Langsiktig kontinuerlig måling av nyreblodstrøm hos bevisste rotter

Summary

Denne protokollen beskriver en langvarig kontinuerlig måling av nyreblodstrøm hos bevisste rotter og samtidig registrering av blodtrykk med implanterte katetre (væskefylt eller ved telemetri).

Abstract

Nyrene spiller en avgjørende rolle i å opprettholde homeostase av kroppsvæsker. Reguleringen av nyreblodstrømmen (RBF) er avgjørende for vitale funksjoner av filtrering og metabolisme i nyrefunksjonen. Mange akutte studier har blitt utført på bedøvede dyr for å måle RBF under ulike forhold for å bestemme mekanismer som er ansvarlige for regulering av nyreperfusjon. Av tekniske årsaker har det imidlertid ikke vært mulig å måle RBF kontinuerlig (24 timer/dag) hos hemningsløse ubedøvede rotter over lengre perioder. Disse metodene tillater kontinuerlig bestemmelse av RBF over mange uker, samtidig som blodtrykket (BP) registreres med implanterte katetre (væskefylt eller ved telemetri). RBF-overvåking utføres med rotter plassert i et sirkulært servokontrollert rottebur som muliggjør uhemmet bevegelse av rotten gjennom hele studien. Samtidig forhindres sammenfletting av kabler fra strømningssonden og arterielle katetre. Rotter blir først instrumentert med en ultralyd strømningssonde plassering på venstre nyrearterie og et arterielt kateter implantert i høyre lårarterie. Disse rutes subkutant til nakken, og kobles til henholdsvis strømningsmåleren og trykktransduseren for å måle RBF og BP. Etter kirurgisk implantasjon plasseres rotter umiddelbart i buret for å gjenopprette i minst en uke og stabilisere ultralydssondeopptakene. Urin samling er også mulig i dette systemet. De kirurgiske og postkirurgiske prosedyrene for kontinuerlig overvåking er vist i denne protokollen.

Introduction

Nyrene er bare 0,5% av kroppsvekten, men rike på blodstrøm, og mottar 20% -25% av den totale^{hjerteutgangen1}. Reguleringen av nyreblodstrøm (RBF) er sentral for nyrefunksjon, kroppsvæske og elektrolytthomeostase. Betydningen av blodstrømsregulering for nyrene illustreres fint av den betydelige økningen av RBF i den gjenværende nyren etter ensidig nefrektomi ^2,3,4 og av reduksjonene av RBF som oppstår ved nyresvikt ^5,6,7. Hvorvidt slike endringer i RBF oppstår som svar på endringer i nyrefunksjon eller nedsatt funksjon på grunn av reduksjon av RBF, har vært utfordrende å fastslå hos bedøvede kirurgisk forberedte dyr eller mennesker. Temporale studier er nødvendige der hendelsene kan bestemmes før og etter en definert endring og observeres hos samme dyr under progresjonen av hendelser. I dyre- og menneskestudier har RBF blitt estimert indirekte ved clearance av para-amino hippurinsyre (PAH) 8,9,10 og i nyere tid ved avbildningsteknikker som ultralyd^9,11,12, MR^4,13 og PET-CT ^14,15 som gir nyttige øyeblikksbilder av hver nyre og som kan følge sykdomsprogresjonen. Det er utfordrende å evaluere RBF hos små dyr ved ultralyd eller MR-skanning uten anestesi. Det har vært umulig å kontinuerlig måle RBF under bevisste forhold hos samme rotte over lengre perioder.

Den nåværende protokollen utviklet derfor teknikker som muliggjør samtidige kontinuerlige 24 timers / dag målinger av RBF, som har blitt kombinert med kontinuerlige blodtrykksmålingsmetoder for fritt bevegelige rotter som beskrevet tidligere 16,17,18,19,20,21 . Denne teknologien muliggjør tidsmessig evaluering av RBF i ulike modeller av rotter for å studere årsakssammenheng i ulike nyresykdommer i fremtiden.

Protocol

Protokollen er godkjent av Medical College of Wisconsin Institutional Animal Care and Use. Dahl saltfølsomme rotter (hanner og hunner), ~8 ukers alder, 200-350 g, ble brukt til forsøkene.

1. Forberedelse av dyr

1. Installer et bevegelsesrespons-caging system for rotte, en perivaskulær strømningsmodul, sprøytepumpe, opptaksenhet og programvare (se Materialtabell) i dyrerommet.
2. Plasser rottene i buret for å bli kjent med miljøet, maten og vannsystemet minst uken før operasjonen. Rask rottene fra dagen før operasjonen fordi et høyt mageinnhold kan forstyrre plasseringen av strømningssonden inn i venstre nyrearterie og kan forårsake trakeal aspirasjon.
3. Koble et 5 cm polyuretanrør (indre diameter 0,30 mm og ytre diameter 0,64 mm) til enden av 90 cm polyuretanrør (indre diameter 0,64 mm og ytre diameter 1,02 mm) med PVC-sement for å lage et lårarteriekateter (se materialtabell).
   1. Steriliser katetrene med en etylenoksidsterilisator, strømningssonden med 2,5% glutaraldehyd og de kirurgiske instrumentene i en dampautoklav. Tørk kirurgiske bord, mikroskopi og lys med 1% natriumhypokloritt.

2. Kirurgi

1. Plasser RBF-sonden ved å følge trinnene nedenfor.
   1. Bedøv rottene med 2,0% -2,5% isofluran i den grad rottene ikke reagerer på smertestimuleringen. Legg den på operasjonsbordet ved 37 °C og injiser 0,09 mg/kg buprenorfin SR og 15 mg/kg cefazolin (se materialfortegnelse) før kirurgi.
   2. Barber hele magen med en elektrisk klipper og en region på nakken rundt 7^th cervical vertebrae hvor kateteret og strømmen bevise ledninger vil gå ut.
   3. Etter barbering, tørk området med 70% etanol, 10% povidon-jod, og igjen med 70% etanol.
   4. Plasser rotta i utsatt stilling. Lag et 1 cm kutt med en skalpell på nakken og venstre flanke. Utfør deretter en stump disseksjon med hemostatiske tang og fjern et subkutant rom fra flankesnittet til baksiden av nakken.
   5. Før strømningssonden gjennom denne subkutane tunnelen fra nakken til flankesnittet med hemostatiske tang.
   6. Plasser rotta i den bakre posisjonen. Lag et 4-5 cm midtlinje abdominal snitt.
   7. Disseker området rundt nyrearterien med buet pinsett for å eksponere et rom som er tilstrekkelig til å plassere strømningssonden (se tabell over materialer). Deretter stikker du den venstre quadratus lumborummuskelen med hemostatiske tang og trekker hodet på strømningssonden inn i bukhulen.
   8. Koble spissen av strømningssonden til venstre nyrearterie og koble den til strømningsmåleren (se materialtabell). Tilsett litt gel rundt sondespissen, og verdien av strømningshastigheten vises på strømningsmåleren.
      MERK: Selv om det avhenger av størrelsen på rotten, vil en strøm på ca. 3-5 ml / min bli observert i en 230 g rotte.
   9. Lim polyesterfibernettet festet til sonden med vevslim til bukveggen og hold til det er tørt og bundet (~ 1-2 min). Når strømmen er på plass, kobler du strømningssonden fra strømningsmåleren og dekker magen med saltvannsdynket gasbind og går videre til trinnet for å sette inn kateteret.
2. Sett inn lårkateteret ved å følge trinnene nedenfor.
   MERK: Metoden for å sette inn et væskefylt kateter er den samme som vanlige telemetriinstallasjoner. Selv om telemetri foretrekkes, muliggjør arteriekateteret trykkovervåking og periodeblodprøvetaking fra bevisst rotte.
   1. Fyll først kateteret med saltvann og klem det med vaskulære tang før du gjør et 1 cm hudinnsnitt ved hjelp av en skalpell på venstre lår for å dissekere og eksponere lårarterien. Mens du blokkerer strømmen på den proksimale siden av lårarterien med en tråd, sett inn kateteret.
   2. Skyll med en liten mengde saltvann, plugg med passende størrelse rustfritt ledning, og bind kateteret med en tråd for å fikse det.
   3. Når ligaturen er bundet rundt kateteret, lager du en subkutan tunnel ved å bruke en trokar i rustfritt stål fra låret til baksiden av nakken for å bringe kateteret til nakkeområdet. Fest den med 3-0 silkesuturer plassert i trapeziusmuskelen.
3. Sutur sonden.
   1. Vri rotten til utsatt stilling og sy den sirkulære sløyfen til strømningssonden subkutant på flanken. Sutur snittet på flanken og nakken med 4-0 kirurgisk sutur (se materialtabell).
   2. Fest en hudknapp til strømningssonden og sutur den med 3-0 silke på baksiden av nakken.
   3. Koble strømningssonden til strømningsmåleren igjen, vri rotta tilbake til dorsalposisjonen for å kontrollere RBF, og foreta endelige justeringer av strømningssonden for å optimalisere posisjonen på nyrearterien.
   4. Til slutt sutur muskelen med 3-0 silke og huden med 4-0 kirurgisk sutur.

3. Gjenoppretting av dyret

1. Etter nøye observasjon, til rottene er fullstendig gjenopprettet fra anestesien, returner rottene til et bevegelsesrespons-caging-system, koble strømningssonden til blodstrømningsmåleren, og tillat en gjenopprettingsperiode på omtrent en uke for å stabilisere sonden og strømningsmålingen.
   MERK: Opptak trenger ikke gjøres i denne perioden.
2. Tilfør 3% heparinisert saltvann kontinuerlig gjennom hele studien fra arteriekateteret med en hastighet på 100 μL / t for å forhindre koagulering.
3. Når strømmen stabiliserer seg etter 5-6 dager, still inn flowmeterkalibreringen for å måle blodstrømmen ved 0-20 ml / min og start kontinuerlig registrering av RBF.

Representative Results

Gjennomsnittlige arterielle trykkdata (figur 1A) og blodstrømsdata (figur 1B) fra en representativ mannlig Dahl saltfølsom rotte er vist. De Dahl saltfølsomme rottene opprettholdes i en koloni og avles ved Medical College of Wisconsin. Operasjonen ble gjort i en alder av 8 uker, og kroppsvekten var 249 g på operasjonstidspunktet. Rotter ble matet med en 0,4% NaCl diett, og dietten ble endret til en 4% NaCl diett i en alder av 10 uker. Målingene ble fortsatt i 3 uker på en 4% NaCl diett, og forsøket ble avsluttet ved 13 ukers alder. Dataene vises med et minuttgjennomsnitt. En klar døgnforskjell ble observert i gjennomsnittlig arterielt trykk og blodstrøm. Mens blodtrykket øker med et høyt salt diett, har blodstrømmen en tendens til å redusere i stedet for å øke, noe som tyder på økt renal vaskulær motstand.

Figur 1: Representative arterielle trykk- og blodstrømsdata. Gjennomsnittlig arterielt trykk (mm Hg) (A) og nyreblodstrøm (ml/min) (B) er vist med et minuttgjennomsnitt. LS: lavt salt (0,4% NaCl) diett, HS: Høyt salt (4% NaCl) diett. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Discussion

Denne protokollen beskriver en teknikk som benytter kommersielt tilgjengelig instrumentering for å registrere RBF og arterielt trykk kontinuerlig over mange uker. I tillegg kan urin samles ved hjelp av enheten beskrevet i trinn 1.1. Det kan også brukes til å evaluere metabolitter i urinen, og når et arterielt kateter er implantert, blodprøvetaking for analyse.

Tradisjonelt har RBF-målinger blitt oppnådd akutt i kirurgisk tilberedte bedøvede dyr eller estimert ved PAH-clearance. Imidlertid har det vist seg at ulike anestetika og kirurgi^22,23 endrer nyreblodstrøm og arterielt trykk. Studier på mennesker har rapportert at isofluran reduserte PAH-clearance fra henholdsvis 476,8-243,3 ml/min og inulinclearance fra 88,0 til 55,7 ml/min⁸. Thiobarbital er et bedøvelsesmiddel som er mye brukt til kritiske studier av rotter. Likevel er det rapportert at_{H2O2-produksjonen}i mitokondriene i nyrebarken øker 90 minutter etter anestesi med tiobarbital²⁴, noe som kan påvirke blodstrømmen. Målinger i unanesthetized og unstressed dyr ville være langt å foretrekke for mange eksperimentelle studier. Metoden for å måle RBF ved å implantere en strømningssonde er vist hos hunder²⁵ og rotter²⁶. Dette arbeidet har også etablert en måte å måle RBF på rotter i laboratoriet.

Bruk av teknikkene beskrevet i denne presentasjonen kan løse mange spørsmål knyttet til sekvensielle hendelser etter en gitt stimulus. Den ubedøvede instrumenterte rottemodellen gjør det mulig å bestemme både umiddelbare og kroniske responser på stoffet og langsiktige konsekvenser av ulike stimuli som kan oppstå under utviklingen av hypertensjon.

Operasjonen innebærer minimalt blodtap med nesten 100% overlevelse med litt trening. Strømningssondene kan gjenbrukes etter vask med anionisk vaskemiddel og sterilisering etter et 4-ukers eksperiment. Imidlertid vil plastbelegget gradvis forringes, og etter flere bruksområder vil det kreve reparasjon. Hudknappen i den neste der katetrene går ut, representerer det viktigste potensielle problemet, da det er sårbart for infeksjon, irritasjon og riper hvis det ikke rengjøres og desinfiseres nøye. Men hvis dette løsner, kan det raskt repareres under anestesi.

Det kritiske trinnet i prosedyren er operasjonen, og det kan ta litt tid å mestre teknikken. Men når det er oppnådd, kan ikke-bedøvede kroniske studier utføres produktivt med minimale problemer. Det er mulig å operere på rotter på 200-350 g uavhengig av belastning eller kjønn. Eksperimenter på rotter av forskjellige størrelser og dyr er også mulig ved bruk av strømningssonder av forskjellige størrelser som allerede er utarbeidet av produsenter.

Det er imidlertid begrensninger og spesifikke problemer som man må ta hensyn til. For det første må kirurgi utføres ved hjelp av steriliserte instrumenter, katetre og strømningssonder i den grad det er mulig for å minimere postoperative infeksjoner. For det andre, siden operasjonen er omfattende og krever over en time, må det gis en tilstrekkelig lang gjenopprettingsperiode før man oppnår "kontroll" -målinger for studien. Denne perioden i vårt laboratorium strekker seg vanligvis fra 7-10 dager. For det tredje har ileus (en okklusjon eller lammelse av tarmen) vært et problem i noen tilfeller som representerer en postoperativ komplikasjon. Dette kan forebygges ved å unngå eksponering av tarmen (for eksempel holde innpakket i fuktig gasbind) under prosedyren og unngå å lukke abdominal snittet til bindingen var godt tørket. Det er viktig å unngå å utsette tarmen for nyrearterien under operasjonen og sørge for at tarmen ikke vrides ved suturering. For det fjerde bør det erkjennes at RBF vil øke proporsjonalt med økende nyrevekt. Dette må vurderes i studier der renal hypertrofi oppstår etter fjerning av kontralateral nyre. For det femte har vi bare erfaring med å måle RBF i opptil en måned og har ikke forsøkt å utvide målingene utover denne perioden. Siden ting fungerte bra gjennom hele denne perioden i nesten alle tilfeller, kunne studier sannsynligvis forlenges mange uker utover. Til slutt, et kort ord om parallelle arterielle trykkmålinger: de implanterte væskefylte katetrene med fortynnet heparin for å opprettholde 24 timer / dag patency og implanterte telemetri enheter benyttes. Hver har fordeler og ulemper avhengig av eksperimentell design og behov. For eksempel er blodprøvetaking mulig fra arterielt kateter dersom katetermetoden er valgt, og heparinisering er ikke nødvendig for telemetrimetoden. Begge har imidlertid tjent oss godt under langsiktige målinger av RBF og BP.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1RB probe	Transonic	1RB	ultrasonic flow probe
Betadine	Avrio Health		povidone-iodine
Buprenorphine SR-LAB	ZooPharm		Buprenorphine
Cefazolin	APOTEX	NDC 60505	Cefazolin
Crile Hemostats	Fine Surgical Instruments	13004-14	Hemostats for blunt dissection
Isoflurane	Piramal	NDC 66794	Isoflurane
Medium Clear PVC cement	Oatey		PVC cement
Mersilene polyester fiber mesh	Ethicon		polyester fiber mesh
MetriCide28	Metrex	SKU 10-2805	2.5% glutaraldehyde
Micro-Renathane 0.025 x 0.012	Braintree Scientific	MRE 025	use for catheter
MINI HYPE-WIPE	Current Technologies	#9803	1% sodium hypochlorite
Oatey Medium Clear PVC Cement	Oatey	#31018	PVC cement
PHD2000 syringe pump	Harvard apparatus	71-2000	syringe pump
Ponemah software	DSI		recording software
Precision 3630 Tower	Dell		Computer for recording
Raturn Stand-Alone System	BASi	MD-1407	a movement response caging system
RenaPulse High Fidelity Pressure Tubing 0.040 x 0.025	Braintree Scientific	RPT 040	use for catheter
Silicone cuff	Transonic	AAPC102	skin button
Surgical lubricant sterile bacteriostatic	Fougera	0168-0205-36	gell for flow probe
Tergazyme	Alconox		protease contained anionic detergent
TS420 Perivascular Flow Module	Transonic	TS420	perivascular flow module
Vetbond	3M	1469SB	tissue adhesive
WinDaq software	DATAQ		recording software