Summary
Bu protokol, bir fare sepsis modelinde çekal ligasyon ve ponksiyonun (CLP) operatif ayrıntılarını sunar. CLP, sepsisin hayvan modelini oluşturmak için en yaygın kullanılan tekniklerden biridir. Bu nedenle, güvenilir araştırma sonuçlarının elde edilmesi için standartlaştırılmış bir CLP protokolü gereklidir.
Abstract
Sepsis, dünya çapında her yıl milyonlarca ölüme neden olan, hayatı tehdit eden ve hızla gelişen ciddi bir hastalıktır. Araştırmacılar, çeşitli hayvan modellerini kullanarak sepsisin patofizyolojisini aydınlatmak için muazzam çaba sarf etmişlerdir; çekal ligasyon ve ponksiyon (CLP) ile indüklenen sepsisin fare modeli laboratuvarlarda yaygın olarak kullanılmaktadır. CLP modelinin ciddiyetini ve tekrarlanabilirliğini etkileyen üç teknik husus, bağlı çekum yüzdesi, çekal ponksiyon için kullanılan iğnenin boyutu ve karın boşluğuna sıkılan dışkı hacmidir. Sepsisin hızlı ve spesifik tanısı sonucu etkileyen çok önemli bir faktördür. Sepsis tanısında altın standart mikrobiyal kültürdür; ancak, bu işlem zaman alıcıdır ve bazen yanlıştır. Sepsise özgü biyobelirteçlerin tespiti hızlıdır, ancak mevcut biyobelirteçler kısa yarı ömür, özgüllük ve yetersiz duyarlılık nedeniyle tatmin edici değildir. Bu nedenle, erken evrelerde güvenilir bir sepsis biyobelirtecine acil ihtiyaç vardır. Önceki yayınlar, sepsiste aşırı nötrofil hücre dışı tuzakların (NET'ler) meydana geldiğini göstermektedir. NET bileşeni olarak sitrülinlenmiş histon H3 (CitH3), hem septik hayvanlarda hem de hastalarda yükselir ve CitH3'ün varlığı sepsisin güvenilir bir tanısal biyobelirtecidir. Bu çalışmada CLP kaynaklı sepsisin standartlaştırılmış fare modelini tanımlamayı ve sepsisin güvenilir bir kan biyobelirtecini oluşturmayı amaçlamıştır. Çalışmalarımız gelecekte sepsisin erken ve doğru teşhisine katkıda bulunabilir.
Introduction
Sepsis, enfeksiyon1'e karşı düzensiz konakçı yanıtının neden olduğu hayatı tehdit eden organ disfonksiyonu olarak tanımlanır ve septik şok, ciddi sepsis2 vakalarında önde gelen ölüm nedenidir. Sepsis ve septik şok her yıl dünya çapında milyonlarca ölüme nedenolmaktadır 3. Sepsisli hastaların sonuçlarını iyileştirmenin anahtarı, antibiyotik4 gibi tedavilerin derhal başlatılmasıdır. Sepsis tanısında altın standart yöntem mikrobiyal kültürdür; Bununla birlikte, mikrobiyal kültür zaman alıcıdır ve klinik önemi büyük ölçüde sınırlayan yanlış pozitif ve yanlış negatif sonuçlara yol açabilir5. Bu nedenle, sepsisin bir kan biyobelirtecini tanımlamak oldukça arzu edilir. Prokalsitonin ideal bir sepsis biyobelirteci olarak kabul edilir, ancak sepsisi steril hastalıklardan ayırt edemediği için tanısal etkinliği sınırlıdır6.
Fare çekal ligasyonu ve ponksiyonu (CLP), bilimsel araştırmalarda bir sepsis modeli oluşturmak için yaygın olarak kullanılır. CLP en yaygın kullanılan sepsis modellerinden biridir, çünkü polimikrobiyal peritoniti taklit eder, hem proinflamatuar hem de antienflamatuar immün yanıtları aktive eder7. CLP'nin bakteriyel endotoksin enjeksiyonu gibi alternatif tekniklerden daha klinik olarak ilgili bir sepsis modeli oluşturduğu kabul edilmektedir. Bu nedenle, CLP, araştırma8'de kullanılmak üzere klasik sepsis modeli olarak kabul edilir. Bununla birlikte, CLP'nin en büyük dezavantajı, model şiddeti, çekum bağlanmış yüzdesi, iğne boyutu, delinme sayısı ve laparotomi tekniği gibi çeşitli faktörlerden etkilendiğinden, tekrarlanabilirliğidir. Bu nedenle, CLP kaynaklı sepsis modelinin standartlaştırılmasına ihtiyaç vardır. Bu çalışmada, standartlaştırılmış prosedürü göstermek ve tekrarlanabilirliğini artırmak için CLP kaynaklı sepsis modelinin protokol detayları açıklanmaktadır.
Enflamatuar yanıt, sepsisin erken evresinde ortaya çıkar ve nötrofiller, organ hasarına neden olan aşırı miktarda oksidan ve proteaz salgılar8. Sepsisin patofizyolojisinde anahtar bir faktör, DNA, sitrülinlenmiş histonlar ve antimikrobiyal proteinazlar gibi nükleer ve sitozolik bileşenleri serbest bırakan nötrofil hücre dışı tuzakların (NET'ler) oluşumudur9. Son zamanlarda yapılan çalışmalar, aşırı NET oluşumunun sepsis patolojisine aracılık ettiğini; Bu arada, peptidil arginin deiminazın (PAD) YW3-56 veya Cl-amidin gibi kimyasallar tarafından enzimatik inhibisyonu yoluyla NET'lerin azalması, sepsis10,11'in fare modellerinde hayatta kalma yanlısı bir etki göstermektedir. Sitrüllinlenmiş histon H3 (CitH3) 2011 yılında sepsise özgü bir protein olarak tanımlanmıştır12 ve sonraki yayınlar dolaşımdaki CitH3 konsantrasyonunun sepsis 13,14'ün güvenilir bir tanısal biyobelirteci olduğunu göstermiştir. CitH3, prokalsitoninden daha hassas ve uzun ömürlü bir biyobelirteç olarak kabul edilir ve sepsisi ayırt etmede inflamatuar sitokinlerden daha spesifiktir13.
Bu çalışmada, CLP ile indüklenen bir sepsis fare modelinde sepsisin güvenilir bir tanısal biyobelirtecini değerlendirdik.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Tüm hayvan deneyleri, Xiangya Hastanesi ve Central South Üniversitesi'ndeki Hayvan İnceleme Komitesi (No. 202103149) tarafından onaylanan kılavuzlara uygun olarak gerçekleştirilmiştir.
1. Hazırlık
- Erkek C57BL/6J farelerini (ağırlık: 20-25 g; yaş: 8-12 hafta) seçin ve herhangi bir işlem yapmadan önce 3 gün boyunca evde konaklayın.
- Fareyi tartın.
- Fareyi soluyarak% 1.5 izofluran ile uyuşturun ve anestezi derinliğini kontrol etmek için ayak parmaklarını sıkıştırın.
- Fareyi ısıtma yastığına sabitleyin. Karnına tüy dökücü krem uygulayın ve kremi ve saçları çıkarmadan önce 1 dakikadan fazla bekletmeyin.
NOT: Ameliyat sırasında anestezi uygulanan farenin altına sıcak bir ped yerleştirilerek normal vücut ısısı korunmalıdır.
2. Operasyon
- Kemirgen hayvan cerrahisi için uygun steril cerrahi aletler hazırlayın. Aseptik koşulları sağlamak için steril eldivenler, yüz maskesi ve cerrahi bir elbise giyin.
- Karın derisini iyotlu mendillerle en az üç kez dezenfekte edin. Ameliyat bölgesini steril cerrahi örtülerle örtün.
- Linea alba boyunca karın duvarında yaklaşık 2 cm'lik bir kesi yapmak için steril cerrahi makas kullanın.
NOT: Organlara zarar vermeyin. - Çekumu peritoneal boşluktan steril cımbızla tanımlayın ve izole edin.
- Çekumun hacminin% 75'ini 4-0 ipek dikişle bağlayın. Mezenterik kan damarlarını yağlamayın.
NOT: Bağlı olan çekumun yüzdesi sepsisin şiddetini belirler. - Kuyruk ucu ile ligasyon seti arasındaki orta noktada 21 G'lik bir iğne ile (bir taraftan çekal duvardan karşı tarafa) bir adet içinden ve içinden delinme (iki delik) oluşturarak çekumu delin.
- İğneyi atın. Penetrasyon deliklerinden çekumdan küçük bir dışkı damlacığını hafifçe sıkın.
NOT: Peritoneal boşluğa sıkılan dışkı miktarı tutarlı olmalıdır, çünkü bu aynı zamanda sepsisin şiddetini de belirler. Sahte fareler için 2.5-2.7 arası adımlar atlanmalıdır. - Çekumu yavaşça karın boşluğuna değiştirin.
- Karın kası ve cildi 6-0 ipek dikişle ayrı ayrı kapatın.
- Kesini iyotla dezenfekte edin.
- Çekumdan kaçınmak için ketoprofen (5 mg / kg) karnın sol alt çeyreğine enjekte edin. Fareyi anesteziden tamamen iyileşene kadar ılık bir pedin üzerine yerleştirin.
- Fareyi sıcaklık kontrollü bir odada (22 °C) bir kafese yerleştirin ve yiyecek ve suya serbest erişim sağlayın. Postoperatif ilk hafta boyunca fareyi her 6 saatte bir kontrol edin.
- Sepsis semptomları önceden tanımlanmış son noktaları karşıladığında fareyi karbondioksit doz aşımı ile ötenazileştirin.
3. Tedavi
- Fareleri rastgele sahte gruba, CLP grubuna, CLP + YW3-56 grubuna (Şekil 2a) ve CLP + Cl-amidin grubuna (Şekil 1) bölün.
NOT: Sahte grup, CLP dışındaki CLP gruplarıyla aynı yordamlara tabi tutulmuştur. YW3-56 (5 mg / kg) veya Cl-amidin (40 mg / kg), kas ve cilt tabakası dikilirken adım 2.9'dan 1 saat sonra periton enjeksiyonu yoluyla uygulandı. - Örnek hasat
- Ameliyattan15 24 saat sonra retrobulber pleksustan periferik kan toplayın.
- Serumu santrifüjleme (1.000 x g, 5 dakika) ile hazırlayın ve kullanıma kadar -80 ° C'de saklayın.
- CitH3 konsantrasyonunu, daha önce tarif edildiği gibi dolaylı bir sandviç ELISA kiti kullanarak ölçün13.
- CitH3 proteinini yakalamak için anti-CitH3 monoklonal antikorunu 96 delikli bir plaka üzerine kaplayın.
- Serumu DNaz I (150 birim / mL, 1 saat boyunca 37 °) ile tedavi edin ve kuyucuklarda (20 μL, oda sıcaklığı) inkübe edin.
- Yakalanan CitH3 proteinini tespit etmek için anti-CitH3 poliklonal antikoru (0.33 μg / mL, 100 μL, 2 saat) ekleyin.
- Tavşan karşıtı peroksidaz etiketli sekonder antikoru (0.02 μg/mL, 100 μl, 1 saat) kuyucuklarda inkübe edin.
- İyice yıkamadan sonra, kuyuları 3,3',5,5'-tetrametilbenzidin (100 μL, 20 dakika) ile geliştirin.
NOT: ELISA kitinin diğer protokol ayrıntıları önceki yayın13'te verilmiştir.
- İstatistiksel analiz
- Üç grup arasındaki farklılıkları analiz etmek için bir yol ANOVA'yı gerçekleştirin, ardından çoklu karşılaştırmalar için Bonferroni post hoc testi yapın. Analizi gerçekleştirmek için istatistiksel bir yazılım kullanın. 0.05 veya daha düşük p değerleri anlamlı olarak kabul edildi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Şekil 2A'da gösterildiği gibi, batı lekelenmesi ile sahte grupta CitH3 tespit edilmemiştir. CLP'den sonra serum CitH3 konsantrasyonu önemli ölçüde artmıştır ve bu artış, bir PAD inhibitörü10 olan YW3-56'nın uygulanması yoluyla NET oluşumunun inhibisyonu ile bloke edilmiştir. Şekil 2B, ELISA tarafından belirlenen serumCitH3 konsantrasyonlarını göstermektedir. CLP'den 24 saat sonra, CLP gruplarında CitH3'ün serum konsantrasyonu, sahte gruba kıyasla artmıştır (p = 0.0008) ve bu CitH3 artışı, NET oluşumunu sınırlayan bir PAD inhibitörü olan Cl-amidin tarafından anlamlı olarak zayıflatılmıştır (p = 0.0028).
Şekil 1: Deney gruplaması. Fareler rastgele sahte grup, CLP grubu, CLP + YW3-56 grubu (A) ve CLP + Cl-amidin grubuna (B) ayrıldı. CLP, protokolde açıklandığı gibi gerçekleştirilmiştir. YW-3-56 (5 mg/kg) veya Cl-amidin (40 mg/kg) CLP'den 1 saat sonra periton enjeksiyonu ile uygulandı. Sahte grup, CLP dışındaki CLP gruplarıyla aynı prosedürlere tabi tutuldu. Kan çeşitli zaman noktalarında toplandı ve serum hazırlandı ve kullanıma kadar -80 ° C'de saklandı. YW3-56 ve Cl-amidin, nötrofil hücre dışı tuzakların oluşumunu önemli ölçüde sınırlayan peptidil arginin deiminaz inhibitörleridir. Kısaltmalar: CitH3 = sitrülinlenmiş histon H3; CLP = çekal ligasyonu ve delinmesi. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: CLP ile indüklenen sepsis modelinde serum CitH3 konsantrasyonu anlamlı olarak artmış ve PAD inhibisyonu ile hafifletilmiştir. (A) Serum CitH3 konsantrasyonunu test etmek için Western blotasyonu yapıldı. Sahte grupta CitH3 saptanmadı. CLP gruplarında CitH3 konsantrasyonu anlamlı olarak artmış ve bu artış YW3-56 tedavisi ile bloke edilmiştir. (B) Serum CitH3 konsantrasyonları ELISA ile ölçüldü. Sahte grupta neredeyse hiç CitH3 tespit edilmedi. CLP grupları, Cl-amidin uygulamasıyla zayıflatılan CitH3'te belirgin artışlar gösterdi. YW3-56 ve Cl-amidin, nötrofil hücre dışı tuzakların oluşumunu önemli ölçüde sınırlayan PAD inhibitörleridir. Kısaltmalar: CitH3 = sitrülinlenmiş histon H3; CLP = çekal ligasyon ve delinme; PAD = peptidil arginin deiminaz. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
CLP, preklinik bir sepsis modeli oluşturmak için karın içine patojenler sokar. CLP yaparken, eksojen bakterilerin girişimini ortadan kaldırmak ve doğru anestezik dozajlarını kullanmak için steril koşullar kullanmak önemlidir16. CLP'nin sepsis modelinin ciddiyetini ve tekrarlanabilirliğini etkileyen üç teknik yönü, bağlı çekumun yüzdesi, çekal ponksiyon için kullanılan iğnenin büyüklüğü ve karın boşluğuna sıkılan dışkı hacmidir. Çekumun yaklaşık% 75'inin bağlanması şiddetli sepsis ile,% 50 ligasyon orta derecede sepsis ile sonuçlanır ve% 25 veya daha az ligasyon hafif sepsis17 ile sonuçlanır. Delinme sayısı ve iğne boyutu ölüm oranınıbelirler 18 ve en iyi sonuç baştan sona delinme ile elde edilir. Bakteriyel peritonite neden olmak için az miktarda (bir damlacık) dışkı yeterlidir ve dışkıyı sıkarken özen gösterilmesi gerekir. CLP, deneyimli bir kişi tarafından gerçekleştirildiğinde yaklaşık 10 dakika sürer.
Bu çalışmada açıklanan CLP kaynaklı sepsisin fare modelinin bazı sınırlamaları vardır. İlk olarak, fare periferik kan analizi ve sitokin ölçümü için yeterli kan örneği almak için çok küçük olabilir. İkincisi, CLP yeni doğmuş hayvanlarda uygulanamaz. Üçüncüsü, değişkenlik hala meydana gelir ve tekrarlanabilir sonuçlar elde edilemeyebilir. Araştırma testleri yapmadan önce cerrahların CLP yapma konusunda yeterli uygulamaya sahip olduklarından emin olmak önemlidir.
CLP, patofizyolojik süreci ve sitokin profillerini taklit eden ve kemirgenlerde yaygın olarak kullanılan klinik olarak gerçekçi bir sepsis modeli oluşturur. CLP'nin şiddeti, iğnenin boyutunu ve bağlı çekumun yüzdesini ayarlayarak farklı çalışma amaçlarını yerine getirmek için manipüle edilebilir. CLP modeli kullanılarak elde edilen sonuçlara göre, dolaşımdaki CitH3 konsantrasyonunun tespit edilmesi, farelerde sepsisin erken teşhisini mümkün kılmaktadır. Serum CitH3 konsantrasyonunun tanısal değeri, septik bireylerin sonuçlarını önemli ölçüde iyileştiren anti-sepsis tedavilerinin derhal başlatılmasını sağlar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Çıkar çatışması ilan edilmedi.
Acknowledgments
Profesör Wang Wei ve Doktor Liu Shuai'ye deneylere yardımcı oldukları için teşekkür ederiz. Bu çalışma, Xiangya Hastanesi, Central South University Genç Araştırma Fonu (No. 2019Q10), Hunan Eyaleti Ulusal ve Bilim Vakfı'ndan (No. 2020JJ4902) ve Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı'ndan (No. 82202394) hibelerle finanse edilmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 21G needle | |||
| 3,3’,5,5’-tetramethylbenzidine | R&D Systems Inc | DY999 | |
| anti-CitH3 monoclonal antibody | laboratory self developed | ||
| anti-CitH3 polyclonal antibody | Abcam | ab5103 | |
| anti-rabbit secondary antibody | Jackson ImmunoResearch | 111-035-003 | |
| C57BL/6 mice | Xiangya School of Medicine, Central South University | ||
| Cl-amidine | Sigma Aldrich | SML2250 | |
| depilatory cream | |||
| Dnase I | Sigma Aldrich | 11284932001 | |
| isoflurane | Sigma-Aldrich | 26675-46-7 | |
| ketoprofen | Sigma Aldrich | PHR1375 | |
| silk sutures (4-0 & 6-0) | |||
| surgical instruments | |||
| YW3-56 | GLPBIO | GC48263 |
References
- Singer, M., et al. The third international consensus definitions for sepsis and septic shock (Sepsis-3). JAMA. 315 (8), 801-810 (2016).
- Shankar-Hari, M., et al. Developing a new definition and assessing new clinical criteria for septic shock: For the Third International Consensus Definitions for Sepsis and Septic Shock (Sepsis-3). JAMA. 315 (8), 775-787 (2016).
- Fleischmann-Struzek, C., et al. Incidence and mortality of hospital- and ICU-treated sepsis: results from an updated and expanded systematic review and meta-analysis. Intensive Care Medicine. 46 (8), 1552-1562 (2020).
- Evans, L., et al. Surviving sepsis campaign: international guidelines for management of sepsis and septic shock 2021. Intensive Care Medicine. 47 (11), 1181-1247 (2021).
- Hughes, J. A., Cabilan, C. J., Williams, J., Ray, M., Coyer, F. The effectiveness of interventions to reduce peripheral blood culture contamination in acute care: a systematic review protocol. Systematic Reviews. 7 (1), 216 (2018).
- Kibe, S., Adams, K., Barlow, G. Diagnostic and prognostic biomarkers of sepsis in critical care. The Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 66, 33-40 (2011).
- Dejager, L., Pinheiro, I., Dejonckheere, E., Libert, C. Cecal ligation and puncture: the gold standard model for polymicrobial sepsis. Trends in Microbiology. 19 (4), 198-208 (2011).
- Hotchkiss, R., Karl, I. The pathophysiology and treatment of sepsis. The New England Journal of Medicine. 348 (2), 138-150 (2003).
- Madhi, R., Rahman, M., Taha, D., Morgelin, M., Thorlacius, H. Targeting peptidylarginine deiminase reduces neutrophil extracellular trap formation and tissue injury in severe acute pancreatitis. Journal of Cellular Physiology. 234 (7), 11850-11860 (2019).
- Brinkmann, V., et al. Neutrophil extracellular traps kill bacteria. Science. 303 (5663), 1532-1535 (2004).
- Liang, Y., et al. Inhibition of peptidylarginine deiminase alleviates LPS-induced pulmonary dysfunction and improves survival in a mouse model of lethal endotoxemia. European Journal of Pharmacology. 833, 432-440 (2018).
- Deng, Q., et al. Citrullinated histone H3 as a therapeutic target for endotoxic shock in mice. Frontiers in Immunology. 10, 2957 (2019).
- Li, Y. Q., et al. Identification of citrullinated histone H3 as a potential serum protein biomarker in a lethal model of lipopolysaccharide-induced shock. Surgery. 150 (3), 442-451 (2011).
- Pan, B., et al. CitH3: a reliable blood biomarker for diagnosis and treatment of endotoxic shock. Scientific Reports. 7 (1), 8972 (2017).
- Park, Y., et al. An integrated plasmo-photoelectronic nanostructure biosensor detects an infection biomarker accompanying cell death in neutrophils. Small. 16 (1), 1905611 (2020).
- Harikrishnan, V. S., Hansen, A. K., Abelson, K. S. P., Sorensen, D. B. A comparison of various methods of blood sampling in mice and rats: Effects on animal welfare. Laboratory Animals. 52 (3), 253-264 (2018).
- Brook, B., et al. A controlled mouse model for neonatal polymicrobial sepsis. Journal of Visualized Experiments. (143), e58574 (2019).
- Rittirsch, D., Huber-Lang, M., Flierl, M., Ward, P. Immunodesign of experimental sepsis by cecal ligation and puncture. Nature Protocols. 4 (1), 31-36 (2009).
- Baker, C. C., Chaudry, I. H., Gaines, H. O., Baue, A. E. Evaluation of factors affecting mortality rate after sepsis in a murine cecal ligation and puncture model. Surgery. 94 (2), 331-335 (1983).
