Summary
本プロトコルは、急性呼吸窮迫症候群(ARDS)を模倣するためにオレイン酸を使用するマウスの肺損傷モデルについて記述する。このモデルは、浮腫の炎症性メディエーターを増加させ、肺コンプライアンスを低下させます。オレイン酸は、この生理学的形態が塞栓症のリスクを回避するため、塩の形態(オレイン酸)で使用されます。
Abstract
急性呼吸窮迫症候群(ARDS)は、致死率の高い重症患者にとって重大な脅威です。汚染物質への曝露、タバコの煙、感染性病原体、および脂肪酸は、ARDSを誘発する可能性があります。動物モデルは、ARDSの複雑な病態メカニズムを模倣することができます。ただし、それぞれに制限があります。特に、オレイン酸(OA)は、肺に有害な影響を与える重症患者で増加します。OAは、塞栓、組織破壊、pHの変化、浮腫クリアランスの障害によって肺損傷を誘発する可能性があります。OA誘発性肺損傷モデルは、内皮損傷、肺胞透過性の増加、炎症、膜硝子形成、および細胞死を伴うARDSのさまざまな特徴に似ています。本明細書では、肺損傷の誘発は、pH 7におけるOAの生理学的形態であるため、OA(塩形態)を肺に直接注射し、マウスに静脈内注射することによって説明される。したがって、塩の形でのOAの注射は、塞栓を引き起こしたりpHを変化させたりすることなく、肺損傷/ARDSを研究するための有用な動物モデルであり、それによって重症患者で起こっていることに近づきます。
Introduction
Ashbaugh et al.1 は、1967 年に急性呼吸窮迫症候群 (ARDS) について初めて記述し、それ以来、複数回の改訂を経てきました。ベルリンの定義によると、ARDSは急性呼吸不全と低酸素血症(PaO 2 / FiO 2 > 300 mm Hg)につながる肺の炎症です 換気と灌流の比率の不均衡、びまん性両側肺胞損傷(DAD)と浸潤、肺重量の増加、および浮腫2,3。肺実質は、上皮細胞、内皮細胞、およびその他の細胞が複合化した複雑な細胞環境です。これらの細胞は、肺胞3におけるガス交換および恒常性に関与する障壁および構造を形成する。上皮バリア内に最も多く存在する細胞は、Na/K-ATPaseを介したガス交換と体液管理のための表面積が大きい肺胞I型細胞(AT1)です。また、肺胞II型細胞(AT2)は界面活性剤を産生し、肺胞4の表面張力を低下させる。その下では、内皮細胞が肺循環を間質から分離する半透性バリアを形成しています。その機能には、刺激の検出、炎症反応の調整、および細胞転生が含まれます5。また、内皮細胞はガス交換、血管緊張、凝固を調節する5。したがって、内皮および上皮機能障害は炎症性表現型を悪化させ、ARDS5につながる肺の損傷を引き起こす可能性があります。
ARDSの発症は、細菌性肺炎やウイルス性肺炎、または非肺敗血症、外傷、輸血、膵炎などの間接的な要因とリスクが関連しています6。これらの状態は、病原体関連分子パターン(PAMP)および損傷関連分子パターン(DAMP)の放出を引き起こし、TNF-α、IL-1β、IL-6、およびIL-8などの炎症性サイトカインおよびケモカインを誘導します5。TNF-αは、血管内皮カドヘリン(VE-カドヘリン)の内皮バリア破壊および肺実質への白血球浸潤に関連しています。好中球は、IL-8およびLTB4 5,7,8に引き寄せられて移動する最初の細胞です。好中球は、炎症性サイトカイン、活性酸素種(ROS)9、好中球細胞外トラップ(NET)の形成をさらに増加させ、余分な内皮および上皮損傷を引き起こします10。上皮損傷は、AT2細胞および常在マクロファージのToll様受容体の炎症と活性化を促し、炎症細胞を肺に引き付けるケモカインの放出を誘導します4。また、インターフェロンβ(INFβ)などのサイトカインの産生は、TNF関連のアポトーシス誘導受容体(TRAIL)を引き起こし、ATII細胞をアポトーシスに導き、体液とイオンクラレンスを損ないます4。内皮および上皮のバリア構造の破壊により、体液、タンパク質、赤血球、および白血球が肺胞腔に流入し、浮腫を引き起こします。浮腫が確立されると、呼吸とガス交換を維持するための肺の努力が変化します11。高炭酸ガス血症と低酸素血症は、細胞死とナトリウム輸送障害を誘発し、クリアランス能力の低下により肺胞浮腫を悪化させます10。ARDSはまた、臓器機能障害、肺胞好中球の割合の増加、および肺胞透過性に関連するIL-17Aのレベルの上昇も示しています9。
近年、ARDSの病態生理学、疫学、および治療に関する研究が継続的に進歩しています12,13。しかし、ARDSは、人工呼吸器や輸液療法の最適化につながる治療研究の進歩にもかかわらず、不均一な症候群です。したがって、より効果的な直接的な薬理学的治療が依然として必要であり10、動物実験はARDSのメカニズムと介入の標的を明らかにするのに役立つ可能性があります。
現在のARDSモデルは、病理学を完全に再現することはできません。したがって、研究者は自分の興味により適したモデルを選択することがよくあります。例えば、リポ多糖(LPS)誘導モデルは、主にTLR414によって引き起こされる内毒性ショックによってARDSを誘導する。HCl誘導は酸吸引を模倣し、損傷は好中栄養依存的である14。一方、現在のオレイン酸ナトリウムモデルは、血管透過性や浮腫を増加させる内皮損傷を誘発します。さらに、オレイン酸の代わりにオレイン酸ナトリウムを液体の形で使用することで、塞栓症のリスクや血液pH15の変化を回避できます。
ARDSの動物モデル
動物モデルを用いた前臨床試験は、病態の理解に役立ち、新しいARDS治療研究に不可欠です。理想的な動物モデルは、臨床状況に似た特徴と、各疾患の病期、進化、および修復に関連する病態生理学的特徴を備えた疾患メカニズムの良好な再現性を備えている必要があります14。いくつかの動物モデルを使用して、ARDSの急性肺損傷を前臨床的に評価します。しかし、すべてのモデルには限界があるため、ヒトの病理を完全に再現することはできません6,14,16。オレイン酸誘発性ARDSは、異なる動物種で使用されている17。OA注射を投与されたブタ18、ヒツジ19、およびイヌ20は、肺胞毛細血管膜の機能不全と、タンパク質および細胞浸潤による透過性の増加を伴う疾患の多くの臨床的特徴を示す。
例えば、1.25 μMのOAを静脈内注射すると、経上皮輸送が遮断され、肺胞浮腫が生じた15。あるいは、A549細胞を用いたin vitroモデルでは、10 μMの濃度のOAは、上皮ナトリウムチャネル(eNAC)またはNa/K-ATPaseの発現を変化させませんでした。しかし、OAは両方のチャネルと関連しているようであり、それらの活動を直接阻害する21。0.1 mL / kgのOA静脈内注射は、肺組織のうっ血と腫れを引き起こし、肺胞中隔が肥厚して肺胞腔が減少し、炎症性血球数と赤血球数が増加しました22。また、OAは肺の内皮細胞および上皮細胞のアポトーシスおよび壊死を誘導した15。マウスの気管内におけるトリスオレイン酸溶液の注射は、刺激後6時間という早い時期に好中球浸潤および浮腫を増強した23。24時間でのOA注射は、炎症性サイトカインレベル(すなわち、TNF-α、IL-6、およびIL-1β)を増加させました23。さらに、10 μMのトリスオレイン酸の静脈内(眼窩神経叢)注射は、選択的酵素阻害剤である10-3 μMのウアバインと同様に、肺Na/K-ATPase活性を阻害します。また、OAは細胞浸潤、脂質体の形成、ロイコトリエンB4(LTB4)およびプロスタグランジンE2(PGE2)の産生を伴う炎症を誘発する22,24。したがって、オレイン酸誘発性ARDSは、浮腫、出血、好中球浸潤、ミエロペルオキシダーゼ(MPO)活性の増加、およびROS24を生成します。したがって、OA投与は肺損傷の確立されたモデルです22,25。この記事で紹介したOAを含むすべての結果は、塩の形であるオレイン酸ナトリウムを表しています。
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Protocol
この研究で使用された手順は、Oswaldo Cruz Foundation の動物の使用に関する倫理委員会 (CEUA ライセンス n°002-08、36/10 および 054/2015) によって承認されました。Oswaldo Cruz Foundation(FIOCRUZ)のInstitute of Science and Technology in Biomodels(ICTB)から提供された、体重20〜30gのオスのスイスウェブスターマウスを実験に使用しました。動物はパビリャン・オゾリオ・デ・アルメイダのビバリウムで換気された隔離装置で飼育され、水と餌は 自由に入手できました。彼らは12時間/12時間の明暗サイクルに曝露された。
1.オレイン酸ナトリウム溶液の調製
- オレイン酸を使用して、滅菌チューブまたはガラスフラスコに100 mmol/Lのオレイン酸ナトリウムストック溶液を調製します。
注:本研究のために50 mL(最終容量)の溶液を調製しましたが、実験の必要性に応じて容量を調整する必要があります。溶液は常に滅菌チューブまたはガラス容器で調製する必要があります。- まず、超純水にNaOH錠剤または溶液を加えてpHを上昇させます。12-13のpH値は25 mLの容量のために推薦される。
注:あるいは、トリス塩基を使用して、トリスオレイン酸溶液を調製することもできます。 - オレイン酸( 材料表参照)を、37°Cの超音波浴中で常に攪拌しながら、非常にゆっくりと一滴ずつ加えます。
注意: オレイン酸の沈殿が発生した場合は、最初からやり直してください。 - オレイン酸が完全に溶解したら、超高純度の希釈HClで攪拌しながらpHを7.4に慎重に調整し、最終容量の50 mLに調整します。
注:作業用オレイン酸溶液を新たに調製します。あるいは、溶液を分注し、貯蔵し、窒素富化環境で-20°Cに維持して、1か月以内の酸化を回避することもできます。凍結-再凍結サイクルは避けてください。
- まず、超純水にNaOH錠剤または溶液を加えてpHを上昇させます。12-13のpH値は25 mLの容量のために推薦される。
2. オレイン酸による肺障害の誘発
- オレイン酸の気管内投与を行います。
- 獣医用麻酔薬気化器を用いて、5%イソフルランと2L/minのO2 を用いてマウスを麻酔した(図1A)。切開部の毛皮を脱毛クリームで取り除き、滅菌ガーゼを使用してベタジンスクラブとアルコールを交互に3回繰り返してその部分を消毒します。つま先つまみで麻酔の深さを確認します。
注意: 手順中は滅菌手袋と器具を使用してください。ドレープを使用して動物を覆い、切開部位のみを露出させます。イソフルオランが環境に漏れないように、生物学的安全キャビネットで実験を行ってください。鎮痛薬は炎症反応を阻害する可能性があるため、投与されません。 - 麻酔後、動物を背側褥瘡の位置に横たえ、甲状腺レベルでV字型に切開(0.5〜1 cm)します。甲状腺を静かに移動させて気管を露出させ(図1B)、調製したオレイン酸溶液50μLを注入します(ステップ1)。
注:マウスを2つのグループに分け、各グループに8匹ずつ配置しました。肺損傷群には25 mM(1.25 μmol)のオレイン酸ナトリウム溶液を投与し、対照群にはインスリン注射器(容量300 μL、30 G)を各マウスの気管に点滴注入して50 μLの滅菌生理食塩水を投与しました(図1C)。 - マウスの切開部位を合成非吸収性モノフィラメント縫合糸で縫合し、ケージに戻し、手術から完全に回復するまで観察します。すべての手順の間、動物を37°Cの加熱パッドの上に維持してください。
注:マウスは通常、手術から回復するまでに最大15分かかります。
- 獣医用麻酔薬気化器を用いて、5%イソフルランと2L/minのO2 を用いてマウスを麻酔した(図1A)。切開部の毛皮を脱毛クリームで取り除き、滅菌ガーゼを使用してベタジンスクラブとアルコールを交互に3回繰り返してその部分を消毒します。つま先つまみで麻酔の深さを確認します。
- オレイン酸の静脈内投与を行う。
- 麻酔後(ステップ2.1.1、 図2A)、眼窩の内側カンサスに極細針( 資料表を参照)を挿入して眼窩神経叢に静脈内注射します(図2B)。
注:マウスを2つのグループに分け、各グループに8匹ずつ配置しました。各群は、100 μLのオレイン酸ナトリウム溶液を10 μmolのOAで投与し、対照群は100 μLの滅菌生理食塩水を投与します。
- 麻酔後(ステップ2.1.1、 図2A)、眼窩の内側カンサスに極細針( 資料表を参照)を挿入して眼窩神経叢に静脈内注射します(図2B)。
- 手術後、動物に副作用がないか毎日監視してください。安楽死の人道的エンドポイントには、副作用、痙攣、昏睡が含まれます。
3.気管支肺胞洗浄液採取(BALF)
- 致死量のケタミン(300 mg / Kg)およびキシラジン(30 mg / Kg)の腹腔内投与でマウスを安楽死させます( 材料表を参照)。
- 動物を背側褥瘡の位置に横たえ、動物の前部を外科用ハサミで約1cm切開し、気管を露出させ、静脈内カテーテル(20 G)を導入するために小さな切り込みを入れます。
- カテーテルを1mLの滅菌シリンジに接続し、0.5mLの滅菌生理食塩水をゆっくりと徐々に肺に注入し、同じシリンジでBALFから液体を吸引します。それを3〜5回繰り返し、滅菌マイクロチューブに移し、氷に入れます。
注:サンプルは-20°Cで最大6か月間保存できます。
4. BALFにおける全細胞・差分細胞解析
- 総細胞数については、20 μL の BALF を 180 μL(10 倍希釈)のターク溶液で希釈します( 材料表を参照)。ノイバウアーチャンバーを使用して、40倍の対物レンズを備えた光学顕微鏡で計数を行います。
- 差分カウントについては、スライドを含む細胞漏斗にBALF100 μLを入れ、細胞遠心分離機で22.86 x g で4°Cで5分間遠心分離し、May-Grunwald(15%、pH 7.2)-Giemsa(1:10)で染色します( 材料表を参照)。浸漬対物レンズを備えた光学顕微鏡で細胞数を進めます。
5. BALFにおける総タンパク質の測定
- 市販のタンパク質定量キットで総BALF上清タンパク質を測定し、メーカーの指示に従って分光光度計を使用して562 nmでの吸光度を読み取ります( 材料表を参照)。
6. 酵素免疫吸着アッセイ
- BALF を 1,200 x g で 4 °C で 10 分間遠心分離します。 次に、ピペットで上清を回収し、TNF-α、IL-1β、IL-6、およびPGE2 15,23,25のアッセイのために-80°Cで保存します。
注:ステップ6.1の遠心分離により、BALFは無細胞になります。- メーカーの指示に従って、市販のELISAキットを使用して無細胞BALFでサイトカインアッセイを実施します。メーカーの指示に従って、酵素免疫測定法(EIA)キットを使用してPGE2アッセイを実施します( 材料表を参照)。
7. 脂質体の染色と計数
- Ca 2+、Mg 2+遊離のハンク緩衝塩溶液(HBSS、pH 7.4)中の3.7%ホルムアルデヒドを使用してサイトスピンスライド上の白血球を固定し、湿ったまま1.5%OsO 4で染色します3(材料表を参照)。次に、顕微鏡の油浸対物レンズを使用して、各スライドから50個の連続した白血球の細胞あたりの脂質体をカウントします。
8. 統計解析
- グラフ作成および統計ソフトウェアを使用して統計分析を実行します( 材料表を参照)。結果を平均±SEMとして表し、一元配置分散分析とそれに続く検定後のNewman-Keuls-Student26で分析します。 P が 0.05 の場合の有意な差<考えます。
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Representative Results
損傷を受けていない肺では、肺胞液のクリアランスは、無傷の肺胞上皮層を通るイオンの輸送によって発生します。浸透圧勾配は、肺胞から肺間質に液体を運び、そこでリンパ管によって排出されるか、再吸収されます。Na/K-ATPaseは、この輸送11を駆動する。OAはNa/K-ATPase27とナトリウムチャネル21の阻害剤であり、すでに示唆したように浮腫形成に寄与する可能性がある23。ARDSの炎症反応の悪化は、肺胞の損傷、内皮および上皮透過性の増加、およびタンパク質および炎症細胞に富む肺胞液の蓄積につながり、浮腫を引き起こします。浮腫は、間質液とガス交換障害の蓄積により肺の呼吸数を増加させ、低酸素血症と呼吸不全を引き起こします28。TNF-αや血管内皮増殖因子(VEGF)などのサイトカインは、VE-カドヘリン結合を不安定にし、内皮透過性の増加と肺胞液の蓄積に寄与します7。
OA注射は、気管内および静脈内経路の総白血球を増加させました(図3)。肺損傷に対するOAは、気管内経路ではなく静脈内経路で誘導する必要がありました。本研究では、6時間でBALFの好中球数が増加し、24時間でピークに達し、48時間と72時間で減少することが示されました。BALFにおけるIL-6、IL-1β、およびTNF-αの高濃度は、OA気管内点滴の24時間後に観察されました23(図4)。OAは浮腫のクリアランスを防ぎ、静脈内経路と気管内経路の両方によってタンパク質が豊富な浮腫の形成を引き起こす可能性があります15,23。肺浮腫は、BALFの総タンパク質アッセイによって評価され、静脈内投与およびIT投与が総タンパク質濃度を増加させることを示しました(図5)。脂質体は、エイコサノイド産生の基質と酵素を含む細胞内小器官です8,29。脂質体の形成は脂質メディエーターの産生を促進し、細胞の活性化にアクセスするために使用できます。気管内および静脈内OA注射により、24時間後の脂質体の形成とPGE2濃度23が増強されました(図6)。また、OA注射は、ヘマトキシリンおよびエオシン(H&E)染色の組織型に示されているように、気管内および静脈内経路における組織破壊、出血、および白血球浸潤を誘発しました(図7)。また、OAは肺機能の変化を引き起こす19。したがって、オレイン酸誘発性肺損傷は多くのARDSの特徴を示します。
図1:気管内投与プロトコルの個々のステップ 。 (A)マウスに5%イソフルオランと2L/minのO2を用いて麻酔をかける。(B)背側褥瘡位のマウスにおける外科的ハサミによる気管切開。(C)インスリン注射器を使用した気管内点滴。BioRender.com で作成。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
図2:静脈内投与プロトコルの個々のステップ 。 (A)マウスに5%イソフルオランと2L/minのO2で麻酔をかけます。(B)内側カンサスによるインスリン注射器を使用した静脈内注射。BioRender.com で作成。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
図3:OAの投与はマウスのBALFに白血球の活性化を誘導する。 静脈内投与(i.v)および気管内投与(i.t)(A)およびMay-Grünwald-Giemsa(B)で染色された気管内投与(i.t.)における説明用顕微鏡写真(倍率1000倍)の総白血球は、OAチャレンジの24時間後に実施されました。スケールバー = 10 μm。同量の滅菌生理食塩水を対照群に投与した。各バーは、少なくとも7匹の動物の平均±SEMを表します。*対照 群と比較したP<0.05。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
図4:OAの気管内投与(i.t)は、マウスの肺に炎症性メディエーターの産生を誘導する。 TNF-α(A)、IL-6(B)、IL-1β(C)は、チャレンジの24時間後に測定されました。滅菌生理食塩水を対照群に投与した。各バーは、少なくとも6匹の動物のSEM±平均値を表しています。*対照 群と比較したP<0.05。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
図5:OA注射後24時間後のBALFの総タンパク質含有量。 OAの気管内投与(i.t.)および静脈内投与(i.v.)は、マウスのBALFの総タンパク質を増加させる。対照群は、同じ量の滅菌生理食塩水を受け取りました。結果は、少なくとも6つの異なる動物からのSEM±手段です。*対照群と比較し< 0.0001。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
図6:OA処理マウスの白血球における脂質体形成とBALFにおけるPGE2 産生。 OAの気管内投与(i.t)および静脈内投与(i.v)は、それぞれマウス(A)および(B)のBALFにおける炎症性メディエーターおよび脂質体の蓄積を誘導する。(C)OAチャレンジの24時間後に四酸化オスミウム(OsO4)で動物の肺に染色した脂質体(倍率1000倍)の説明顕微鏡写真。矢印は脂質体を指しています。スケールバー = 10 μm。対照群には、同じ量の生理食塩水を投与した。結果は、7匹の動物からのSEM±平均です。*対照群と比較し< 0.05P。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
図7:マウスの肺組織学の例示 。 (A)生理食塩水で処理し、出血の兆候がない対照マウス。(B)OA(i.v)の静脈内投与。(C)組織の変化を伴う気管内投与(i.t)。H&E染色を行った。倍率、1000倍。スケールバー = 50 μm。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
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Discussion
前臨床試験を実施するには、正しいARDSモデルを選択することが不可欠であり、評価者は、年齢、性別、投与方法など、考えられるすべての変数を考慮する必要があります6。選択したモデルは、敗血症、脂質塞栓症、肺血管系の虚血再灌流、およびその他の臨床リスクなどの危険因子に基づいて疾患を再現する必要があります14。しかし、ARDSに用いられた動物モデルでは、ヒト症候群のすべての特徴を再現することはできません。LPS、OA、塩酸、細菌、ウイルスなど、複数の傷害剤モデルがあります6。また、より一般的には、気管内、鼻腔内、または静脈内など、さまざまな投与方法が使用されます。肺虚血再灌流モデルは、毛細血管の破裂と肺胞内タンパク質の蓄積を引き起こします6。LPS誘発性肺損傷は広く使用されており、上皮および内皮バリアの急性損傷を引き起こします。LPSは気道上皮のToll様受容体4(TLR-4)に結合し、NF-κBの活性化を引き起こし、サイトカインとケモカインの産生を促進し、炎症細胞を誘引し30、強力な好中球性肺胞炎を引き起こす6。しかし、このモデルでは、動物の系統や種によってばらつきがあり、ARDS30のヒト患者では、動物における結果の再現性が低下している。
HCl傷害モデルは、酸性含量吸引によってARDSを模倣します。肺のpHが低いと、急性炎症反応が誘発され、その後、晩発性線維化傷害が起こります。損傷は好中球に依存し、肺胞出血、浮腫、および体液クリアランス障害を引き起こします。しかし、ヒトはHClだけでなく、pHがしばしば1.531を超える複雑な胃内容物を吸引します。これらおよびその他のARDSモデルは、他の場所で広範囲にレビューされています31。使用されるすべてのモデルの中で、オレイン酸誘発ARDSモデルは最も理想的な14です。
オレイン酸ナトリウムモデルは、肺の損傷を引き起こし、肺胞細胞のアポトーシスと壊死を誘導し、TNFα、IL-8、IL-6、IL-1β、MIP-1αなどのサイトカイン産生を増強します19。OAはまた、プロテアーゼとエラスターゼの発現を誘発し、出血は重度の肺損傷を引き起こします25。OAは、脂質塞栓症、肺血管透過性の増加、およびX線写真による血管外液浸潤により、この疾患を再現する32。また、ARDSの患者は血漿OA濃度が高い15,22,24。
OA気管内投与は、臨床ARDSと同様に炎症性メディエーターの産生を誘導し、肺コンプライアンスとガス交換を低下させます25,32。OA静脈内注射は、疾患の組織形態学的および生理学的側面を促進する32。血清アルブミンは強力なOAリガンドであり、この経路が肺損傷を誘発するために気管内(1.25 μmol)23よりも高い量のOA(10 μmol)15を必要とする理由を説明することができます。実際、私たちのグループは、レプトスピラ症患者におけるOA/アルブミンの不均衡と死亡リスクの上昇との間に相関関係があることを示しました33。
他のすべてのモデルと同様に、このモデルにはいくつかの欠点があります。オレイン酸は、塩の形で投与しない場合、血液乳化による毒性作用や変動を引き起こす可能性があります。この記事で実証したように、その塩の形態を使用すると、毒性の影響が減少し、塞栓形成と血液と肺のpH変動という2つの問題を回避できます。また、肺の損傷がオレイン酸によって引き起こされ、二次的効果によって引き起こされないことを保証します15。さらに、このモデルにおける塩形態のオレイン酸の調製は、アルブミンとの結合を必要としない。研究によると、アルブミンは炎症と血管透過性の軽減に有益な効果があります。さらに、アルブミンは肺損傷患者の血行動態と呼吸を回復させます。したがって、アルブミンをOAと結合させると、動物への影響が損なわれ、モデルの生存率が低下する可能性があります33,34。
分子レベルでは、オレイン酸ナトリウムはナトリウム-カリウムATPアーゼ(NKA)とナトリウムチャネル(eNac)を阻害し、イオン輸送を損ない、血管透過性と浮腫形成を増加させます15。また、OAは遊離脂肪酸受容体1(FFAR1)に結合し、細胞内Ca2+ 濃度を上昇させ、PI3KやMAPKなどのキナーゼシグナル伝達タンパク質を誘発し、活性化B細胞の核因子κ-軽鎖-エンハンサー(NF-κB)活性化をもたらし、炎症反応を増強する25。
要約すると、ARDSの特徴を完全に再現できるモデルはありませんが、ARDSは疾患を研究するための貴重なツールです。前臨床研究は、ARDSの病態生理学を理解し、新しい治療法を開発する上で非常に重要です。OAの気管内および静脈内投与は、塩の形で、信頼性と再現性のあるARDSモデルを生成し、ARDSを研究するためのゴールデンモデルになります。
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Disclosures
著者らは、利益相反がないことを宣言します。
Acknowledgments
この研究は、Instituto Oswaldo Cruz、Fundação Oswaldo Cruz(FIOCRUZ)、Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) Grant 001、Programa de Biotecnologia da Universidade Federal Fluminense (UFF)、Universidade Federal do Estado do Rio de Janeiro (UNIRIO)、Fundação Carlos Chagas Filho de Amparo à Pesquisa do Estado do Rio de Janeiro (FAPERJ) によって資金提供されました。 Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico(CNPq)です。図 1 と 図 2 は BioRender.com で作成されています。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anesthetic vaporizer | SurgiVet | model 100 | |
| Braided slik thread with needle number 5 | Shalon medical | N/A | |
| Cabinet vivarium | Insight | Model EB273 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5430/5430R | |
| Cytofunnel | ThermoFisher | 11-025-48 | |
| Drontal puppy | Bayer | N/A | |
| Hank's balanced Salts | Sigma-Aldrich | H4981 | |
| Heatpad | tkreprodução | TK-500 | |
| Hydrocloric Acid | Sigma-Aldrich | 30721 | |
| Insulin syringe Ultrafine | BD | 328322 | |
| Isoforine 1mL/mL | Cristália | N/A | |
| Ketamine | Syntec | N/A | |
| May-Grunwald-Giemsa | Sigma-Aldrich | 205435 | |
| Micro BCA Protein Assay Kit | ThermoFisher | 23235 | |
| Microscope PrimoStar | Carl Zeiss | ||
| Mouse IL-1 beta duoSet ELISA | R&D system | DY401 | |
| Mouse IL-6 duoSet ELISA | R&D system | DY406 | |
| Mouse TNF-alpha duoSet ELISA | R&D system | DY410 | |
| Neubauer chamber improved bright-line | Global optics | ||
| Oleic Acid (99%) | Sigma-Aldrich | O1008 | |
| Osmium tetroxide solution (4%) | Sigma-Aldrich | 75632 | |
| Peripheral Intravenous Catherter 20 G | BD Angiocath | 388333 | |
| Prism 8 (graphic and statistic software) | Graphpad | N/A | |
| Prostaglandin E2 ELISA Kit -Monoclonal | Cayman Chemical | 514010 | |
| Shandon Cytospin 3 | ThermoFisher | N/A | |
| Sodium hydroxide | Merck | 1,06,49,81,000 | |
| Spectrophotometer | Molecular Devices | SpectraMax ABS plus | |
| Swiss webster mice | ICTB/FIOCRUZ | N/A | |
| Syringe 1 mL | BD | 990189 | |
| Tris-base | Bio Rad | 161-0719 | Electrophoresis purity reagent |
| Türk's solution | Sigma-Aldrich | 93770 | |
| Xilazine | Syntec | N/A |
References
- Ashbaugh, D. G., Bigelow, D. B., Petty, T. L., Levine, B. E.
- The ARDS Definition Task Force. Acute respiratory distress syndrome: The Berlin definition. JAMA. 307 (23), 2526-2533 (2012).
- Hewitt, R. J., Lloyd, C. M. Regulation of immune responses by the airway epithelial cell landscape. Nature Reviews Immunology. 21 (6), 347-362 (2021).
- Zepp, J. A., Morrisey, E. E. Cellular crosstalk in the development and regeneration of the respiratory system. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 20 (9), 551-566 (2019).
- Millar, F. R., Summers, C., Griffiths, M. J., Toshner, M. R., Proudfoot, A. G. The pulmonary endothelium in acute respiratory distress syndrome: insights and therapeutic opportunities. Thorax. 71 (5), 462 (2016).
- D'Alessio, F. R. Mouse models of acute lung injury and ARDS. Methods in Molecular Biology. 1809, 341-350 (2018).
- Corada, M., et al. Vascular endothelial-cadherin is an important determinant of microvascular integrity in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (17), 9815-9820 (1999).
- Bozza, P. T., et al. Leukocyte lipid body formation and eicosanoid generation: cyclooxygenase-independent inhibition by aspirin. PNAS. 93 (20), 11091-11096 (1996).
- Mikacenic, C., et al. Interleukin-17A is associated with alveolar inflammation and poor outcomes in acute respiratory distress syndrome. Critical Care Medicine. 44 (3), 496-502 (2016).
- Matthay, M. A., et al.
- Huppert, L. A., Matthay, M. A., Ware, L. B. Pathogenesis of acute respiratory distress syndrome. Seminars in Respiratory and Critical Care Medicine. 40 (1), 31-39 (2019).
- Matthay, M. A., McAuley, D. F., Ware, L. B. Clinical trials in acute respiratory distress syndrome: challenges and opportunities. The Lancet Respiratory Medicine. 5 (6), 524-534 (2017).
- Fan, E., Brodie, D., Slutsky, A. S. Acute respiratory distress syndrome: advances in diagnosis and treatment. JAMA. 319 (7), 698-710 (2018).
- Matute-Bello, G., Frevert, C. W., Martin, T. R. Animal models of acute lung injury. The American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 295 (3), 379-399 (2008).
- Gonçalves-de-Albuquerque, C. F., et al. Oleic acid inhibits lung Na/K-ATPase in mice and induces injury with lipid body formation in leukocytes and eicosanoid production. Journal of Inflammation. 10 (1), Lond. 34 (2013).
- Matthay, M. A., Ware, L. B., Zimmerman, G. A. The acute respiratory distress syndrome). Journal of Clinical Investigation. 122 (8), 2731-2740 (2012).
- Wang, H. M., Bodenstein, M., Markstaller, K. Overview of the pathology of three widely used animal models of acute lung injury. European Surgical Research. 40 (4), 305-316 (2008).
- Moriuchi, H., Zaha, M., Fukumoto, T., Yuizono, T. Activation of polymorphonuclear leukocytes in oleic acid-induced lung injury. Intensive Care Medicine. 24 (7), 709-715 (1998).
- Julien, M., Hoeffel, J. M., Flick, M. R. Oleic acid lung injury in sheep. Journal of Applied Physiology. 60 (2), 433-440 (1986).
- Hofman, W. F., Ehrhart, I. C. Permeability edema in dog lung depleted of blood components. Journal of Applied Physiology. 57 (1), 147-153 (1984).
- Vadász, I., et al. Oleic acid inhibits alveolar fluid reabsorption: a role in acute respiratory distress syndrome. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 171 (5), 469-479 (2005).
- Tenghao, S., et al. Keratinocyte growth factor-2 reduces inflammatory response to acute lung injury induced by oleic acid in rats by regulating key proteins of the wnt/β-catenin signaling pathway. Evidence-Based Complementary and Alternative. 2020, 8350579 (2020).
- Gonçalves-de-Albuquerque, C. F., et al. Oleic acid induces lung injury in mice through activation of the ERK pathway. Mediators of Inflammation. 2012, 956509 (2012).
- Huang, H., et al. Dipyrithione attenuates oleic acid-induced acute lung injury. Pulmonary Pharmacology & Therapeutics. 24 (1), 74-80 (2011).
- Goncalves-de-Albuquerque, C. F., Silva, A. R., Burth, P., Castro-Faria, M. V., Castro-Faria-Neto, H. C. acute respiratory distress syndrome: role of oleic acid-triggered lung injury and inflammation. Mediators of Inflammation. 2015, 260465 (2015).
- McHugh, M. L. Multiple comparison analysis testing in ANOVA. Biochemia Medica (Zagreb). 21 (3), 203-209 (2011).
- Swarts, H. G. P., Schuurmans Stekhoven, F. M. A. H., De Pont, J. J. H. H. M. Binding of unsaturated fatty acids to Na+,K+-ATPase leading to inhibition and inactivation. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 1024 (1), 32-40 (1990).
- Swenson, K. E., Swenson, E. R. Pathophysiology of acute respiratory distress syndrome and COVID-19 lung injury. Critical Care Clinics. 37 (4), 749-776 (2021).
- Bozza, P. T., Magalhães, K. G., Weller, P. F. Leukocyte lipid bodies - Biogenesis and functions in inflammation. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Molecular and Cell Biology of Lipids. 1791 (6), 540-551 (2009).
- Chen, H., Bai, C., Wang, X. The value of the lipopolysaccharide-induced acute lung injury model in respiratory medicine. Expert Review of Respiratory Medicine. 4 (6), 773-783 (2010).
- Martin, T. R., Matute-Bello, G. Experimental models and emerging hypotheses for acute lung injury. Critical Care Clinics. 27 (3), 735-752 (2011).
- Schuster, D. P. ARDS: clinical lessons from the oleic acid model of acute lung injury. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 149 (1), 245-260 (1994).
- Martins, C. A., et al. The relationship of oleic acid/albumin molar ratio and clinical outcomes in leptospirosis. Heliyon. 7 (3), 06420 (2021).
- Yu, M. -yal, et al. Hypoalbuminemia at admission predicts the development of acute kidney injury in hospitalized patients: A retrospective cohort study. PLOS ONE. 12 (7), 0180750 (2017).
