurgiska ingreppen för kontinuerlig övervakning demonstreras i detta protokoll.

Introduction

Njurarna är bara 0,5% av kroppsvikten men rika på blodflödet och får 20%-25% av den totala hjärtminutvolymen¹. Regleringen av njurblodflödet (RBF) är central för njurfunktion, kroppsvätska och elektrolythomeostas. Betydelsen av blodflödesreglering för njuren illustreras fint av den betydande ökningen av RBF i den återstående njuren efter ensidig nefrektomi ^2,3,4 och av minskningarna av RBF som uppstår vid njursvikt ^5,6,7. Huruvida sådana förändringar i RBF inträffar som svar på förändringar i njurfunktionen eller en minskning av funktionen på grund av minskning av RBF har varit utmanande att fastställa hos sövda kirurgiskt beredda djur eller människor. Tidsstudier krävs där händelserna kan bestämmas före och efter en definierad förändring och observeras hos samma djur under händelseförloppet. I djur- och humanstudierna har RBF uppskattats indirekt genom clearance av para-amino hippurinsyra (PAH)8,9,10 och på senare tid genom avbildningstekniker som ultraljud^9,11,12, MRI^4,13 och PET-CT ^14,15 som ger användbara ögonblicksbilder av varje njure och som kan följa sjukdomsprogressionen. Det är utmanande att utvärdera RBF hos små djur genom ultraljud eller MR-skanningar utan anestesi. Det har varit omöjligt att kontinuerligt mäta RBF under medvetna förhållanden hos samma råtta under längre perioder.

Detta protokoll utvecklade därför tekniker som möjliggör samtidiga kontinuerliga 24 h/dag mätningar av RBF, vilket har kombinerats med kontinuerliga blodtrycksmätningsmetoder för fritt rörliga råttor som beskrivits tidigare 16,17,18,19,20,21 . Denna teknik möjliggör tidsmässig utvärdering av RBF i olika modeller av råttor för att studera orsakseffektrelationer vid olika njursjukdomar i framtiden.

Protocol

Protokollet är godkänt av Medical College of Wisconsin Institutional Animal Care and Use. Dahl saltkänsliga råttor (hanar och honor), ~8 veckors ålder, 200-350 g, användes för experimenten.

1. Beredning av djur

1. Installera ett rörelseresponssystem för råttan, en perivaskulär flödesmodul, sprutpump, inspelningsanordning och programvara (se materialförteckning) i djurrummet.
2. Placera råttorna i buren för att bli bekanta med miljön, maten och vattensystemet minst veckan före operationen. Snabba råttorna från dagen före operationen eftersom ett högt maginnehåll kan störa placeringen av flödessonden i vänster njurartär och kan orsaka trakeal aspiration.
3. Anslut en 5 cm polyuretanslang (innerdiameter 0,30 mm och ytterdiameter 0,64 mm) till änden av 90 cm polyuretanslang (innerdiameter 0,64 mm och ytterdiameter 1,02 mm) med PVC-cement för att göra en lårbensartärkateter (se materialförteckning).
   1. Sterilisera katetrarna med en etylenoxidsterilisator, flödessonden med 2,5% glutaraldehyd och de kirurgiska instrumenten i en ångautoklav. Torka av kirurgiska bord, mikroskopi och lampor med 1% natriumhypoklorit.

2. Kirurgi

1. Placera RBF-sonden enligt stegen nedan.
   1. Bedöva råttorna med 2,0% -2,5% Isofluran i den grad att råttorna inte svarar på smärtstimulansen. Placera den på operationsbordet vid 37 °C och injicera 0,09 mg/kg buprenorfin SR och 15 mg/kg cefazolin (se materialtabell) före operationen.
   2. Raka hela buken med en elektrisk klippare och en region på nacken runt den 7^{: e} livmoderhalsen där katetern och flödet visar att ledningar kommer att gå ut.
   3. Efter rakning, torka av området med 70% etanol, 10% povidon-jod och igen med 70% etanol.
   4. Placera råttan i benäget läge. Gör ett snitt på 1 cm med en skalpell på nacken och vänster flank. Utför sedan en trubbig dissektion med hemostatiska pincett och rensa ett subkutant utrymme från flanksnittet till baksidan av nacken.
   5. För flödessonden genom denna subkutana tunnel från nacken till flanksnittet med hemostatiska pincett.
   6. Placera råttan i ryggläge. Gör ett 4-5 cm mittlinje buksnitt.
   7. Dissekera området runt njurartären med böjd pincett för att exponera ett utrymme som är tillräckligt för att placera flödessonden (se Materialförteckning). Genomborra sedan trubbigt den vänstra quadratus lumborummuskeln med de hemostatiska tångarna och dra huvudet på flödessonden in i bukhålan.
   8. Haka fast flödessondens spets i vänster njurartär och anslut den till flödesmätaren (se Materialförteckning). Tillsätt lite gel runt sondspetsen, och värdet på flödeshastigheten visas på flödesmätaren.
      OBS: Även om det beror på råttans storlek, kommer ett flöde på cirka 3-5 ml / min att observeras hos en 230 g råtta.
   9. Limma polyesterfibernätet som är fäst vid sonden med vävnadslim mot bukväggen och håll det torrt och bundet (~ 1-2 min). När flödet är på plats, koppla bort flödessonden från flödesmätaren och täck buken med saltindränkt gasväv och gå vidare till steget att sätta in katetern.
2. Sätt i lårbenskatetern genom att följa stegen nedan.
   OBS: Metoden för att sätta in en vätskefylld kateter är densamma som vanliga telemetriinstallationer. Även om telemetri är att föredra, möjliggör artärkatetern tryckövervakning och periodblodprovtagning från den medvetna råttan.
   1. Fyll först katetern med saltlösning och kläm fast den med vaskulära pincett innan du gör ett 1 cm hudsnitt med en skalpell på vänster lår för att dissekera och exponera lårbensartären. Medan du blockerar flödet vid den proximala sidan av lårbensartären med en tråd, sätt in katetern.
   2. Spola med en liten mängd saltlösning, plugga med lämplig storlek rostfri tråd och bind katetern med en tråd för att fixa den.
   3. När ligaturen är bunden runt katetern, skapa en subkutan tunnel genom att använda en trocar i rostfritt stål från låret till baksidan av nacken för att föra katetern till nackregionen. Säkra den med 3-0 silkesuvturer placerade i trapeziusmuskeln.
3. Suturera sonden.
   1. Vrid råttan till det benägna läget och sy den cirkulära slingan på flödessonden subkutant vid flanken. Suturera snittet vid flanken och nacken med 4-0 kirurgisk sutur (se Materialförteckning).
   2. Fäst en hudknapp på flödessonden och suturera den med 3-0 siden på baksidan av nacken.
   3. Anslut flödessonden till flödesmätaren igen, vrid råttan tillbaka till dorsalläget för att kontrollera RBF och gör slutliga justeringar av flödessonden för att optimera dess position på njurartären.
   4. Slutligen suturera muskeln med 3-0 siden och huden med 4-0 kirurgisk sutur.

3. Återvinning av djuret

1. Efter noggrann observation, tills råttorna är helt återhämtade från anestesi, återför råttorna till ett rörelseresponssystem, anslut flödessonden till blodflödesmätaren och tillåt en återhämtningsperiod på ungefär en vecka för att stabilisera sonden och flödesmätningen.
   OBS: Inspelning behöver inte göras under denna period.
2. Infusera 3% hepariniserad saltlösning kontinuerligt under hela studien från artärkatetern med en hastighet av 100 μl / h för att förhindra koagulering.
3. När flödet stabiliseras efter 5-6 dagar, ställ in flödesmätarens kalibrering för att mäta blodflödet vid 0-20 ml / min och börja den kontinuerliga registreringen av RBF.

Representative Results

Medelvärdet för arteriella tryckdata (figur 1A) och blodflödesdata (figur 1B) från en representativ Dahl-saltkänslig råtta visas. De Dahl saltkänsliga råttorna hålls i en koloni och föds upp vid Medical College of Wisconsin. Operationen gjordes vid 8 veckors ålder och kroppsvikten var 249 g vid operationen. Råttor matades med en 0,4% NaCl-diet, och kosten ändrades till en 4% NaCl-diet vid 10 års ålder. Mätningarna fortsatte i 3 veckor på en 4% NaCl-diet, och experimentet avslutades vid 13 veckors ålder. Data visas med ett minutmedelvärde. En tydlig daglig skillnad observerades i genomsnittligt arteriellt tryck och blodflöde. Medan blodtrycket ökar med en diet med högt salt, tenderar blodflödet att minska snarare än att öka, vilket tyder på ökad renal vaskulär resistens.

Figur 1: Representativt arteriellt tryck och blodflödesdata. Genomsnittligt arteriellt tryck (mm Hg) (A) och njurblodflöde (ml/min) (B) visas med ett minutmedelvärde. LS: diet med låg salthalt (0,4% NaCl), HS: Hög saltdiet (4% NaCl). Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Discussion

Det nuvarande protokollet beskriver en teknik som använder kommersiellt tillgänglig instrumentering för att registrera RBF och arteriellt tryck kontinuerligt under många veckor. Dessutom kan urin samlas in med hjälp av den anordning som beskrivs i steg 1.1. Det kan också användas för att utvärdera metaboliter i urinen och, när en arteriell kateter implanteras, blodprovtagning för analys.

Traditionellt har RBF-mätningar erhållits akut hos kirurgiskt beredda bedövade djur eller uppskattats genom PAH-clearance. Det har dock visat sig att olika anestetika och kirurgi^22,23 förändrar njurblodflödet och artärtrycket. Studier på människa har rapporterat att isofluran minskade PAH-clearance från 476,8-243,3 ml/min och inulinclearance från 88,0 till 55,7 ml/min respektive⁸. Tiobarbital är ett bedövningsmedel som ofta används för kritiska studier av råttor. Ändå rapporteras att_{H2O2-produktionen}i mitokondrierna i njurbarken ökar 90 minuter efter anestesi med tiobarbital²⁴, vilket kan påverka blodflödet. Mätningar i oestetiserade och ostressade djur skulle vara mycket att föredra för många experimentella studier. Metoden att mäta RBF genom att implantera en flödessond har visats hos hundar²⁵ och^{råttor 26}. Detta arbete har också etablerat ett sätt att mäta RBF hos råttor i laboratoriet.

Att tillämpa de tekniker som beskrivs i denna presentation kan ta itu med många frågor relaterade till sekventiella händelser efter en given stimulans. Den oestetiserade instrumenterade råttmodellen möjliggör bestämning av både omedelbara och kroniska svar på läkemedel och långsiktiga konsekvenser av olika stimuli som kan uppstå under utvecklingen av högt blodtryck.

Operationen innebär minimal blodförlust med nästan 100% överlevnad med viss träning. Flödesproberna kan återanvändas efter tvättning med proteas innehållande anjoniskt tvättmedel och sterilisering efter ett 4-veckors experiment. Plastbeläggningen kommer emellertid gradvis att försämras och kommer efter flera användningar att kräva reparation. Hudknappen i nästa där katetrarna går ut representerar det viktigaste potentiella problemet eftersom det är sårbart för infektion, irritation och repor om det inte noggrant rengörs och desinficeras. Men om detta lossnar kan det snabbt repareras under anestesi.

Det kritiska steget i proceduren är operationen, och det kan ta ett tag att behärska tekniken. Men när de väl har uppnåtts kan oestetiserade kroniska studier utföras produktivt med minimala problem. Det är möjligt att operera råttor på 200-350 g oavsett stam eller kön. Experiment på råttor av olika storlekar och djur är också möjliga med hjälp av flödesprober av olika storlekar som redan är förberedda av tillverkare.

Det finns dock begränsningar och specifika frågor som man måste vara uppmärksam på. För det första måste kirurgi utföras med steriliserade instrument, katetrar och flödesprober i den mån det är möjligt för att minimera postkirurgiska infektioner. För det andra, eftersom operationen är omfattande och kräver över en timme, måste en tillräckligt lång återhämtningsperiod tillhandahållas innan man får "kontroll" -mätningar för studien. Denna period i vårt laboratorium sträcker sig i allmänhet från 7-10 dagar. För det tredje har tarmvred (en ocklusion eller förlamning av tarmen) varit ett problem som i vissa fall representerar en postoperativ komplikation. Detta kan förhindras genom att undvika exponering av tarmen (t.ex. hålla insvept i fuktig gasväv) under proceduren och undvika att stänga buksnittet tills bindningen torkades väl. Det är viktigt att undvika att utsätta tarmen för njurartären under operationen och se till att tarmen inte vrids vid suturering. För det fjärde bör det erkännas att RBF kommer att öka proportionellt med ökande njurvikt. Detta måste beaktas i studier där njurhypertrofi uppträder efter avlägsnande av den kontralaterala njuren. För det femte har vi bara erfarenhet av att mäta RBF i upp till en månad och har inte försökt förlänga mätningarna utöver denna period. Eftersom saker och ting fungerade bra under hela denna period i nästan alla fall, kan studier sannolikt förlängas många veckor bortom. Slutligen ett kort ord om parallella arteriella tryckmätningar: de implanterade vätskefyllda katetrarna med utspädd heparin för att upprätthålla 24 h / dag patency och implanterade telemetrianordningar används. Var och en har fördelar och nackdelar beroende på experimentell design och behov. Till exempel är blodprovtagning möjlig från artärkatetern om katetermetoden väljs, och heparinisering krävs inte för telemetrimetoden. Båda har dock tjänat oss väl under långtidsmätningar av RBF och BP.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1RB probe	Transonic	1RB	ultrasonic flow probe
Betadine	Avrio Health		povidone-iodine
Buprenorphine SR-LAB	ZooPharm		Buprenorphine
Cefazolin	APOTEX	NDC 60505	Cefazolin
Crile Hemostats	Fine Surgical Instruments	13004-14	Hemostats for blunt dissection
Isoflurane	Piramal	NDC 66794	Isoflurane
Medium Clear PVC cement	Oatey		PVC cement
Mersilene polyester fiber mesh	Ethicon		polyester fiber mesh
MetriCide28	Metrex	SKU 10-2805	2.5% glutaraldehyde
Micro-Renathane 0.025 x 0.012	Braintree Scientific	MRE 025	use for catheter
MINI HYPE-WIPE	Current Technologies	#9803	1% sodium hypochlorite
Oatey Medium Clear PVC Cement	Oatey	#31018	PVC cement
PHD2000 syringe pump	Harvard apparatus	71-2000	syringe pump
Ponemah software	DSI		recording software
Precision 3630 Tower	Dell		Computer for recording
Raturn Stand-Alone System	BASi	MD-1407	a movement response caging system
RenaPulse High Fidelity Pressure Tubing 0.040 x 0.025	Braintree Scientific	RPT 040	use for catheter
Silicone cuff	Transonic	AAPC102	skin button
Surgical lubricant sterile bacteriostatic	Fougera	0168-0205-36	gell for flow probe
Tergazyme	Alconox		protease contained anionic detergent
TS420 Perivascular Flow Module	Transonic	TS420	perivascular flow module
Vetbond	3M	1469SB	tissue adhesive
WinDaq software	DATAQ		recording software