Summary
Snabb detektion och tillförlitlig kvantifiering av RNA-redigeringshändelser i genomisk skala är fortfarande utmanande och förlitar sig för närvarande på direkta RNA-sekvenseringsmetoder. Protokollet som beskrivs här använder mikrotemperaturgradientgelelektrofores (μTGGE) som en enkel, snabb och bärbar metod för att detektera RNA-redigering.
Abstract
RNA-redigering är en process som leder till posttranskriptionella sekvensförändringar i RNA. Detektion och kvantifiering av RNA-redigering bygger huvudsakligen på Sanger-sekvensering och RNA-sekvenseringstekniker. Dessa metoder kan dock vara kostsamma och tidskrävande. I detta protokoll används ett bärbart mikrotemperaturgradientgelelektroforessystem (μTGGE) som en icke-sekvenseringsmetod för snabb detektion av RNA-redigering. Processen är baserad på principen om elektrofores, som använder höga temperaturer för att denaturera nukleinsyraprover när de rör sig över en polyakrylamidgel. Över ett temperaturområde bildar ett DNA-fragment en gradient av helt dubbelsträngat DNA till delvis separerade strängar och sedan till helt separerat enkelsträngat DNA. RNA-redigerade platser med distinkta nukleotidbaser producerar olika smältprofiler i μTGGE-analyser. Vi använde det μTGGE-baserade tillvägagångssättet för att karakterisera skillnaderna mellan smältprofilerna för fyra redigerade RNA-fragment och deras motsvarande icke-redigerade (vildtyp) fragment. Pattern Similarity Scores (PaSS) beräknades genom att jämföra bandmönstren som producerades av de redigerade och icke-redigerade RNA: erna och användes för att bedöma metodens reproducerbarhet. Sammantaget möjliggör plattformen som beskrivs här detektering av även enskilda basmutationer i RNA på ett enkelt, enkelt och kostnadseffektivt sätt. Det förväntas att detta analysverktyg kommer att hjälpa nya molekylärbiologiska fynd.
Introduction
Enstaka nukleotidvarianter (SNV) i genomiskt RNA, inklusive A-till-I,C-till-U och U-till-C-varianter, kan indikera RNA-redigeringshändelser. Detektionen av SNV i RNA är dock fortfarande en tekniskt utmanande uppgift. Konventionellt bestäms förhållandet mellan redigerat och icke-redigerat RNA genom direkt sekvensering, allelspecifik realtidspolymeraskedjereaktion (PCR) eller denaturering av högpresterande vätskekromatografi (HPLC) närmar sig 1,2,3,4,5,6. Dessa metoder är dock inte särskilt tids- eller kostnadseffektiva, och deras låga noggrannhet, orsakad av höga ljudnivåer, utgör tekniska flaskhalsar för RNA-baserad SNV-detektering 7,8. Här beskriver vi ett protokoll baserat på temperaturgradientgelelektrofores (TGGE) för att identifiera enstaka nukleotidpolymorfismer (SNP) som en alternativ metod som eliminerar behovet av direkta RNA-sekvenseringsmetoder för RNA-redigeringsanalyser.
Elektrofores är en föredragen metod för separation och analys av biomolekyler i life science-laboratorier. TGGE möjliggör separation av dubbelsträngade DNA-fragment som är lika stora men har olika sekvenser. Tekniken bygger på sekvensrelaterade skillnader i DNA-fragmentens smälttemperaturer och efterföljande förändringar i deras mobiliteter i porösa geler med en linjär temperaturgradient 9,10. Smältning av DNA-fragment genererar specifika smältprofiler. När domänen med den lägsta smälttemperaturen når motsvarande temperatur vid en viss position i gelén sker övergången från en spiralformad struktur till en delvis smält struktur och migrationen av molekylen kommer praktiskt taget att stanna. Därför använder TGGE både rörlighet (storleksinformation) och temperaturinducerade strukturella övergångar av DNA-fragment (sekvensberoende information), vilket gör det till ett kraftfullt tillvägagångssätt för karakterisering av DNA-fragment. Funktionspunkterna i ett TGGE-smältmönster, som motsvarar tre strukturella övergångar av DNA-molekylen, är strängens initialdissociationspunkt, strängens mittdissociationspunkt och strängens end-dissociationspunkt (figur 1). Sekvensvariationer inom domäner, även skillnader i en bas, påverkar smälttemperaturen, varför molekyler med olika sekvenser kommer att visa diskreta smältmönster (denaturering) i TGGE-analyser. Därför kan TGGE användas för att analysera SNV i genomiskt RNA och kan vara en ovärderlig metod med hög genomströmning för att detektera RNA-redigering. Denna förstärkning med hög genomströmning går förlorad när traditionell gelelektroforesbaserad TGGE används. En miniatyriserad version av TGGE, kallad microTGGE (μTGGE), kan dock användas för att förkorta gelelektroforetisk tid och påskynda analysen med en 100-faldig produktivitetsökning11. Enkelheten och kompaktiteten hos μTGGE-metoden har förbättrats genom introduktionen av PalmPAGE12, ett fälttillämpligt, handhållet och prisvärt gelelektroforessystem.
Här används ett nytt TGGE-baserat protokoll för att undersöka tre typer av RNA-redigeringsställen (A-till-I, C-till-U och U-till-C) i fyra gener, inklusive två från Arabidopsis thaliana-vävnader och två uttryckta i däggdjur HEK293-celler (Figur 1A). Protokollet integrerar användningen av PalmPAGE (hårdvara), ett bärbart system för snabb detektion av RNA-redigering, och uMelt (programvara)13. Med en genomsnittlig körtid på 15-30 minuter möjliggör detta protokoll snabb, tillförlitlig och enkel identifiering av RNA-redigering utan behov av direkta RNA-sekvenseringsmetoder.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Optimering av målfragmentet
OBS: Fyra redigerade gener användes vid utvecklingen av detta protokoll, inklusive två kärngener (AT2G16586 och AT5G02670) från A. thaliana, och generna som kodar för blått fluorescerande protein (BFP) och förbättrat grönt fluorescerande protein (EGFP) uttryckt i HEK293-celler.
- För att identifiera genfragment med olika smältprofiler, som representerar redigerade kontra icke-redigerade regioner, generera förutsagda smältkurvor med hjälp av uMelt HETS webbaserade verktyg, en förlängning av den ursprungliga uMelt-programvaran13.
OBS: Detta verktyg förutsäger formerna av smältkurvor för heteroduplex och homoduplex produkter. - För varje målgen, designa tre par genfragment (300-324 bp i längd). Varje par består av ett fragment med en redigerad webbplats och ett motsvarande fragment av vild typ med en icke-redigerad webbplats, som ligger i antingen 5'-terminaländen, mittpositionen eller 3'-terminaländen.
- Välj det icke-redigerade/redigerade paret som visade den maximala skillnaden mellan smältregionerna på helicitetsaxeln för vidare analys. För μTGGE-analys, syntetisera det valda genfragmentet genom PCR-amplifiering, enligt beskrivningen i avsnitt 2 nedan.
- Designa primers framåt och bakåt med DNADynamo-programvaran (https://www.bluetractorsoftware.com/DynamoDemo.htm) och verifiera med hjälp av NCBI Primer-BLAST-verktyget.
- Späd primrar i TE-buffert (10 mM Tris-HCl innehållande 1 mM EDTA· Na2) och förvara dem i en koncentration av 100 pmol/μL. Späd varje primer till en koncentration av 10 pmol/μL med destillerat vatten före användning.
2. RNA-extraktion och RT-PCR-amplifiering av målfragmentet
- RNA-extraktion
- Extrahera totalt RNA från källan till redigerade och icke-redigerade gener med hjälp av standardmetoder, såsom TRIzol-extraktion14 eller kommersiellt tillgängliga kit.
- Utför syntesen av motsvarande cDNA med hjälp av ett standard RT-PCR-protokoll enligt beskrivningen i steg 2.2.
- Omvänd transkription
- Tillsätt 1 μL oligo(dT)-primer, 1 μL 10 mM dNTP-blandning, 10 μL totalt RNA och 10 μL sterilt destillerat vatten till ett nukleasfritt mikrocentrifugrör.
- Värm blandningen vid 65 °C i 5 minuter och inkubera sedan på is i minst 1 min.
- Samla in innehållet i röret genom centrifugering med maximal hastighet (12 000 x g) i 2-3 s och tillsätt 4 μL 5x ReverTra Ace-buffert, 1 μL 0,1 M DTT och 1 μL M-MLV (Moloney Murine Leukemia Virus) omvänt transkriptas (200 U / μL, Materialtabell).
- Blanda genom att pipettera försiktigt upp och ner. Om du använder slumpmässiga primrar, inkubera röret vid 25 °C i 5 minuter.
- Inkubera röret vid 55 °C i 60 minuter och inaktivera sedan reaktionen genom uppvärmning vid 70 °C i 15 minuter, i en digital torrbads-/blockvärmare.
- Mät koncentrationen av cDNA med hjälp av en spektrofotometer och förvara den vid -25 °C.
-
PCR-förstärkning och bekräftande sekvensering av produkter
- Tillsätt följande reagenser i ett nukleasfritt mikrocentrifugrör: 4 μL 5x Taq-polymerasbuffert, 2 μL 2 mM dNTP-blandning, 2 μL 25 mMMgCl2, 1,6 μL av primersatsen (framåt och bakåt; vardera 10 mM), 2 μL cDNA-mall, 0,1 μL Taq-polymeras (2,5 U/μL) och 8,3 μL sterilt destillerat vatten (slutlig volym, 20 μL).
- Utför PCR med följande cykelförhållanden: initial denaturering vid 95 °C i 2 min; 35 denatureringscykler vid 95 °C i 2 minuter, glödgning vid lämplig temperatur (beroende på vilken specifik primeruppsättning som används) i 30 s och förlängning vid 72 °C i 2 minuter. och sedan en slutlig förlängning vid 72 ° C i 7 min.
- För att rena PCR-produkterna, tillsätt 2 U exonukleas I och 0,5 U räkor alkaliskt fosfatas (ExoSAP). Inkubera röret i en termisk cykler vid 37 °C i 1 timme, följt av 80 °C i 15 minuter, och håll sedan vid 4 °C tills nästa steg.
- För bekräftande sekvensering, tillsätt 11,5 μL sterilt destillerat vatten, 2,5 μL framåt- eller bakåtprimer och 1 μL PCR-produkter (med ExoSAP) till ett nytt mikrocentrifugrör.
OBS: Använd DNA-sekvenseringstjänster (t.ex. Eurofins Genomics) för sekvenseringsanalys. - För att validera PCR-produkternas specificitet, utför sekvensering med både framåt och bakåt primers. De grundpar som används i den representativa analysen anges i tabell 1.
- Späd de renade PCR-produkterna till en koncentration av 200 ng/μL med avjoniserat vatten. Blanda sedan 6 μL av den renade produkten med 3 μL 6x gelladdningsfärgämne i ett 250 μL rör och höj den totala volymen till 12 μL med sterilt vatten. Förvara PCR-produkten (vid -25 °C) tills den är redo att fortsätta med μTGGE enligt beskrivningen nedan.
3. μTGGE-analys
OBS: μTGGE-analysen utförs med hjälp av ett miniatyriserat och ekonomiskt system. En översikt över hela systemet, inklusive gelkassetter, gelkassetthållare, horisontell gelelektroforesplattform, strömförsörjning och gelarvbildningssystem, visas i figur 2.
- Montering av gelacksetterna
- Gelakassetten som används för μTGGE-analys visas i figur 2A. Designen består av tre 1 tums gelplattor: en bottengelplatta, en toppgelplatta och en lane-former platta. Sandwich den övre gelplattan mellan de andra två plattorna och montera i gelatskassetthållaren för gelpolymerisation.
- Polyakrylamidgelberedning
- Tillsätt 7,2 g urea till ett 50 ml rör och lös upp i 10 ml sterilt vatten. Värm provet i en mikrovågsugn i 20-30 s och ta det sedan till rumstemperatur (RT).
- Tillsätt 3 ml 5x Tris/borat/EDTA(TBE) buffert (materialtabell), 2,25 ml 40 % akrylamid/bis (19:1), 75 μL 10x ammoniumpersulfat och 15 μL tetrametyletylendiamin till lösningen.
- Häll omedelbart gellösningen långsamt i gelaskassetthållaren och undvik bildandet av luftbubblor.
- Generering av smältprofiler med μTGGE-enheten
- Använd den miniatyriserade, ekonomiska versionen av μTGGE-apparaten som visas i figur 2 med en temperaturgradient (25-65 °C) inställd vinkelrätt mot DNA-migrationsriktningen.
- Blötlägg de övre och nedre elektroforesbuffertkuddarna (0,5 cm x 2,5 cm) i 2 ml 1x TBE-buffert.
- Placera gelkassetten i den horisontella elektroforeskammarenheten och placera de övre och nedre buffertkuddarna i enlighet där med detta, som visas i figur 2.
- Ladda sedan 10 μL av PCR-produkten i mitten (längre) brunnen och 1 μL av PCR-produkten i varje sidobrunn.
- Efter en 1 minuters väntan, anslut kraftenheten och leverera 100 V i 12 minuter vid en linjär temperaturgradient från 25-65 ° C.
- När körningen är klar tar du ut kassetten och tar bort det övre glasskyddet.
- Häll 300 μL 10x SYBR Gold-fläck på gelén. Visualisera smältprofilerna med den blå LED-ficklampan installerad i den elektroforetiska enheten i palmstorlek.
OBS: En mjuk fil av gelbilden ska sparas för PaSS-beräkning (Pattern Similarity Score). - Upprepa varje elektroforetiskt experiment 3x för att bekräfta reproducerbarheten av data.
4. PaSS-beräkningar
OBS: Beräkningarna utförs med hjälp av μTGGE Analyzer-programvaran.
- Ladda ner och öppna programvaran.
- Öppna JPEG-filen som innehåller gelbilden. Observera att programvaran endast accepterar filer i JPEG-format.
- Klicka på knappen Ram och välj lämpligt område (ram) på gelbilden.
- Klicka på knappen Koordinatkorrigering och lägg till två referenspunkter, som visas i figur 1B.
- Klicka på knappen Tillägg av funktionspunkter och lägg till exempelpunkter som visas i figur 1B. Spara sedan bearbetade gelbilddata i μTGGE-format (*.tgg).
- Klicka på knappen Exempel och välj alternativet Sök efter enkla poäng för att jämföra två eller flera bilder.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Användning av μTGGE för att identifiera enskilda nukleotidbasförändringar i RNA-redigeringshändelser
Fyra redigerade gener användes för detta protokoll (tabell 1), inklusive BFP-genen som producerades i HEK293-celler (med C-till-U-RNA-redigering av deaminasenzymerna av apolipoprotein B mRNA-redigeringsenzymkomplex; APOBEC115), EGFP-genen innehållande ockrastoppkodonet (TAA) som produceras i HEK293-celler (med A-till-I-RNA-redigering av adenosindeaminas som verkar på RNA1; ADAR116) och kärngenerna AT2G16586 och AT5G02670 i A. thaliana17,18 (med U-till-C RNA-redigering). Skillnader i enstaka nukleotider mellan de redigerade och motsvarande icke-redigerade proverna bekräftades genom DNA-sekvensering. Därefter utfördes en μTGGE-analys för att undersöka skillnaderna mellan provernas smältkurvor (figur 3).
För C-till-U RNA-redigeringstypen visade det icke-redigerade provet med den ursprungliga C-basen ett längre smältmönster vid strängens ändsmältpunkt än det redigerade provet med den modifierade U-basen (figur 3A). För redigeringstypen A-till-I(G) RNA visade det redigerade provet med den modifierade I(G)-basen ett längre smältmönster vid strängens ändsmältpunkt än det oredigerade provet med den ursprungliga A-basen (figur 3B). För den "omvända" U-till-C RNA-redigeringstypen analyserades två gener. För AT2G16586-genen visade det redigerade provet med den modifierade C-basen ett längre smältmönster mellan strängens initialsmältnings- och strängsmältpunkter än det oredigerade provet med den ursprungliga U-basen (figur 3C). Ett liknande mönster observerades emellertid inte för den andra AT5G02670-genen (figur 3D). Ändå fanns det en distinkt skillnad mellan de icke-redigerade och redigerade typerna vid slutsmältpunkten. Detta visar att observation av smältprofiler tydligt är ett viktigt steg för att skilja mellan icke-redigerade och redigerade typer.
Kvantitativ analys av μTGGE-smältmönster som representerar RNA-redigeringshändelser
Därefter beräknade vi PaSS-värden11 för att utvärdera reproducerbarheten hos de μTGGE-baserade smältprofilerna som representerar de fyra RNA-redigeringshändelserna som beskrivs ovan. PaSS-värdet ger ett mått på hur nära två smältmönster kan överlagras, vilket genererar ett högre värde (maximalt: 1) för mycket liknande smältmönster. Således förväntas PaSS-värden för jämförelser av icke-redigerade och redigerade prover vara mindre än ett. Som visas i figur 1B användes funktionspunkterna i smältmönstren som motsvarade strukturella övergångar från dubbelsträngat till enkelsträngat DNA för att beräkna PaSS-värden. För att eliminera experimentella variabler utfördes datorstödd normalisering med hjälp av två interna referenspunkter: referenspunkt # 1, som representerar provets position i dubbelsträngad form (den vänstra körfältet) och referenspunkt # 2, som representerar provets position i enkelsträngad form (den högra körfältet). Koordinaterna för funktionspunkterna normaliserades till de interna referenspunkterna och användes sedan för att beräkna PaSS-värdena. Varje experiment upprepades tre gånger och medelvärdet bestämdes. Som förväntat var PaSS-värdena för de fyra redigerade proverna lägre än ett (figur 4). PaSS-värdena för C-till-du- och A-till-I-RNA-redigeringstyperna var lägre än för de två U-till-C-RNA-redigeringstyperna. Denna skillnad är sannolikt relaterad till respektive plats för redigeringswebbplatserna. Specifikt var de C-till-du- och A-till-I-redigerade webbplatserna relativt nära 5'-terminaländarna (vid positionerna 48 respektive 59 i ~ 300 bp-fragmenten), medan de U-till-C-redigerade platserna var belägna nära mitten av fragmenten (vid positionerna 152 och 169). Dessa resultat tyder på att redigerade platser som ligger vid terminalpositioner kan detekteras med μTGGE lättare än de som ligger mot mitten av fragment.
Optimering av TGGE-smältmönster för att identifiera RNA-redigeringshändelser
Eftersom våra tidigare resultat föreslog att PaSS-värdet kan variera beroende på RNA-redigeringsplatsens specifika position, undersökte vi skillnaderna mellan smältmönstren för ett 300 bp-fragment av BFP-genen (uttryckt i HEK293T-celler) där en C-till-U-redigerad plats var belägen nära 5'-terminaländen, nära 3'-terminaländen, eller i mitten av fragmentet (figur 5A). Före μTGGE-analysen förutspåddes smältmönstren för det icke-redigerade fragmentet och tre redigerade fragment med hjälp av uMelt HETS webbaserade verktyg. Denna analys visade att C-till-U-modifieringen skulle förväntas flytta smältkurvan till vänster längs temperaturaxeln (figur 5B). PaSS-värdena beräknade från μTGGE-analyser av de icke-redigerade och de tre redigerade fragmenten ordnades enligt följande: 5'-terminal end RNA edit < 3'-terminal end RNA edit < center of 5'- and 3'-terminal ends RNA edit (Figur 5C). I synnerhet överensstämde dessa PaSS-värden med de resultat som förutspåddes med uMelt. Dessa fynd indikerar att nukleotidbasskillnader belägna vid 5'- eller 3'-terminalen resulterar i större variationer mellan PaSS-värdena för redigerade och icke-redigerade gener än nukleotidbasskillnader som ligger mer centralt. Dessutom tyder dessa resultat på att förkunskaper om skillnaderna mellan smältprofilerna för redigerade och icke-redigerade gener kan användas som en guide för att optimera genfragment för RNA-redigering.
Figur 1: Förfarandet som används för att identifiera RNA-redigering av μTGGE. (A) De typer av RNA-redigeringshändelser som undersökts. (B) En schematisk illustration av de typiska smältprofilerna för redigerade och icke-redigerade gener. I μTGGE migrerar ett prov genom en temperaturgradientgel, vilket ger en karakteristisk krökning. Funktionspunkterna i smältmönstret tilldelas och bearbetas sedan för att beräkna ett PaSS-värde (Pattern Similarity Score). PaSS-beräkningen utförs som visas i ekvationen, där vektorn P för varje funktionspunkt är i motsvarande position och funktionen av temperatur och rörlighet (dvs vektor P = P (T, m)). Överskrifterna (1) och (2) representerar de redigerade respektive icke-redigerade generna. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: Illustrationer och fotografier av gelelektroforesanordningen i palmstorlek. (A) Montering av de tre 1 i gelkassetterna. (B) Illustration av gelaksetthållaren med temperaturgradientplattan. Fotografiet visar positionerna för de övre och nedre buffertkuddarna, liksom provets efter den första laddningen. (C) Översikt över hela systemet, inklusive strömförsörjning, horisontell gelelektroforesplattform och gelarvbildningssystem. Detta system tillhandahåller en genomförbar lösning för snabba, på plats polyakrylamidgelelektroforesbaserade analyser. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3: TGGE-analyser av enstaka nukleotidförändringar i RNA-redigeringshändelser. Smältprofiler för tre olika RNA-redigeringstyper undersöktes med hjälp av fyra gener. (A) C-till-U RNA-redigering i BFP uttryckt i HEK293T-celler. (B) A-till-I(G)RNA-redigering i EGFP uttryckt i HEK293T-celler. (C) U-till-C RNA-redigering i AT2G16586-genen från A. thaliana. (D) U-till-C RNA-redigering i AT5G02670-genen från A. thaliana. Platserna för de redigerade webbplatserna markeras i gult (med rött teckensnitt) och primerpositionerna är understrukna. Skillnaderna mellan smältmönstren för de redigerade och icke-redigerade proverna indikeras av röda cirklar. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 4: De genomsnittliga PaSS-värdena för de fyra redigerade generna som undersöks här. Felstaplar representerar standardavvikelsen för tre repliker. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 5: Positionsspecifik PaSS-analys. (A) Redigeringsstället för C-till-U-typ RNA i BFP-genen uttryckt i HEK293T-celler flyttades till 5'-terminaländen, 3'-terminaländen eller mitten av genfragmentet. (B) Teoretisk förutsägelse av smältmönstren för de icke-redigerade och tre redigerade fragmenten som visas i (A). Förutsägelserna utfördes med uMelt. (C) De genomsnittliga PaSS-värdenaför de redigerade gener som visas i (A). Felstaplar representerar standardavvikelsen för tre repliker. Klicka här för att se en större version av denna figur.
| S.No | RNA-redigering | Källa | Position | Gen-ID | Framåt Primer | Omvänd primer | Sekvens längd | ||
| 1 | C-till-U | HEK293T-celler | 48:e plats | EGFP | AAGCTGACCC TGAAGTTCATC |
GCTGTTGTAGT TGTACTCCAGC |
324 | ||
| 2 | A-till-I | HEK293T-celler | 59:e plats | EGFP | AGGGCGATGC CACCTACGGCA |
CCGTCCTCCT TTAAGTCGA |
300 | ||
| 3 | U-till-C | Arabidopsis | 152:e plats | AT2G16586 | GGGCGATGTT ACGCTCGATGA |
GTGAAGAGTAA CATGGCGTT |
301 | ||
| 4 | U-till-C | Arabidopsis | 169:e plats | AT5G02670 | CCAGTTGGCAG AATCCAGTCA |
CTAGCTTCCAC TGTTGAGATTC |
300 | ||
Tabell 1: Förteckning över gener som används i det aktuella protokollet
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
RNA-redigering spelar en viktig roll i biologin; Nuvarande metoder för att detektera RNA-redigering, såsom kromatografi och sekvensering, utgör emellertid flera utmaningar på grund av deras höga kostnader, överdrivna tidskrav och komplexitet. Protokollet som beskrivs här är en enkel, snabb och kostnadseffektiv metod för att detektera RNA-redigering som använder ett bärbart, mikrosized, TGGE-baserat system. Detta system kan användas för att skilja mellan redigerade och icke-redigerade gener före Sanger-sekvensering. Specifikt kan redigerade och icke-redigerade gener med enbasnukleotidmodifieringar differentieras baserat på förändringar i TGGE-smältprofilerna. Eftersom det innehåller 1 i geler kräver systemet mycket små mängder prover och möjliggör snabb upptäckt av skillnader mellan sekvenser. Dessutom är protokollet som beskrivs här mycket lätt att följa för både experter och nykomlingar på området. Optimering av målgenfragmentet är avgörande för tydlig differentiering mellan redigerade och icke-redigerade regioner, och denna process förenklas i det nuvarande protokollet.
Detta protokoll är kompatibelt med multiplexanalyser med fluorescerande märkta primers. För kvantitativa analyser kan okända RNA-prover (redigerade eller icke-redigerade) märkas med grön fluorescens och komigeras med en röd fluorescensmärkt referensstandard (redigerad eller icke-redigerad) under TGGE-analys.
Förutom att demonstrera förmågan hos μTGGE-metoden att detektera enstaka nukleotid-RNA-redigeringshändelser, validerade vi också likheten mellan det experimentella resultatet erhållet med användning av μTGGE och ett teoretiskt resultat erhållet för samma genfragment med användning av uMELT. Vidare fann vi att nukleotidbasskillnader belägna vid 5'- och 3'-terminalerna i genfragment ger större skillnader i μTGGE-smältprofiler (dvs. mindre PaSS-värden) än de som ligger mot mitten av fragmenten. Även om det är lovande kan det nuvarande protokollet begränsas till analys och detektion av specifika typer av nukleotidmodifieringar under RNA-redigering. Ytterligare optimering och utveckling av detta protokoll för att analysera andra typer och / eller platser för RNA-redigering kommer att utföras i vår kommande forskning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar inga intressekonflikter.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av ett grant-in-aid för vetenskaplig forskning från Japan Society for the Promotion of Science (17H02204 och 18K19288). Ruchika stöddes ekonomiskt av den japanska regeringen (MEXT-stipendium). Vi tackar Radhika Biyani (Takagi Laboratory, JAIST) och Dr. Kirti Sharma (BioSeeds Corporation) för hjälp med elektroforesrelaterade experiment.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2U ExoI | Takara | 2650A | Exonuclease I |
| 40(w/v)%-acrylamide/bis (19:1) | Thermo fisher | AM9022 | |
| Ammonium persulfate (APS) | Thermo Fisher | 17874 | |
| Centrifuge Mini spin | eppendorf | 5452000034 | |
| Digital dry bath/ block heater | Thermo fisher | NA | |
| Gold Taq Polymerase Master mixture | Promega | M7122 | |
| LATaq DNA polymerase | TAKARA | RR002A | Taq Polymerase |
| micro-TGGE cassette holder | BioSeeds Corp. | BS-GE-CH | |
| micro-TGGE apparatus | Lifetech Corp. | TG | |
| micro-TGGE gel cassette | BioSeeds Corp. | BS-TGGE-C | |
| NanoDrop 1000 | Thermo fisher | ND-1000 | Spectrophotometer |
| Plant Rneasy Mini kit | Qiagen | 74904 | |
| ReverTra Ace Master Mix | TOYOBO | TRT101 | M-MLV (Moloney Murine Leukemia Virus) reverse transcriptase |
| Rneasy Mini kit | Qiagen | 74104 | |
| Shrimp Alkaline Phosphatase | Takara | 2660B | |
| SYBR Gold nucleic acid gel stain | Thermo fisher | S11494 | |
| TBE buffer | Thermo fisher | B52 | |
| Tetramethylethylenediamine (TEMED) | Nacalai tesque | 33401-72 | |
| Urea, Nuclease and protease tested | Nacalai tesque | 35940-65 |
References
- Chateigner-Boutin, A. L., Small, I. A rapid high-throughput method for the detection and quantification of RNA editing based on high-resolution melting of amplicons. Nucleic Acids Research. 35 (17), 114 (2007).
- Chen, Y. C., et al. A real-time PCR method for the quantitative analysis of RNA editing at specific sites. Analytical Biochemistry. 375 (1), 46-52 (2008).
- Barbon, A., Vallini, I., La Via, L., Marchina, E., Barlati, S. Glutamate receptor RNA editing: a molecular analysis of GluR2, GluR5 and GluR6 in human brain tissues and in NT2 cells following in vitro neural differentiation. Molecular Brain Research. 117 (2), 168-178 (2003).
- Gallo, A., Thomson, E., Brindle, J., O'Connell, M. A., Keegan, L. P. Micro-processing events in mRNAs identified by DHPLC analysis. Nucleic Acids Research. 30 (18), 3945-3953 (2002).
- Schiffer, H. H., Heinemann, S. F. A Quantitative method to detect RNA editing events. Analytical Biochemistry. 276 (2), 257-260 (1999).
- Burns, C. M., et al. Regulation of serotonin-2C receptor G-protein coupling by RNA editing. Nature. 387 (6630), 303-308 (1997).
- Marian, A. J.
- Bird, A. Genome biology: Not drowning but waving. Cell. 154 (5), 951-952 (2013).
- Jones, B. M., Knapp, L. A. Temporal temperature gradient electrophoresis for detection of single nucleotide polymorphisms. Methods in Molecular Biology. 578, Clifton, N.J. 153-165 (2009).
- Riesner, D., et al. Temperature-gradient gel electrophoresis of nucleic acids: analysis of conformational transitions, sequence variations, and protein-nucleic acid interactions. Electrophoresis. 10 (5-6), 377-389 (1989).
- Biyani, M., Nishigaki, K. Hundred-fold productivity of genome analysis by introduction of micro-temperature gradient gel electrophoresis. Electrophoresis. 22 (1), 23-28 (2001).
- Rathore, H., Biyani, R., Kato, H., Takamura, Y., Biyani, M. Palm-size and one-inch gel electrophoretic device for reliable and field-applicable analysis of recombinase polymerase amplification. Analytical Methods. 11 (39), 4969-4976 (2019).
- Dwight, Z., Palais, R., Wittwer, C. T. uMELT: prediction of high-resolution melting curves and dynamic melting profiles of PCR products in a rich web application. Bioinformatics. 27 (7), 1019-1020 (2011).
- Rio, D. C., Ares, M., Hannon, G. J., Nilsen, T. W. Purification of RNA using TRIzol (TRI Reagent). Cold Spring Harbor Protocols. 2010 (6), (2010).
- Bhakta, S., Sakari, M., Tsukahara, T. RNA editing of BFP, a point mutant of GFP, using artificial APOBEC1 deaminase to restore the genetic code. Scientific Reports. 10 (1), 17304 (2020).
- Azad, T. A., Qulsum, U., Tsukahara, T. Comparative activity of adenosine deaminase acting on RNA (ADARs) isoforms for correction of genetic code in gene therapy. Current Gene Therapy. 19 (1), 31-39 (2019).
- Ruchika, O. C., Sakari, M., Tsukahara, T. Genome-wide identification of U-To-C RNA editing events for nuclear genes in Arabidopsis thaliana. Cells. 10 (3), 635 (2021).
- Tsukahara, T. The U-to-C RNA editing affects the mRNA stability of nuclear genes in Arabidopsis thaliana. Biochemical and Biophysical Research Communications. 571, 110-117 (2021).
