Summary
यह प्रोटोकॉल सेप्सिस के माउस मॉडल में सेकल लिगेशन और पंचर (सीएलपी) के ऑपरेटिव विवरण प्रस्तुत करता है। सीएलपी सेप्सिस के पशु मॉडल को बनाने के लिए सबसे व्यापक रूप से इस्तेमाल की जाने वाली तकनीकों में से एक है। इसलिए, विश्वसनीय अनुसंधान परिणामों की प्राप्ति के लिए एक मानकीकृत सीएलपी प्रोटोकॉल की आवश्यकता होती है।
Abstract
सेप्सिस एक गंभीर जीवन-धमकाने वाली और तेजी से विकसित होने वाली बीमारी है जो दुनिया भर में सालाना लाखों मौतों का कारण बनती है। शोधकर्ताओं ने विभिन्न पशु मॉडल का उपयोग करके सेप्सिस के पैथोफिज़ियोलॉजी को स्पष्ट करने के लिए जबरदस्त प्रयास किए हैं; सेकल लिगेशन और पंचर (सीएलपी) द्वारा प्रेरित सेप्सिस का माउस मॉडल व्यापक रूप से प्रयोगशालाओं में उपयोग किया जाता है। सीएलपी मॉडल की गंभीरता और प्रतिकृति को प्रभावित करने वाले तीन तकनीकी पहलू सेकुम लिगेट का प्रतिशत, सेकल पंचर के लिए उपयोग की जाने वाली सुई का आकार और पेट की गुहा में निचोड़े गए मल की मात्रा हैं। सेप्सिस का तेजी से और विशिष्ट निदान एक महत्वपूर्ण कारक है जो परिणाम को प्रभावित करता है। सेप्सिस निदान के लिए स्वर्ण मानक माइक्रोबियल संस्कृति है; हालाँकि, यह प्रक्रिया समय लेने वाली है और कभी-कभी गलत होती है। सेप्सिस-विशिष्ट बायोमाकर्स का पता लगाना तेज है, लेकिन मौजूदा बायोमाकर्स एक छोटे आधे जीवन, गैर-विशिष्टता और अपर्याप्त संवेदनशीलता के कारण असंतोषजनक हैं। इसलिए, शुरुआती चरणों में सेप्सिस के एक विश्वसनीय बायोमार्कर की तत्काल आवश्यकता है। पिछले प्रकाशनों से पता चलता है कि सेप्सिस में अत्यधिक न्यूट्रोफिल एक्स्ट्रासेल्युलर ट्रैप (एनईटी) होते हैं। साइट्रूलिनेटेड हिस्टोन एच 3 (CitH3), एक नेट घटक के रूप में, सेप्टिक जानवरों और रोगियों दोनों में ऊंचा है, और CitH3 की उपस्थिति सेप्सिस का एक विश्वसनीय नैदानिक बायोमार्कर है। वर्तमान अध्ययन का उद्देश्य सीएलपी-प्रेरित सेप्सिस के एक मानकीकृत माउस मॉडल का वर्णन करना और सेप्सिस का एक विश्वसनीय रक्त बायोमार्कर स्थापित करना है। हमारा काम भविष्य में सेप्सिस के प्रारंभिक और सटीक निदान में योगदान कर सकता है।
Introduction
सेप्सिस को संक्रमण 1 के लिए एक अनियमित मेजबान प्रतिक्रिया के कारण जीवन-धमकाने वाले अंग की शिथिलता के रूप में परिभाषित कियागया है, और सेप्टिक शॉक सेप्सिस2 के गंभीर मामलों में मृत्यु का प्रमुख कारण है। सेप्सिस और सेप्टिक शॉक हर साल दुनिया भर में लाखों मौतों का कारण बनताहै। सेप्सिस वाले रोगियों के परिणाम में सुधार करने की कुंजी एंटीबायोटिक दवाओं जैसेउपचारों की शीघ्र शुरुआत है। सेप्सिस के निदान के लिए स्वर्ण मानक विधि माइक्रोबियल संस्कृति है; हालांकि, माइक्रोबियल संस्कृति समय लेने वाली है और गलत-सकारात्मक और गलत-नकारात्मक परिणामों को जन्म दे सकती है, जो नैदानिक महत्व को बहुत सीमित करतीहै। इस प्रकार, सेप्सिस के रक्त बायोमार्कर की पहचान करना अत्यधिक वांछनीय है। प्रोकैल्सीटोनिन को एक आदर्श सेप्सिस बायोमार्कर के रूप में मान्यता प्राप्त है, लेकिन सीमित नैदानिक प्रभावकारिता है क्योंकि यह बाँझरोगों से सेप्सिस को अलग करने में असमर्थ है।
माउस सेकल लिगेशन एंड पंचर (सीएलपी) का उपयोग आमतौर पर वैज्ञानिक अनुसंधान में सेप्सिस का एक मॉडल बनाने के लिए किया जाता है। सीएलपी सबसे व्यापक रूप से इस्तेमाल किए जाने वाले सेप्सिस मॉडल में से एक है क्योंकि यह पॉलीमाइक्रोबियल पेरिटोनिटिस की नकल करता है, जो प्रोइन्फ्लेमेटरी और विरोधी भड़काऊ प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं दोनों को सक्रिय करताहै। यह अच्छी तरह से स्वीकार किया जाता है कि सीएलपी वैकल्पिक तकनीकों की तुलना में अधिक चिकित्सकीय रूप से प्रासंगिक सेप्सिस मॉडल बनाता है, जैसे कि बैक्टीरियल एंडोटॉक्सिन का इंजेक्शन। इसलिए, सीएलपी को अनुसंधान में उपयोग के लिए शास्त्रीय सेप्सिस मॉडल माना जाताहै। हालांकि, सीएलपी का एक बड़ा नुकसान इसकी प्रजनन क्षमता है, क्योंकि मॉडल की गंभीरता कई कारकों से प्रभावित होती है जैसे कि सेकम लिगेट का प्रतिशत, सुई का आकार, पंचर की संख्या और लैप्रोटॉमी तकनीक। इसलिए, सीएलपी-प्रेरित सेप्सिस मॉडल को मानकीकृत करने की आवश्यकता है। वर्तमान अध्ययन मानकीकृत प्रक्रिया को दिखाने और इसकी प्रजनन क्षमता बढ़ाने के लिए सीएलपी-प्रेरित सेप्सिस मॉडल के प्रोटोकॉल विवरण का वर्णन करता है।
भड़काऊ प्रतिक्रिया सेप्सिस के शुरुआती चरण में होती है, जिसमें न्यूट्रोफिल अत्यधिक मात्रा में ऑक्सीडेंट और प्रोटीज जारी करते हैं जोअंग क्षति का कारण बनते हैं। सेप्सिस के पैथोफिज़ियोलॉजी में एक महत्वपूर्ण कारक न्यूट्रोफिल एक्स्ट्रासेल्युलर ट्रैप (एनईटी) का गठन है, जो डीएनए, सिट्रूलिनेटेड हिस्टोन और रोगाणुरोधी प्रोटीन जैसे परमाणु और साइटोसोलिकघटकों को छोड़ता है। हाल के अध्ययनों से पता चलता है कि एनईटी की अत्यधिक पीढ़ी सेप्सिस की विकृति की मध्यस्थता करती है; इस बीच, वाईडब्ल्यू 3-56 या सीएल-एमिडाइन जैसे रसायनों द्वारा पेप्टिडिल आर्जिनिन डीमिनेज (पीएडी) के एंजाइमेटिक अवरोध के माध्यम से एनईटी की कमी, सेप्सिस10,11 के माउस मॉडल में एक प्रो-सर्वाइवल प्रभाव डालती है। सिट्रूलिनेटेड हिस्टोन एच 3 (CitH3) को 201112 में सेप्सिस-विशिष्ट प्रोटीन के रूप में पहचाना गया था, और बाद के प्रकाशनों से पता चला है कि परिसंचारी CitH3 एकाग्रता सेप्सिस13,14 का एक विश्वसनीय नैदानिक बायोमार्कर है। CitH3 को प्रोकैल्सीटोनिन की तुलना में अधिक संवेदनशील और लंबे समय तक चलने वाला बायोमार्कर माना जाता है, और भड़काऊ साइटोकिन्स13 की तुलना में सेप्सिस को अलग करने में अधिक विशिष्ट है।
इस अध्ययन में, हमने सेप्सिस के सीएलपी-प्रेरित माउस मॉडल में सेप्सिस के एक विश्वसनीय नैदानिक बायोमार्कर का मूल्यांकन किया है।
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Protocol
सभी पशु प्रयोगों को जियांग्या अस्पताल और सेंट्रल साउथ यूनिवर्सिटी (नंबर 202103149) में एनीमल रिव्यू कमेटी द्वारा अनुमोदित दिशानिर्देशों के अनुसार किया गया था।
1. तैयारी
- 6 जे चूहों (वजन: 20-25 ग्राम; आयु: 8-12 सप्ताह) का चयन करें और किसी भी प्रक्रिया को करने से पहले 3 दिनों के लिए घर।
- माउस का वजन करें।
- एनेस्थीसिया की गहराई की जांच करने के लिए इनहेलेशन द्वारा माउस को 1.5% आइसोफ्लुरेन के साथ एनेस्थेटाइज करें और पैर की उंगलियों को चुटकी लें।
- हीटिंग पैड पर माउस ठीक करें। पेट पर डिपिलेटरी क्रीम लागू करें और क्रीम और बालों को हटाने से पहले 1 मिनट से अधिक समय तक न छोड़ें।
नोट: सर्जरी के दौरान एनेस्थेटाइज्ड माउस के नीचे एक गर्म पैड रखकर शरीर के सामान्य तापमान को बनाए रखा जाना चाहिए।
2. ऑपरेशन
- कृंतक पशु सर्जरी के लिए उपयुक्त बाँझ शल्य चिकित्सा उपकरण तैयार करें। सड़न रोकनेवाली स्थितियों को सुनिश्चित करने के लिए बाँझ दस्ताने, एक फेस मास्क और एक सर्जिकल गाउन पहनें।
- कम से कम तीन बार आयोडीन पोंछे के साथ पेट की त्वचा को कीटाणुरहित करें। बाँझ सर्जिकल ड्रेप्स के साथ ऑपरेटिव सर्जिकल क्षेत्र को कवर करें।
- लिनिया अल्बा के साथ पेट की दीवार में लगभग 2 सेमी चीरा लगाने के लिए बाँझ सर्जिकल कैंची का उपयोग करें।
नोट: अंगों को नुकसान न पहुंचाएं। - बाँझ चिमटी के साथ पेरिटोनियल गुहा से सीकुम को पहचानें और अलग करें।
- 4-0 रेशम सीवन के साथ सीकुम की मात्रा का 75% हिस्सा लें। मेसेंटेरिक रक्त वाहिकाओं को न हटाएं।
नोट: सेकुम का प्रतिशत जो लिगेट किया जाता है, सेप्सिस की गंभीरता को निर्धारित करता है। - पूंछ के छोर और बंधाव सेट के बीच के मध्य बिंदु पर 21 ग्राम सुई (एक तरफ से सेकल दीवार के माध्यम से दूसरी तरफ) के साथ एक थ्रू-एंड-थ्रू वेध (दो छेद) बनाकर सेकुम को पंचर करें।
- सुई को फेंक दें। धीरे से प्रवेश छेद के माध्यम से सेकुम से मल की एक छोटी बूंद निचोड़ें।
नोट: पेरिटोनियल गुहा में निचोड़े गए मल की मात्रा सुसंगत होनी चाहिए, क्योंकि यह सेप्सिस की गंभीरता को भी निर्धारित करता है। चरण 2.5-2.7 को शाम चूहों के लिए छोड़ दिया जाना चाहिए। - धीरे से सेकम को पेट की गुहा में बदलें।
- पेट की मांसपेशियों और त्वचा को 6-0 रेशम सीवन के साथ अलग से बंद करें।
- आयोडीन के साथ चीरा कीटाणुरहित करें।
- सेकुम से बचने के लिए पेट के निचले बाएं चतुर्थांश में केटोप्रोफेन (5 मिलीग्राम / किग्रा) इंजेक्ट करें। माउस को एक गर्म पैड पर रखें जब तक कि यह एनेस्थेटिक से पूरी तरह से ठीक न हो जाए।
- माउस को तापमान-नियंत्रित कमरे (22 डिग्री सेल्सियस) में पिंजरे में रखें और भोजन और पानी तक मुफ्त पहुंच दें। पहले सप्ताह के लिए हर 6 घंटे में माउस की जांच करें।
- जब सेप्सिस के लक्षण पूर्व-परिभाषित समापन बिंदुओं को पूरा करते हैं तो कार्बन डाइऑक्साइड ओवरडोज द्वारा माउस को यूथेनाइज़ करें।
3. उपचार
- यादृच्छिक रूप से चूहों को शाम समूह, सीएलपी समूह, सीएलपी + वाईडब्ल्यू 3-56 समूह (चित्रा 2 ए), और सीएलपी + सीएल-एमिडाइन समूह (चित्रा 1) में विभाजित करें।
नोट: शाम समूह ने सीएलपी को छोड़कर सीएलपी समूहों के समान प्रक्रियाओं से गुजरना पड़ा। वाईडब्ल्यू 3-56 (5 मिलीग्राम / किग्रा) या सीएल-एमिडाइन (40 मिलीग्राम / किग्रा) को मांसपेशियों और त्वचा की परत को घुमाते समय चरण 2.9 के 1 घंटे बाद पेरिटोनियल इंजेक्शन के माध्यम से प्रशासित किया गया था। - नमूना फसल
- ऑपरेशन के15 24 घंटे बाद रेट्रोबुलबार प्लेक्सस से परिधीय रक्त की कटाई करें।
- सेंट्रीफ्यूजेशन (1,000 x g, 5 मिनट) द्वारा सीरम तैयार करें और उपयोग होने तक -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
- एक अप्रत्यक्ष सैंडविच एलिसा किट का उपयोग करके CitH3 एकाग्रता को मापें जैसा कि पहले वर्णित13 है।
- CitH3 प्रोटीन को पकड़ने के लिए 96-वेल प्लेट पर एंटी-CitH3 मोनोक्लोनल एंटीबॉडी को कोट करें।
- सीरम को DNase I (150 इकाई / mL, 1 घंटे के लिए 37 ° ) के साथ इलाज करें और कुओं (20 μL, कमरे का तापमान) में इनक्यूबेट करें।
- कैप्चर किए गए CitH3 प्रोटीन का पता लगाने के लिए एंटी-CitH3 पॉलीक्लोनल एंटीबॉडी (0.33 μg/mL, 100 μL, 2h) जोड़ें।
- कुओं में एंटी-खरगोश पेरोक्सीडेज-लेबल द्वितीयक एंटीबॉडी (0.02 μg / mL, 100 μl, 1 h) को इनक्यूबेट करें।
- पूरी तरह से धोने के बाद, कुओं को 3,3', 5,5'-टेट्रामिथाइलबेंजिडाइन (100 μL, 20 मिनट) के साथ विकसित करें।
नोट: एलिसा किट के आगे प्रोटोकॉल विवरण पिछले प्रकाशन13 में प्रदान किए गए हैं।
- सांख्यिकीय विश्लेषण
- तीन समूहों के बीच मतभेदों का विश्लेषण करने के लिए एनोवा का एक तरीका करें, इसके बाद कई तुलनाओं के लिए बोनफेरोनी पोस्ट हॉक परीक्षण करें। विश्लेषण करने के लिए एक सांख्यिकीय सॉफ़्टवेयर का उपयोग करें। 0.05 या उससे कम के पी मानों को महत्वपूर्ण माना जाता था।
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Representative Results
जैसा कि चित्र 2 ए में दिखाया गया है, पश्चिमी सोख्ता द्वारा शाम समूह में कोई CitH3 का पता नहीं लगाया गया था। सीएलपी के बाद सीरम CitH3 एकाग्रता में काफी वृद्धि हुई, और यह वृद्धि YW3-56, एक PAD अवरोधक10 के प्रशासन के माध्यम से NET गठन के निषेध से अवरुद्ध हो गई थी। चित्रा 2 बी एलिसा द्वारा निर्धारित सीरम सीटीएच 3 सांद्रता को दर्शाता है। सीएलपी के 24 घंटे बाद, सीएलपी समूहों में सिटएच 3 की सीरम एकाग्रता शाम समूह (पी = 0.0008) की तुलना में बढ़ गई थी, और यह CitH3 वृद्धि Cl-एमिडाइन द्वारा काफी क्षीण हो गई थी, एक पीएडी अवरोधक जो नेट गठन (पी = 0.0028) को सीमित करता है।
चित्र 1: प्रायोगिक समूहीकरण। चूहों को यादृच्छिक रूप से शाम समूह, सीएलपी समूह, सीएलपी + वाईडब्ल्यू 3-56 समूह (ए), और सीएलपी + सीएल-एमिडाइन समूह (बी) में विभाजित किया गया था। प्रोटोकॉल में वर्णित के रूप में सीएलपी किया गया था। वाईडब्ल्यू -3-56 (5 मिलीग्राम / किग्रा) या सीएल-एमिडाइन (40 मिलीग्राम / किग्रा) को सीएलपी के 1 घंटे बाद पेरिटोनियल इंजेक्शन के माध्यम से प्रशासित किया गया था। शाम समूह ने सीएलपी को छोड़कर सीएलपी समूहों के समान प्रक्रियाओं को किया। रक्त को विभिन्न समय बिंदुओं पर एकत्र किया गया था, और सीरम तैयार किया गया था और उपयोग तक -80 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया गया था। वाईडब्ल्यू 3-56 और सीएल-एमिडाइन दोनों पेप्टिडिल आर्जिनिन डीमिनेस इनहिबिटर हैं जो न्यूट्रोफिल बाह्य जाल के गठन को काफी सीमित करते हैं। संक्षिप्तरूप: CitH3 = citrullined हिस्टोन H3; सीएलपी = सेकल बंधाव और पंचर। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा 2: सीएलपी-प्रेरित सेप्सिस मॉडल में सीरम CitH3 एकाग्रता में काफी वृद्धि हुई थी और PAD अवरोध द्वारा कम किया गया था। (A) सीरम CitH3 एकाग्रता का परीक्षण करने के लिए पश्चिमी सोख्ता का प्रदर्शन किया गया था। शाम समूह में कोई CitH3 का पता नहीं चला था। सीएलपी समूहों में CitH3 एकाग्रता में काफी वृद्धि हुई थी, और इस वृद्धि को YW3-56 उपचार द्वारा अवरुद्ध किया गया था। (बी) सीरम सिथ 3 सांद्रता एलिसा द्वारा मापा गया था। शाम समूह में लगभग कोई CitH3 का पता नहीं चला था। सीएलपी समूहों ने CitH3 में उल्लेखनीय वृद्धि दिखाई, जो Cl-Amidine के प्रशासन द्वारा क्षीण हो गई थी। वाईडब्ल्यू 3-56 और सीएल-एमिडाइन दोनों पीएडी अवरोधक हैं जो न्यूट्रोफिल बाह्य जाल के गठन को काफी सीमित करते हैं। संक्षिप्तरूप: CitH3 = citrullined हिस्टोन H3; सीएलपी = सेकल बंधाव और पंचर; पीएडी = पेप्टिडिल आर्जिनिन डीमिनेज। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
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Discussion
सीएलपी सेप्सिस के प्रीक्लिनिकल मॉडल बनाने के लिए पेट में रोगजनकों का परिचय देता है। सीएलपी करते समय, बहिर्जात बैक्टीरिया के हस्तक्षेप को खत्म करने और एनेस्थेटिक्स16 की सटीक खुराक का उपयोग करने के लिए बाँझ स्थितियों का उपयोग करना महत्वपूर्ण है। सीएलपी के तीन तकनीकी पहलू जो सेप्सिस मॉडल की गंभीरता और प्रतिकृति को प्रभावित करते हैं, वे हैं सेकुम लिगेट का प्रतिशत, सेकल पंचर के लिए उपयोग की जाने वाली सुई का आकार, और पेट की गुहा में निचोड़े गए मल की मात्रा। लगभग 75% सेकुम के बंधाव के परिणामस्वरूप गंभीर सेप्सिस होता है, 50% बंधाव के परिणामस्वरूप मध्यम सेप्सिस होता है, और 25% बंधाव या उससे कम परिणाम हल्के सेप्सिसमें होता है। पंचर की संख्या और सुई का आकार मृत्यु दर18 निर्धारित करता है, और सबसे अच्छा परिणाम पंचर के माध्यम से प्राप्त होता है। मल की एक छोटी मात्रा (एक बूंद) बैक्टीरियल पेरिटोनिटिस का कारण बनने के लिए पर्याप्त है, और मल को निचोड़ते समय देखभाल की आवश्यकता होती है। एक अनुभवी व्यक्ति द्वारा किए जाने पर सीएलपी में लगभग 10 मिनट लगते हैं।
इस अध्ययन में वर्णित सीएलपी-प्रेरित सेप्सिस के माउस मॉडल की कई सीमाएं हैं। सबसे पहले, परिधीय रक्त विश्लेषण और साइटोकिन माप के लिए पर्याप्त रक्त नमूने प्राप्त करने के लिए माउस बहुत छोटा हो सकता है। दूसरा, नवजात जानवरों में सीएलपी नहीं किया जा सकता है। तीसरा, परिवर्तनशीलता अभी भी होती है, और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य परिणाम प्राप्त नहीं हो सकते हैं। यह सुनिश्चित करना महत्वपूर्ण है कि सर्जनों को अनुसंधान परीक्षण करने से पहले सीएलपी करने में पर्याप्त अभ्यास हुआ है।
सीएलपी सेप्सिस का एक नैदानिक रूप से यथार्थवादी मॉडल बनाता है जो पैथोफिजियोलॉजिकल प्रक्रिया और साइटोकिन प्रोफाइल की नकल करता है और कृन्तकों में व्यापक रूप से उपयोग किया जाता है। सीएलपी की गंभीरता को सुई के आकार और सीकुम लिगेट के प्रतिशत को समायोजित करके विभिन्न अध्ययन उद्देश्यों को पूरा करने के लिए हेरफेर किया जा सकता है। सीएलपी मॉडल का उपयोग करके प्राप्त हमारे परिणामों के अनुसार, परिसंचारी CitH3 एकाग्रता का पता लगाने से चूहों में सेप्सिस का प्रारंभिक निदान सक्षम होता है। सीरम CitH3 एकाग्रता का नैदानिक मूल्य एंटी-सेप्सिस उपचार की शीघ्र शुरुआत को सक्षम बनाता है जो सेप्टिक व्यक्तियों के परिणामों में काफी सुधार करता है।
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Disclosures
हितों के टकराव की कोई घोषणा नहीं की गई है।
Acknowledgments
हम प्रयोगों में मदद करने के लिए प्रोफेसर वांग वेई और डॉक्टर लियू शुआई को धन्यवाद देते हैं। इस काम को जियांग्या अस्पताल, सेंट्रल साउथ यूनिवर्सिटी (नंबर 2019 क्यू 10), हुनान प्रांत के राष्ट्रीय और विज्ञान फाउंडेशन (नंबर 2020जेजे 4902) और चीन के राष्ट्रीय प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन (नंबर 82202394) के युवा अनुसंधान फंडिंग से अनुदान द्वारा वित्त पोषित किया गया था।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 21G needle | |||
| 3,3’,5,5’-tetramethylbenzidine | R&D Systems Inc | DY999 | |
| anti-CitH3 monoclonal antibody | laboratory self developed | ||
| anti-CitH3 polyclonal antibody | Abcam | ab5103 | |
| anti-rabbit secondary antibody | Jackson ImmunoResearch | 111-035-003 | |
| C57BL/6 mice | Xiangya School of Medicine, Central South University | ||
| Cl-amidine | Sigma Aldrich | SML2250 | |
| depilatory cream | |||
| Dnase I | Sigma Aldrich | 11284932001 | |
| isoflurane | Sigma-Aldrich | 26675-46-7 | |
| ketoprofen | Sigma Aldrich | PHR1375 | |
| silk sutures (4-0 & 6-0) | |||
| surgical instruments | |||
| YW3-56 | GLPBIO | GC48263 |
References
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