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Biochemistry

बड़े पैमाने पर संवेदनशील कण ट्रैकिंग झिल्ली-संबद्ध Macromolecule Dynamics को चिह्नित करने के लिए

Published: February 18, 2022 doi: 10.3791/63583
Automatic Translation
1,2, 1, 3, 1
1Department of Cellular and Molecular Biophysics, Max Planck Institute of Biochemistry, 2Department of Physics, Technical University Munich, 3Department of Cellular Physiology, Biomedical Center (BMC), Ludwig-Maximilians-Universität München

Summary

यह प्रोटोकॉल एक iSCAT-आधारित छवि प्रसंस्करण और एकल-कण ट्रैकिंग दृष्टिकोण का वर्णन करता है जो आणविक द्रव्यमान की एक साथ जांच और लिपिड झिल्ली के साथ बातचीत करने वाले मैक्रोमोलेक्यूल्स के विसर्पण व्यवहार को सक्षम बनाता है। नमूना तैयारी, मास-टू-कंट्रास्ट रूपांतरण, फिल्म अधिग्रहण और पोस्ट-प्रोसेसिंग के लिए चरण-दर-चरण निर्देश संभावित नुकसान को रोकने के लिए दिशाओं के साथ प्रदान किए जाते हैं।

Abstract

लिपिड झिल्ली पर और उसके साथ मैक्रोमोलेक्यूल्स की अल्पकालिक या क्षणिक बातचीत, एक इंटरफ़ेस जहां आवश्यक जैविक प्रतिक्रियाओं की एक भीड़ होती है, मानक बायोफिजिकल तरीकों के साथ मूल्यांकन करना स्वाभाविक रूप से मुश्किल होता है। बड़े पैमाने पर संवेदनशील कण ट्रैकिंग (MSPT) की शुरूआत इस तरह की प्रक्रियाओं के एक पूरी तरह से मात्रात्मक लक्षण वर्णन की दिशा में एक महत्वपूर्ण कदम का गठन करती है। तकनीकी रूप से, यह इंटरफेरोमेट्रिक स्कैटरिंग माइक्रोस्कोपी (आईएससीएटी) -आधारित मास फोटोमेट्री (एमपी) के आगमन के माध्यम से संभव बनाया गया था। जब पृष्ठभूमि हटाने की रणनीति को झिल्ली से जुड़े कणों की दो-आयामी गति को प्रकट करने के लिए अनुकूलित किया जाता है, तो यह तकनीक जैविक झिल्ली पर बिना लेबल वाले मैक्रोमोलेक्यूल्स के प्रसार और आणविक द्रव्यमान दोनों के वास्तविक समय के विश्लेषण की अनुमति देती है। यहां, झिल्ली से जुड़े सिस्टम के बड़े पैमाने पर संवेदनशील कण ट्रैकिंग को करने और विश्लेषण करने के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल का वर्णन किया गया है। एक वाणिज्यिक द्रव्यमान फोटोमीटर पर किए गए माप मिलीसेकंड शासन में समय संकल्प प्राप्त करते हैं और, एमपी सिस्टम के आधार पर, 50 केडीए तक एक द्रव्यमान का पता लगाने की सीमा। सामान्य रूप से झिल्ली-उत्प्रेरित मैक्रोमोलेक्यूल गतिशीलता के गहन विश्लेषण के लिए एमएसपीटी की क्षमता का प्रदर्शन करने के लिए, देशी झिल्ली इंटरैक्टर एनेक्सिन वी जैसे अनुकरणीय प्रोटीन प्रणालियों के लिए प्राप्त परिणाम प्रस्तुत किए जाते हैं।

Introduction

एक बार केवल परिवेशी भौतिक स्थितियों की विस्तृत श्रृंखला के खिलाफ एक बाधा के रूप में माना जाता है, जैविक झिल्ली को आजकल कार्यात्मक संस्थाओं और उत्प्रेरक प्लेटफार्मों 1,2 माना जाता है। झिल्ली से जुड़े मैक्रोमोलेक्यूल प्रतिक्रियाओं के जवाब में स्थानीयकरण, प्रवर्धित और प्रत्यक्ष संकेतों की उनकी क्षमता के आधार पर, लिपिड इंटरफेस झिल्ली तस्करी और सिग्नलिंग कैस्केड 3,4,5 जैसी विभिन्न प्रकार की सेलुलर प्रक्रियाओं के लिए एक महत्वपूर्ण तत्व का गठन करते हैं। स्थिर परिसरों की असेंबली के लिए एक न्यूक्लिएशन साइट के रूप में कार्य करते हुए, झिल्ली अनुलग्नक अक्सर मैक्रोमोलेक्यूल्स के झिल्ली से जुड़े और साइटोसोलिक रूपों के बीच एक गतिशील संतुलन पर निर्भर करता है और इसलिए क्षणिक प्रकृति 6,7 का होता है।

जीव विज्ञान में उनके महान महत्व के बावजूद, यह अब तक उन तरीकों को विकसित करने के लिए चुनौतीपूर्ण रहा है जो वास्तविक समय 7,8 में झिल्ली से जुड़े मैक्रोमोलेक्यूल प्रतिक्रियाओं की रचनात्मक, स्थानिक और अस्थायी विषमताओं तक पहुंच प्रदान कर सकते हैं। अंतर्निहित आणविक प्रक्रियाओं को हल करने के लिए, दो प्रयोगात्मक पहलू निर्णायक हैं: पर्याप्त समय संकल्प और एकल-कण संवेदनशीलता। इसलिए, कलाकारों की टुकड़ी औसत तकनीकों जैसे कि फोटोब्लीचिंग (एफआरएपी) के बाद प्रतिदीप्ति वसूली, लेकिन बहुत अधिक संवेदनशील प्रतिदीप्ति सहसंबंध स्पेक्ट्रोस्कोपी (एफसीएस) की सीमाएं भी हैं, क्योंकि वे काफी हद तक अस्थायी जानकारी9 से स्थानिक जानकारी को अनकपल करते हैं। व्यक्तिगत अणु गतिशीलता के लक्षण वर्णन की दिशा में एक महत्वपूर्ण कदम इस प्रकार अत्यधिक संवेदनशील माइक्रोस्कोपी के साथ संयोजन में एकल-कण ट्रैकिंग (एसपीटी) का आगमन रहा है। विशेष रूप से, दो एसपीटी दृष्टिकोण इस संबंध में प्रभावी साबित हुए हैं। सबसे पहले, लेबल के रूप में फ्लोरोफोरस के उपयोग और इसी प्रतिदीप्ति का पता लगाने वाली प्रणालियों ने नैनोमीटर परिशुद्धता और मिलीसेकंड समय रिज़ॉल्यूशन10,11,12 के लिए मार्ग प्रशस्त किया। दूसरे, सोने के नैनोकणों का उपयोग करके प्रकीर्णन-आधारित पता लगाने ने स्थानीयकरण परिशुद्धता और समय रिज़ॉल्यूशन दोनों में सुधार किया उप-नैनोमीटर और माइक्रोसेकंड रेंज, क्रमशः 13,14,15,16। दोनों दृष्टिकोणों के कई फायदों और झिल्ली से जुड़े प्रणालियों17,18 की यांत्रिक समझ के बारे में उनके महत्वपूर्ण योगदान के बावजूद, दोनों तकनीकों को अब तक सीमित किया गया है: उन्हें ब्याज के अणुओं के लेबलिंग की आवश्यकता होती है, जो संभावित रूप से उनके मूल व्यवहार को परेशान करता है और झिल्ली से जुड़े कणों की आणविक संरचना के प्रति असंवेदनशील हैं19,20।

इन दोनों सीमाओं को हाल ही में एक उपन्यास इंटरफेरोमेट्रिक स्कैटरिंग (आईएससीएटी) -आधारित दृष्टिकोण की शुरूआत से दूर कर दिया गया है जिसे मास फोटोमेट्री (एमपी) 21,22,23 कहा जाता है। यह तकनीक ग्लास इंटरफ़ेस पर उतरते समय बायोमोलेक्यूल्स के इन-सॉल्यूशन मास डिस्ट्रीब्यूशन के निर्धारण को उनके आईएससीएटी कंट्रास्ट के अनुसार अनुमति देती है। हालांकि, लिपिड झिल्ली पर अलग-अलग मोबाइल अणुओं का पता लगाने और लक्षण वर्णन के लिए, एक अधिक परिष्कृत छवि विश्लेषण दृष्टिकोण विकसित किया जाना था। यह इस बीच सफलतापूर्वक लागू किया गया है और एक लिपिड इंटरफ़ेस24,25 पर अलग-अलग एकल लेबल वाले बायोमोलेक्यूल्स के आणविक द्रव्यमान का पता लगाने, ट्रैक करने और निर्धारित करने की अनुमति देता है। गतिशील द्रव्यमान फोटोमेट्री या द्रव्यमान-संवेदनशील कण ट्रैकिंग (MSPT) के रूप में संदर्भित, यह तकनीक अब ट्रैक की गई संस्थाओं के आणविक द्रव्यमान में परिवर्तनों को सीधे रिकॉर्ड करके जटिल मैक्रोमोलेक्यूल इंटरैक्शन के मूल्यांकन को सक्षम बनाती है और इसलिए झिल्ली से जुड़े आणविक गतिशीलता के यांत्रिक विश्लेषण के लिए नई संभावनाओं को खोलती है।

यहां, नमूना तैयारी, इमेजिंग और MSPT के लिए आवश्यक डेटा विश्लेषण पाइपलाइन के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल प्रस्तुत किया गया है। विशेष रूप से, नमूना आवश्यकताओं और संभावित समस्याओं पर चर्चा की जाती है जो माप और विश्लेषण के दौरान हो सकती हैं। इसके अलावा, झिल्ली-बातचीत मैक्रोमोलेक्यूल सिस्टम का विश्लेषण करने की अद्वितीय क्षमता को विभिन्न प्रतिनिधि परिणामों के माध्यम से प्रदर्शित किया जाता है।

Protocol

1. नमूना तैयारी

  1. मल्टीलैमेलर पुटिकाओं का उत्पादन (एमएलवी)
    1. वांछित लिपिड मिश्रण और आवश्यक निलंबन मात्रा के अनुसार क्लोरोफॉर्म-भंग लिपिड (ओं) की मात्रा की गणना करें।
      नोट: 4 मिलीग्राम / एमएल लिपिड की एक अंतिम पुटिका एकाग्रता को पुन: निलंबन (प्रतिक्रिया) बफर के लिए अनुशंसित किया जाता है।
    2. पिपेट ग्लास युक्तियों से सुसज्जित सकारात्मक विस्थापन पिपेट्स का उपयोग करके 1.5 मिलीलीटर ग्लास शीशी में लिपिड की गणना की गई मात्रा को पिपेट करें।
    3. नाइट्रोजन की एक बेहोश धारा के तहत लिपिड विलायक को वाष्पित करें और कांच की दीवारों पर लिपिड के समान वितरण को सुनिश्चित करने के लिए लगातार शीशी को घुमाएं।
    4. 15 मिनट के लिए नाइट्रोजन की एक स्थिर धारा के तहत शीशी रखकर पूर्ण विलायक वाष्पीकरण सुनिश्चित करें।
    5. एक अतिरिक्त घंटे के लिए एक वैक्यूम desiccator में वैक्यूम सुखाने के द्वारा क्लोरोफॉर्म के अवशिष्ट निशान निकालें।
    6. वांछित resuspension (प्रतिक्रिया) बफर में लिपिड मिश्रण rehydrate और अच्छी तरह से निलंबन भंवर जब तक लिपिड फिल्म शीशी की दीवारों से भंग कर दिया गया है.
      नोट: प्रतिक्रिया बफर प्रोटीन गतिविधि और स्थिरता सुनिश्चित करना चाहिए। इस अध्ययन में उपयोग किए जाने वाले प्रतिक्रिया बफर में 50 mM Tris-HCl (pH = 7.5), 150 mM KCl, और 5 mM MgCl2 शामिल हैं। ध्यान दें कि लिपिड या प्रोटीन को पतला करने के लिए उपयोग किए जाने वाले किसी भी बफर को हस्तक्षेप करने वाले कण अशुद्धियों को हटाने के लिए फ़िल्टर करने की आवश्यकता होती है (चरण 5 देखें)।
  2. छोटे unilamellar vesicles (एसयूवी) की पीढ़ी
    1. लिपिड रीसस्पेंशन (चरण 1.1.6) के लगातार फ्रीज-पिघलने वाले चक्रों के लिए, एक गर्म प्लेट (70 डिग्री सेल्सियस से 99 डिग्री सेल्सियस के बीच) पर बीकर में 500 मिलीलीटर पानी उबालें और तरल नाइट्रोजन के साथ एक कंटेनर तैयार करें।
    2. शॉक-तरल नाइट्रोजन में लिपिड resuspension फ्रीज. गर्म पानी के साथ शीशी को बीकर में स्थानांतरित करें जब तक कि समाधान पूरी तरह से पिघल न जाए। इस फ्रीज-पिघलने वाले चक्र को 8-10 बार दोहराएं या जब तक कि पहले टर्बिड मिश्रण स्पष्ट न हो जाए।
      सावधानी: तरल नाइट्रोजन, जमे हुए लिपिड शीशी, या उबलते पानी के साथ किसी भी सीधे संपर्क को रोकने के लिए उचित सुरक्षा परिधानों और उपकरणों जैसे चश्मे, दस्ताने और चिमटी का उपयोग करें।
    3. एक monodispersed पुटिका वितरण की पीढ़ी के लिए, एक लिपिड-extruder इकट्ठा और प्रतिक्रिया बफर के साथ अपनी अखंडता का परीक्षण करने के लिए यह सुनिश्चित करने के लिए कि यह रिसाव नहीं करता है।
      नोट: यदि रिसाव मनाया जाता है, तो ध्यान से लिपिड-एक्सट्रूडर को फिर से इकट्ठा करें जब तक कि कोई बफर स्पिलिंग स्पष्ट न हो।
    4. 37 के लिए लिपिड निलंबन को बाहर निकालना 50 एनएम26 के छिद्र आकार के साथ एक न्यूक्लियोपोर झिल्ली से गुजरता है। पास की संख्या यह सुनिश्चित करने के लिए असमान होनी चाहिए कि अंतिम एसयूवी मिश्रण न्यूक्लियोपोर झिल्ली को पार कर गया है और इसलिए लिपिड समुच्चय या मल्टीलैमेलर पुटिकाओं से मुक्त है। बहिष्कृत पुटिकाओं का उपयोग बाद में समर्थित लिपिड बाईलेयर बनाने के लिए किया जाएगा (चरण 6 और 7 देखें)।
      नोट: एसयूवी भी इसी तरह rehydrated लिपिड मिश्रण के sonication द्वारा बनाया जा सकता है. हालांकि, एक्सट्रूज़न के माध्यम से तैयारी एसयूवी का एक अधिक मोनोडिस्पर्स वितरण प्रदान करती है, जो समर्थित लिपिड बाईलेयर गठन के दौरान पुटिका के टूटने की सुविधा प्रदान करती है। Extruded vesicles को रेफ्रिजरेटर में अधिकतम 3 दिनों के लिए संग्रहीत किया जा सकता है।

2. माइक्रोस्कोप स्लाइड की सफाई

  1. पॉलीटेट्राफ्लोरोएथिलीन (PTFE) माइक्रोस्कोप धारकों में 24 मिमी x 60 मिमी और 24 मिमी x 24 मिमी के आयामों के साथ माइक्रोस्कोप स्लाइड (नंबर # 1.5; 0.17 मिमी मोटाई) की समान संख्या वितरित करें।
  2. PTFE धारकों को बीकर में स्थानांतरित करें जिसमें अल्ट्राप्योर पानी होता है और उन्हें कमरे के तापमान पर 15 मिनट के लिए sonicate करें।
    नोट: बीकर के आधार पर, पानी की मात्रा को पूरी तरह से PTFE धारक को कवर करने के लिए समायोजित करने की आवश्यकता है।
  3. बीकर से धारकों को हटाने के लिए चिमटी का उपयोग करें और पानी को अल्ट्राप्योर आइसोप्रोपेनॉल के साथ बदलें। आइसोप्रोपेनोल युक्त बीकर में धारक डालें और 15 मिनट के लिए फिर से sonicate करें।
    नोट: बीकर के आधार पर, isopropanol की मात्रा को PTFE धारक को पूरी तरह से कवर करने के लिए समायोजित करने की आवश्यकता है।
  4. Ultrapure पानी के साथ isopropanol की जगह और 15 मिनट के लिए धारकों युक्त बीकर sonicate.
  5. बीकर्स से PTFE धारकों को निकालें और नाइट्रोजन गैस या संपीड़ित हवा की एक स्थिर धारा के तहत धारक में माइक्रोस्कोप स्लाइड को ब्लो-ड्राई करें।
    नोट: प्रत्येक बीकर को कवर करने के लिए दस्ताने, साफ बीकर, और पैराफिन फिल्म का उपयोग करके कवर स्लाइड की उचित सफाई सुनिश्चित करें। अन्यथा, अवशिष्ट धूल MSPT माप के दौरान महत्वपूर्ण पृष्ठभूमि उतार-चढ़ाव का कारण बन सकता है।

3. माइक्रोस्कोप स्लाइड के हाइड्रोफिलाइजेशन

नोट: एक सजातीय और तरल पदार्थ समर्थित लिपिड बाईलेयर प्राप्त करने के लिए, स्लाइड का हाइड्रोफिलाइजेशन आवश्यक है और प्रवाह कक्ष असेंबली से ठीक पहले किया जाना चाहिए।

  1. प्रक्रिया गैस के रूप में ऑक्सीजन के साथ एक प्लाज्मा क्लीनर में केवल 24 मिमी x 60 मिमी माइक्रोस्कोप स्लाइड वाले पीटीएफई धारकों को रखें और प्लाज्मा के साथ माइक्रोस्कोप स्लाइड को साफ करें (इस काम में उपयोग किए जाने वाले पैरामीटर: 30% शक्ति, 30 एस के लिए 0.3 एमबार ऑक्सीजन दबाव; उपयोग किए गए प्लाज्मा क्लीनर के विवरण के लिए सामग्री की तालिका देखें)।
    नोट: द्रव झिल्ली प्राप्त करने के लिए, प्लाज्मा सफाई पैरामीटर जैसे कि बिजली, ऑक्सीजन दबाव, और सफाई समय को प्रत्येक उपकरण के लिए समायोजित किया जाना चाहिए। इस उद्देश्य के लिए, झिल्ली तरलता सुनिश्चित करने के लिए फ्लोरोसेंटली लेबल वाले लिपिड के उपयोग की सिफारिश की जाती है, जिसे फोटोब्लीचिंग (एफआरएपी) प्रयोगों के बाद प्रतिदीप्ति वसूली के साथ परिमाणित किया जा सकताहै। यदि पैरामीटर संबंधित सेटअप के लिए अनुकूलित नहीं हैं, तो झिल्ली प्रसार कम झिल्ली तरलता के कारण बिगड़ा हो सकता है।

4. प्रवाह कक्षों की असेंबली

  1. प्रवाह कक्ष असेंबली से पहले, निम्नलिखित घटकों को तैयार रखें: साफ माइक्रोस्कोप स्लाइड (24 मिमी x 24 मिमी), हाइड्रोफिलाइज्ड माइक्रोस्कोप स्लाइड (24 मिमी x 60 मिमी), एल्यूमीनियम पन्नी, फ्लैट कार्डबोर्ड, स्केलपेल, और डबल-साइडेड टेप।
  2. एल्यूमीनियम पन्नी के साथ फ्लैट कार्डबोर्ड लपेटें।
  3. एक दूसरे के बीच पर्याप्त दूरी के साथ एल्यूमीनियम पन्नी पर साफ 24 मिमी x 24 मिमी माइक्रोस्कोप स्लाइड फैलाएं।
  4. स्लाइड्स के ऊपरी और निचले किनारों पर डबल-साइडेड टेप स्ट्रिप्स अनुलग्न करें.
  5. स्केलपेल के साथ प्रत्येक माइक्रोस्कोप स्लाइड को एक्साइज करें, जैसे कि इसे एल्यूमीनियम पन्नी से हटाया जा सकता है। नतीजतन, प्रत्येक स्लाइड में स्लाइड के ऊपरी और निचले किनारों से जुड़े डबल-साइडेड टेप की धारियां होनी चाहिए ( चित्र1 देखें)।
  6. छोटे और बड़े माइक्रोस्कोप स्लाइड के बीच एक प्रवाह पथ बनाने के लिए हाइड्रोफिलाइज्ड 24 मिमी x 60 मिमी स्लाइड के लिए दो डबल-साइडेड टेप स्ट्रिप्स के साथ 24 मिमी x 24 मिमी स्लाइड संलग्न करें।
    नोट: स्वच्छ प्रवाह कक्षों को सुनिश्चित करने के लिए, लगातार दस्ताने पहनें और सुनिश्चित करें कि वर्कबेंच धूल से मुक्त है।

5. प्रतिक्रिया buffers के निस्पंदन

  1. बाँझ 0.45 μm सेल्यूलोज एसीटेट झिल्ली के माध्यम से सभी प्रतिक्रिया buffers फ़िल्टर MSPT माप के दौरान न्यूनतम पृष्ठभूमि संकेत सुनिश्चित करने के लिए।
    नोट: यदि एटीपी जैसे न्यूक्लियोटाइड्स की उपस्थिति एक सफल प्रयोग के लिए आवश्यक है, तो पृष्ठभूमि संकेत में संभावित वृद्धि के बारे में जागरूक रहें। यह केवल न्यूनतम मात्रा का उपयोग करने की सिफारिश की जाती है जो अभी भी प्रोटीन गतिविधि सुनिश्चित करती है।

6. समर्थित लिपिड बाईलेयर (SLB) गठन

नोट: यह नेत्रहीन सफल पुटिका प्रसार और unfused vesicles के पूर्ण हटाने सुनिश्चित करने के लिए बड़े पैमाने पर फोटोमीटर पर समर्थित लिपिड बाईलेयर के गठन का प्रदर्शन करने की सिफारिश की है।

  1. आवश्यक प्रतिक्रिया बफर में 0.4 मिलीग्राम / एमएल की अंतिम एकाग्रता के लिए ताजा extruded एसयूवी (अधिक विवरण के लिए चरण 1 देखें) को पतला करें। वैकल्पिक रूप से, पुटिका टूटने को बढ़ावा देने के लिए, पुटिका निलंबन में 2 mM CaCl2 जोड़ें।
    नोट: Divalent धनायन कुछ लिपिड जैसे PiP2 के एकत्रीकरण का कारण बन सकता है। इस तरह के लिपिड युक्त मिश्रण के लिए, पुटिका टूटना या resuspension बफर में अन्य divalent धनायन को बढ़ावा देने के लिए CaCl2 का उपयोग करने से बचें। यदि प्रयोग के लिए आवश्यक हो, तो समर्थित लिपिड बाईलेयर के सफल गठन के बाद द्विसंयोजक धनायनों को जोड़ा जा सकता है।
  2. प्रवाह कक्ष (चरण 4) में पुटिका निलंबन के 50 μL फ्लश और 2 मिनट के लिए कक्ष incubate.
    नोट: बफ़र्स, पुटिकाओं, या प्रोटीन समाधान भिगोने ऊतक के एक छोटे से टुकड़े के साथ प्रवाह कक्ष के माध्यम से flushed किया जा सकता है। हालांकि, एक यांत्रिक पंप प्रणाली का उपयोग करना भी संभव है।
  3. हर बार प्रतिक्रिया बफर के 200 μL के साथ प्रवाह कक्ष के बार-बार (कम से कम तीन बार) धोने के माध्यम से unfused vesicles निकालें।
    नोट: MSPT माप के दौरान एक स्थिर पृष्ठभूमि संकेत सुनिश्चित करने के लिए पुटिकाओं को प्रवाह कक्ष से अच्छी तरह से धोया जाना चाहिए।

7. अंशांकन वक्र की पीढ़ी

नोट: पता लगाए गए कणों के विपरीत को आणविक द्रव्यमान में परिवर्तित करने के लिए, उनके संकेत को ज्ञात आकारों के प्रोटीन का उपयोग करके कैलिब्रेट करने की आवश्यकता होती है। ब्याज की प्रणाली के लिए अपेक्षित आणविक द्रव्यमान की सीमा को कवर करने के लिए मानक प्रोटीन आकार शासन को समायोजित करने की सिफारिश की जाती है।

  1. एक सिस्टीन अवशेषों के साथ मानक प्रोटीन का बायोटिनिलेशन
    1. निर्माता के निर्देशों के अनुसार मानक प्रोटीन के लिए मैलिमाइड-बायोटिन की उचित मात्रा की गणना करें।
    2. कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए मैलिमाइड-बायोटिन की निर्धारित मात्रा के साथ मानक प्रोटीन को इनक्यूबेट करें।
    3. संयुग्मित बायोटिन-प्रोटीन कॉम्प्लेक्स से असंगत मालिमाइड-बायोटिन को हटाने के लिए, ब्याज के प्रोटीन के लिए उपयुक्त कॉलम पर आकार-बहिष्करण क्रोमैटोग्राफी करें।
    4. एक ब्रैडफोर्ड परख का उपयोग कर प्रोटीन एकाग्रता निर्धारित करें.
      नोट: आगे के माप के लिए मानक प्रोटीन को स्टोर करने के लिए, तरल नाइट्रोजन में एकल-उपयोग एलीकोट में प्रोटीन को फ्रीज करें और उन्हें -80 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत करें।
  2. अंशांकन वक्र के लिए मानक प्रोटीन का मापन
    1. एक प्रवाह कक्ष में, 0.4 मिलीग्राम / एमएल एक्सट्रूडेड एसयूवी के साथ एक समर्थित लिपिड बाईलेयर तैयार करें (अधिक जानकारी के लिए चरण 1 और 6 देखें) जिसमें 0.01 मोल% (वी / वी) बायोटिनिल कैप पीई (1,2-डायोलियोइल-एसएन-ग्लिसरो-3-फॉस्फोएथेनोलामाइन-एन-कैप बायोटिनाइल) शामिल हैं।
    2. प्रवाह कक्ष में बाईलेयर के लिए 2.5 nM divalent streptavidin के 50 μL जोड़ें और 10 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
      नोट: Divalent streptavidin को व्यक्त किया गया है और Howarth et al.28 में उल्लिखित के रूप में शुद्ध किया गया है। Tetravalent streptavidin का भी उपयोग किया जा सकता है। हालांकि, द्विसंयोजक स्ट्रेप्टाविडिन का उपयोग बायोटिनिलेटेड लिपिड और मानक प्रोटीन के बीच संभावित प्रतिक्रिया स्टोइकोमेट्री को कम कर सकता है जो प्रजातियों के असाइनमेंट को सुविधाजनक बनाने के लिए बायोटिन समूह के लिए संयुग्मित होते हैं।
    3. प्रतिक्रिया बफर के 100 μL के साथ अनबाउंड divalent streptavidin निकालें।
    4. प्रवाह कक्ष में बाईलेयर के लिए 100 एनएम बायोटिन-संयुग्मित मानक प्रोटीन के 50 μL जोड़ें और 2 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
      नोट: बायोटिनाइलेशन दक्षता के आधार पर और क्या di- या tetravalent streptavidin का उपयोग किया जाता है, बायोटिन-संयुग्मित मानक प्रोटीन और स्ट्रेप्टाविडिन की इष्टतम सांद्रता भिन्न हो सकती है।
    5. चरण 8 में उल्लिखित विवरण के अनुसार MSPT माप निष्पादित करें।
      चेतावनी: इमेजिंग शर्तों को नमूना और अंशांकन मानकों दोनों के लिए समान होने की आवश्यकता है।

8. इमेजिंग

  1. SLB गठन और नमूना तैयारी
    1. जैसा कि चरण 6 में अधिक विस्तार से वर्णित है, नमूना प्रवाह कक्ष में वांछित लिपिड मिश्रण (25 μL) की एसयूवी पेश करें और एक समर्थित लिपिड बाईलेयर बनाएं। सभी unfused vesicles को हटाने के लिए प्रतिक्रिया बफर के 100 μL के साथ कक्ष (तीन बार) को अच्छी तरह से धोलें।
    2. नमूना कक्ष के लिए ब्याज के प्रोटीन के 50 μL जोड़ें।
      नोट: चूंकि MSPT एक एकल-कण विधि है, प्रोटीन एकाग्रता को अबाधित कण का पता लगाने और ट्रैकिंग की अनुमति देने के लिए पीएम से एनएम रेंज में रखा जाना चाहिए।
  2. वीडियो अधिग्रहण
    1. वांछित इमेजिंग शर्तें सेट करें जैसे कि दृश्य के क्षेत्र का आकार (FOV), फ़्रेम दर, एक्सपोज़र समय, और अधिग्रहण सॉफ़्टवेयर में अधिग्रहण समय.
      नोट: निम्नलिखित सेटिंग्स एक वाणिज्यिक द्रव्यमान फोटोमीटर पर MSPT के लिए काम करने के लिए साबित हुआ है ( सामग्री की तालिका देखें): 128 पिक्सेल x 35 पिक्सेल का FOV, 1 kHz की एक फ्रेम दर जिसके परिणामस्वरूप बाद के 5-गुना फ्रेम औसत के बाद लगभग 200 फ्रेम प्रति सेकंड, और 0.95 ms का एक्सपोजर समय।
    2. फ़ोकस को स्वचालित रूप से या मैन्युअल रूप से समायोजित करें. यदि आवश्यक हो, तो एफओवी को पार्श्व नियंत्रण का उपयोग करके एक समरूप झिल्ली के साथ एक स्थिति में ले जाएं।
    3. कोई प्रोजेक्ट फ़ोल्डर बनाएँ और चलचित्र रिकॉर्ड करना प्रारंभ करें. रिकॉर्डिंग के पूरा होने पर, अधिग्रहण सॉफ़्टवेयर द्वारा संकेतित संवाद में कोई फ़ाइल नाम निर्दिष्ट करें. फिल्म तब स्वचालित रूप से बाद के विश्लेषण के लिए एक एमपी फ़ाइल के रूप में परियोजना फ़ोल्डर में सहेजा जाता है।
      नोट: अलग-अलग झिल्ली की अखंडता और परिणामों की पुनरुत्पादकता सुनिश्चित करने के लिए विभिन्न प्रवाह कक्षों में कम से कम तीन प्रतिकृतियों को रिकॉर्ड करें। फिल्म की अवधि को पहले से सेट किया जा सकता है और प्रयोग के प्रकार पर निर्भर करता है। ज्यादातर मामलों में, 5 मिनट और 7 मिनट के बीच अधिग्रहण समय की सिफारिश की जाती है।
      चेतावनी: डिफ़ॉल्ट रूप से, वाणिज्यिक मास फोटोमीटर अधिग्रहण सॉफ़्टवेयर पर फिल्म रिकॉर्डिंग को भंडारण स्थान को कम करने के लिए सहेजे जाने से पहले संकुचित किया जाता है। हालाँकि, इस प्रोटोकॉल में वर्णित कस्टम डेटा विश्लेषण को सक्षम करने के लिए फ़ाइल संपीड़न को बंद करने की आवश्यकता है. फ़ाइल संपीड़न को बंद करने के तरीके पर विवरण निर्माता के उपयोगकर्ता मैनुअल में पाया जा सकता है।

9. डेटा विश्लेषण

नोट:: डेटा विश्लेषण पाइपलाइन दो इंटरैक्टिव Jupyter नोटबुक (MSPT analysis.ipynb, मूवी visualization.ipynb) के साथ है। नीचे उल्लिखित MSPT विश्लेषण करने के लिए आवश्यक Jupyter नोटबुक और संबंधित कस्टम-लिखित पायथन मॉड्यूल एक सार्वजनिक भंडार में उपलब्ध हैं: https://github.com/MSPT-toolkit/MSPT-toolkit। नीचे दिए गए विश्लेषण पर विस्तृत निर्देशों के लिए, पाठकों को उपरोक्त लिंक का उपयोग करके एक्सेस किए गए MSPT analysis.ipynb को संदर्भित किया जाता है।

  1. वीडियो प्रसंस्करण
    1. image_processing.mp_reader फ़ंक्शन का उपयोग करके पिक्सेल-वार पृष्ठभूमि अनुमान एल्गोरिथ्म के साथ प्रकाश के प्रमुख स्थैतिक प्रकीर्णन को निकालें।
      1. पृष्ठभूमि हटाने को लागू करने के लिए, पैरामीटर मोड के लिए continuous_median विकल्प चुनें और नोटबुक अनुभाग B.1 में स्लाइडिंग माध्यिका विंडो (window_length) के लिए एक उपयुक्त लंबाई सेट करें. वैकल्पिक रूप से, कण का पता लगाने और प्रक्षेपवक्र लिंकिंग के लिए उपयोग किए जाने वाले पृष्ठभूमि हटाने के बाद फिल्मों को सहेजें (पैरामीटर को सही करने के लिए save_processed_movies सेट करके)।
        नोट:: विंडो आकार (window_length) 101 और 2001 के बीच झिल्ली पर कण घनत्व, अपेक्षित प्रसार गुणांक, अधिग्रहण फ़्रेम दर, और आवश्यक प्रसंस्करण गति के आधार पर मानों के लिए समायोजित करें।
        चेतावनी: पृष्ठभूमि हटाने की रणनीति अच्छी तरह से काम करती है यदि झिल्ली बहुत घनी रूप से पैक नहीं होती है और यदि कणों का प्रसार पर्याप्त रूप से तेज होता है (यानी, प्रत्येक पिक्सेल अधिकांश समय कण के साथ कब्जा नहीं किया जाता है)। अन्यथा, कणों के विपरीत को व्यवस्थित रूप से कम करके आंका जाएगा क्योंकि उन्हें पृष्ठभूमि संकेत से ठीक से अलग नहीं किया जा सकता है। यह कम्प्यूटेशनल गति की लागत पर औसत खिड़की के आकार में वृद्धि के लिए क्षतिपूर्ति की जा सकती है। हालांकि, ध्यान रखें कि विंडो आकार को बहुत बड़ा सेट करना नमूना बहाव के कारण आउटपुट को नकारात्मक रूप से प्रभावित कर सकता है। संसाधित वीडियो का एक दृश्य निरीक्षण महत्वपूर्ण है।
    2. फ़ंक्शन particle_fitting.particle_fitter का उपयोग करके फिल्म भर में कणों और उनकी संबंधित स्थिति का पता लगाएं (नोटबुक अनुभाग B.2 देखें)।
      1. थ्रेशोल्ड पैरामीटर (थ्रेश; नोटबुक अनुभाग B.1 देखें) के साथ कण का पता लगाने की संवेदनशीलता को ट्यून करें, जिसका उपयोग छवि binarization द्वारा उम्मीदवार स्पॉट को हाइलाइट करने के लिए किया जाता है। स्पॉट डिटेक्शन संवेदनशीलता पर अलग-अलग थ्रेशोल्ड पैरामीटर के प्रभाव की जांच एक अलग नोटबुक (मूवी विज़ुअलाइज़ेशन.ipynb) में की जा सकती है। कण का पता लगाने के परिणाम स्वचालित रूप से चलचित्र फ़ाइल की एक उपनिर्देशिका में CSV फ़ाइलों के लिए सहेजे जाते हैं।
        नोट: थ्रेशोल्ड पैरामीटर को मनमाने ढंग से कम सेट करना (उदाहरण के लिए, उपयोग किए गए द्रव्यमान फोटोमीटर के साथ ली गई फिल्मों के लिए, 0.0005 से नीचे एक थ्रेशोल्ड पैरामीटर) की सिफारिश नहीं की जाती है क्योंकि उम्मीदवार स्पॉट नकली शोर का प्रभुत्व होगा और इसलिए प्रसंस्करण समय को लम्बा खींचेगा।
  2. पायथन पैकेज trackpy (v.0.5.0)29 का उपयोग कर trajectories में लगातार फ्रेम में कणों को लिंक करें।
    नोट:: प्रक्षेपवक्र लिंकिंग स्पॉट का पता लगाने के बाद मक्खी पर किया जाता है। नतीजतन, प्रक्षेपवक्र जानकारी वाली एक अतिरिक्त CSV फ़ाइल कण का पता लगाने वाली CSV फ़ाइल की एक उपनिर्देशिका में संग्रहीत की जाती है।
    1. प्रसार गुणांक का एक मजबूत निर्धारण सक्षम करने के लिए पैरामीटर minimum_trajectory_length (नोटबुक अनुभाग B.1 देखें) का उपयोग करके बहुत कम बिंदुओं के साथ trajectories निकालें। Trackpy कार्यों के अन्य मापदंडों के बारे में विस्तृत स्पष्टीकरण के लिए, trackpy के प्रलेखन को देखें।
  3. प्रक्षेपवक्र विश्लेषण
    1. नोटबुक अनुभाग C.1 में, nm (pixel_size) में फ़्रेम दर (frame_rate) और पिक्सेल आकार निर्दिष्ट करें, जिसका उपयोग चलचित्र अधिग्रहण के लिए किया गया था. trajectory_analysis.get_csv_files फ़ंक्शन (नोटबुक अनुभाग C.2) के साथ trackpy द्वारा दी गई प्रक्षेपवक्र जानकारी वाली CSV फ़ाइलों की एक सूची बनाएँ (चरण 9.2 देखें).
    2. साथ ही, HDF5 संग्राहक के लिए कोई आउटपुट फ़ाइल नाम निर्दिष्ट करें, जिसका उपयोग डिस्क (नोटबुक अनुभाग C.3) पर फिटिंग परिणाम संग्रहीत करने के लिए किया जाता है. नोटबुक अनुभाग C.4 में trajectory_analysis.fit_trajectories फ़ंक्शन के साथ सभी trajectories का विश्लेषण करें, जो CSV फ़ाइलों की सूची के माध्यम से पुनरावृत्ति करता है। यह फ़ंक्शन प्रत्येक प्रक्षेपवक्र के प्रसार गुणांक का अनुमान लगाने के लिए कूद दूरी वितरण (JDD) 30 और माध्य वर्ग विस्थापन (MSD) 31 विश्लेषण का उपयोग करता है।
    3. MSPT अंशांकन से प्राप्त कंट्रास्ट-मास संबंध का उपयोग करके प्रत्येक प्रक्षेपवक्र के माध्यिका कंट्रास्ट को इसके संगत द्रव्यमान में कनवर्ट करें (अनुभाग 7 देखें)। अंशांकन रेखा की ढलान (ढलान) और y-इंटरसेप्ट (ऑफसेट) निर्दिष्ट करें, जो आणविक द्रव्यमान (फ़ंक्शन trajectory_analysis.apply_calibration; नोटबुक अनुभाग C.5 देखें) से iSCAT कंट्रास्ट से संबंधित है। यह फ़ंक्शन प्रत्येक डेटा फ़्रेम में प्रक्षेपवक्र के माध्य द्रव्यमान के साथ एक स्तंभ जोड़ता है.
    4. फ़ंक्शन trajectory_analysis.membrane_density के साथ झिल्ली पर स्पष्ट कण घनत्व का मूल्यांकन करें, जो डेटा फ्रेम में अतिरिक्त कॉलम के रूप में पता लगाए गए कणों और वर्तमान प्रक्षेपवक्रों के संदर्भ में माध्यिका घनत्व मान लौटाता है (नोटबुक अनुभाग C.6 देखें)।
      नोट: जैसा कि कणों का एक हिस्सा पता लगाने और प्रक्षेपवक्र जोड़ने की प्रक्रिया दोनों के दौरान खो जाएगा, वास्तविक कण घनत्व अधिक हो सकता है। कण घनत्व के साथ-साथ बड़े पैमाने पर हिस्टोग्राम के बारे में विश्वसनीय परिणामों के लिए, नेत्रहीन प्रतिनिधि फिल्म स्नैपशॉट का निरीक्षण करें ताकि यह सत्यापित किया जा सके कि माप की स्थिति एकल-कण ट्रैकिंग के लिए प्रशंसनीय है (चरण 9.1.1 देखें)।

10. डेटा विज़ुअलाइज़ेशन

  1. दो-आयामी कर्नेल घनत्व अनुमान (केडीई) के साथ द्रव्यमान और प्रसार गुणांक के सहसंबंध को स्पष्ट करें, जो पायथन पैकेज फास्टकेडीई (v.1.0.19; https://pypi.org/project/fastkde/) पर आधारित है।
  2. प्लॉट जनरेट करने के लिए, MSPT परिणाम वाली HDF5 फ़ाइल निर्दिष्ट करें (चरण 9.3.2 और नोटबुक अनुभाग D.1 देखें) और plotting.generate_2D_KDE फ़ंक्शन (नोटबुक अनुभाग D.4) के लिए इनपुट डेटा के रूप में एकल (नोटबुक अनुभाग D.2) या एक concatenated डेटा फ़्रेम (नोटबुक अनुभाग D.3) का चयन करें।
    नोट:: प्रत्येक प्लॉट किए गए डेटासेट में एक विश्वसनीय 2D-KDE के लिए आदर्श रूप से 1,000 से अधिक प्रक्षेपवक्र होने चाहिए.

Representative Results

प्रवाह कक्षों (चित्रा 1) में समर्थित लिपिड बाईलेयर (एसएलबी) की तैयारी के लिए यहां विस्तृत प्रोटोकॉल का पालन करते हुए, कोई भी स्पष्ट रूप से सभी प्रदर्शित स्थितियों (चित्रा 2) के मूल दृश्य में एक धब्बेदार जैसे पैटर्न को पहचान सकता है। यह प्रभाव कांच की सतह खुरदरापन के कारण होता है, जो आम तौर पर प्रकीर्णन संकेत पर हावी होता है और नेत्रहीन अप्रभेद्य स्थितियों (कांच, एसएलबी के साथ कांच, या एसएलबी और संलग्न प्रोटीन के साथ ग्लास) की ओर जाता है। पुटिकाओं की उपस्थिति, हालांकि, पुटिकाओं के बड़े बिखरने वाले क्रॉस-सेक्शन के कारण स्पष्ट रूप से अलग है और सजातीय झिल्ली में पुटिका टूटने और संलयन के अवलोकन को सक्षम बनाता है (चित्रा 2 बी और पूरक फिल्म 1)। कांच की सतह के स्थैतिक प्रकीर्णन संकेत को एक रेशियोमेट्रिक दृष्टिकोण के साथ हटाते समय जो दृश्य24,25 के क्षेत्र के भीतर गतिशील तत्वों पर जोर देता है, कोई झिल्ली (चित्रा 2 डी) पर डिफ्यूजिंग अनलेबल प्रोटीन को उजागर कर सकता है जबकि एक खाली एसएलबी (चित्रा 2 सी) या ग्लास स्वयं (चित्रा 2 ए) एक शोर छवि के रूप में दिखाई देता है।

MSPT माप की अंतर्निहित पृष्ठभूमि को स्थानीय रूप से प्रत्येक पिक्सेल मान को n पूर्ववर्ती और उसी छवि स्थिति (चित्रा 3) पर फिल्म के सफल पिक्सेल के माध्यिका के माध्यम से विभाजित करके अनुमान लगाया जा सकता है। नतीजतन, मैक्रोमोलेक्यूल्स आइसोट्रोपिक पॉइंट-स्प्रेड फ़ंक्शन (पीएसएफ) के रूप में दिखाई देते हैं जिनकी झिल्ली पर गति को देखा जा सकता है, ट्रैक किया जा सकता है, और परिमाणित किया जा सकता है। वास्तव में, इसके विपरीत और गतिशील व्यवहार दोनों की उपलब्धता कण के आणविक आकार के सीधे संबंध को अपने संबंधित विसर्पण व्यवहार से सक्षम बनाती है, सभी कण को लेबल करने की आवश्यकता के बिना। फिर भी, MSPT प्रयोगों के दौरान निर्धारित iSCAT कंट्रास्ट की व्याख्या करने के लिए, एक अंशांकन करना आवश्यक है जो सिग्नल आयाम को आणविक द्रव्यमान में अनुवाद करता है। यह एक बायोटिन-स्ट्रेप्टाविडिन-बायोटिन कॉम्प्लेक्स (चित्रा 4 ए) के माध्यम से एक एसएलबी के लिए ज्ञात द्रव्यमान के बायोमोलेक्यूल्स को संलग्न करके प्राप्त किया जा सकता है। एक अनुकरणीय रणनीति के रूप में, कोई भी बोवाइन सीरम एल्ब्यूमिन (बीएसए), प्रोटीन ए (पीआरए), क्षारीय फॉस्फेट (एपी), और फाइब्रोनेक्टिन (एफएन) के बायोटिनिलेटेड वेरिएंट का उपयोग कर सकता है, जो स्ट्रेप्टाविडिन (एसटीपी) से बंधते हैं जो झिल्ली में बायोटिन युक्त लिपिड (बायोटिनिल कैप पीई) के लिए बाध्य हैं। जैसा कि चित्रा 4 ए में प्रदर्शित किया गया है, इन अनुकरणीय मैक्रोमोलेक्यूल्स के तेजी से स्पष्ट विपरीत संबंधित बायोटिनिलेटेड मानकों के बढ़ते आणविक वजन को दर्शाता है। मानक प्रोटीन के ओलिगोमर राज्य के संबंधित द्रव्यमान के लिए कंट्रास्ट हिस्टोग्राम (चित्रा 4 बी) के प्रत्येक शिखर को असाइन करके, इसके विपरीत और द्रव्यमान के बीच एक रैखिक संबंध21,22 प्रकट होता है और बाद में अज्ञात मैक्रोमोलेक्यूल सिस्टम (चित्रा 4 सी) के विश्लेषण के लिए उपयोग किया जा सकता है।

आणविक भार का विश्लेषण करने के लिए MSPT की प्रयोज्यता और क्षमताओं का प्रदर्शन करने वाला एक अच्छा उदाहरण और इसलिए ओलिगोमर राज्यों और ओलिगोमेराइजेशन घटनाओं का अध्ययन biotinylated aldolase और biotinylated IgG (चित्रा 5) का विचार है। Aldolase को आमतौर पर एक homotetramer32 होने की सूचना दी जाती है। हालांकि, MSPT द्वारा हल किए गए बड़े पैमाने पर वितरण में चार अलग-अलग चोटियां हैं, जो कई आबादी (चित्रा 5 ए) की उपस्थिति पर प्रकाश डालती हैं। जबकि पहली छोटी चोटी खाली स्ट्रेप्टाविडिन से मेल खाती है और इस तरह के प्रयोग में कॉन्फ़िगरेशन के कारण उम्मीद की जा सकती है, केवल दो सबयूनिट्स (2एसयू) या छह सबयूनिट्स (6एसयू) के साथ एल्डोलेज़ कॉम्प्लेक्स का भी पता लगाया जा सकता है (चित्रा 5 बी)। दिलचस्प बात यह है कि टेट्रा- और हेक्सामेरिक एल्डोलेज़-स्ट्रेप्टाविडिन कॉम्प्लेक्स अकेले डिमेरिक एल्डोलेज़ और स्ट्रेप्टाविडिन की तुलना में कम प्रसार गुणांक प्रदर्शित करते हैं, जो एक बढ़े हुए चिपचिपा ड्रैग को इंगित करता है, उदाहरण के लिए, स्ट्रेप्टाविडिन के लिए एक दूसरे बायोटिनिलेटेड लिपिड के लगाव के माध्यम से । इसी तरह, बायोटिनिलेटेड आईजीजी बड़े पैमाने पर वितरण में तीन चोटियों को प्रदर्शित करता है, जिसमें पहली चोटी फिर से एकल स्ट्रेप्टाविडिन के द्रव्यमान से मेल खाती है। सबसे प्रचुर मात्रा में चोटी का द्रव्यमान एक प्रकाश और एक भारी श्रृंखला (1एसयू) के द्रव्यमान से मेल खाता है, यानी, एक आईजीजी एंटीबॉडी का आधा हिस्सा। दो समान हिस्सों (2एसयू) के साथ पूर्ण एंटीबॉडी लगभग 11% मामलों में पाया जाता है। जटिल आकारों में वृद्धि के साथ प्रसार गुणांक की कमी एक से अधिक बायोटिनिलेटेड लिपिड या संलग्न आईजीजी, या दोनों के कारण अतिरिक्त ड्रैग के साथ स्ट्रेप्टाविडिन की बातचीत को इंगित करती है।

झिल्ली-निर्भर ओलिगोमर राज्यों के एकमात्र विश्लेषण के अलावा, MSPT भी अपने oligomer राज्य के साथ ब्याज के एक मैक्रोमोलेक्यूल के विसर्पण व्यवहार को सहसंबंधित करने का विशेष लाभ प्रदान करता है। इस प्रकार के विश्लेषण के लिए प्रतिनिधि परिणाम एनेक्सिन वी (एएनवी) और हैजा टॉक्सिन सबयूनिट बी (सीटीएक्सबी) के लिए दिखाए गए हैं, जो क्रमशः झिल्ली (चित्रा 6 ए) में शामिल डायोलियोइलफॉस्फेटिडिलसेरीन (डीओपीएस) या ग्लाइकोस्फिंगोलिपिड्स (जीएम 1) को बांधते हैं। दोनों कर्नेल घनत्व अनुमान (केडीई) में द्रव्यमान और प्रसार के यूनिमोडल वितरण की सुविधा है, जो समान विसर्पण व्यवहार के साथ एक एकल प्रचुर मात्रा में प्रजातियों को दर्शाता है। आणविक द्रव्यमान और प्रसार गुणांक की चरम स्थिति क्रमशः 49.8 ± 2.2 kDa और 1.4 ± 0.1 μm2/s पाई गई, AnV के लिए और साथ ही CTxB के लिए क्रमशः 62.7 ± 3.1 kDa और 0.4 ± 0.1 μm2/s, क्रमशः। मापा प्रसार गुणांक उच्च गति AFM और FRAP33,34 से प्राप्त पहले रिपोर्ट किए गए मूल्यों के लिए तुलनीय हैं। अपेक्षित मैक्रोमोलेक्यूल के द्रव्यमान की तुलना में थोड़ा कम द्रव्यमान (एक एएनवी ट्रिमर के लिए 52 केडीए, सीटीएक्सबी पेंटामर के लिए 65 केडीए) पहनावा में कम सबयूनिट्स के साथ छोटे परिसरों की उपस्थिति का संकेत दे सकता है। जबकि प्रोटीन के बीच द्रव्यमान का अंतर छोटा है और माइक्रोस्कोप (≈50 केडीए) की निर्दिष्ट पहचान सीमा के करीब है, उनके प्रसार गुणांक काफी भिन्न होते हैं। एक सममोलर मिश्रण में, उदाहरण के लिए, अकेले AnV और CTxB के वितरण के लिए मिश्रण के प्रसार की तुलना करके, कोई भी यह निष्कर्ष निकाल सकता है कि AnV CTxB (चित्रा 6B) की तुलना में झिल्ली पर अधिक प्रचुर मात्रा में है। हालांकि, यदि सीटीएक्सबी की एकाग्रता को एएनवी की एकाग्रता की तुलना में दोगुना कर दिया जाता है, तो संतुलन को झिल्ली पर प्रमुख प्रोटीन के रूप में सीटीएक्सबी की ओर स्थानांतरित कर दिया जाता है। जैसा कि AnV और CTxB के मिश्रण के लिए सचित्र है, MSPT न केवल झिल्ली से जुड़े मैक्रोमोलेक्यूल्स को उनके आणविक भार के अनुसार भेदभाव करने की अनुमति देता है, बल्कि उनके विसर्पण व्यवहार के अनुसार विभिन्न मैक्रोमोलेक्यूल आबादी के भेदभाव को भी सक्षम बनाता है।

सभी माइक्रोस्कोपी तकनीकों के साथ, डेटा की वांछित गुणवत्ता प्राप्त करने के लिए कुछ प्रयोगात्मक आवश्यकताएं महत्वपूर्ण हैं। इस संदर्भ में एक महत्वपूर्ण उदाहरण अच्छी तरह से साफ कवरलिप्स है। सामान्य तौर पर, इसे माइक्रोस्कोपी से संबंधित एकल-अणु प्रयोगों के लिए एक शर्त माना जाता है, लेकिन MSPT विशेष रूप से नमूना अशुद्धियों के प्रति संवेदनशील है। अशुद्ध कवरलिप की कांच की सतह से उत्पन्न होने वाला बढ़ा हुआ प्रकीर्णन किसी भी मात्रात्मक iSCAT माप को रोकता है। विशेष रूप से, यहां तक कि अपर्याप्त रूप से साफ किए गए ग्लास पर अवशिष्ट गंदगी या धूल के कण उल्लेखनीय छवि विकृतियों का कारण बन सकते हैं, जो देशी इमेजिंग मोड (चित्रा 7 ए) में उज्ज्वल धब्बे के रूप में पहचानने योग्य हैं। यद्यपि इन दोषों को उनकी स्थिर प्रकृति के कारण पृष्ठभूमि अनुमान द्वारा हटा दिया जाता है, एक कण के विपरीत का सटीक निर्धारण बिगड़ा हो सकता है और इस प्रकार इसके मात्रात्मक विश्लेषण को नकारात्मक रूप से प्रभावित करता है। MSPT प्रयोगों में सामना की जाने वाली एक और आम समस्या शेष पुटिकाएं हैं जो या तो दृश्य के क्षेत्र के माध्यम से तैरती हैं (नारंगी में घिरी हुई) या अनफ्यूज्ड पुटिकाएं जो झिल्ली पर एक विशिष्ट स्थिति में फंस जाती हैं (नीले रंग में घिरी हुई) होती हैं और बड़े स्पंदन प्रकीर्णकों के रूप में दिखाई देती हैं (चित्रा 7 बी)। फिल्म अधिग्रहण के साथ उनकी घटना और हस्तक्षेप को कम करने के लिए, प्रोटीन जोड़ने से पहले एसएलबी को अच्छी तरह से धोने और छोटे यूनिलैमेलर पुटिकाओं (एसयूवी) और द्विसंयोजक धनायनों के ताजा तैयार मिश्रण का उपयोग करने की सिफारिश की जाती है।

एक कारक जिसे बड़े पैमाने पर संवेदनशील कण ट्रैकिंग प्रयोगों के डिजाइन के लिए ध्यान में रखा जाना चाहिए, वह झिल्ली इंटरफ़ेस से जुड़े मैक्रोमोलेक्यूल्स का घनत्व है। झिल्ली पर उच्च कण घनत्व वास्तव में दो कारणों से समस्याएं पैदा कर सकता है: i) लगातार फ्रेम से कण का पता लगाने को प्रक्षेपवक्र में जोड़ना अस्पष्ट हो जाता है और इसलिए त्रुटियों की संभावना बढ़ जाती है और प्रसार गुणांक को गलत तरीके से आंका जाता है। ii) कणों का द्रव्यमान, जो उनके संबंधित पीएसएफ फिट के आयाम से निकाला जाता है, व्यवस्थित रूप से कम हो जाता है और द्रव्यमान चोटियों को व्यापक बनाया जाता है क्योंकि गतिशील कण संकेत से स्थैतिक पृष्ठभूमि संकेत का पृथक्करण तेजी से मुश्किल होता है (चित्रा 7 सी)। वर्तमान में, MSPT वीडियो प्राप्त करने की प्रक्रिया में डेटा गुणवत्ता का दृश्य मूल्यांकन उपलब्ध वाणिज्यिक माइक्रोस्कोप पर मुश्किल है क्योंकि अधिग्रहण सॉफ़्टवेयर में कार्यान्वित रेशियोमेट्रिक दृश्य यहां वर्णित माध्य-आधारित एल्गोरिथ्म के बजाय द्रव्यमान फोटोमेट्री21 के लिए स्थापित पृष्ठभूमि हटाने का उपयोग कर रहा है औरसंदर्भों में 24,25 (चित्रा 7D) ). द्रव्यमान फोटोमेट्री में लैंडिंग अणुओं की कल्पना करने के लिए उपयोग किए जाने वाले माध्य-आधारित निरंतर पृष्ठभूमि हटाने से कणों को उज्ज्वल पूंछ के साथ अंधेरे मोर्चों के रूप में दिखाई देने के लिए अलग-अलग कणों का कारण बनता है, जो धब्बे अत्यधिक अनिसोट्रोपिक दिखाई देता है और पता लगाने की प्रक्रिया के दौरान पीएसएफ फिटिंग के साथ हस्तक्षेप करता है। इस प्रकार, अधिग्रहण सॉफ़्टवेयर में कार्यान्वित माध्य-आधारित छवि प्रसंस्करण का उपयोग झिल्ली पर बायोमोलेक्यूल्स को अलग करने के विश्लेषण के लिए अनुपयुक्त है।

Figure 1
चित्रा 1: द्रव्यमान-संवेदनशील कण ट्रैकिंग (MSPT) के साथ प्रोटीन-झिल्ली इंटरैक्शन का विश्लेषण करने के लिए आवश्यक व्यक्तिगत चरणों का प्रक्रिया प्रवाह आरेख। MSPT माप के लिए नमूने तैयार करने के लिए, ग्लास कवर स्लाइड को ऑक्सीजन प्लाज्मा के साथ अच्छी तरह से साफ और सक्रिय किया जाना चाहिए। नमूना प्रवाह कक्षों में उनकी असेंबली के बाद, छोटे यूनिलैमेलर पुटिकाओं (एसयूवी) को समर्थित लिपिड बाईलेयर (एसएलबी) गठन के लिए तैयार किया जाता है और पृष्ठभूमि बिखरने को कम करने के लिए सभी प्रतिक्रिया बफर को फ़िल्टर किया जाता है। एसयूवी प्रवाह कक्षों में लिपिड बाईलेयर बनाने के लिए जोड़े जाते हैं। वैकल्पिक रूप से, पुटिका के टूटने को बढ़ावा देने के लिए Ca2 + आयनों जैसे द्विसंयोजक धनायनों को एसयूवी में जोड़ा जा सकता है। अंत में, ब्याज के प्रोटीन की कम सांद्रता प्रतिक्रिया कक्ष में फ्लश की जाती है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्रा 2: MSPT माप के लिए प्रासंगिक अनुकरणीय सतहों के मूल और ratiometric दृश्य. एक ग्लास कवर स्लाइड (ए) की सतह खुरदरापन की प्रतिनिधि छवियां, एक समर्थित लिपिड बाईलेयर (बी) के गठन के दौरान, एक बरकरार समर्थित लिपिड बाईलेयर (सी) के साथ और एक एसएलबी (डी) पर पुनर्गठित अनुकरणीय प्रोटीन के साथ। सभी चार उदाहरण मूल मोड में प्रदर्शित होते हैं, जिन्हें माप के दौरान ही एक्सेस किया जा सकता है, और माध्य-आधारित पृष्ठभूमि हटाने के बाद संसाधित रेशियोमेट्रिक छवियों के रूप में। स्केल बार 1 μm का प्रतिनिधित्व करते हैं। डेटा विश्लेषण के लिए (Jupyter नोटबुक के साथ देखें; चरण 9), निम्नलिखित पैरामीटर का उपयोग किया गया था: माध्यिका विंडो आकार (window_length) = 1001। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्रा 3: MSPT डेटा संग्रह और विश्लेषण के लिए आवश्यक चरणों का चरण-दर-चरण आरेख. मास फोटोमीटर पर ब्याज के नमूने के लिए डेटा अधिग्रहण के बाद, फिल्मों को पिक्सेल-वार स्लाइडिंग माध्यिका दृष्टिकोण के माध्यम से स्थिर पृष्ठभूमि को हटाने के लिए संसाधित किया जाता है। इसके बाद, उम्मीदवार कणों की पहचान की जाती है और कण प्रक्षेपवक्र में उनके लिंकिंग से पहले एक बिंदु प्रसार समारोह (पीएसएफ) द्वारा फिट किया जाता है। प्रत्येक कण के लिए प्रसार गुणांक के निर्धारण को सक्षम करने के लिए, माध्य वर्ग विस्थापन (MSD) या कूद दूरी वितरण (JDD) विश्लेषण नियोजित किया जाता है। इस स्तर पर, अंशांकन रणनीति के माध्यम से निर्धारित विपरीत-द्रव्यमान-संबंध के अनुसार विपरीत मूल्यों को आणविक द्रव्यमान में परिवर्तित किया जा सकता है। एक अंतिम चरण के रूप में, प्रक्षेपवक्र को उनकी लंबाई या झिल्ली कण घनत्व के आधार पर फ़िल्टर किया जा सकता है और दो-आयामी कर्नेल घनत्व अनुमान (2 डी-केडीई) द्वारा कल्पना की जा सकती है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्रा 4: MSPT माप के लिए द्रव्यमान-से-विपरीत संबंध का अंशांकन। (A) अनुकरणीय स्ट्रेप्टाविडिन-मानक प्रोटीन परिसरों के लिए प्राप्त प्रतिनिधि रेशियोमेट्रिक फ्रेम एक समर्थित लिपिड बाईलेयर पर अलग-अलग होते हैं जिसमें बायोटिनिलेटेड लिपिड का एक छोटा प्रतिशत होता है (DOPC: DOPG: Biotinyl Cap PE अनुपात 70:29.99:0.01 mol%) का। मॉडल आणविक भार मानकों के रूप में, मोनोवैलेंट स्ट्रेप्टाविडिन28 (एसटीपी केवल) या द्विसंयोजक स्ट्रेप्टाविडिन28 या तो बायोटिनिलेटेड गोजातीय सीरम एल्ब्यूमिन (बीएसए), बायोटिनिलेटेड प्रोटीन ए (पीआरए), बायोटिनिलेटेड क्षारीय फॉस्फेट (एपी), या बायोटिनिलेटेड फाइब्रोनेक्टिन (एफएन) के साथ जटिल में दिखाया गया है। उम्मीदवार के धब्बे नारंगी (धराशायी हलकों) में हाइलाइट किए जाते हैं और सफल कण का पता लगाने को लाल (ठोस हलकों) में हाइलाइट किया जाता है। स्केल बार 1 μm का प्रतिनिधित्व करते हैं। (B) पांच मॉडल मानक प्रोटीन के लिए प्राप्त विपरीत मूल्यों की प्रायिकता घनत्व वितरण। सभी प्रदर्शित डेटा प्रति शर्त तीन स्वतंत्र प्रयोगों के पूल किए गए वितरण का प्रतिनिधित्व करते हैं: एसटीपी केवल एन = 82,719; बीएसए एन = 9,034; पीआरए एन = 22,204; AP n = 69,065, और FN n = 71,759 trajectories। प्रोटीन के साथ झिल्ली के लिए निर्धारित कण संख्याओं की तुलना में, एक खाली बाईलेयर पर पाए गए कणों की संख्या मध्यम झिल्ली घनत्व (पूरक चित्र1) पर नगण्य है। बड़े पैमाने पर अंशांकन के लिए माना जाता है इसके विपरीत चोटियों को निरंतर लाइनों के माध्यम से चिह्नित किया जाता है जबकि धराशायी लोग ओलिगोमर राज्यों का प्रतिनिधित्व करते हैं जिन पर विचार नहीं किया जाता है। (सी) कंट्रास्ट-टू-मास अंशांकन वक्र पैनल डी में शिखर विरोधाभासों और परिसरों के संबंधित अनुक्रम द्रव्यमानों से व्युत्पन्न होता है। त्रुटि पट्टियाँ बूटस्ट्रैपिंग द्वारा अनुमानित चोटी के स्थानों की मानक त्रुटि प्रदर्शित करती हैं (प्रत्येक 1,000 प्रक्षेपवक्र के साथ 100 resamples)। डेटा विश्लेषण के लिए (Jupyter नोटबुक देखें; चरण 9), निम्नलिखित पैरामीटर का उपयोग किया गया था: माध्यिका विंडो आकार (window_length) = 1,001 फ्रेम, डिटेक्शन थ्रेशोल्ड (थ्रेश) = 0.00055, खोज रेंज (dmax) = 4 पिक्सेल, मेमोरी (max_frames_to_vanish) = 0 फ्रेम, न्यूनतम प्रक्षेपवक्र लंबाई (minimum_trajectory_length) = 7 फ्रेम (केवल STP), 9 फ्रेम (BSA / FN), 15 फ्रेम (prA), 10 फ्रेम (AP)। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 5
चित्रा 5: झिल्ली से जुड़े प्रोटीन के ओलिगोमर राज्यों को समझना। (ए) बायोटिनिलेटेड एल्डोलेज़ (बाएं पैनल) के साथ जटिल में टेट्रावैलेंट स्ट्रेप्टाविडिन के द्रव्यमान और प्रसार गुणांक दोनों के 2 डी कर्नेल घनत्व अनुमान या बायोटिन-संशोधित बकरी एंटी-रैबिट आईजीजी एंटीबॉडी (दाएं पैनल) के साथ। दोनों परिसरों का पुनर्गठन क्रमशः 70: 29.99: 0.01 मोल% के अनुपात में डीओपीसी, डीओपीजी और बायोटिनिल कैप पीई युक्त एक समर्थित लिपिड बाईलेयर पर किया गया है। कुल मिलाकर, तीन स्वतंत्र प्रतिकृतियों के 116,787 प्रक्षेपवक्रों को स्ट्रेप्टाविडिन-एल्डोलेज़ कॉम्प्लेक्स (0.1 μm-2 के कण घनत्व) और स्ट्रेप्टाविडिन-आईजीजी समग्र (0.1 μm-2 के कण घनत्व) के लिए 348,405 के लिए शामिल किया गया है। केवल कम से कम पांच फ्रेम की ट्रैक लंबाई वाले कणों को शामिल किया गया था। आणविक द्रव्यमान (शीर्ष) और प्रसार गुणांक (दाएं) दोनों के सीमांत संभाव्यता वितरण प्रस्तुत किए जाते हैं। दोनों पैनलों में काला x केडीई के संबंधित स्थानीय मैक्सिमा को चिह्नित करता है। (बी) बायोटिन-संशोधित एल्डोलेज़ (बाएं पैनल) या बायोटिनिलेटेड आईजीजी (दाएं पैनल) के साथ टेट्रावैलेंट स्ट्रेप्टाविडिन के परिसर के लिए निर्धारित ओलिगोमर द्रव्यमान की तुलना, अनुक्रम द्रव्यमान के अनुसार, अपेक्षित आणविक भार के साथ। संक्षिप्त नाम SU को हितों के सबयूनिट के प्रोटीन की ओर से पेश किया गया है। त्रुटि पट्टियाँ बूटस्ट्रैपिंग द्वारा अनुमानित चोटी के स्थानों की मानक त्रुटि प्रदर्शित करती हैं (प्रत्येक 1,000 प्रक्षेपवक्र के साथ 100 resamples)। डेटा विश्लेषण के लिए (Jupyter नोटबुक के साथ देखें; चरण 9), निम्नलिखित पैरामीटर का उपयोग किया गया था: माध्यिका विंडो आकार (window_length) = 1,001 फ्रेम, डिटेक्शन थ्रेशोल्ड (थ्रेश) = 0.00055, खोज रेंज (dmax) = 4 पिक्सेल, मेमोरी (max_frames_to_vanish) = 0 फ्रेम, न्यूनतम प्रक्षेपवक्र लंबाई (minimum_trajectory_length) = 5। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 6
चित्रा 6: V (AnV) और हैजा विष सबयूनिट B (CTxB) में देशी झिल्ली-इंटरैक्टिंग प्रोटीन एनेक्सिन के विसर्पण व्यवहार को भंग करना। (A) एनेक्सिन V (बाएं पैनल) और हैजा टॉक्सिन सबयूनिट B (दाएं पैनल) के द्रव्यमान और प्रसार गुणांक दोनों के 2D कर्नेल घनत्व अनुमान। AnV और CTxB झिल्ली पुनर्गठन के लिए, क्रमशः 80:20 mol% DOPC से DOPS और 99.99:0.01 mol% DOPC से GM1 के लिपिड रचनाओं का उपयोग किया गया है। कुल मिलाकर तीन स्वतंत्र प्रतिकृतियों के 206,819 प्रक्षेपवक्रों को AnV (0.1 μm-2 का कण घनत्व) और CTxB (0.2 μm-2 का कण घनत्व) के लिए 142,895 प्रक्षेपवक्रों के लिए शामिल किया गया है। (बी) सीटीएक्सबी और एएनवी मिश्रणों के 2 डी कर्नेल घनत्व अनुमान क्रमशः 1: 1 (बाएं पैनल) या 2: 1 (दाएं पैनल) के अनुपात में। प्रोटीन मिश्रण का पुनर्गठन 80: 19.99: 0.01 मोल% के अनुपात में डीओपीसी, डीओपीएस और जीएम 1 लिपिड युक्त एक समर्थित लिपिड बाईलेयर पर किया गया था। कुल मिलाकर तीन स्वतंत्र प्रतिकृतियों के 42,696 प्रक्षेपवक्रों को 1: 1 मिश्रण (0.1 μm-2 के कण घनत्व) और 2: 1 अनुपात (0.3 μm-2 का कण घनत्व) के लिए 264,561 प्रक्षेपवक्रों के लिए शामिल किया गया है। (ए) और (बी) दोनों के लिए, केवल कम से कम पांच फ्रेम की ट्रैक लंबाई वाले कणों को शामिल किया गया था। आणविक द्रव्यमान (शीर्ष) और प्रसार गुणांक (दाएं) दोनों के सीमांत संभाव्यता वितरण प्रस्तुत किए जाते हैं। प्रत्येक पैनल में सफेद x केडीई के संबंधित वैश्विक अधिकतम को चिह्नित करता है। डेटा विश्लेषण के लिए (Jupyter नोटबुक के साथ देखें; चरण 9), निम्नलिखित पैरामीटर का उपयोग किया गया था: माध्यिका विंडो आकार (window_length) = 1,001 फ्रेम, डिटेक्शन थ्रेशोल्ड (थ्रेश) = 0.00055, खोज रेंज (dmax) = 4 पिक्सेल, मेमोरी (max_frames_to_vanish) = 0 फ्रेम, न्यूनतम प्रक्षेपवक्र लंबाई (minimum_trajectory_length) = 5। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 7
चित्रा 7: MSPT माप के दौरान या डेटा विश्लेषण के दौरान संभावित जटिलताएं। (A) मूल और संसाधित (माध्यिका-आधारित पृष्ठभूमि हटाने) दोनों में प्रदर्शित सतह खुरदरापन की प्रतिनिधि छवियां एक अशुद्ध कवर ग्लास स्लाइड के रेशियोमेट्रिक दृश्य। दोनों मामलों में, उज्ज्वल धब्बे अवशिष्ट सतह अशुद्धियों का गठन करते हैं जो आर्टिफैक्ट-मुक्त माप में बाधा डालते हैं। (बी) अपर्याप्त झिल्ली धोने के बाद दृश्य के क्षेत्र में अवशिष्ट पुटिकाओं की अनुकरणीय छवियां। स्थैतिक (नीले रंग में हाइलाइट किया गया) और डिफ्यूसिंग (नारंगी में हाइलाइट किया गया) पुटिकाओं दोनों माप की गुणवत्ता को या तो स्पंदन और घुमावदार होने के कारण या उनके दिशात्मक आंदोलन के कारण, क्रमशः खराब कर देंगे। (सी) एक एकल-कण तकनीक के रूप में, MSPT को प्रत्येक कण के उचित लिंकिंग और द्रव्यमान निर्धारण को सक्षम करने के लिए कम कण घनत्व (प्रतिनिधि छवि, ऊपरी पैनल) की आवश्यकता होती है। उच्च झिल्ली-कण घनत्व (मध्य पैनल) के मामले में, कण फिटिंग बिगड़ा हुआ है, जो बड़े पैमाने पर निर्धारण को प्रभावित करता है (निचले पैनल देखें)। (डी) माध्य-आधारित (ऊपरी पैनल) या माध्य-आधारित पृष्ठभूमि हटाने के बाद झिल्ली इंटरफ़ेस पर अलग होने वाले कणों की प्रतिनिधि रेशियोमेट्रिक छवियां। कणों को अलग करने के लिए, माध्य-आधारित पृष्ठभूमि हटाने की रणनीति कण के पीएसएफ की विकृत छवियों का उत्पादन करती है जैसा कि ऊपरी और मध्य पैनल के बीच छोटे इनसेट में देखा जा सकता है। इसके विपरीत, अविभाजित कण पीएसएफ को माध्यिका-आधारित दृष्टिकोण के माध्यम से प्राप्त किया जा सकता है। निचला पैनल: माध्य- या माध्य-आधारित पृष्ठभूमि हटाने के बाद प्राप्त पीएसएफ के केंद्र के माध्यम से लाइन प्रोफाइल की तुलना। इस आकृति में प्रदर्शित सभी देशी और ratiometric छवियों के लिए, स्केल सलाखों 1 μm का प्रतिनिधित्व करते हैं। डेटा विश्लेषण के लिए (Jupyter नोटबुक के साथ देखें; चरण 9), निम्नलिखित पैरामीटर का उपयोग किया गया था: माध्यिका विंडो आकार (window_length) = 1,001 फ्रेम, डिटेक्शन थ्रेशोल्ड (थ्रेश) = 0.00055, खोज रेंज (dmax) = 4 पिक्सेल, मेमोरी (max_frames_to_vanish) = 0 फ्रेम, न्यूनतम प्रक्षेपवक्र लंबाई (minimum_trajectory_length) = 5। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

अनुपूरक चित्रा 1: प्रोटीन मुक्त और कब्जा झिल्ली की तुलना। (ए) से पहले और (बी) के बाद (बी) शुद्ध स्ट्रेप्टाविडिन (एसटीपी) के अलावा एक बरकरार समर्थित लिपिड बाईलेयर की प्रतिनिधि छवियां। उम्मीदवार स्पॉट जो मॉडल पीएसएफ के लिए सफलतापूर्वक फिट थे, लाल रंग में घिरे हुए हैं। (सी) एक खाली झिल्ली (झिल्ली पृष्ठभूमि, ग्रे) पर पाए गए कणों के विपरीत संभाव्यता वितरण और स्ट्रेप्टाविडिन कणों (नीले) के साथ एक बाईलेयर पर पाया जाता है। दोनों संभाव्यता वितरण समान फिल्म अधिग्रहण और विश्लेषण मापदंडों के साथ तीन स्वतंत्र प्रयोगों के पूल किए गए डेटा का प्रतिनिधित्व करते हैं। डेटा विश्लेषण के लिए (Jupyter नोटबुक के साथ देखें; चरण 9), निम्नलिखित पैरामीटर का उपयोग किया गया था: माध्यिका विंडो आकार (window_length) = 1,001 फ्रेम, डिटेक्शन थ्रेशोल्ड (थ्रेश) = 0.00055, खोज रेंज (dmax) = 4 पिक्सेल, मेमोरी (max_frames_to_vanish) = 0 फ्रेम, न्यूनतम प्रक्षेपवक्र लंबाई (minimum_trajectory_length) = 7 फ्रेम। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें।

अनुपूरक मूवी 1: अनुकरणीय फिल्म द्रव्यमान फोटोमीटर के साथ दर्ज एक सजातीय झिल्ली में पुटिकाओं के टूटने और संलयन को दर्शाती है। छवि प्रसंस्करण माध्यिका विंडो आकार (window_length) = 1,001 फ्रेम। स्केल बार: 1 μm. कैमरा गिनती रेंज: काला = 16,892; सफेद = 65,408। इस फिल्म को डाउनलोड करने के लिए कृपया यहाँ क्लिक करें.

अनुपूरक मूवी 2: अनुकरणीय फिल्में एनेक्सिन वी (शीर्ष) और बायोटिनिलेटेड एल्डोलेज़ (नीचे) परिसरों के प्रसार को एक बाईलेयर पर दिखाती हैं जैसा कि एमएसपीटी माप से प्राप्त होता है। छवि प्रसंस्करण माध्यिका विंडो आकार (window_length) = 1,001 फ्रेम। स्केल बार: 1 μm. इंटरफेरोमेट्रिक प्रकीर्णन कंट्रास्ट रेंज: काला = -0.0075; सफेद = 0.0075. इस फिल्म को डाउनलोड करने के लिए कृपया यहाँ क्लिक करें.

Discussion

प्रस्तुत प्रोटोकॉल बड़े पैमाने पर फोटोमेट्री21 का विस्तार करता है, एक ऐसी तकनीक जो कांच पर adsorbing एकल बायोमोलेक्यूल्स के द्रव्यमान का विश्लेषण करती है, एक और भी अधिक बहुमुखी उपकरण है जो बिना लेबल वाले झिल्ली-इंटरैक्टिंग बायोमोलेक्यूल्स के द्रव्यमान और प्रसार को एक साथ मापने में सक्षम है। यह विश्लेषण विस्तारअणुओं 24,25 की पार्श्व गति के लिए अनुकूलित एक संशोधित पृष्ठभूमि हटाने की रणनीति के कार्यान्वयन के माध्यम से प्राप्त किया जाता है। सामान्य तौर पर, पृष्ठभूमि हटाने iSCAT-आधारित दृष्टिकोण के लिए अत्यंत महत्वपूर्ण है, क्योंकि कांच की सतह खुरदरापन का मजबूत प्रकीर्णन मुख्य विश्लेषण बाधा का प्रतिनिधित्व करता है, और प्रत्येक पिक्सेल की स्थानीय पृष्ठभूमि का सटीक निर्धारण कण द्रव्यमान और स्थान के परिमाणीकरण के लिए आवश्यक है। कण गति के लिए अनुकूलित छवि-विश्लेषण के अलावा, बाद में कण का पता लगाने, प्रक्षेपवक्र जोड़ने, और डेटा विश्लेषण बड़े पैमाने पर संवेदनशील कण ट्रैकिंग (MSPT) में एमपी के उपन्यास विस्तार को पूरा करते हैं।

सामान्य तौर पर, पूरी तरह से साफ ग्लास कवर स्लाइड और एक स्वच्छ कार्य वातावरण MSPT प्रयोगों के सफल प्रदर्शन के लिए महत्वपूर्ण आवश्यकताएं हैं। मैक्रोमोलेक्यूल लेबलिंग की अनुपस्थिति के कारण, अधिग्रहित सिग्नल स्वाभाविक रूप से गैर-चयनात्मक है। स्वच्छ नमूने, साथ ही उचित नमूना हैंडलिंग, इसलिए यह सुनिश्चित करने के लिए महत्वपूर्ण हैं कि टिप्पणियों की गलत व्याख्या नहीं की जा सकती है। विशेष रूप से, जब कम आणविक भार के अणुओं की जांच की जाती है, तो पृष्ठभूमि योगदान (पूरक चित्रा 1) का आकलन करने के लिए प्रोटीन मुक्त झिल्ली के नियंत्रण माप का समर्थन किया जाता है। नियंत्रण माप को शामिल करने के अलावा, इस प्रकार प्रत्येक प्रवाह कक्ष के लिए चित्र2 में प्रदर्शित तैयारी चरणों का पालन करने की सिफारिश की जाती है। जब संयुक्त किया जाता है, तो ये सुरक्षा उपाय यह सुनिश्चित करेंगे कि पता लगाया गया संकेत ब्याज के बायोमोलेक्यूल से उत्पन्न होता है और उदाहरण के लिए, एक दूषित प्रवाह कक्ष, बफर या झिल्ली नहीं।

प्रायोगिक डिजाइन के बारे में सावधानियों के अलावा, MSPT छवि प्रसंस्करण के दौरान भी देखभाल की जरूरत है। वीडियो प्रोसेसिंग के दौरान, सही परिणाम सुनिश्चित करने के लिए तीन पैरामीटर के लिए मान को सावधानीपूर्वक चुना जाना चाहिए: i) पृष्ठभूमि हटाने के लिए माध्यिका विंडो की लंबाई, ii) कण का पता लगाने के लिए दहलीज, और iii) लिंकिंग असाइनमेंट के दौरान अधिकतम खोज त्रिज्या। एक बड़ी माध्यिका खिड़की (i) आमतौर पर अधिरोपित अर्ध-स्थिर पृष्ठभूमि से अलग कणों के पृथक्करण की सुविधा प्रदान करती है। हालांकि, बहुत बड़ी खिड़की के आकार के लिए नमूना बहाव अंततः ध्यान देने योग्य हो जाएगा और पृष्ठभूमि अनुमान की सटीकता को कम कर देगा। इष्टतम सेटिंग्स नमूना गुणों और माप स्थितियों पर बहुत अधिक निर्भर करती हैं। फिर भी, 1,001 के मूल्य का उपयोग एक मजबूत प्रारंभिक बिंदु के रूप में किया जा सकता है। थ्रेशोल्ड पैरामीटर (ii) को नमूने में अपेक्षित सबसे कम आणविक द्रव्यमान के आधार पर ट्यून किया जाना चाहिए। इस अध्ययन में उपयोग किए जाने वाले द्रव्यमान फोटोमीटर के साथ लिए गए माप के लिए 0.0005 से नीचे के मान की सिफारिश नहीं की जाती है। विश्लेषण समय को गति देने के लिए, उच्च मूल्यों को चुना जा सकता है यदि उच्च आणविक वजन वाले नमूने की उम्मीद की जाती है। प्रक्षेपवक्र लिंकिंग (iii) में खोज त्रिज्या पिक्सेल में अधिकतम रेडियल दूरी को निर्दिष्ट करती है जिसमें कण के स्थानांतरित स्थान को लगातार फ्रेम में खोजा जाएगा। इसे नमूने में सबसे तेज़ कण के लिए अनुकूलित किया जाना चाहिए, और, यदि इष्ट किया जाता है, तो गणना समय को कम करने के बजाय एक अनुकूली खोज रेंज ( trackpy के प्रलेखन देखें) का उपयोग किया जा सकता है। विशेष रूप से एक परियोजना के प्रारंभिक चरण के दौरान, प्राप्त परिणामों को मान्य करने के लिए अलग-अलग मापदंडों के साथ फिल्मों का फिर से विश्लेषण करने की सिफारिश की जाती है।

MSPT की एकल-अणु प्रकृति के प्रकाश में, इसे उच्च झिल्ली कण घनत्व पर मापने से बचा जाना चाहिए क्योंकि वे सटीक विपरीत और द्रव्यमान निर्धारण में हस्तक्षेप कर सकते हैं। यह दिखाया गया है कि प्रति वर्ग माइक्रोमीटर प्रति एक कण से नीचे घनत्व MSPT माप24 के लिए अनुकूल हैं। एक अतिरिक्त विचार नमूने में अपेक्षित प्रसार गुणांक है। हालांकि प्रसार गुणांक की एक विस्तृत श्रृंखला के लिए लागू होता है, MSPT में सुलभ प्रसार गुणांक की एक कम सीमा होती है। माध्यिका विंडो अवधि के एक महत्वपूर्ण हिस्से के दौरान कुछ पिक्सेल के क्षेत्र के लिए स्थानीय कारावास कण को स्थैतिक पृष्ठभूमि के साथ विलय कर देता है। इस प्रोटोकॉल में उपयोग की जाने वाली इमेजिंग स्थितियों के लिए, 0.01 μm2/s से नीचे प्रसार गुणांक के माप की सिफारिश नहीं की जाती है। इस प्रसार की गति पर, उदाहरण के लिए, माध्यिका खिड़की के आधे आकार के दौरान एक कण का औसत वर्गित विस्थापन लगभग 4 पिक्सेल है और इसलिए पीएसएफ की सीमा के समान आकार का है। नतीजतन, स्थैतिक पृष्ठभूमि अनुमान में कण से ही सिग्नल योगदान होने की संभावना है, जिसके परिणामस्वरूप कण के स्पष्ट रूप से कम विपरीत होते हैं जब तक कि यह अंततः शोर स्तर तक नहीं पहुंच जाता है। हालांकि, 0.05 और 10 μm2/s के बीच के मैक्रोमोलेक्यूल प्रसार गुणांक को स्पष्ट रूप से हल किया जा सकता है।

MSPT अनुप्रयोगों की सीमा को आगे बढ़ाने के लिए, कोई भी पिक्सेल के उन्मूलन के माध्यम से माध्य-आधारित पृष्ठभूमि एल्गोरिथ्म की उन्नति की कल्पना कर सकता है जो अस्थायी रूप से कण के साथ कब्जा कर लिया जाता है, या नमूना बहाव सुधार द्वारा बड़े माध्यिका विंडो आकार को सक्षम करता है। दोनों दृष्टिकोण उच्च कण घनत्व और धीमी गति से प्रसार पर माप के बारे में समस्याओं को कम करेंगे। कम द्रव्यमान संवेदनशीलता के संदर्भ में सुधार बड़े पैमाने पर फोटोमीटर की एक नई पीढ़ी के साथ क्षितिज पर हैं, जो 50 केडीए से छोटे बायोमोलेक्यूल्स तक पहुंच प्रदान कर सकते हैं। इसलिए, भविष्य के MSPT प्रयोगों को एकल-अणु गतिशीलता और झिल्ली से संबंधित इंटरैक्शन का अध्ययन करने में सक्षम होगा, जो झिल्ली की नकल की एक विस्तृत श्रृंखला के लिए है जैसे कि कुशन्ड बाईलेयर और मैक्रोमोलेक्यूलर सिस्टम।

Disclosures

लेखकों के हितों का कोई टकराव नहीं है।

Acknowledgments

हम ईमानदारी से फिलिप कुकुरा, गेविन यंग और रेफिन सॉफ्टवेयर टीम के समर्थन की सराहना करते हैं और छवि विश्लेषण कोड के कुछ हिस्सों को साझा करके उनकी सहायता को स्वीकार करते हैं। हम वाणिज्यिक Refeyn मास फोटोमीटर तक पहुंच प्रदान करने के लिए क्रायो-EM MPIB कोर सुविधा को धन्यवाद देते हैं। F.S. कृतज्ञतापूर्वक Jürgen Plitzko और Wolfgang Baumeister द्वारा दिए गए समर्थन और वित्त पोषण को स्वीकार करता है। टी.एच. और पी.एस. को ड्यूश Forschungsgemeinschaft (DFG, जर्मन रिसर्च फाउंडेशन) के माध्यम से धन प्राप्त हुआ - प्रोजेक्ट-आईडी 201269156 - SFB 1032 (A09)। N.H. एक DFG वापसी अनुदान HU 2462/3-1 द्वारा समर्थित किया गया था। पी.एस. जर्मन संघीय शिक्षा और अनुसंधान मंत्रालय (BMBF) और मैक्स प्लैंक सोसाइटी की संयुक्त वित्त पोषण पहल के माध्यम से अनुसंधान नेटवर्क MaxSynBio के माध्यम से समर्थन स्वीकार करता है।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
annexin V Sigma Aldrich #SRP8026 examplary membrane-interacting protein
Bio-Rad Protein Assay Bio-Rad Laboratories Inc. #5000006 bradford assay kit to determine protein stock concentrations
biotin labeled bovine albumin Sigma Aldrich #A8549 examplary protein that can be used as standard protein for MSPT
cholera toxin subunit B Sigma Aldrich #SAE0069 examplary membrane-interacting protein
cover glasses, #1.5, 24 x 24 mm Paul Marienfeld GmbH & Co. KG #0102062
cover glasses, #1.5, 24 x 60 mm Paul Marienfeld GmbH & Co. KG #0102242
dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DOPC) Avanti Polar Lipids #850375 lipid - in the form of extruded small unilamellar vesicles required for supported lipid bilayer formation
dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-cap biotinyl (18:1 Biotinyl Cap PE Avanti Polar Lipids #870273 lipid - in the form of extruded small unilamellar vesicles required for supported lipid bilayer formation
dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoglycerol (DOPG) Avanti Polar Lipids #840475 lipid - in the form of extruded small unilamellar vesicles required for supported lipid bilayer formation
dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-L-serine (DOPS) Avanti Polar Lipids #840035 lipid - in the form of extruded small unilamellar vesicles required for supported lipid bilayer formation
double-sided tape tesa #57912-00000-02 needed for the assembly of glass sample chambers
Extruder Avanti Polar Lipids #610023 Lipid extruder to enable monodisperse vesicle distributions
EZ-Link Maleimide-PEG2-Biotin Thermo Fisher Scientific #A39261 maileimide-fused biotin that can be used to biotinylate standard proteins for MSPT
Fibronectin (Biotinylated) Cytoskeleton Inc. #FNR03-A examplary protein that can be used as standard protein for MSPT
Gel Filtration HMW Calibration Kit Cytiva #28403842 standard proteins, e.g. aldolase that can be biotinylated and used as molecular weight standards for MSPT
GM1 Ganglioside (Brain, Ovine-Sodium Salt) Avanti Polar Lipids #860065 lipid - in the form of extruded small unilamellar vesicles required for supported lipid bilayer formation
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Biotin Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA) #31820 examplary protein to highlight the existence of different protein states
Isopropanol, 99.5%, for spectroscopy Thermo Fisher Scientific #10003643
Low Autofluorescence Immersion Oil Olympus K.K. #IMMOIL-F30CC
pET21a-Streptavidin-Alive Addgene #20860 required to express and purify divalent streptavidin in combination with each other
pET21a-Streptavidin-Dead Addgene #20859 required to express and purify divalent streptavidin in combination with each other
Pierce Alkaline Phosphatase, biotinylated Thermo Fisher Scientific #29339 examplary protein that can be used as standard protein for MSPT
Pierce Protein A, Biotinylated Thermo Fisher Scientific #29989 examplary protein that can be used as standard protein for MSPT
Refeyn Acquire Refeyn Ltd. control software for Refeyn OneMP
Refeyn One Refeyn Ltd. - mass photometer
sterile syringe filters 0.45 µm cellulose acetate membrane VWR International #514-0063 needed to filter particles from the buffer of interest
tetravalent streptavidin Thermo Fisher Scientific #SNN1001 tetravalent streptavidin to enable the presence of several biotin binding sites
Whatman Nuclepore Hydrophilic Membrane, 0.05 µm Pore Size, 25 mm Circle Cytiva #110603 a pore size of 50 nm is recommended for supported lipid bilayer formation in the context of MSPT
Zepto model 2 plasma cleaner Diener electronic GmbH -

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References

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Steiert, F., Heermann, T., Hundt, N., Schwille, P. Mass-Sensitive Particle Tracking to Characterize Membrane-Associated Macromolecule Dynamics. J. Vis. Exp. (180), e63583, doi:10.3791/63583 (2022).

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