Summary
Le présent protocole décrit une mesure continue à long terme du débit sanguin rénal chez des rats conscients et l’enregistrement simultané de la pression artérielle avec des cathéters implantés (remplis de liquide ou par télémétrie).
Abstract
Les reins jouent un rôle crucial dans le maintien de l’homéostasie des fluides corporels. La régulation du débit sanguin rénal (FBR) est essentielle aux fonctions vitales de filtration et de métabolisme de la fonction rénale. De nombreuses études aiguës ont été réalisées chez des animaux anesthésiés pour mesurer le FBR dans diverses conditions afin de déterminer les mécanismes responsables de la régulation de la perfusion rénale. Cependant, pour des raisons techniques, il n’a pas été possible de mesurer la FBR en continu (24 h/jour) chez des rats non anesthésiés non retenus sur des périodes prolongées. Ces méthodes permettent la détermination continue de la FBR pendant plusieurs semaines tout en enregistrant simultanément la pression artérielle (PA) avec des cathéters implantés (remplis de liquide ou par télémétrie). La surveillance du FBR est effectuée avec des rats placés dans une cage à rats circulaire servo-contrôlée qui permet le mouvement sans retenue du rat tout au long de l’étude. Dans le même temps, l’emmêlement des câbles de la sonde d’écoulement et des cathéters artériels est empêché. Les rats sont d’abord instrumentés avec un placement de sonde d’écoulement ultrasonique sur l’artère rénale gauche et un cathéter artériel implanté dans l’artère fémorale droite. Ceux-ci sont acheminés par voie sous-cutanée vers la nuque et connectés au débitmètre et au transducteur de pression, respectivement, pour mesurer le FBR et la PA. Après l’implantation chirurgicale, les rats sont immédiatement placés dans la cage pour récupérer pendant au moins une semaine et stabiliser les enregistrements de la sonde à ultrasons. La collecte d’urine est également réalisable dans ce système. Les procédures chirurgicales et post-chirurgicales pour la surveillance continue sont démontrées dans ce protocole.
Introduction
Les reins ne représentent que 0,5% du poids corporel mais sont riches en flux sanguin, recevant 20% à 25% du débit cardiaque total1. La régulation du débit sanguin rénal (FBR) est essentielle à la fonction rénale, aux fluides corporels et à l’homéostasie électrolytique. L’importance de la régulation du flux sanguin vers le rein est bien illustrée par l’augmentation substantielle de la FBR dans le rein restant après néphrectomie unilatérale 2,3,4 et par les réductions de FBR qui se produisent dans l’insuffisance rénale 5,6,7. Il a été difficile de déterminer si de tels changements dans le FBR se produisent en réponse à des altérations de la fonction rénale ou à une diminution de la fonction due à une réduction de la FBR chez des animaux ou des sujets humains anesthésiés préparés chirurgicalement. Des études temporelles sont nécessaires dans lesquelles les événements peuvent être déterminés avant et après un changement défini et observés chez le même animal au cours de la progression des événements. Dans les études animales et humaines, la FBR a été estimée indirectement par la clairance de l’acide para-amino hippurique (HAP)8,9,10 et, plus récemment, par des techniques d’imagerie telles que l’échographie9,11,12, l’IRM4,13 et la TEP-TDM 14,15 qui donnent des images instantanées utiles de chaque rein et qui peuvent suivre la progression de la maladie. Il est difficile d’évaluer la FBR chez les petits animaux par échographie ou IRM sans anesthésie. Il a été impossible de mesurer en continu la FBR dans des conditions conscientes chez le même rat sur des périodes prolongées.
Le présent protocole a donc mis au point des techniques permettant des mesures simultanées en continu 24 heures sur 24 de la FBR, qui ont été combinées à des méthodes de mesure continue de la pression artérielle pour les rats en mouvement libre, comme décrit précédemment 16,17,18,19,20,21 . Cette technologie permet l’évaluation temporelle de la FBR dans divers modèles de rats afin d’étudier les relations de cause à effet dans divers troubles rénaux à l’avenir.
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Protocol
Le protocole est approuvé par le Medical College of Wisconsin Institutional Animal Care and Use. Des rats sensibles au sel Dahl (mâles et femelles), âgés de ~8 semaines, 200-350 g, ont été utilisés pour les expériences.
1. Préparation des animaux
- Installez un système de cage de réponse au mouvement pour le rat, un module de flux périvasculaire, une pompe à seringue, un appareil d’enregistrement et un logiciel (voir le tableau des matériaux) dans la salle animalière.
- Placez les rats dans la cage pour se familiariser avec l’environnement, la nourriture et le système d’eau au moins la semaine précédant la chirurgie. Jeûnez les rats de la veille de la chirurgie, car une teneur élevée de l’estomac peut interférer avec le placement de la sonde d’écoulement dans l’artère rénale gauche et peut provoquer une aspiration trachéale.
- Connectez un tube en polyuréthane de 5 cm (diamètre intérieur 0,30 mm et diamètre extérieur 0,64 mm) à l’extrémité du tube en polyuréthane de 90 cm (diamètre intérieur 0,64 mm et diamètre extérieur 1,02 mm) avec du ciment PVC pour fabriquer un cathéter artériel fémoral (voir le tableau des matériaux).
- Stérilisez les cathéters avec un stérilisateur à l’oxyde d’éthylène, la sonde de débit avec 2,5% de glutaraldéhyde et les instruments chirurgicaux dans un autoclave à vapeur. Essuyez les tables chirurgicales, la microscopie et les lumières avec de l’hypochlorite de sodium à 1%.
2. Chirurgie
- Placez la sonde RBF en suivant les étapes ci-dessous.
- Anesthésiez les rats avec 2,0% -2,5% d’isoflurane dans la mesure où les rats ne répondent pas au stimulus de la douleur. Placez-le sur la table chirurgicale réglée à 37 °C et injectez 0,09 mg/kg de buprénorphine SR et 15 mg/kg de céfazoline (voir tableau des matières) avant la chirurgie.
- Rasez tout l’abdomen avec une tondeuse électrique et une région sur la nuque autour de la 7ème vertèbre cervicale où le cathéter et le flux prouvent que les fils sortiront.
- Après le rasage, essuyez la zone avec 70% d’éthanol, 10% de povidone-iode, et à nouveau avec 70% d’éthanol.
- Placez le rat en position couchée. Faites une coupe de 1 cm à l’aide d’un scalpel sur la nuque et le flanc gauche. Ensuite, effectuez une dissection contondante avec une pince hémostatique et dégagez un espace sous-cutané de l’incision du flanc à l’arrière du cou.
- Faites passer la sonde d’écoulement à travers ce tunnel sous-cutané du cou à l’incision du flanc avec une pince hémostatique.
- Placez le rat en décubitus dorsal. Faites une incision abdominale médiane de 4-5 cm.
- Disséquez la zone autour de l’artère rénale à l’aide d’une pince à épiler incurvée pour exposer un espace suffisant pour placer la sonde d’écoulement (voir le tableau des matériaux). Ensuite, percez carrément le muscle quadratus lumborum gauche avec la pince hémostatique et tirez la tête de la sonde d’écoulement dans la cavité abdominale.
- Accrochez l’extrémité de la sonde d’écoulement à l’artère rénale gauche et connectez-la au débitmètre (voir le tableau des matériaux). Ajoutez un peu de gel autour de la pointe de la sonde et la valeur du débit apparaîtra sur le débitmètre.
REMARQUE : Bien que cela dépende de la taille du rat, un débit d’environ 3 à 5 mL/min sera observé chez un rat de 230 g. - Collez le treillis de fibres de polyester attaché à la sonde avec de l’adhésif tissulaire sur la paroi abdominale et maintenez-le jusqu’à ce qu’il soit sec et collé (~1-2 min). Une fois le flux en place, débranchez la sonde de débit du débitmètre et couvrez l’abdomen avec de la gaze imbibée de solution saline et passez à l’étape d’insertion du cathéter.
- Insérez le cathéter fémoral en suivant les étapes ci-dessous.
REMARQUE: La méthode d’insertion d’un cathéter rempli de liquide est la même que les installations de télémétrie régulières. Bien que la télémétrie soit préférée, le cathéter artériel permet de surveiller la pression et le prélèvement sanguin menstruel du rat conscient.- Tout d’abord, remplissez le cathéter avec une solution saline et serrez-le avec une pince vasculaire avant de faire une incision cutanée de 1 cm à l’aide d’un scalpel sur la cuisse gauche pour disséquer et exposer l’artère fémorale. Tout en bloquant l’écoulement du côté proximal de l’artère fémorale avec un fil, insérez le cathéter.
- Rincer avec une petite quantité de solution saline, boucher avec un fil en acier inoxydable de taille appropriée et attacher le cathéter avec un fil pour le fixer.
- Une fois la ligature attachée autour du cathéter, créez un tunnel sous-cutané en utilisant un trocart en acier inoxydable de la cuisse à l’arrière du cou pour amener le cathéter dans la région du cou. Fixez-le avec des sutures de soie 3-0 placées dans le muscle trapèze.
- Suturer la sonde.
- Tournez le rat en position couchée et cousez la boucle circulaire de la sonde d’écoulement par voie sous-cutanée sur le flanc. Suturer l’incision au niveau du flanc et du cou avec suture chirurgicale 4-0 (voir Tableau des matériaux).
- Attachez un bouton de peau à la sonde d’écoulement et suturez-la avec de la soie 3-0 à l’arrière du cou.
- Reconnectez la sonde de débit au débitmètre, retournez le rat en position dorsale pour vérifier le FBR et effectuez les derniers ajustements de la sonde de débit pour optimiser sa position sur l’artère rénale.
- Enfin, suturez le muscle avec de la soie 3-0 et la peau avec une suture chirurgicale 4-0.
3. Récupération de l’animal
- Après une observation attentive, jusqu’à ce que les rats soient complètement rétablis de l’anesthésie, ramener les rats dans un système de cage de réponse au mouvement, connecter la sonde de débit au débitmètre sanguin et prévoir une période de récupération d’environ une semaine pour stabiliser la sonde et la mesure du débit.
REMARQUE: L’enregistrement n’a pas besoin d’être effectué pendant cette période. - Injecter une solution saline héparinée à 3 % en continu tout au long de l’étude à partir du cathéter artériel à raison de 100 μL/h pour prévenir la coagulation.
- Lorsque le débit se stabilise après 5-6 jours, réglez l’étalonnage du débitmètre pour mesurer le débit sanguin à 0-20 mL/min et commencez l’enregistrement continu du FBR.
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Representative Results
Les données sur la pression artérielle moyenne (figure 1A) et les données sur le débit sanguin (figure 1B) d’un rat mâle Dahl sensible au sel sont présentées. Les rats sensibles au sel Dahl sont maintenus dans une colonie et élevés au Medical College of Wisconsin. La chirurgie a été effectuée à l’âge de 8 semaines et le poids corporel était de 249 g au moment de la chirurgie. Les rats ont été nourris avec un régime NaCl à 0,4%, et le régime a été changé pour un régime à 4% NaCl à l’âge de 10 semaines. Les mesures ont été poursuivies pendant 3 semaines avec un régime NaCl à 4%, et l’expérience a été interrompue à l’âge de 13 semaines. Les données sont affichées avec une moyenne infime. Une nette différence diurne a été observée dans la pression artérielle moyenne et le débit sanguin. Alors que la pression artérielle augmente avec un régime riche en sel, le flux sanguin a tendance à diminuer plutôt qu’à augmenter, suggérant une résistance vasculaire rénale accrue.
Figure 1 : Données représentatives sur la pression artérielle et le débit sanguin. La pression artérielle moyenne (mm Hg) (A) et le débit sanguin rénal (mL/min) (B) sont indiqués avec une moyenne infimale. LS: régime pauvre en sel (0,4% NaCl), HS: régime riche en sel (4% NaCl). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
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Discussion
Le présent protocole décrit une technique qui utilise des instruments disponibles dans le commerce pour enregistrer la FBR et la pression artérielle en continu pendant plusieurs semaines. De plus, l’urine peut être recueillie à l’aide du dispositif décrit à l’étape 1.1. Il peut également être utilisé pour évaluer les métabolites dans l’urine et, lorsqu’un cathéter artériel est implanté, le prélèvement de sang pour analyse.
Traditionnellement, les mesures de FBR ont été obtenues de manière aiguë chez des animaux anesthésiés préparés chirurgicalement ou estimées par la clairance des HAP. Cependant, il a été démontré que divers anesthésiques et chirurgies22,23 modifient le flux sanguin rénal et la pression artérielle. Des études chez l’homme ont rapporté que l’isoflurane réduisait la clairance des HAP de 476,8 à 243,3 mL/min et la clairance de l’inuline de 88,0 à 55,7 mL/min, respectivement8. Le thiobarbital est un anesthésique largement utilisé pour les études critiques sur les rats. Pourtant, il est rapporté que la productionde H 2 O2 dans les mitochondries du cortex rénal augmente 90 minutes après l’anesthésie avec le thiobarbital24, ce qui pourrait affecter le flux sanguin. Des mesures chez des animaux non anesthésiés et non stressés seraient de loin préférables pour de nombreuses études expérimentales. La méthode de mesure du FBR par implantation d’une sonde d’écoulement a été démontrée chez le chien25 et le rat26. Ce travail a également permis d’établir un moyen de mesurer le FBR chez le rat en laboratoire.
L’application des techniques décrites dans cette présentation peut répondre à de nombreuses questions liées aux événements séquentiels suivant un stimulus donné. Le modèle instrumenté non anesthésié de rat permet de déterminer les réponses immédiates et chroniques aux médicaments et les conséquences à long terme de divers stimuli pouvant survenir pendant le développement de l’hypertension.
La chirurgie implique une perte de sang minimale avec des taux de survie de près de 100% avec un peu d’entraînement. Les sondes d’écoulement peuvent être réutilisées après lavage avec un détergent anionique contenant de la protéase et stérilisation après une expérience de 4 semaines. Cependant, le revêtement plastique se détériorera progressivement et, après plusieurs utilisations, nécessitera une réparation. Le bouton cutané à l’endroit suivant où les cathéters sortent représente le problème potentiel le plus important car il est vulnérable à l’infection, à l’irritation et aux rayures s’il n’est pas soigneusement nettoyé et désinfecté. Cependant, si cela devient lâche, il peut être rapidement réparé sous anesthésie.
L’étape critique de la procédure est la chirurgie, et il peut prendre un certain temps pour maîtriser la technique. Cependant, une fois réalisées, les études chroniques non anesthésiées peuvent être menées de manière productive avec un minimum de problèmes. Il est possible d’opérer sur des rats de 200 à 350 g indépendamment de la souche ou du sexe. Des expériences sur des rats de différentes tailles et des animaux sont également possibles à l’aide de sondes d’écoulement de différentes tailles déjà préparées par les fabricants.
Cependant, il y a des limites et des problèmes spécifiques auxquels il faut prêter attention. Tout d’abord, la chirurgie doit être effectuée à l’aide d’instruments stérilisés, de cathéters et de sondes d’écoulement dans la mesure du possible pour minimiser les infections post-chirurgicales. Deuxièmement, comme la chirurgie est étendue et nécessite plus d’une heure, une période de récupération suffisamment longue doit être prévue avant d’obtenir des mesures « de contrôle » pour l’étude. Cette période dans notre laboratoire s’étend généralement de 7 à 10 jours. Troisièmement, l’iléus (une occlusion ou une paralysie de l’intestin) a été un problème dans certains cas représentant une complication postopératoire. Cela peut être évité en évitant l’exposition de l’intestin (par exemple, garder enveloppé dans de la gaze humide) pendant la procédure et en évitant de fermer l’incision abdominale jusqu’à ce que la liaison soit bien sèche. Il est essentiel d’éviter d’exposer l’intestin à l’artère rénale pendant la chirurgie et de s’assurer que l’intestin n’est pas tordu lors de la suture. Quatrièmement, il faut reconnaître que la FBR augmentera proportionnellement avec l’augmentation du poids des reins. Cela doit être envisagé dans les études dans lesquelles l’hypertrophie rénale survient après l’ablation du rein controlatéral. Cinquièmement, nous n’avons d’expérience dans la mesure du FBR que pendant un mois et nous n’avons pas essayé d’étendre les mesures au-delà de cette période. Étant donné que les choses fonctionnaient bien tout au long de cette période dans presque tous les cas, les études pourraient probablement être prolongées de plusieurs semaines au-delà. Enfin, un petit mot sur les mesures parallèles de la pression artérielle : les cathéters implantés remplis de liquide avec de l’héparine diluée pour maintenir la perméabilité 24 heures / jour et les dispositifs de télémétrie implantés sont utilisés. Chacun a des avantages et des inconvénients en fonction de la conception expérimentale et des besoins. Par exemple, le prélèvement sanguin est possible à partir du cathéter artériel si la méthode du cathéter est choisie, et l’héparinisation n’est pas nécessaire pour la méthode de télémétrie. Cependant, les deux nous ont bien servis lors des mesures à long terme du FBR et de la BP.
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Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
Cette étude a été financée par des subventions pour la recherche scientifique (P01 HL116264, RO1 HL137748). Les auteurs tiennent à remercier Theresa Kurth pour ses conseils et son aide dans le maintien de l’environnement expérimental en tant que gestionnaire du laboratoire.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1RB probe | Transonic | 1RB | ultrasonic flow probe |
| Betadine | Avrio Health | povidone-iodine | |
| Buprenorphine SR-LAB | ZooPharm | Buprenorphine | |
| Cefazolin | APOTEX | NDC 60505 | Cefazolin |
| Crile Hemostats | Fine Surgical Instruments | 13004-14 | Hemostats for blunt dissection |
| Isoflurane | Piramal | NDC 66794 | Isoflurane |
| Medium Clear PVC cement | Oatey | PVC cement | |
| Mersilene polyester fiber mesh | Ethicon | polyester fiber mesh | |
| MetriCide28 | Metrex | SKU 10-2805 | 2.5% glutaraldehyde |
| Micro-Renathane 0.025 x 0.012 | Braintree Scientific | MRE 025 | use for catheter |
| MINI HYPE-WIPE | Current Technologies | #9803 | 1% sodium hypochlorite |
| Oatey Medium Clear PVC Cement | Oatey | #31018 | PVC cement |
| PHD2000 syringe pump | Harvard apparatus | 71-2000 | syringe pump |
| Ponemah software | DSI | recording software | |
| Precision 3630 Tower | Dell | Computer for recording | |
| Raturn Stand-Alone System | BASi | MD-1407 | a movement response caging system |
| RenaPulse High Fidelity Pressure Tubing 0.040 x 0.025 | Braintree Scientific | RPT 040 | use for catheter |
| Silicone cuff | Transonic | AAPC102 | skin button |
| Surgical lubricant sterile bacteriostatic | Fougera | 0168-0205-36 | gell for flow probe |
| Tergazyme | Alconox | protease contained anionic detergent | |
| TS420 Perivascular Flow Module | Transonic | TS420 | perivascular flow module |
| Vetbond | 3M | 1469SB | tissue adhesive |
| WinDaq software | DATAQ | recording software |
References
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