Summary
本方案描述了一种标准化的手术方法，通过弹性蛋白酶直接应用于小鼠红外腹主动脉的外来，用于弹性蛋白酶诱导的AAA模型。
Abstract
腹主动脉瘤 （AAA） 虽然主要无症状，但可能危及生命，因为 AAA 破裂通常具有毁灭性后果。目前，AAA有几种不同的实验模型，每种模型都强调AAA发病机制的不同方面。弹性蛋白酶诱导的AAA模型是第二常用的啮齿动物AAA模型。该模型涉及直接输注或应用猪胰腺弹性蛋白酶（PPE）到主动脉的红外线段。由于技术挑战，现在大多数弹性蛋白酶诱导的AAA模型都是通过外部应用而不是腔内输注PPE进行的。弹性蛋白酶的浸润会导致内侧层弹性薄片的降解，导致主动脉壁完整性的丧失和随后的腹主动脉扩张。然而，弹性蛋白酶诱导的AAA模型的一个缺点是手术方式的不可避免的变化。具体而言，分离主动脉红外段的手术技术、用于主动脉包裹和PPE孵育的材料、PPE的酶活性以及PPE应用的持续时间都是影响最终AAA形成速率和动脉瘤直径的重要决定因素。值得注意的是，这些因素与AAA不同研究的差异可能导致可重复性问题。本文描述了弹性蛋白酶诱导的AAA模型的详细手术过程，方法是将PPE直接应用于小鼠红外腹主动脉的外膜。按照这一程序，雄性和雌性小鼠的稳定AAA形成率约为80%是可以实现的。通过建立标准外科手术，使用弹性蛋白酶诱导的AAA模型的AAA研究的一致性和可重复性可以显着提高。
Introduction
腹主动脉瘤 （AAA） 定义为腹主动脉节段性扩张，血管直径至少增加 50%1。AAA可能是致命的，因为破裂可导致极高的死亡率，即使有干预2，3，4。据报道，AAA每年在美国造成约13，000人死亡，这使其成为第 10大死因1，5。
AAA的发病机制尚未完全了解6，7，8。为了研究AAA的分子机制并测试潜在的治疗靶点，已经建立了几个实验AAA模型9，10。AAA的啮齿动物模型包括弹性蛋白酶、氯化钙、血管紧张素II和异种移植物模型，其中弹性蛋白酶诱导的AAA模型是第二常用的模型10、11、12、13、14、15、16、17。该模型涉及直接输注或应用猪胰腺弹性蛋白酶（PPE）到主动脉的红外线段。弹性蛋白酶渗透到主动脉的内侧层将导致弹性薄片的降解和炎性细胞的浸润，导致主动脉壁完整性的丧失和随后腹主动脉7，18的扩张。弹性蛋白酶诱导的AAA模型于1990年由Anidjar等人使用大鼠首次报道，其中分离的主动脉部分灌注弹性蛋白酶17。2012年晚些时候，Bhamidipati等人报告了使用个人防护装备的腹膜应用的改进模型。如今，弹性蛋白酶诱导的AAA模型的大多数手术都受到Bhamidipati组的启发，并且通过外部应用而不是PPE的腔内灌注进行。虽然外用对精细手术技能的要求较低，但AAA的发生率相对较低，且尺寸略小于腔内灌注11，19。
虽然在AAA研究中广泛使用，但弹性蛋白酶诱导的AAA模型具有一定的局限性。该模型的一个警告是手术方式的不可避免的变化，这可能导致可重复性的问题。例如，在如何分离主动脉的红外线段以及选择该段的哪个部分用于不同实验室的PPE应用方面，外科手术中可能存在差异。PPE的酶活性和PPE孵育的持续时间也可能不同。然而，这些都是影响最终AAA形成率和动脉瘤直径的基本决定因素。这些关键决定因素的变化使得使用该模型的不同组的AAA研究的数据比较非常困难。因此，需要标准化的外科手术程序作为从各种机构获得可比结果的工具。
本文描述了弹性蛋白酶诱导的AAA模型的标准化手术方案，方法是将PPE直接应用于小鼠红外腹主动脉的外膜。还将讨论有关使用此模型在小鼠中成功和稳健地生成AAA所必需的手术材料和程序的详细信息。
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Protocol
动物协议已获得密歇根大学机构动物护理和使用委员会（PRO00010092）的批准。雄性和雌性C57BL / 6J野生型（WT）小鼠，〜7周龄，用于实验。
1. 动物准备
- 在手术前后用标准的食物喂养小鼠（参见 材料表）。
注意：可以使用不同的菌株和年龄的小鼠。然而，建议年龄在 5.5-12 周龄范围内，以达到最大发病率。 - 对于每只小鼠，在麻醉诱导前30分钟皮下施用5mg / kg卡洛芬。
- 30分钟后， 通过 腹膜注射给予100mg / kg氯胺酮和5mg / kg甲苯噻嗪以诱导麻醉。
2. 手术准备
- 准备手术材料。
- 将丁腈手套切成4厘米x 4毫米的条状。将化妆棉切成3厘米x 2毫米的碎片。用其他手术器械高压灭菌这些，包括手术剪刀，组织镊子和Halsted-Mosquito止血器（ 见材料表）。
- 将鼠标置于无菌吸收剂敷料垫上的仰卧位。用手术胶带固定前爪和后爪。
- 使用棉头涂抹器（见 材料表）将脱毛剂化妆水刷在中下腹部区域，然后用手术纱布擦拭该区域以去除毛发。
- 以打圈的方式对手术区域进行至少三次消毒，交替使用70%酒精和碘基或氯己定基磨砂膏。让其干燥。
3. 手术程序
- 执行以下步骤以进入腹腔。
- 在皮肤切口前测试小鼠缺乏脚趾夹反应。
- 使用手术剪刀沿着中下腹部的中线在皮肤上做一个2.5厘米的纵向切口。
- 轻轻拉起下面的肌肉，沿着白线做一个2.5厘米的纵向切口，以进入腹腔。
- 暴露腹主动脉。
- 使用湿润的棉头涂抹器将肠道和胃移动到小鼠的右侧。
注意：理想情况下，这将暴露主动脉的红外线段。如果主动脉难以定位，右肾和右肾动脉可以识别主动脉（因为右肾的解剖位置略低于左肾）。 - 使用镊子轻轻切除覆盖腹主动脉和下腔静脉（IVC）的结缔组织。
注意：腹主动脉和IVC包含在同一血管鞘内。没有必要去除所有结缔组织，因为完全去除会增加损坏这两个血管的风险。 - 使用镊子轻轻地从下面的肌肉中解剖腹主动脉和IVC的背面。
注意：镊子的尖端应横向进入鞘的背面，并在筋膜上形成一个将鞘连接到下层肌肉的孔。一旦孔被打好，通过缓慢释放镊子来扩大其尺寸。 - 将一块4厘米x 4毫米的手套条纹（如前所述，步骤2.1.1）穿过腹主动脉和IVC的背面，然后拉直条纹。将条纹放置在距离右肾动脉约0.5厘米的地方。
注意：确保孔足够大，以便周围的筋膜不会扭曲条纹。 - 在条纹上方，将一块3厘米x 2毫米的化妆棉垫穿过腹主动脉和IVC的背面，然后拉直化妆棉。
- 使用湿润的棉头涂抹器将肠道和胃移动到小鼠的右侧。
- 孵育弹性蛋白酶。
- 使用移液器将30μL猪胰腺弹性蛋白酶（总酶活性为1.8单位，见 材料表）滴到化妆棉上方的主动脉段上，然后将化妆棉包裹在主动脉和IVC周围。用无菌的0.9%盐水冲洗一块10厘米x 10厘米的纱布，并将其放在腹部。
注意：纱布只需要部分冲洗，因为过量使用可能会稀释下面的弹性蛋白酶。 - 30分钟后，用镊子取下条纹和化妆棉。
- 使用移液器将30μL猪胰腺弹性蛋白酶（总酶活性为1.8单位，见 材料表）滴到化妆棉上方的主动脉段上，然后将化妆棉包裹在主动脉和IVC周围。用无菌的0.9%盐水冲洗一块10厘米x 10厘米的纱布，并将其放在腹部。
- 按照以下步骤关闭腹腔。
- 用500μL无菌0.9%盐水冲洗主动脉和腹腔。使用10厘米x 10厘米的纱布吸收剩余的盐水。
- 用6-0不可吸收的单丝缝合线重新靠近肌肉层。
- 用3-4根中断的6-0不可吸收的单丝缝合线闭合皮肤。
4. 术后护理
- 术后第1天皮下注射5mg / kg卡洛芬。
- 在术后第10天去除皮肤缝合线。
5. 测量腹主动脉瘤直径
- 在术后第14 天通过CO 2过量对小鼠实施安乐死。这表示最大膨胀的时间点。
- 按照步骤3.1中所述进入腹腔。
- 通过将 10 mL 0.9% 盐水通过左心室注射到循环中来进行血管灌注。
- 暴露腹主动脉的红外线段，如步骤3.1-3.2中所述。小心切除周围的结缔组织，将腹主动脉与IVC分开。
- 用卡尺测量腹主动脉的直径。
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Representative Results
总共有23只7周龄的野生型（WT）小鼠，包括12只雌性和11只雄性，按照所提出的方案进行手术。存活率为100%（不包括手术死亡率）。最大腹主动脉直径由卡尺测量。
AAA被定义为腹主动脉扩张，血管直径增加50%。因此，选择腹主动脉最大直径增加 50% 作为成功 AAA 诱导的临界点。根据这一标准，雌性动物术后第14天AAA的发生率为91.7%，接受手术的12只动物中有11只发展为AAA;而雄性动物的发病率为72.7%，接受手术的11只动物中有8只发展为AAA（图1A）。在发生AAA的19种动物中，与非手术对照组相比，雌性和雄性的最大腹主动脉直径分别增加了1.7倍和1.6倍（图1B）。术后第14天来自非手术组和手术组的主动脉的代表性图像如图 1C所示。
图1：接受手术的小鼠中AAA的表征。 所有测量均在术后第14天完成。（A）接受手术的小鼠中AAA的发病率。（B）非手术（雌性和雄性为n = 4）和手术组（雌性为n = 12;雄性为n = 11）小鼠中红外线主动脉的最大直径。数据均±SEM.*p <0.05。（C）来自非手术组和手术组的小鼠主动脉的代表性图像。比例尺 = 2 mm。 请点击此处查看此图的大图。
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Discussion
弹性蛋白酶诱导的AAA模型首先由Anidjar等人于1990年使用大鼠报道17。在过去的三十年中，已经引入了各种改进版本，同时在手术技术方面有显着改进19，20，21，22。数百个研究所使用弹性蛋白酶诱导的AAA模型作为AAA研究的第二常用啮齿动物实验模型12。很自然，不同的小组将以略微不同的方式进行这种模型的手术。因此，该模型的一个警告是手术方式的不可避免的变化，这使得使用此模型比较来自不同组的数据非常困难。这些变化包括但不限于如何暴露主动脉的红外线段，覆盖主动脉的筋膜层的清洁范围，孵育期有多长，以及用于主动脉包裹和弹性蛋白酶孵育的材料以及添加到包裹材料上的弹性蛋白酶的体积。然而，这些都是影响AAA最终发病率和直径的重要决定因素。需要标准化的外科手术来解决这些变化引起的可重复性问题。本文通过直接将PPE应用于小鼠红外腹主动脉外膜，为弹性蛋白酶诱导的AAA模型提供了标准化的手术方案。
除了AAA的一致感应率外，该协议还具有低费用和短操作时间的优点。该方案中使用的手术材料都可以以低成本轻松获得。该方案的平均操作时间为50分钟，包括30分钟的PPE孵育。这些优点将允许许多动物研究更容易进行，有助于更大的统计能力和可重复性。
腹主动脉暴露是该方案中最关键的一步。必须去除围绕腹主动脉和IVC的血管鞘中的结缔组织，以便弹性蛋白酶有更好的机会穿透主动脉的内侧层。然而，完全切除这些结缔组织非常耗时，并且有损害下层主动脉和IVC的风险。这是导致大多数手术死亡的步骤。如果IVC或主动脉受损，大多数动物即使通过手术存活，也无法在接下来的48小时内存活下来，这可能是由于手术后持续出血导致放血。出于这个原因，在最大程度上暴露主动脉和不损坏大血管之间的微妙平衡需要考虑。在血管鞘上留下少量结缔组织将显着降低围手术期死亡率，同时不影响AAA的发生。因此，不建议完全切除覆盖主动脉和IVC的结缔组织以暴露于腹主动脉。尽管如此，在腹主动脉和IVC从邻近结缔组织解剖过程中仍需要格外小心。
在解剖学上，腹主动脉和IVC 通过 薄筋膜层紧密连接，并一起包含在同一血管鞘中。一些实验模型，如静脉血栓形成，可能需要将主动脉与邻近的IVC分开。然而，在弹性蛋白酶诱导的AAA模型23中没有必要这样做。有些人可能更喜欢顺时针旋转血管鞘，以便主动脉正好位于IVC上方，然后弹性蛋白酶可以直接施用于主动脉。这是不必要的，因为下面的化妆棉被弹性蛋白酶饱和，并且主动脉将持续暴露于弹性蛋白酶，而不管其与IVC的解剖学关系如何。建议 通过 镊子将主动脉和IVC的背面与下层肌肉充分分离。如果此步骤中的解剖范围不够广泛，则周围的筋膜和条纹和棉垫上的肌肉将产生张力，导致它们的扭曲和随后弹性蛋白酶的低效吸收。
该协议的一个限制是诱导AAA的最终形状。不可避免的是，当被滴到主动脉上时，一些弹性蛋白酶会流向主动脉的其他部分，这些部分没有被棉垫包裹。此外，在30分钟的潜伏期内，由解剖引起的附近出血，即使是少量的出血，也可以将弹性蛋白酶从化妆棉洗到其他主动脉段。这些将导致弹性蛋白酶穿透主动脉的其他部分，从而导致内侧层的分解和腹主动脉的扩张，而不限于棉垫包裹的节段。因此，一些动物没有表现出由局灶性扩张引起的梭形动脉瘤，而是表现出腹主动脉长段的一般扩张。然而，与对照组相比，这些主动脉持续扩张的动物的最大主动脉直径仍然显示增加50%以上。同时，在腹主动脉连续扩张和局灶性扩张的动物之间没有观察到最大主动脉直径的差异，这表明动脉瘤的形状既不是成功诱导AAA的指标，也不是在这种情况下的实际AAA大小。
该协议的另一个限制是将这种方法应用于大型动物。局部弹性蛋白酶诱导的AAA模型应易于应用于其他小动物，如大鼠。然而，单独的弹性蛋白酶可能不足以使猪或灵长类动物等大型动物诱导一致的AAA表型。例如，Marinov等人报告说，仅在猪中灌注弹性蛋白酶可引起一些组织学变化，包括弹性蛋白破坏，但不能诱导一致的动脉瘤24。Shannon A等人报道了弹性蛋白酶诱导的红外线AAA的猪模型。然而，鉴于主动脉25 的相当耐久性，它需要球囊血管成形术、灌注、局部弹性蛋白酶和含有 BAPN（一种防止胶原交联的赖氨酰氧化酶抑制剂）的饮食。因此，由于小鼠和大型动物之间主动脉的大小和耐久性的差异，技术挑战以及潜在的高成本，标准化弹性蛋白酶诱导的AAA方案在大型动物中的应用似乎仍然相当具有挑战性。
总之，尽管存在一些局限性，但在此标准化方案中，AAA可以在雄性和雌性小鼠中一致诱导。通过建立这种标准外科手术，使用弹性蛋白酶诱导的AAA模型的AAA研究的一致性和可重复性有望显着提高。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
我们感谢密歇根大学实验动物医学部在动物饲养和繁殖方面的帮助。本研究由NIH RO1 HL138139，NIH RO1 HL153710至J. Zhang，NIH RO1 HL109946，RO1 HL134569至Y.E. Chen，以及美国心脏协会资助20POST35110064至G. Zhao。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 6-0 non-absorbable monofilament suture | Pro Advantage | P420697 | |
| Carprofen | Zoetis Inc. | NDC: 54771-8507 | |
| Chow Diet | LabDiet | 3005659-220 | PicoLab 5L0D |
| Cotton Applicator | Dynarex | 4303 | |
| Cotton Pad | Rael | UPC: 810027130969 | |
| GraphPad Prism 8 | GraphPad Software Inc. | Version 8.4.3 | |
| Grarfe Forceps | Fine Science Tools | 11051-10 | |
| Halsted Mosquito Hemostats | Fine Science Tools | 13009-12 | |
| Ketamine | Par Pharmaceutical | NDC: 42023-0115-10 | |
| Nitrile gloves | Fisherbrand | 19-130-1597 | |
| Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher | 15140122 | |
| Porcine pancreatic elastase | Sigma-Aldrich | E1250-100MG | |
| Scissors | Fine Science Tools | 14068-12 | |
| Sterile 0.9% saline solution | Baxter | 2B1324X | |
| Xylazine | Akorn | NDC: 59399-110-20 |
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