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Immunology and Infection

ओलिक एसिड-प्रेरित तीव्र श्वसन संकट सिंड्रोम का माउस मॉडल

Published: June 2, 2022 doi: 10.3791/63566
Automatic Translation
*1,2,5, *1,2,6, 1,3,4, 1,3, 1,2,4,5,6
1Laboratório de Imunofarmacologia, Fundação Oswaldo Cruz, FIOCRUZ, 2Laboratório de Imunofarmacologia, Departamento de Bioquímica, Instituto Biomédico, Universidade Federal do Estado do Rio de Janeiro, 3Programa de Pós-Graduação em Biologia Celular e Molecular, Instituto Oswaldo Cruz, FIOCRUZ, 4Programa de Pós-Graduação em Biologia Molecular e Celular, Universidade Federal do Estado do Rio de Janeiro, 5Programa de Pós-Graduação em Ciências e Biotecnologia, Universidade Federal Fluminense, 6Programa de Pós-Graduação em Neurociências, Universidade Federal Fluminense
* These authors contributed equally

Summary

वर्तमान प्रोटोकॉल तीव्र श्वसन संकट सिंड्रोम (एआरडीएस) की नकल करने के लिए ओलिक एसिड का उपयोग करके चूहों में फेफड़ों की चोट मॉडल का वर्णन करता है। यह मॉडल एडिमा पर भड़काऊ मध्यस्थों को बढ़ाता है और फेफड़ों के अनुपालन को कम करता है। ओलिक एसिड का उपयोग नमक के रूप (ओलेट) में किया जाता है क्योंकि यह शारीरिक रूप एम्बोलिज्म के जोखिम से बचता है।

Abstract

तीव्र श्वसन संकट सिंड्रोम (एआरडीएस) उच्च मृत्यु दर वाले गंभीर रूप से बीमार रोगियों के लिए एक महत्वपूर्ण खतरा है। प्रदूषक जोखिम, सिगरेट का धुआं, संक्रामक एजेंट और फैटी एसिड एआरडीएस को प्रेरित कर सकते हैं। पशु मॉडल एआरडीएस के जटिल पैथोमैकेनिज्म की नकल कर सकते हैं। हालांकि, उनमें से प्रत्येक की सीमाएं हैं। विशेष रूप से, फेफड़ों पर हानिकारक प्रभाव के साथ गंभीर रूप से बीमार रोगियों में ओलिक एसिड (ओए) बढ़ जाता है। ओए एम्बोली द्वारा फेफड़ों की चोट को प्रेरित कर सकता है, ऊतक को बाधित कर सकता है, पीएच को बदल सकता है, और एडिमा निकासी को खराब कर सकता है। ओए-प्रेरित फेफड़ों की चोट मॉडल एंडोथेलियल चोट, वायुकोशीय पारगम्यता में वृद्धि, सूजन, झिल्ली हाइलिन गठन और कोशिका मृत्यु के साथ एआरडीएस की विभिन्न विशेषताओं से मिलता-जुलता है। इसमें, फेफड़ों की चोट के प्रेरण को ओए (नमक के रूप में) को सीधे फेफड़े में और एक माउस में अंतःशिरा रूप से इंजेक्ट करके वर्णित किया गया है क्योंकि यह पीएच 7 पर ओए का शारीरिक रूप है। इस प्रकार, नमक के रूप में ओए का इंजेक्शन एम्बोली पैदा किए बिना या पीएच को बदले बिना फेफड़ों की चोट / एआरडीएस का अध्ययन करने के लिए एक सहायक पशु मॉडल है, जिससे गंभीर रूप से बीमार रोगियों में क्या हो रहा है।

Introduction

1967 में, एशबॉग एट अल.1 ने पहली बार तीव्र श्वसन संकट सिंड्रोम (एआरडीएस) का वर्णन किया और तब से कई संशोधनों से गुजर रहा है। बर्लिन परिभाषा के अनुसार, एआरडीएस एक फुफ्फुसीय सूजन है जो वेंटिलेशन से छिड़काव अनुपात में असंतुलन के कारण तीव्र श्वसन विफलता और हाइपोक्सिमिया (पीएओ 2 / एफआईओ 2 > 300 मिमी एचजी) की ओर जाता है, द्विपक्षीय वायुकोशीय क्षति (डीएडी) को फैलाता है और घुसपैठ, फेफड़ों के वजन में वृद्धि और एडिमा 2,3 की ओर जाता है। फुफ्फुसीय पैरेन्काइमा उपकला, एंडोथेलियल और अन्य कोशिकाओं द्वारा मिश्रित एक जटिल सेलुलर वातावरण है। ये कोशिकाएं एल्वियोली3 में गैस विनिमय और होमियोस्टैसिस के लिए जिम्मेदार बाधाएं और संरचनाएं बनाती हैं। उपकला अवरोध के भीतर सबसे प्रचुर मात्रा में कोशिकाएं वायुकोशीय प्रकार 1 कोशिकाएं (एटी 1) हैं जिनमें एनए / के-एटीपीस के माध्यम से गैस विनिमय और द्रव प्रबंधन के लिए एक बड़ा सतह क्षेत्र है। इसके अलावा, वायुकोशीय प्रकार II कोशिकाएं (एटी 2) सर्फेक्टेंट का उत्पादन करती हैं, जिससे एल्वियोली4 में सतह तनाव कम हो जाता है। नीचे, एंडोथेलियल कोशिकाएं एक अर्धपारगम्य बाधा बनाती हैं जो फुफ्फुसीय परिसंचरण को इंटरस्टिटियम से अलग करती हैं। इसके कार्यों में उत्तेजनाओं का पता लगाना, भड़काऊ प्रतिक्रियाओं का समन्वय करना और सेलुलर ट्रांसमाइग्रेशन5 शामिल हैं। एंडोथेलियल कोशिकाएं गैस विनिमय, संवहनी टोनस और जमावट5 को भी नियंत्रित करती हैं। इसलिए, एंडोथेलियल और उपकला समारोह की गड़बड़ी एक प्रोइन्फ्लेमेटरी फेनोटाइप को बढ़ा सकती है, जिससे एआरडीएस5 के कारण फेफड़ों की क्षति हो सकती है।

एआरडीएस विकास बैक्टीरिया और वायरल निमोनिया या अप्रत्यक्ष कारकों जैसे गैर-फुफ्फुसीय सेप्सिस, आघात, रक्त आधान और अग्नाशयशोथ6 से जुड़ा जोखिम है। ये स्थितियां रोगजनकों से जुड़े आणविक पैटर्न (पीएएमपी) और क्षति से जुड़े आणविक पैटर्न (डीएएमपी) की रिहाई का कारण बनती हैं, जो टीएनएफ -α, आईएल -1, आईएल -6 और आईएल -85 जैसे प्रोइन्फ्लेमेटरी साइटोकिन्स और केमोकाइन ्स को प्रेरित करती हैं। टीएनएफ -α एंडोथेलियल बाधा व्यवधान और फेफड़ों के पैरेन्काइमा में ल्यूकोसाइट घुसपैठ में संवहनी-एंडोथेलियल कैडरिन (वीई-कैडरिन) गिरावट से जुड़ा हुआ है। न्यूट्रोफिल माइग्रेट करने वाली पहली कोशिकाएं हैं, जो आईएल -8 और एलटीबी4 5,7,8 से आकर्षित होती हैं। न्यूट्रोफिल आगे प्रोइन्फ्लेमेटरी साइटोकिन्स, प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों (आरओएस)9, और न्यूट्रोफिल एक्स्ट्रासेल्युलर ट्रैप (एनईटी) गठन को बढ़ाते हैं जो अतिरिक्त एंडोथेलियल और उपकला क्षतिपैदा करते हैं। उपकला क्षति एटी 2 कोशिकाओं और निवासी मैक्रोफेज में टोल-जैसे रिसेप्टर्स की सूजन और सक्रियण को प्रेरित करती है, जिससे फेफड़ों में भड़काऊ कोशिकाओं को आकर्षित करने वाले केमोकाइन की रिहाई को प्रेरित किया जाताहै। इसके अलावा, इंटरफेरॉन-β (आईएनएफβ) जैसे साइटोकिन्स का उत्पादन टीएनएफ से संबंधित एपोप्टोसिस-उत्प्रेरण रिसेप्टर्स (ट्रेल) का कारण बनता है, जिससे एटीआईआई कोशिकाएं एपोप्टोसिस की ओर ले जाती हैं, द्रव और आयन क्लेरेंस4 को खराब करती हैं। एंडोथेलियल और उपकला बाधा संरचना का विघटन वायुकोशीय स्थान में तरल पदार्थ, प्रोटीन, लाल रक्त कोशिकाओं और ल्यूकोसाइट्स के प्रवाह की अनुमति देता है, जिससे एडिमा होती है। एडिमा स्थापित होने के साथ, श्वास और गैस विनिमय को बनाए रखने के लिए फुफ्फुसीयप्रयास बदल जाता है। हाइपरकेनिया और हाइपोक्सिमिया कोशिका मृत्यु और सोडियम परिवहन गड़बड़ी को प्रेरित करते हैं, खराबनिकासी क्षमता के कारण वायुकोशीय एडिमा को बढ़ाते हैं। एआरडीएस में आईएल -17 ए का ऊंचा स्तर भी है, जो अंग की शिथिलता, वायुकोशीय न्यूट्रोफिल के प्रतिशत में वृद्धि और वायुकोशीय पारगम्यता9 से जुड़ा हुआ है।

हालके वर्षों में एआरडीएस के पैथोफिज़ियोलॉजी, महामारी विज्ञान और उपचार पर अनुसंधान में प्रगति हुई है। हालांकि, एआरडीएस चिकित्सीय अनुसंधान में प्रगति के बावजूद एक विषम सिंड्रोम है जिसके परिणामस्वरूप यांत्रिक वेंटिलेशन और द्रव चिकित्सा अनुकूलन होता है। इस प्रकार, एक अधिक प्रभावी प्रत्यक्ष औषधीय उपचार की अभी भी आवश्यकता है10, और पशु अध्ययन एआरडीएस तंत्र और हस्तक्षेप के लक्ष्यों का अनावरण करने में मदद कर सकता है।

वर्तमान एआरडीएस मॉडल पैथोलॉजी को पूरी तरह से दोहराने में सक्षम नहीं हैं। इस प्रकार, शोधकर्ता अक्सर उस मॉडल का चयन करते हैं जो उनके हितों को बेहतर ढंग से फिट कर सकता है। उदाहरण के लिए, लिपोपॉलेसेकेराइड (एलपीएस) प्रेरण मॉडल मुख्य रूप से टीएलआर 414 द्वारा ट्रिगर एंडोटॉक्सिक शॉक द्वारा एआरडीएस को प्रेरित करता है। एचसीएल प्रेरण एसिड आकांक्षा की नकल करता है, और क्षति न्यूट्रोफिलिक-निर्भर14 है। दूसरी ओर, वर्तमान सोडियम ओलेट मॉडल एंडोथेलियल क्षति को प्रेरित करता है जो संवहनी पारगम्यता और एडिमा को बढ़ाता है। इसके अलावा, तरल रूप में ओलिक एसिड के बजाय सोडियम ओलेट का उपयोग करने से रक्त पीएच15 में एम्बोलिज्म जोखिम और परिवर्तन से बचा जा सकता है।

एआरडीएस के लिए पशु मॉडल
पशु मॉडल में प्रीक्लिनिकल अध्ययन पैथोलॉजी को समझने में मदद करते हैं और नए एआरडीएस उपचार अनुसंधान के लिए आवश्यक हैं। आदर्श पशु मॉडल में नैदानिक स्थिति और प्रत्येक रोग चरण, विकासऔर मरम्मत की प्रासंगिक पैथोफिजियोलॉजिकल विशेषताओं के साथ रोग तंत्र की अच्छी प्रजनन क्षमता जैसी विशेषताएं होनी चाहिए। एआरडीएस में पूर्व-चिकित्सकीय रूप से तीव्र फेफड़ों की चोट का आकलन करने के लिए कई पशु मॉडल का उपयोग किया जाता है। हालांकि, जैसा कि सभी मॉडलों की सीमाएं हैं, वे मानव विकृति 6,14,16 को पूरी तरह से पुन: पेश नहीं करते हैं। ओलिक एसिड-प्रेरित एआरडीएस का उपयोग विभिन्नपशु प्रजातियों में किया जाता है। ओए इंजेक्शन के लिए प्रस्तुत सूअर18, भेड़19, और कुत्ते20 वायुकोशीय-केशिका झिल्ली शिथिलता और प्रोटीन और कोशिका घुसपैठ के साथ बढ़ी हुई पारगम्यता के साथ रोग की कई नैदानिक विशेषताएं पेश करते हैं।

उदाहरण के लिए, 1.25 μM पर OA ने अंतःशिरा रूप से अवरुद्ध ट्रांसएपिथेलियल परिवहन को इंजेक्ट किया जिससे वायुकोशीय एडिमा15 हो गई। वैकल्पिक रूप से, ए 549 कोशिकाओं का उपयोग करके इन विट्रो मॉडल में, 10 μM की एकाग्रता पर ओए ने उपकला सोडियम चैनल (eNAC) या Na / K-ATPase की अभिव्यक्ति को नहीं बदला। हालांकि, ओए दोनों चैनलों के साथ जुड़ता प्रतीत होता है, सीधे उनकी गतिविधि को बाधित करताहै। 0.1 एमएल / किग्रा पर ओए अंतःशिरा इंजेक्शन फेफड़ों के ऊतकों की भीड़ और सूजन का कारण बनता है, मोटे वायुकोशीय सेप्टा के साथ वायुकोशीय रिक्त स्थान कम हो जाता है, और सूजन और लाल रक्त कोशिका की संख्यामें वृद्धि होती है। इसके अलावा, ओए ने फेफड़ों में एंडोथेलियल और उपकला कोशिकाओं में एपोप्टोसिस और नेक्रोसिस को प्रेरित किया। चूहों में इंट्राट्रेकियल रूप से ट्राइस-ओलेट समाधान का इंजेक्शन, उत्तेजनाके 6 घंटे बाद न्यूट्रोफिल घुसपैठ और एडिमा को बढ़ाता है। 24 घंटे में ओए इंजेक्शन ने प्रोइन्फ्लेमेटरी साइटोकिन स्तर (यानी, टीएनएफ -α, आईएल -6, और आईएल -1 ) 23 में वृद्धि की। इसके अलावा, ट्राइस-ओलेट के 10 μM का अंतःशिरा (ऑर्बिटल प्लेक्सस) इंजेक्शन फुफ्फुसीय Na / K-ATPase गतिविधि को रोकता है, जो 10-3 μM पर Ouabain के समान है, एक चयनात्मक एंजाइम अवरोधक। इसके अलावा, ओए कोशिका घुसपैठ, लिपिड निकायों के गठन, और ल्यूकोट्रिएन बी 4 (एलटीबी4) और प्रोस्टाग्लैंडीन ई 2 (पीजीई2) 22,24 के उत्पादन के साथ सूजन को प्रेरित करता है। इसलिए, ओलिक एसिड-प्रेरित एआरडीएस एडिमा, रक्तस्राव, न्यूट्रोफिल घुसपैठ, मायलोपेरोक्सीडेज (एमपीओ) गतिविधि में वृद्धि और आरओएस24 उत्पन्न करता है। इसलिए, ओए प्रशासन फेफड़ों की चोट22,25 के लिए एक अच्छी तरह से स्थापित मॉडल है। इस लेख में प्रस्तुत सभी परिणाम जिसमें ओए है, नमक के रूप का प्रतिनिधित्व करता है, सोडियम ओलेट।

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Protocol

इस अध्ययन में उपयोग की जाने वाली प्रक्रियाओं को ओसवाल्डो क्रूज़ फाउंडेशन के जानवरों के उपयोग पर आचार समिति द्वारा अनुमोदित किया गया था (सीईयूए लाइसेंस एन ° 002-08, 36/10 और 054/2015)। ओसवाल्डो क्रूज फाउंडेशन (एफआईओक्रूज) के इंस्टीट्यूट ऑफ साइंस एंड टेक्नोलॉजी इन बायोमॉडेल्स (आईसीटीबी) द्वारा प्रदान किए गए 20-30 ग्राम वजन वाले नर स्विस वेबस्टर चूहों का उपयोग प्रयोगों के लिए किया गया था। जानवरों को पाविलहाओ ओज़ोरियो डी अल्मेडा के विवेरियम में हवादार आइसोलेटर्स में रखा गया था, और लिबिटम में पानी और भोजन उपलब्ध था। वे 12 घंटे / 12 घंटे प्रकाश और अंधेरे चक्र के संपर्क में थे।

1. सोडियम ओलेट घोल की तैयारी

  1. किसी भी बाँझ ट्यूब या ग्लास फ्लास्क में सोडियम ओलेट स्टॉक समाधान के 100 mmol / L तैयार करने के लिए ओलिक एसिड का उपयोग करें।
    नोट: वर्तमान कार्य के लिए एक 50 एमएल (अंतिम मात्रा) समाधान तैयार किया गया था, लेकिन मात्रा को प्रयोगात्मक आवश्यकता के अनुसार समायोजित किया जाना चाहिए। समाधान हमेशा बाँझ ट्यूबों या कांच के कंटेनरों में तैयार किया जाना चाहिए।
    1. सबसे पहले, पीएच को बढ़ाने के लिए अल्ट्राप्योर पानी में एनएओएच गोलियां या घोल जोड़ें। 25 एमएल वॉल्यूम के लिए 12-13 के पीएच मान की सिफारिश की जाती है।
      नोट: वैकल्पिक रूप से, ट्रिस-ओलेट समाधान तैयार करने के लिए ट्रिस बेस का उपयोग किया जा सकता है।
    2. 37 डिग्री सेल्सियस पर अल्ट्रासोनिक स्नान में निरंतर आंदोलन के तहत, ओलिक एसिड ( सामग्री की तालिका देखें) को बहुत धीरे-धीरे, बूंद-दर-बूंद जोड़ें।
      नोट: यदि ओलिक एसिड वर्षा होती है, तो शुरुआत से ही शुरू करें।
    3. एक बार ओलिक एसिड पूरी तरह से घुल जाने के बाद, पीएच को सावधानीपूर्वक 7.4 तक समायोजित करें, अल्ट्रा-शुद्ध पतला एचसीएल के साथ सरगर्मी के तहत बूंद-बूंद करें और फिर 50 एमएल की अंतिम मात्रा में समायोजित करें।
      नोट: ताजा काम करने वाले ओलेट समाधान तैयार करें। वैकल्पिक रूप से, समाधान को एक महीने से अधिक समय तक ऑक्सीकरण से बचने के लिए नाइट्रोजन-समृद्ध वातावरण में -20 डिग्री सेल्सियस पर एलिकोट, स्टॉक और बनाए रखा जा सकता है। जमे हुए-पुन: जमे हुए चक्रों से बचें।

2. ओलिक एसिड द्वारा फेफड़ों की चोट का प्रेरण

  1. ओलिक एसिड के इंट्राट्रेकियल प्रशासन का प्रदर्शन करें।
    1. पशु चिकित्सा एनेस्थेटिक वेपोराइज़र (चित्रा 1 ए) का उपयोग करके ओ 2 के2 एल / मिनट के साथ 5% आइसोफ्लुरेन का उपयोग करके चूहों को एनेस्थेटाइज करें। चीरा क्षेत्र पर फर को डिपिलेटरी क्रीम के साथ हटा दें और बाँझ धुंध का उपयोग करके बीटाडीन स्क्रब और अल्कोहल के तीन वैकल्पिक राउंड के साथ क्षेत्र को कीटाणुरहित करें। पैर की अंगुली चुटकी द्वारा संज्ञाहरण की गहराई की पुष्टि करें।
      नोट: प्रक्रिया के दौरान बाँझ दस्ताने और उपकरणों का उपयोग करें। जानवर को ढंकने के लिए ड्रेप का उपयोग करें और केवल चीरा साइट को उजागर करें। पर्यावरण में आइसोफ्लोरेन पलायन से बचने के लिए एक जैविक सुरक्षा कैबिनेट में प्रयोग करें। एनाल्जेसिक को प्रशासित नहीं किया जाता है क्योंकि वे भड़काऊ प्रतिक्रिया को रोक सकते हैं।
    2. संज्ञाहरण के बाद, जानवर को पृष्ठीय डेक्यूबिटस स्थिति में रखें और थायराइड स्तर पर वी-आकार में एक चीरा (0.5-1 सेमी) बनाएं। श्वासनली (चित्रा 1 बी) को उजागर करने के लिए थायरॉयड को धीरे से विस्थापित करें और तैयार ओलेट समाधान (चरण 1) के 50 μL इंजेक्ट करें।
      नोट: चूहों को दो समूहों में विभाजित किया गया था, प्रत्येक समूह में आठ जानवर थे। फेफड़ों की चोट समूह को 25 mM (1.25 μmol) पर सोडियम-ओलेट समाधान प्राप्त होता है, और नियंत्रण समूह को इंसुलिन सिरिंज (वॉल्यूम 300 μL, 30 G) के साथ प्रत्येक माउस की श्वासनली में प्रवेश करके 50 μL बाँझ खारा प्राप्त होता है (चित्रा 1 सी)।
    3. सिंथेटिक गैर-अवशोषक मोनोफिलामेंट सीवन के साथ चूहों के चीरा स्थल को सीवन करें, इसे अपने पिंजरे में वापस करें, और सर्जरी से पूरी तरह से ठीक होने तक इसकी निगरानी करें। सभी प्रक्रियाओं के दौरान, जानवरों को 37 डिग्री सेल्सियस पर हीटिंग पैड पर बनाए रखें।
      नोट: चूहों को आमतौर पर सर्जरी से उबरने में 15 मिनट तक का समय लगता है।
  2. ओलिक एसिड के अंतःशिरा प्रशासन का प्रदर्शन करें।
    1. संज्ञाहरण (चरण 2.1.1, चित्रा 2 ए) के बाद, आंख सॉकेट (चित्रा 2 बी) के औसत दर्जे के कैंथस में अल्ट्राफाइन सुई (सामग्री की तालिका देखें) डालकर कक्षीय जाल में अंतःशिरा रूप से इंजेक्ट करें।
      नोट: चूहों को दो समूहों में विभाजित किया गया था, प्रत्येक समूह में आठ जानवर थे। प्रत्येक समूह को प्रति पशु ओए के 10 μmol पर सोडियम-ओलेट समाधान का 100 μL प्राप्त होता है, जबकि नियंत्रण समूह को बाँझ खारा का 100 μL प्राप्त होता है।
  3. सर्जरी के बाद, प्रतिकूल प्रतिक्रियाओं के लिए रोजाना जानवरों की निगरानी करें। इच्छामृत्यु के लिए मानवीय समापन बिंदु में प्रतिकूल प्रतिक्रियाएं, आक्षेप और कोमा शामिल हैं।

3. ब्रोन्कोएल्वोलर लैवेज द्रव संग्रह (बीएएलएफ)

  1. केटामाइन (300 मिलीग्राम / किग्रा) और ज़ाइलेज़िन (30 मिलीग्राम / किग्रा) की इंट्रापरिटोनियल घातक खुराक के साथ चूहों को इच्छामृत्यु दें ( सामग्री की तालिका देखें)।
  2. जानवर को पृष्ठीय डेक्यूबिटस स्थिति में रखें, जानवरों के पूर्ववर्ती क्षेत्र में सर्जिकल कैंची के साथ लगभग 1 सेमी का चीरा लगाएं, श्वासनली को उजागर करें और अंतःशिरा कैथेटर (20 ग्राम) पेश करने के लिए एक छोटा सा कट बनाएं।
  3. कैथेटर को 1 एमएल बाँझ सिरिंज से कनेक्ट करें, धीरे-धीरे और धीरे-धीरे फेफड़ों में 0.5 एमएल बाँझ खारा इंजेक्ट करें, और फिर उसी सिरिंज के साथ बीएएलएफ से तरल पदार्थ को एस्पिरेट करें। इसे 3-5 बार दोहराएं, और इसे एक बाँझ माइक्रोट्यूब में स्थानांतरित करें, उन्हें बर्फ में रखें।
    नोट: नमूने 6 महीने तक -20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है।

4. बीएएलएफ में कुल और अंतर सेल विश्लेषण।

  1. कुल सेल गणना के लिए, तुर्क के घोल के 180 μL (10x कमजोर पड़ने) में BALF के 20 μL को पतला करें ( सामग्री की तालिका देखें)। 40x उद्देश्य के साथ एक ऑप्टिकल माइक्रोस्कोप के तहत एक न्यूबॉयर कक्ष का उपयोग करके गिनती करें।
  2. विभेदक गणना के लिए, स्लाइड युक्त सेलुलर फ़नल में बीएएलएफ के 100 μL डालें और इसे साइटोसेंट्रीफ्यूज में 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 22.86 x g पर सेंट्रीफ्यूज करें, और मई-ग्रुनवाल्ड (15%, पीएच 7.2)-गिम्सा (1:10) के साथ दाग दें (सामग्री की तालिका देखें)। विसर्जन उद्देश्य के साथ एक प्रकाश माइक्रोस्कोप में सेल गिनती के साथ आगे बढ़ें।

5. बीएएलएफ में कुल प्रोटीन का निर्धारण

  1. एक वाणिज्यिक प्रोटीन परिमाणीकरण किट द्वारा कुल बीएएलएफ सुपरनैटेंट प्रोटीन का निर्धारण करें और निर्माता के निर्देशों का पालन करते हुए स्पेक्ट्रोफोटोमीटर का उपयोग करके 562 एनएम पर अवशोषण पढ़ें ( सामग्री की तालिका देखें)।

6. एंजाइम इम्यूनोसॉर्बेंट परख

  1. 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 1,200 x g पर सेंट्रीफ्यूज बीएएलएफ। फिर एक पिपेट के साथ सतह पर तैरनेवाला इकट्ठा करें और इसे टीएनएफ -α, आईएल -1, आईएल -6, और पीजीई 2 15,23,25 के परीक्षण के लिए -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
    नोट: चरण 6.1 में सेंट्रीफ्यूजेशन बीएएलएफ सेल मुक्त बनाता है।
    1. निर्माता के निर्देशों के अनुसार एक वाणिज्यिक एलिसा किट का उपयोग करके सेल-मुक्त बीएएलएफ पर साइटोकिन्स परख करें। निर्माता के निर्देशों का पालन करते हुए एंजाइम इम्यूनोएसे (ईआईए) किट का उपयोग करके पीजीई 2 परख करें ( सामग्री की तालिका देखें)।

7. लिपिड बॉडी धुंधला होना और गिनती

  1. साइटोस्पिन स्लाइड्स पर ल्यूकोसाइट्स को सीए2 +, एमजी2 + फ्री हैंक के बफर नमक समाधान (एचबीएसएस, पीएच 7.4) में 3.7% फॉर्मलाडेहाइड का उपयोग करके ठीक करें और 1.5% ओएसओ4 के साथ दाग लगाएं जबकि अभी भी नम3 ( सामग्री की तालिका देखें)। फिर, माइक्रोस्कोप के तेल-विसर्जन उद्देश्य लेंस का उपयोग करके प्रत्येक स्लाइड से 50 लगातार ल्यूकोसाइट्स में प्रति सेल लिपिड निकायों की गणना करें।

8. सांख्यिकीय विश्लेषण

  1. ग्राफ़िंग और सांख्यिकी सॉफ्टवेयर का उपयोग करके सांख्यिकीय विश्लेषण करें ( सामग्री की तालिका देखें)। परिणामों को एसईएम ± औसत के रूप में व्यक्त करें और वन-वे एनोवा द्वारा विश्लेषण करें, इसके बाद पोस्ट-टेस्ट न्यूमैन-केल्स-स्टूडेंट26 का विश्लेषण करें। पी < 0.05 होने पर मतभेदों पर विचार करें।

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Representative Results

एक घायल फेफड़े में, वायुकोशीय द्रव निकासी बरकरार वायुकोशीय उपकला परत के माध्यम से आयनों के परिवहन से होती है। आसमाटिक ढाल एल्वियोली से फुफ्फुसीय इंटरस्टिटियम में तरल पदार्थ ले जाती है, जहां इसे लसीका वाहिकाओं द्वारा सूखा या पुन: अवशोषित किया जाता है। Na/K-ATPase इस परिवहन को चलाता है11. ओए एनए / के-एटीपीस27 और सोडियम चैनल21 का अवरोधक है, जो एडिमा गठन में योगदान कर सकता है, जैसा कि हमने पहले ही सुझाव दियाहै 23। एआरडीएस में बढ़ी हुई भड़काऊ प्रतिक्रिया से वायुकोशीय क्षति, एंडोथेलियल और उपकला पारगम्यता में वृद्धि और प्रोटीन और भड़काऊ कोशिकाओं से भरपूर वायुकोशीय द्रव का संचय होता है, जिससे एडिमा होती है। एडीमा अंतरालीय द्रव और गैस विनिमय हानि के संचय के कारण फेफड़ों को सांस लेने की दर बढ़ाने का कारण बनता है, जिसके परिणामस्वरूप हाइपोक्सिमिया और श्वसन विफलता28 होती है। टीएनएफ -α और संवहनी एंडोथेलियल ग्रोथ फैक्टर (वीईजीएफ) जैसे साइटोकिन्स वीई-कैडरिन बॉन्ड को अस्थिर करते हैं, एंडोथेलियल पारगम्यता और वायुकोशीय द्रव संचयमें वृद्धि में योगदान करते हैं।

ओए इंजेक्शन ने इंट्राट्रेकियल और अंतःशिरा मार्गों में कुल ल्यूकोसाइट्स में वृद्धि की (चित्रा 3)। इंट्राट्रेकियल मार्ग के बजाय अंतःशिरा मार्ग द्वारा फेफड़ों की चोट के लिए ओए को प्रेरित करना आवश्यक था। वर्तमान कार्य में बीएएलएफ में न्यूट्रोफिल की संख्या में 6 घंटे की वृद्धि देखी गई, जिसमें शिखर 24 घंटे पर और 48 घंटे और 72 घंटे पर घट गया। ओए इंट्राट्रेकियल इंस्टिलेशन 23 (चित्रा 4) के24 घंटे के बाद बीएएलएफ में आईएल -6, आईएल -1 और टीएनएफ -α की उच्च सांद्रता देखी गई। ओए एडिमा निकासी को रोकता है और अंतःशिरा और इंट्राट्रेचल मार्गों15,23 दोनों द्वारा प्रोटीन में समृद्ध एडिमा के गठन को ट्रिगर कर सकता है। फेफड़ों की एडिमा का मूल्यांकन बीएएलएफ में कुल प्रोटीन परख द्वारा किया गया था, जिसमें दिखाया गया था कि यानी और यानी प्रशासन ने कुल प्रोटीन एकाग्रता में वृद्धि की (चित्रा 5)। लिपिड शरीर इंट्रासेल्युलर ऑर्गेनेल होते हैं जिनमें सब्सट्रेट और एंजाइम होते हैं जो इकोसैनोइड्स उत्पादन 8,29 होते हैं। लिपिड निकायों का गठन लिपिड मध्यस्थों के उत्पादन को बढ़ाता है, और इसका उपयोग सेल सक्रियण तक पहुंचने के लिए किया जा सकता है। इंट्राट्रेकियल और अंतःशिरा ओए इंजेक्शन ने 24 घंटे के बाद लिपिड शरीर के गठन और पीजीई2 एकाग्रता23 को बढ़ाया (चित्रा 6)। ओए इंजेक्शन ने इंट्राट्रेकियल और अंतःशिरा मार्गों में ऊतक विघटन, रक्तस्राव और ल्यूकोसाइट घुसपैठ को भी प्रेरित किया, जैसा कि हेमटोक्सिलिन और ईओसिन (एच एंड ई) स्टेनिंग हिस्टोलॉजी (चित्रा 7) में दिखाया गया है। इसके अलावा, ओए फेफड़ोंके कार्य में परिवर्तन का कारण बनता है। इस प्रकार, ओलिक एसिड-प्रेरित फेफड़ों की चोट कई एआरडीएस विशेषताओं को प्रस्तुत करती है।

Figure 1
चित्र 1: इंट्राट्रेकियल प्रशासन प्रोटोकॉल में व्यक्तिगत कदम । (A) एक माउस को 5% आइसोफ्लोरेन और 2 L/minO2 का उपयोग करके एनेस्थेटाइज किया जाता है। (बी) पृष्ठीय डिक्यूबिटस स्थिति में चूहों में सर्जिकल कैंची के साथ एक श्वासनली चीरा। (सी) इंसुलिन सिरिंज का उपयोग करके इंट्राट्रेकियल इंस्टिलेशन। BioRender.com के साथ बनाया गया। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्रा 2: अंतःशिरा प्रशासन प्रोटोकॉल में व्यक्तिगत कदम । (A) एक माउस को 5% आइसोफ्लोरेन और 2L/min O2 के साथ एनेस्थेटाइज्ड किया जाता है। (बी) औसत दर्जे के कैंथस द्वारा इंसुलिन सिरिंज का उपयोग करके अंतःशिरा इंजेक्शन। BioRender.com के साथ बनाया गया। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्रा 3: ओए का प्रशासन चूहों के बीएएलएफ में ल्यूकोसाइट सक्रियण को प्रेरित करता है। ओए चुनौती के 24 घंटे बाद अंतःशिरा (यानी) और इंट्राट्रेकियल एडमिनिस्ट्रेशन (आई.टी.) (ए) में कुल ल्यूकोसाइट्स और इंट्राट्रेकियल एडमिनिस्ट्रेशन (यानी) में एक चित्रात्मक फोटोमाइक्रोग्राफ (1000 एक्स आवर्धन) किया गया। स्केल बार = 10 μm। नियंत्रण समूह को बाँझ खारा की समान मात्रा दी गई थी। प्रत्येक पट्टी कम से कम सात जानवरों के औसत ± एसईएम का प्रतिनिधित्व करती है। * नियंत्रण की तुलना में पी < 0.05। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्रा 4: ओए का इंट्राट्रेकियल प्रशासन (यानी) चूहों के फेफड़ों में भड़काऊ मध्यस्थों के उत्पादन को प्रेरित करता है। टीएनएफ -α (ए), आईएल -6 (बी), आईएल -1 (सी) को चुनौती के 24 घंटे बाद मापा गया था। नियंत्रण समूह को बाँझ खारा प्रशासित किया गया था। प्रत्येक पट्टी कम से कम छह जानवरों के लिए औसत ± एसईएम का प्रतिनिधित्व करती है। * नियंत्रण की तुलना में पी < 0.05। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 5
चित्रा 5: ओए इंजेक्शन के 24 घंटे बाद बीएएलएफ में कुल प्रोटीन सामग्री। इंट्राट्रेकियल (यानी) और अंतःशिरा (यानी) ओए के प्रशासन से चूहों के बीएएलएफ में कुल प्रोटीन बढ़ जाता है। नियंत्रण समूह को बाँझ खारा की समान मात्रा प्राप्त हुई। परिणाम कम से कम छह अलग-अलग जानवरों से एसईएम ± का मतलब है। * नियंत्रण की तुलना में पी < 0.0001। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 6
चित्रा 6: ल्यूकोसाइट्स में लिपिड शरीर का गठन और ओए उपचारित चूहों के बीएएलएफ में पीजीई2 उत्पादन। ओए का इंट्राट्रेकियल (यानी) और अंतःशिरा (यानी) प्रशासन क्रमशः चूहों (ए) और (बी) के बीएएलएफ में भड़काऊ मध्यस्थों और लिपिड निकायों के संचय को प्रेरित करता है। (सी) ओए चुनौती के 24 घंटे बाद ऑस्मियम टेट्रोक्साइड (ओएसओ4) के साथ जानवरों के फेफड़ों में दाग वाले लिपिड निकायों (1000 x आवर्धन) का चित्रात्मक फोटोमाइक्रोग्राफ। तीर लिपिड निकायों को इंगित करते हैं। स्केल बार = 10 μm। नियंत्रणों को लवण की समान मात्रा प्राप्त हुई। परिणाम सात जानवरों से एसईएम ± साधन हैं। * नियंत्रण की तुलना में पी < 0.05। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 7
चित्रा 7: चूहों में फुफ्फुसीय हिस्टोलॉजी का चित्रण । (ए) खारा के साथ इलाज किए गए चूहों को नियंत्रित करें और रक्तस्राव का कोई संकेत नहीं है। (बी) ओए का अंतःशिरा प्रशासन (i.v)। (सी) ऊतक परिवर्तन के साथ इंट्राट्रेकियल प्रशासन (यानी)। एच एंड ई धुंधला प्रदर्शन किया गया था। आवर्धन, 1000x. स्केल बार = 50 μm। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

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Discussion

प्रीक्लिनिकल अध्ययन करने के लिए सही एआरडीएस मॉडल का चयन करना आवश्यक है, और मूल्यांकनकर्ता को सभी संभावित चर, जैसे आयु, लिंग, प्रशासन के तरीकों और अन्य6 पर विचार करना चाहिए। चुने हुए मॉडल को सेप्सिस, लिपिड एम्बोलिज्म, फुफ्फुसीय वाहिका के इस्किमिया-रीपरफ्यूजन और अन्यनैदानिक जोखिमों जैसे जोखिम कारकों के आधार पर रोग को पुन: पेश करना चाहिए। हालांकि, एआरडीएस के लिए उपयोग किया जाने वाला कोई भी पशु मॉडल सभी मानव सिंड्रोम की विशेषताओं को फिर से नहीं बना सकता है। कई घायल एजेंट मॉडल में एलपीएस, ओए, हाइड्रोक्लोरिक एसिड, बैक्टीरिया और वायरस6 शामिल हैं। इसके अलावा, विभिन्न प्रशासन विधियों का उपयोग किया जाता है, आमतौर पर, इंट्राट्राचेल, इंट्रानेसल, या अंतःशिरा। फुफ्फुसीय इस्किमिया-रीपरफ्यूजन मॉडल केशिका टूटने और इंट्रा-वायुकोशीय प्रोटीन6 के संचय का कारण बनता है। एलपीएस-प्रेरित फेफड़ों की चोट का व्यापक रूप से उपयोग किया जाता है और उपकला और एंडोथेलियल बाधाओं की तीव्र चोट की ओर जाता है। एलपीएस वायुमार्ग उपकला में टोल-जैसे रिसेप्टर 4 (टीएलआर -4) को बांधता है जो एनएफ-ओबी सक्रियण को ट्रिगर करता है जो साइटोकिन्स और केमोकाइन के उत्पादन को बढ़ाता है, भड़काऊ कोशिकाओं को आकर्षित करताहै30, जो एक मजबूत न्यूट्रोफिलिक एल्वियोलिटिस6 की ओर जाता है। हालांकि, मॉडल उपभेदों और जानवरों की प्रजातियों के बीच भिन्नता दिखाता है, एआरडीएस30 के साथ मानव रोगियों के लिए जानवरों में परिणामों की प्रजनन क्षमता को कम करता है।

एचसीएल-चोट मॉडल अम्लीय सामग्री आकांक्षा द्वारा एआरडीएस की नकल करता है। फेफड़ों में कम पीएच एक तीव्र भड़काऊ प्रतिक्रिया को प्रेरित करता है जिसके बाद देर से फाइब्रोटिक चोट होती है। क्षति न्यूट्रोफिल-निर्भर है, जिससे वायुकोशीय रक्तस्राव, एडिमा और बिगड़ा हुआ द्रव निकासी होती है। हालांकि, मनुष्य केवल एचसीएल को एस्पिरेट नहीं करते हैं, लेकिन पीएच के साथ एक जटिल गैस्ट्रिक सामग्री अक्सर 1.531 से अधिक होती है। इन और अन्य एआरडीएस मॉडलों की कहीं और व्यापक रूप से समीक्षा की गईहै। उपयोग किए गए सभी मॉडलों में, ओलिक एसिड-प्रेरित एआरडीएस मॉडल सबसे आदर्श14 है।

सोडियम ओलेट मॉडल फेफड़ों की क्षति का कारण बनता है, वायुकोशीय कोशिकाओं के एपोप्टोसिस और नेक्रोसिस को प्रेरित करता है, और टीएनएफ, आईएल -8, आईएल -6, आईएल -1 और एमआईपी -19 जैसे साइटोकिन्स उत्पादन को बढ़ाता है। ओए रक्तस्राव के साथ प्रोटीज और इलास्टेस अभिव्यक्ति को भी प्रेरित करता है जिससे फेफड़ों की गंभीर चोटहोती है। ओए लिपिड एम्बोलिज्म, फुफ्फुसीय संवहनी पारगम्यता में वृद्धि, और रेडियोग्राफिक घुसपैठ के साथ एक्स्ट्रावस्कुलर द्रवके कारण रोग को पुन: उत्पन्न करता है। इसके अलावा, एआरडीएस वाले रोगियों में उच्च प्लास्माटिक ओए एकाग्रता 15,22,24 है।

ओए इंट्राट्रेकियल प्रशासन नैदानिक एआरडीएस के समान भड़काऊ मध्यस्थों के उत्पादन को प्रेरित करता है और फेफड़ों के अनुपालन और गैस विनिमय25,32 को कम करता है। ओए अंतःशिराइंजेक्शन रोग के हिस्टोमॉर्फोलॉजिकल और शारीरिक पहलुओं को बढ़ावा देता है। सीरम एल्बुमिन एक शक्तिशाली ओए लिगैंड है जो यह समझा सकता है कि फेफड़ों की क्षति को प्रेरित करने के लिए इस मार्ग को इंट्राट्रेकियल (1.25 μmol)23 की तुलना में उच्च OA (10 μmol)15 राशि की आवश्यकता क्यों होती है। दरअसल, हमारे समूह ने लेप्टोस्पायरोसिस33 के रोगियों में ओए / एल्ब्यूमिन असंतुलन और उच्च मृत्यु जोखिम के बीच एक सहसंबंध दिखाया।

हर दूसरे मॉडल के साथ, मॉडल में प्रस्तुत कुछ नुकसान हैं। जब नमक के रूप में प्रशासित नहीं किया जाता है, तो ओलिक एसिड रक्त पायसीकरण के कारण विषाक्त प्रभाव और विविधताएं पैदा कर सकता है। जैसा कि इस लेख में दिखाया गया है, इसके नमक के रूप का उपयोग विषाक्त प्रभाव को कम करता है और दो समस्याओं से बचता है: एम्बोली गठन और रक्त और फेफड़ों में पीएच उतार-चढ़ाव। इसके अलावा, यह सुनिश्चित करता है कि फुफ्फुसीय चोट ओलेट के कारण होती है और द्वितीयक प्रभाव15 के कारण नहीं होती है। इसके अलावा, इस मॉडल में नमक के रूप में ओलिक एसिड की तैयारी को एल्ब्यूमिन के साथ संयुग्मन की आवश्यकता नहीं होती है। शोध सूजन और संवहनी पारगम्यता को कम करने में एल्ब्यूमिन के लाभकारी प्रभाव दिखाते हैं। इसके अलावा, एल्बुमिन फेफड़ों की चोट के रोगियों में हेमोडायनामिक और श्वसन को पुनर्स्थापित करता है। इस प्रकार, ओए के साथ एल्ब्यूमिन को संयुग्मित करने से जानवर पर इसका प्रभाव कम हो सकता है, जिससे मॉडल की व्यवहार्यता33,34 कम हो सकती है।

आणविक स्तर पर, सोडियम ओलेट सोडियम-पोटेशियम एटीपीस (एनकेए) और सोडियम चैनल (ईएनएसी) को रोकता है, जो आयनों के परिवहन को बाधित करता है, संवहनी पारगम्यता और एडिमा गठनको बढ़ाता है। इसके अलावा, ओए मुक्त फैटी एसिड रिसेप्टर 1 (एफएफएआर 1) से जुड़ सकता है, जिससे इंट्रासेल्युलर सीए2 + एकाग्रता बढ़ जाती है, जो पीआई 3 के और एमएपी जैसे किनेसेस सिग्नलिंग प्रोटीन को ट्रिगर करती है, जिससे सक्रिय बी कोशिकाओं (एनएफ-3बी) सक्रियण के परमाणु कारक कप्पा-लाइट-चेन-एन्हांसर होते हैं और भड़काऊ प्रतिक्रिया25 बढ़ जाती है।

सारांश में, हालांकि कोई भी मॉडल एआरडीएस सुविधाओं को पूरी तरह से पुन: पेश नहीं कर सकता है, वे बीमारी का अध्ययन करने के लिए मूल्यवान उपकरण हैं। एआरडीएस के पैथोफिज़ियोलॉजी और नए उपचारों के विकास को समझने में प्रीक्लिनिकल अनुसंधान महत्वपूर्ण है। नमक के रूप में ओए का इंट्राट्रेकियल और अंतःशिरा प्रशासन, विश्वसनीय और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य एआरडीएस मॉडल उत्पन्न करता है, जिससे यह एआरडीएस का अध्ययन करने के लिए एक सुनहरा मॉडल बन जाता है।

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Disclosures

लेखक ों ने हितों के टकराव की घोषणा नहीं की है।

Acknowledgments

इस शोध को इंस्टीट्यूटो ओसवाल्डो क्रूज़, फंडाको ओसवाल्डो क्रूज़ (एफआईओक्रूज़), कोर्डेनाको डी एपरफेइकोमेंटो डी पेस्सोअल डी निवेल सुपीरियर (सीएपीएस) ग्रांट 001, प्रोग्राम डी बायोटेक्नोलोगिया डी यूनिवर्सिटी फेडरल फ्लुमिनेंस (यूएफएफ), यूनिवर्सिटी फेडरल डो एस्टाडो डो रियो डी जनेरियो (यूएनआईआरआईओ), फंडाको कार्लोस चागास फिलो डी एम्पारो द्वारा वित्त पोषित किया गया था। और कॉन्सेल्हो नेशनल डी डेसेनवोल्विमेंटो साइंटिफिको और टेक्नोलोजिको (सीएनपीक्यू)। चित्र 1 और चित्र 2 BioRender.com के साथ बनाए गए हैं।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Anesthetic vaporizer SurgiVet model 100
Braided slik thread with needle number 5 Shalon medical N/A
Cabinet vivarium Insight  Model EB273
Centrifuge Eppendorf 5430/5430R
Cytofunnel ThermoFisher 11-025-48
Drontal puppy Bayer N/A
Hank's balanced Salts Sigma-Aldrich H4981
Heatpad tkreprodução TK-500
Hydrocloric Acid Sigma-Aldrich 30721
Insulin syringe Ultrafine BD 328322
Isoforine 1mL/mL Cristália N/A
Ketamine Syntec N/A
May-Grunwald-Giemsa Sigma-Aldrich 205435
Micro BCA Protein Assay Kit ThermoFisher 23235
Microscope  PrimoStar Carl Zeiss
Mouse IL-1 beta duoSet ELISA R&D system DY401
Mouse IL-6 duoSet ELISA R&D system DY406
Mouse TNF-alpha duoSet ELISA R&D system DY410
Neubauer chamber improved bright-line Global optics
Oleic Acid (99%) Sigma-Aldrich O1008
Osmium tetroxide solution (4%) Sigma-Aldrich 75632
Peripheral Intravenous Catherter 20 G BD Angiocath 388333
Prism 8 (graphic and statistic software) Graphpad N/A
Prostaglandin E2 ELISA Kit -Monoclonal Cayman Chemical 514010
Shandon Cytospin 3 ThermoFisher N/A
Sodium hydroxide Merck 1,06,49,81,000
Spectrophotometer Molecular Devices SpectraMax ABS plus
Swiss webster mice ICTB/FIOCRUZ N/A
Syringe 1 mL BD 990189
Tris-base Bio Rad 161-0719 Electrophoresis purity reagent
Türk's solution Sigma-Aldrich 93770
Xilazine Syntec N/A

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References

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