Protokollen her viser at ekstracellulære vesikler kan skilles tilstrekkelig fra betingede cellekulturmedier ved bruk av størrelseseksklusjonskromatografi.
Ekstracellulære vesikler (EV) er nano-størrelse lipidmembranbundne strukturer som frigjøres fra alle celler, er tilstede i alle biofluider, og inneholder proteiner, nukleinsyrer og lipider som reflekterer foreldrecellen som de er avledet fra. Riktig separasjon av elbiler fra andre komponenter i en prøve muliggjør karakterisering av tilhørende last og gir innsikt i deres potensial som intercellulære kommunikatorer og ikke-invasive biomarkører for mange sykdommer. I den nåværende studien ble oligodendrocytterte elbiler isolert fra cellekulturmedier ved hjelp av en kombinasjon av toppmoderne teknikker, inkludert ultrafiltrering og størrelseseksklusjonskromatografi (SEC) for å skille elbiler fra andre ekstracellulære proteiner og proteinkomplekser. Ved hjelp av kommersielt tilgjengelige SEC-kolonner ble EV skilt fra ekstracellulære proteiner frigjort fra humane oligodendrogliomceller under både kontroll og endoplasmatisk retikulum (ER) stressforhold. De kanoniske EV-markørene CD9, CD63 og CD81 ble observert i fraksjonene 1-4, men ikke i fraksjonene 5-8. GM130, et protein i Golgi-apparatet, og calnexin, et integrert protein av ER, ble brukt som negative EV-markører, og ble ikke observert i noen fraksjon. Videre, ved sammenslåing og konsentrasjon av fraksjonene 1-4 som EV-fraksjonen, og fraksjonene 5-8 som proteinfraksjonen, ble ekspresjon av CD63, CD81 og CD9 i EV-fraksjonen observert. Ekspresjonen av GM130 eller kalnexin ble ikke observert i noen av fraksjonstypene. De samlede fraksjonene fra både kontroll- og ER-stressforhold ble visualisert med transmisjonselektronmikroskopi og vesikler ble observert i EV-fraksjonene, men ikke i proteinfraksjonene. Partikler i EV og proteinfraksjoner fra begge forholdene ble også kvantifisert med nanopartikkelsporingsanalyse. Sammen viser disse dataene at SEC er en effektiv metode for å skille elbiler fra betingede cellekulturmedier.
Eksplosjonen av interesse for å studere ekstracellulære vesikler (EV) har blitt ledsaget av store fremskritt i teknologiene og teknikkene som brukes til å skille og studere disse nanostore, heterogene partiklene. I tiden siden oppdagelsen for nesten fire tiår siden1,2, har disse små membranøse strukturer blitt funnet å inneholde bioaktive lipider, nukleinsyrer og proteiner, og spiller store roller i intercellulær kommunikasjon 3,4. Elbiler frigjøres fra alle celletyper og er derfor til stede i alle biologiske væsker, inkludert blodplasma og serum, spytt og urin. Elbiler i disse væskene har stort løfte om å tjene som ikke-invasive biomarkører for ulike sykdommer, inkludert nevroinflammatoriske og nevrodegenerative sykdommer, kreft og autoimmune lidelser 5,6,7. Videre kan in vitro mekanistiske studier utføres gjennom cellekulturteknikker ved å separere elbiler som slippes ut i kulturmediet 3,8,9.
For å forstå elbilers rolle i sykdomspatofysiologi, er tilstrekkelig separasjon fra væsken der de er funnet, avgjørende. Gullstandarden for EV-separasjon har lenge vært differensial ultracentrifugering (dUC)10, men mer sofistikerte teknikker har oppstått for å oppnå bedre separasjon av elbiler fra andre ekstracellulære komponenter. Noen av disse teknikkene inkluderer tetthetsgradienter, asymmetrisk strømningsfeltstrømningsfraksjon (A4F), flowcytometri, immunfangst, polyetylenglykolutfelling og størrelseseksklusjonskromatografi (SEC)11,12,13. Hver teknikk har sitt eget sett med fordeler og ulemper; Imidlertid har SEC spesielt vist seg å skille elbiler fra både biologiske væsker og cellekultursupernatanter ganske effektivt 8,14,15. SEC har også den ekstra bonusen å være relativt grei og brukervennlig.
SEC er en metode som separerer komponenter av en væske basert på størrelse. Med denne teknikken brukes en kolonne av harpiks (enten laget internt eller kjøpt kommersielt) for å fraksjonere en prøve. Små partikler i prøven blir fanget mellom perlene i harpiksen, mens større partikler er i stand til å passere gjennom harpiksen mer fritt, og dermed eluere tidligere i prosessen. Fordi elbiler er større i størrelse enn mange ekstracellulære proteiner og proteinaggregater, passerer elbiler raskere gjennom kolonnen og eluerer i tidligere fraksjoner enn ekstracellulære proteiner14.
I dette metodepapiret skisseres bruken av SEC for separasjon av EV fra cellekulturmedier (CCM) fra humane oligodendrocytter under både kontroll og endoplasmatisk retikulum (ER) stressforhold. Ved hjelp av denne protokollen er det vist at elbiler separert med denne teknikken finnes innenfor spesifikke fraksjoner som kan samles sammen og konsentreres for nedstrøms karakterisering, og at de separerte elbilene er avledet fra celler og ikke fra en eksogen kilde som føtalt bovint serum (FBS) som brukes til å supplere CCM. Tilstedeværelsen av de kanoniske EV-markørene, CD63, CD81 og CD916,17,18,19 i EV-fraksjonene, og deres fravær i proteinfraksjonene er demonstrert med vestlig blotting. Ved hjelp av transmisjonselektronmikroskopi (TEM) visualiseres EV og viser forventet morfologi og observeres bare i EV-fraksjonen. Partikler telles også i EV- og proteinfraksjonene av både kontroll- og ER-spenningsforhold, og et stort antall partikler innenfor det forventede størrelsesområdet 50-200 nm i diameter observeres i EV-prøvene. Sammen støtter disse dataene forestillingen om at SEC er en effektiv og effektiv metode for å skille elbiler fra cellekulturmedier.
SEC er en brukervennlig metode for tilstrekkelig separering av elbiler fra betinget CCM. For å spesifikt isolere celleavledede elbiler, må det tas hensyn til typen CCM og dens kosttilskudd. Mange cellekulturmedier må suppleres med FBS, som inneholder elbiler avledet fra dyret der serumet ble høstet. Disse serum-EV-ene kan mette og maskere ethvert signal produsert av elbiler avledet fra celler i kultur26. Derfor, når du utfører eksperimenter, bør EV-utarmet FBS brukes når det er mulig for ?…
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne vil gjerne takke Penn State Behrend og Hamot Health Foundation for finansiering, samt Penn State Microscopy Facility i University Park, PA.
2-Mercaptoethanol | VWR | 97064-588 | |
4X Laemmli Sample Buffer | BioRad | 1610747 | |
Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Unit, Ultracel, 3 KDa, 15mL | Sigma-Aldrich | UFC900308 | 3 kDa cutoff |
Amicon Ultra-2 Centrifugal Filter Unit with Ultracel-3 membrane | Sigma-Aldrich | UFC200324 | 3 kDa cutoff |
Ammonium Persulfate | Sigma-Aldrich | A3678-100G | |
Anti rabbit IgG, HRP linked Antibody | Cell Signaling Technology | 7074V | 1:1000 Dilution |
Anti-Calnexin antibody | Abcam | ab22595 | 1:500 Dilution |
Anti-CD9 Mouse Monoclonal Antibody | BioLegend | 312102 | 1:500 Dilution |
Anti-GM130 antibody [EP892Y] – cis-Golgi Marker | Abcam | ab52649 | 1:500 Dilution |
Anti-mouse IgG, HRP-linked Antibody | Cell Signaling Technology | 7076V | 1:1000 Dilution |
Automatic Fraction Collector | Izon Science | ||
BCA assay Kit | Bio-Rad | ||
CCD camera | Gatan Orius SC200 | ||
Cd63 Mouse anti Human | BD | 556019 | 1:1000 Dilution |
CD81 Antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-23962 | 1:1000 Dilution |
Cellstar Filter Cap Cell Culture Flasks | Greiner Bio-One | 660175 | |
ChemiDoc MP Imager | BioRad | ||
Clarity Western ECL Substrate | BioRad | 1705061 | |
deoxycholate | Sigma-Aldrich | D6750-10G | |
dithiothreitol | Sigma | 3483-12-3 | |
DMEM/High glucose with L-glutamine; without sodium | Cytiva | SH300022.FS | |
Fetal Bovine Serum Premium grade | VWR | 97068-085 | |
Fetal Bovine Serum, exosome-depleted | Thermo Scientific | A2720801 | |
Glycine | BioRad | 1610718 | |
Great Value Nonfat Dry Milk | Amazon | B076NRD2TZ | |
HOG Human Oligodendroglioma Cell Line | Sigma-Aldrich | SCC163 | |
Izon Science Usa Ltd qev Size Exclusion Columns 5pk | Izon Science | ||
Methanol >99.8% ACS | VWR | BDH1135-4LP | |
Mini-PROTEAN Glass plates | BioRad | 1653310 | with 0.75mm spacers |
Mini-PROTEAN Short plates | BioRad | 1653308 | |
NP-40 | Sigma-Aldrich | 492016 | |
Penicillin-Streptomycin,Solution | Sigma-Aldrich | P4458-100mL | |
Phosphate Buffered Saline PBS | Fisher Scientific | BP66150 | |
Pierce BCA Protein Assay Kits and Reagents | Thermo Fisher Scientific | 23227 | |
Pierce PVDF Transfer Membranes | Thermo Scientific | 88518 | |
Pierce Western Blotting Filter Paper | Thermo Scientific | 84783 | |
Polyoxyethylene-20 (TWEEN 20), 500mL | Bio Basic | TB0560 | |
Protease/phosphatase Inhibitor Cocktail (100X) | Cell Signaling Technology | 5872S | |
Recombinant Anti-TSG101 antibody [EPR7130(B)] | ABCam | ab125011 | 1:1000 dilution |
Slodium hydroxide | Sigma-Aldrich | SX0603 | |
Sodium azide | Fisher Scientific | BP922I-500 | |
Sodium Chloride | Sigma-Aldrich | S9888-500G | |
Sodium dodecyl sulfate,≥99.0% (GC), dust-free pellets | Sigma-Aldrich | 75746-1KG | |
Tetramethylethylenediamine | Sigma-Aldrich | T9281-25ML | |
TGX Stain-Free FastCast Acrylamide Kit, 10% | BioRad | 1610183 | |
Transmission Electron Microscope | FEI Tecnai 12 Biotwin | ||
Tris | BioRad | 1610716 | |
Trypsin 0.25% protease with porcine trypsin, HBSS, EDTA; without calcium, magnesium | Cytiva | SH30042.01 | |
Tunicamycin | Tocris | 3516 | |
Zeta View software | Analytik | NTA software |