Summary
Denne protokol præsenterer de operative detaljer om cecal ligering og punktering (CLP) i en musemodel af sepsis. CLP er en af de mest anvendte teknikker til at skabe en dyremodel af sepsis. Derfor kræves en standardiseret CLP-protokol for at opnå pålidelige forskningsresultater.
Abstract
Sepsis er en alvorlig livstruende og hurtigt udviklende sygdom, der forårsager millioner af dødsfald årligt over hele verden. Forskere har gjort en enorm indsats for at belyse sepsis patofysiologi ved hjælp af forskellige dyremodeller; musemodellen af sepsis induceret af cecal ligering og punktering (CLP) anvendes i vid udstrækning i laboratorier. De tre tekniske aspekter, der påvirker CLP-modellens sværhedsgrad og replikabilitet, er procentdelen af cecum ligated, størrelsen af nålen, der anvendes til cecal punktering, og mængden af afføring presset ind i bukhulen. Den hurtige og specifikke diagnose af sepsis er en afgørende faktor, der påvirker resultatet. Guldstandarden for sepsisdiagnose er mikrobiel kultur; Denne proces er dog tidskrævende og undertiden unøjagtig. Påvisning af sepsisspecifikke biomarkører er hurtig, men de eksisterende biomarkører er utilfredsstillende på grund af en kort halveringstid, ikke-specificitet og utilstrækkelig følsomhed. Derfor er der et presserende behov for en pålidelig biomarkør for sepsis i de tidlige stadier. Tidligere publikationer tyder på, at overdreven neutrofil ekstracellulære fælder (NET'er) forekommer i sepsis. Citrullineret histon H3 (CitH3), som en NET-komponent, er forhøjet både hos septiske dyr og patienter, og tilstedeværelsen af CitH3 er en pålidelig diagnostisk biomarkør for sepsis. Denne undersøgelse havde til formål at beskrive en standardiseret musemodel af CLP-induceret sepsis og etablere en pålidelig blodbiomarkør for sepsis. Vores arbejde kan bidrage til den tidlige og præcise diagnose af sepsis i fremtiden.
Introduction
Sepsis er defineret som livstruende organdysfunktion forårsaget af et dysreguleret værtsrespons på infektion1, og septisk chok er den største dødsårsag i alvorlige tilfælde af sepsis2. Sepsis og septisk chok forårsager millioner af dødsfald verden over hvert år3. Nøglen til at forbedre resultatet af patienter med sepsis er hurtig initiering af behandlinger som antibiotika4. Guldstandardmetoden til diagnosticering af sepsis er mikrobiel kultur; Mikrobiel kultur er imidlertid tidskrævende og kan føre til falsk-positive og falsk-negative resultater, hvilket i høj grad begrænser den kliniske betydning5. Det er således meget ønskeligt at identificere en blodbiomarkør for sepsis. Procalcitonin er anerkendt som en ideel sepsis biomarkør, men har begrænset diagnostisk effekt, fordi det ikke er i stand til at skelne sepsis fra sterile sygdomme6.
Mus cecal ligering og punktering (CLP) bruges almindeligvis til at skabe en model for sepsis i videnskabelig forskning. CLP er en af de mest anvendte sepsismodeller, fordi den efterligner polymikrobiel peritonitis og aktiverer både proinflammatoriske og antiinflammatoriske immunresponser7. Det er godt accepteret, at CLP skaber en mere klinisk relevant sepsismodel end alternative teknikker, såsom injektion af bakterielt endotoksin. Derfor betragtes CLP som den klassiske sepsismodel til brug i forskning8. En stor ulempe ved CLP er imidlertid dens reproducerbarhed, da modellens sværhedsgrad påvirkes af flere faktorer, såsom procentdelen af cecum ligated, nålestørrelse, antal punkteringer og laparotomiteknik. Derfor er der behov for at standardisere den CLP-inducerede sepsismodel. Denne undersøgelse beskriver protokoldetaljerne i den CLP-inducerede sepsismodel for at vise den standardiserede procedure og øge dens reproducerbarhed.
Det inflammatoriske respons forekommer i den tidlige fase af sepsis, hvor neutrofiler frigiver for store mængder oxidanter og proteaser, der forårsager organskader8. En nøglefaktor i sepsisens patofysiologi er dannelsen af neutrofile ekstracellulære fælder (NET'er), som frigiver nukleare og cytosoliske komponenter såsom DNA, citrullinerede histoner og antimikrobielle proteinaser9. Nylige undersøgelser tyder på, at overdreven generering af NET'er formidler sepsispatologien; i mellemtiden udøver et fald i NETS gennem enzymatisk hæmning af peptidylarginin deiminase (PAD) af kemikalier som YW3-56 eller Cl-amidin en pro-overlevelseseffekt i musemodeller af sepsis10,11. Citrullineret histon H3 (CitH3) blev identificeret som et sepsisspecifikt protein i 201112, og efterfølgende publikationer har vist, at den cirkulerende CitH3-koncentration er en pålidelig diagnostisk biomarkør for sepsis13,14. CitH3 betragtes som en mere følsom og langvarig biomarkør end procalcitonin og er mere specifik til at skelne sepsis end inflammatoriske cytokiner13.
I denne undersøgelse har vi evalueret en pålidelig diagnostisk biomarkør for sepsis i en CLP-induceret musemodel af sepsis.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dyreforsøg blev udført i overensstemmelse med de retningslinjer, der blev godkendt af Animal Review Committee på Xiangya Hospital og Central South University (nr. 202103149).
1. Forberedelse
- Vælg C57BL/6J-hanmus (vægt: 20-25 g; alder: 8-12 uger) og hus i 3 dage, før der udføres procedurer.
- Vej musen.
- Anæstetiser musen med 1,5% isofluran ved indånding og klem tæerne for at kontrollere dybden af anæstesi.
- Fastgør musen på varmepuden. Påfør hårfjerningscreme på maven og lad den stå i højst 1 minut, før du fjerner cremen og håret.
BEMÆRK: Normal kropstemperatur skal opretholdes ved at placere en varm pude under den bedøvede mus under operationen.
2. Fremgangsmåde
- Forbered sterile kirurgiske instrumenter, der er egnede til gnaverdyrkirurgi. Brug sterile handsker, en ansigtsmaske og en kirurgisk kjole for at sikre aseptiske forhold.
- Desinficere maveskindet med jodservietter mindst tre gange. Dæk det operative kirurgiske område med sterile kirurgiske gardiner.
- Brug steril kirurgisk saks til at lave et ca. 2 cm snit i bugvæggen langs linea alba.
BEMÆRK: Beskadig ikke organerne. - Identificer og isoler cecum ud af bughulen med steril pincet.
- Læg 75% af volumenet af cecum med 4-0 silkesuturer. Liger ikke de mesenteriske blodkar.
BEMÆRK: Procentdelen af cecum, der er ligeret, bestemmer sværhedsgraden af sepsis. - Punktere cecum ved at skabe en gennemgående perforering (to huller) med en 21 G nål (fra den ene side gennem cecalvæggen til den modsatte side) i midtpunktet mellem haleenden og ligeringssættet.
- Kassér nålen. Pres forsigtigt en lille dråbe afføring ud af cecum gennem penetrationshullerne.
BEMÆRK: Mængden af afføring, der presses ind i bughulen, skal være konsistent, da dette også bestemmer sværhedsgraden af sepsis. Trin 2.5-2.7 skal springes over for falske mus. - Udskift forsigtigt cecum i bukhulen.
- Luk mavemusklen og huden separat med 6-0 silkesuturer.
- Desinficer snittet med jod.
- Injicer ketoprofen (5 mg/kg) i den nederste venstre kvadrant af maven for at undgå cecum. Placer musen på en varm pude, indtil den er helt kommet sig efter bedøvelsen.
- Placer musen i et bur i et temperaturkontrolleret rum (22 °C), og giv fri adgang til mad og vand. Tjek musen hver 6. time i den første uge postoperativt.
- Afliv musen ved overdosering af kuldioxid, når symptomer på sepsis opfylder de foruddefinerede endepunkter.
3. Behandling
- Opdel tilfældigt mus i sham-gruppen, CLP-gruppen, CLP + YW3-56-gruppen (figur 2a) og CLP + Cl-amidingruppen (figur 1).
BEMÆRK: Den falske gruppe gennemgik de samme procedurer som CLP-grupperne undtagen CLP. YW3-56 (5 mg/kg) eller Cl-amidin (40 mg/kg) blev administreret via peritoneal injektion 1 time efter trin 2.9 ved suturering af muskel- og hudlaget. - Prøve høst
- Høst perifert blod fra retrobulbar plexus15 24 timer efter operationen.
- Serumet tilberedes ved centrifugering (1.000 x g, 5 min.), og det opbevares ved -80 °C indtil brug.
- CitH3-koncentrationen måles ved hjælp af et indirekte ELISA-sandwichsæt som tidligere beskrevet13.
- Belæg anti-CitH3 monoklonalt antistof på en 96-brøndplade for at fange CitH3-proteinet.
- Serumet behandles med DNase I (150 enheder/ml, 37° i 1 time) og inkuberes i brøndene (20 μL, stuetemperatur).
- Tilsæt anti-CitH3 polyklonalt antistof (0,33 μg/ml, 100 μL, 2 timer) for at detektere det indfangede CitH3-protein.
- Inkuber det anti-kaninperoxidase-mærkede sekundære antistof (0,02 μg / ml, 100 μl, 1 time) i brøndene.
- Efter grundig vask udvikles brøndene med 3,3',5,5'-tetramethylbenzidin (100 μL, 20 min).
BEMÆRK: Yderligere protokoldetaljer om ELISA-sættet findes i tidligere publikation13.
- Statistisk analyse
- Udfør en måde ANOVA for at analysere forskellene mellem de tre grupper, efterfulgt af Bonferroni post hoc-test for flere sammenligninger. Brug en statistisk software til at udføre analysen. p-værdier på 0,05 eller derunder blev betragtet som signifikante.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Som vist i figur 2A blev der ikke påvist CitH3 i skingruppen ved western blotting. Serumkoncentrationen CitH3 steg signifikant efter CLP, og denne stigning blev blokeret af inhiberingen af NET-dannelse via administration af YW3-56, en PAD-hæmmer10. Figur 2B viser serumCitH3-koncentrationerne bestemt af ELISA. Ved 24 timer efter CLP blev serumkoncentrationen af CitH3 øget i CLP-grupperne sammenlignet med skingruppen (p = 0,0008), og denne CitH3-stigning blev signifikant svækket af Cl-amidin, en PAD-hæmmer, der begrænser NET-dannelse (p = 0,0028).
Figur 1: Eksperimentel gruppering. Mus blev tilfældigt opdelt i sham-gruppen, CLP-gruppen, CLP +YW3-56-gruppen (A) og CLP + Cl-amidingruppen (B). CLP blev udført som beskrevet i protokollen. YW-3-56 (5 mg/kg) eller Cl-amidin (40 mg/kg) blev administreret via peritoneal injektion 1 time efter CLP. Fupgruppen gennemgik de samme procedurer som CLP-grupperne bortset fra CLP. Blod blev indsamlet på forskellige tidspunkter, og serum blev tilberedt og opbevaret ved -80 °C indtil brug. YW3-56 og Cl-amidin er begge peptidylarginin deiminasehæmmere, der signifikant begrænser dannelsen af neutrofile ekstracellulære fælder. Forkortelser: CitH3 = citrullineret histon H3; CLP = cecal ligering og punktering. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Serumkoncentrationen CitH3 blev signifikant forøget i den CLP-inducerede sepsismodel og blev lindret ved PAD-hæmning. (A) Western blotting blev udført for at teste serum CitH3-koncentrationen. Der blev ikke påvist CitH3 i skingruppen. CitH3-koncentrationen blev signifikant øget i CLP-grupperne, og denne stigning blev blokeret af YW3-56-behandling. B) Serumkoncentrationerne CitH3 blev målt ved ELISA. Næsten ingen CitH3 blev påvist i sham-gruppen. CLP-grupperne viste markante stigninger i CitH3, som blev dæmpet ved administration af Cl-amidin. YW3-56 og Cl-amidin er begge PAD-hæmmere, der signifikant begrænser dannelsen af neutrofile ekstracellulære fælder. Forkortelser: CitH3 = citrullineret histon H3; CLP = cecal ligering og punktering; PAD = peptidyl arginin deiminase. Klik her for at se en større version af denne figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
CLP introducerer patogener i maven for at skabe en præklinisk model af sepsis. Ved udførelse af CLP er det vigtigt at anvende sterile forhold for at eliminere interferens fra eksogene bakterier og at anvende nøjagtige doser af anæstetika16. De tre tekniske aspekter af CLP, der påvirker sværhedsgraden og replikabiliteten af sepsismodellen, er procentdelen af cecum ligated, størrelsen af nålen, der anvendes til cecal punktering, og mængden af afføring presset ind i bukhulen. Ligering af ca. 75% af cecum resulterer i svær sepsis, 50% ligering resulterer i moderat sepsis, og 25% ligering eller mindre resulterer i mild sepsis17. Antallet af punkteringer og nålestørrelsen bestemmer dødeligheden18, og det bedste resultat opnås ved gennem-og-gennem-punktering. En lille mængde (en dråbe) afføring er nok til at forårsage bakteriel peritonitis, og der kræves omhu, når afføringen presses ud. CLP tager cirka 10 minutter, når det udføres af en erfaren person.
Musemodellen af CLP-induceret sepsis beskrevet i denne undersøgelse har flere begrænsninger. For det første kan musen være for lille til at få nok blodprøver til perifer blodanalyse og cytokinmåling. For det andet kan CLP ikke udføres hos nyfødte dyr. For det tredje forekommer variabilitet stadig, og reproducerbare resultater opnås muligvis ikke. Det er vigtigt at sikre, at kirurgerne har haft tilstrækkelig praksis med at udføre CLP, før de udfører forskningstest.
CLP skaber en klinisk realistisk model af sepsis, der efterligner den patofysiologiske proces og cytokinprofiler og har været meget udbredt hos gnavere. Sværhedsgraden af CLP kan manipuleres til at opfylde forskellige undersøgelsesformål ved at justere nålens størrelse og procentdelen af cecum ligated. Ifølge vores resultater opnået ved hjælp af CLP-modellen muliggør detektering af den cirkulerende CitH3-koncentration tidlig diagnose af sepsis hos mus. Den diagnostiske værdi af serum CitH3-koncentration muliggør hurtig initiering af anti-sepsisbehandlinger, der signifikant forbedrer resultaterne af septiske individer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen interessekonflikter erklæret.
Acknowledgments
Vi takker professor Wang Wei og doktor Liu Shuai for at hjælpe med eksperimenterne. Dette arbejde blev finansieret af tilskud fra Young Research Funding of Xiangya Hospital, Central South University (nr. 2019Q10), fra National and Science Foundation of Hunan Province (nr. 2020JJ4902) og fra National Natural Science Foundation of China (nr. 82202394).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 21G needle | |||
| 3,3’,5,5’-tetramethylbenzidine | R&D Systems Inc | DY999 | |
| anti-CitH3 monoclonal antibody | laboratory self developed | ||
| anti-CitH3 polyclonal antibody | Abcam | ab5103 | |
| anti-rabbit secondary antibody | Jackson ImmunoResearch | 111-035-003 | |
| C57BL/6 mice | Xiangya School of Medicine, Central South University | ||
| Cl-amidine | Sigma Aldrich | SML2250 | |
| depilatory cream | |||
| Dnase I | Sigma Aldrich | 11284932001 | |
| isoflurane | Sigma-Aldrich | 26675-46-7 | |
| ketoprofen | Sigma Aldrich | PHR1375 | |
| silk sutures (4-0 & 6-0) | |||
| surgical instruments | |||
| YW3-56 | GLPBIO | GC48263 |
References
- Singer, M., et al. The third international consensus definitions for sepsis and septic shock (Sepsis-3). JAMA. 315 (8), 801-810 (2016).
- Shankar-Hari, M., et al. Developing a new definition and assessing new clinical criteria for septic shock: For the Third International Consensus Definitions for Sepsis and Septic Shock (Sepsis-3). JAMA. 315 (8), 775-787 (2016).
- Fleischmann-Struzek, C., et al. Incidence and mortality of hospital- and ICU-treated sepsis: results from an updated and expanded systematic review and meta-analysis. Intensive Care Medicine. 46 (8), 1552-1562 (2020).
- Evans, L., et al. Surviving sepsis campaign: international guidelines for management of sepsis and septic shock 2021. Intensive Care Medicine. 47 (11), 1181-1247 (2021).
- Hughes, J. A., Cabilan, C. J., Williams, J., Ray, M., Coyer, F. The effectiveness of interventions to reduce peripheral blood culture contamination in acute care: a systematic review protocol. Systematic Reviews. 7 (1), 216 (2018).
- Kibe, S., Adams, K., Barlow, G. Diagnostic and prognostic biomarkers of sepsis in critical care. The Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 66, 33-40 (2011).
- Dejager, L., Pinheiro, I., Dejonckheere, E., Libert, C. Cecal ligation and puncture: the gold standard model for polymicrobial sepsis. Trends in Microbiology. 19 (4), 198-208 (2011).
- Hotchkiss, R., Karl, I. The pathophysiology and treatment of sepsis. The New England Journal of Medicine. 348 (2), 138-150 (2003).
- Madhi, R., Rahman, M., Taha, D., Morgelin, M., Thorlacius, H. Targeting peptidylarginine deiminase reduces neutrophil extracellular trap formation and tissue injury in severe acute pancreatitis. Journal of Cellular Physiology. 234 (7), 11850-11860 (2019).
- Brinkmann, V., et al. Neutrophil extracellular traps kill bacteria. Science. 303 (5663), 1532-1535 (2004).
- Liang, Y., et al. Inhibition of peptidylarginine deiminase alleviates LPS-induced pulmonary dysfunction and improves survival in a mouse model of lethal endotoxemia. European Journal of Pharmacology. 833, 432-440 (2018).
- Deng, Q., et al. Citrullinated histone H3 as a therapeutic target for endotoxic shock in mice. Frontiers in Immunology. 10, 2957 (2019).
- Li, Y. Q., et al. Identification of citrullinated histone H3 as a potential serum protein biomarker in a lethal model of lipopolysaccharide-induced shock. Surgery. 150 (3), 442-451 (2011).
- Pan, B., et al. CitH3: a reliable blood biomarker for diagnosis and treatment of endotoxic shock. Scientific Reports. 7 (1), 8972 (2017).
- Park, Y., et al. An integrated plasmo-photoelectronic nanostructure biosensor detects an infection biomarker accompanying cell death in neutrophils. Small. 16 (1), 1905611 (2020).
- Harikrishnan, V. S., Hansen, A. K., Abelson, K. S. P., Sorensen, D. B. A comparison of various methods of blood sampling in mice and rats: Effects on animal welfare. Laboratory Animals. 52 (3), 253-264 (2018).
- Brook, B., et al. A controlled mouse model for neonatal polymicrobial sepsis. Journal of Visualized Experiments. (143), e58574 (2019).
- Rittirsch, D., Huber-Lang, M., Flierl, M., Ward, P. Immunodesign of experimental sepsis by cecal ligation and puncture. Nature Protocols. 4 (1), 31-36 (2009).
- Baker, C. C., Chaudry, I. H., Gaines, H. O., Baue, A. E. Evaluation of factors affecting mortality rate after sepsis in a murine cecal ligation and puncture model. Surgery. 94 (2), 331-335 (1983).
