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Neuroscience

Größenausschlusschromatographie zur Trennung extrazellulärer Vesikel aus konditionierten Zellkulturmedien

Published: May 13, 2022 doi: 10.3791/63614
Automatic Translation
1, 1, 1,2
1Department of Biology, School of Science, Penn State Erie, The Behrend College, 2Magee Womens Research Institute—Allied Member

Summary

Das Protokoll zeigt hier, dass extrazelluläre Vesikel mittels Größenausschlusschromatographie adäquat von konditionierten Zellkulturmedien getrennt werden können.

Abstract

Extrazelluläre Vesikel (EVs) sind lipidmembrangebundene Strukturen in Nanogröße, die von allen Zellen freigesetzt werden, in allen Bioflüssigkeiten vorhanden sind und Proteine, Nukleinsäuren und Lipide enthalten, die die Mutterzelle widerspiegeln, von der sie abgeleitet sind. Die richtige Trennung von EVs von anderen Komponenten in einer Probe ermöglicht die Charakterisierung ihrer zugehörigen Fracht und gibt Einblick in ihr Potenzial als interzelluläre Kommunikatoren und nicht-invasive Biomarker für zahlreiche Krankheiten. In der aktuellen Studie wurden aus Oligodendrozyten gewonnene EVs aus Zellkulturmedien isoliert, wobei eine Kombination modernster Techniken, einschließlich Ultrafiltration und Größenausschlusschromatographie (SEC), verwendet wurde, um EVs von anderen extrazellulären Proteinen und Proteinkomplexen zu trennen. Unter Verwendung kommerziell erhältlicher SEC-Säulen wurden EVs von extrazellulären Proteinen getrennt, die aus menschlichen Oligodendrogliom-Zellen sowohl unter Kontroll- als auch unter endoplasmatischem Retikulum (ER) -Stressbedingungen freigesetzt wurden. Die kanonischen EV-Marker CD9, CD63 und CD81 wurden in den Fraktionen 1-4 beobachtet, nicht jedoch in den Fraktionen 5-8. GM130, ein Protein des Golgi-Apparates, und Calnexin, ein integrales Protein des ER, wurden als negative EV-Marker verwendet und in keiner Fraktion beobachtet. Ferner wurde beim Pooling und der Konzentration der Fraktionen 1-4 als EV-Fraktion und der Fraktionen 5-8 als Proteinfraktion die Expression von CD63, CD81 und CD9 in der EV-Fraktion beobachtet. Die Expression von GM130 oder Calnexin wurde bei keinem der Fraktionstypen beobachtet. Die gepoolten Fraktionen sowohl aus Kontroll- als auch aus ER-Stressbedingungen wurden mit Transmissionselektronenmikroskopie visualisiert und Vesikel wurden in den EV-Fraktionen, aber nicht in den Proteinfraktionen beobachtet. Partikel in den EV- und Proteinfraktionen aus beiden Bedingungen wurden ebenfalls mit einer Nanopartikel-Tracking-Analyse quantifiziert. Zusammen zeigen diese Daten, dass SEC eine effektive Methode zur Trennung von EVs aus konditionierten Zellkulturmedien ist.

Introduction

Die Explosion des Interesses an der Untersuchung extrazellulärer Vesikel (EVs) wurde von großen Fortschritten in den Technologien und Techniken begleitet, die zur Trennung und Untersuchung dieser nanogroßen, heterogenen Partikel verwendet werden. In der Zeit seit ihrer Entdeckung vor fast vier Jahrzehnten1,2 wurde festgestellt, dass diese kleinen membranösen Strukturen bioaktive Lipide, Nukleinsäuren und Proteine enthalten und eine wichtige Rolle in der interzellulären Kommunikation spielen 3,4. EVs werden von allen Zelltypen freigesetzt und sind daher in allen biologischen Flüssigkeiten vorhanden, einschließlich Blutplasma und Serum, Speichel und Urin. EVs in diesen Flüssigkeiten sind vielversprechend, um als nicht-invasive Biomarker für verschiedene Krankheiten zu dienen, einschließlich neuroinflammatorischer und neurodegenerativer Erkrankungen, Krebs und Autoimmunerkrankungen 5,6,7. Ferner können mechanistische In-vitro-Studien durch Zellkulturtechniken durchgeführt werden, indem in das Kulturmedium 3,8,9 freigesetzte EVs getrennt werden.

Um die Rolle von EVs in der Krankheitspathophysiologie zu verstehen, ist eine angemessene Trennung von der Flüssigkeit, in der sie gefunden werden, von größter Bedeutung. Der Goldstandard für die EV-Trennung ist seit langem die differentielle Ultrazentrifugation (dUC)10, jedoch sind ausgefeiltere Techniken entstanden, um eine bessere Trennung von EVs von anderen extrazellulären Komponenten zu erreichen. Einige dieser Techniken umfassen Dichtegradienten, asymmetrische Flussfeldflussfraktion (A4F), Durchflusszytometrie, Immuneinfang, Polyethylenglykolfällung und Größenausschlusschromatographie (SEC) 11,12,13. Jede Technik hat ihre eigenen Vor- und Nachteile; Es wurde jedoch gezeigt, dass insbesondere SEC EVs sowohl von biologischen Flüssigkeiten als auch von Zellkulturüberständen recht effektiv trennt 8,14,15. SEC hat auch den zusätzlichen Vorteil, relativ einfach und benutzerfreundlich zu sein.

SEC ist eine Methode, die Komponenten einer Flüssigkeit basierend auf der Größe trennt. Bei dieser Technik wird eine Harzsäule (entweder intern hergestellt oder kommerziell gekauft) verwendet, um eine Probe zu fraktionieren. Kleine Partikel in der Probe werden zwischen den Perlen im Harz eingeschlossen, während größere Partikel das Harz freier passieren und somit früher im Prozess eluieren können. Da EVs größer sind als viele extrazelluläre Proteine und Proteinaggregate, passieren EVs die Säule schneller und eluieren in früheren Fraktionen als extrazelluläre Proteine14.

In diesem Methodenpapier wird die Verwendung von SEC zur Trennung von EVs aus Zellkulturmedien (CCM) aus menschlichen Oligodendrozyten sowohl unter Kontroll- als auch unter endoplasmatischem Retikulum (ER) Stressbedingungen skizziert. Unter Verwendung dieses Protokolls wird gezeigt, dass EVs, die mit dieser Technik getrennt werden, in bestimmten Fraktionen gefunden werden, die für die nachgeschaltete Charakterisierung zusammengefasst und konzentriert werden können, und dass die getrennten EVs aus Zellen stammen und nicht aus einer exogenen Quelle wie fetalem Rinderserum (FBS), das zur Ergänzung des CCM verwendet wird. Das Vorhandensein der kanonischen EV-Marker CD63, CD81 und CD916,17,18,19 in den EV-Fraktionen und ihre Abwesenheit in den Proteinfraktionen wird mit Western Blotting nachgewiesen. Mit Hilfe der Transmissionselektronenmikroskopie (TEM) werden EVs sichtbar gemacht und zeigen die erwartete Morphologie und werden nur in der EV-Fraktion beobachtet. Partikel werden auch in den EV- und Proteinfraktionen sowohl der Kontroll- als auch der ER-Stressbedingungen gezählt, und eine große Anzahl von Partikeln innerhalb des erwarteten Größenbereichs von 50-200 nm Durchmesser wird in den EV-Proben beobachtet. Zusammen unterstützen diese Daten die Vorstellung, dass SEC eine effiziente und effektive Methode zur Trennung von EVs aus Zellkulturmedien ist.

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Protocol

1. Herstellung von Puffern und Reagenzien

HINWEIS: Stellen Sie Zellkulturreagenzien in Zellkulturhauben her, um die Sterilität zu erhalten.

  1. Herstellung von Zellkulturreagenzien
    1. Bereiten Sie normales DMEM mit hohem Glukosegehalt zu, indem Sie 50 ml FBS und 5 ml Penicillin-Streptokokken (Pen-Streptokokken) in 500 ml DMEM mit hohem Glukosegehalt geben und bei 4 °C lagern. Verwenden Sie dieses Medium zum Kultivieren und Expandieren von Zellen.
    2. Exosomenarmes DMEM mit hohem Glukosegehalt durch Zugabe von 50 ml FBS mit Exosomenverbrauch und 5 ml Pen-Streptokokken in 500 ml DMEM mit hohem Glukosegehalt herstellen und bei 4 °C lagern. Verwenden Sie dieses Medium für Zellbehandlungen vor der EV-Isolierung.
    3. Bereiten Sie Tunicamycin vor, indem Sie 10 mg Tunicamycin zu 1 ml Dimethylsulfoxid (DMSO) hinzufügen. 50 μL Aliquots in 0,2 ml Röhrchen herstellen und bei -20 °C lagern.
  2. Herstellung von EV-Trennreagenzien
    1. Bereiten Sie 1x phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) vor, indem Sie 9,89 g PBS-Pulver zu 1 L entionisiertem (DI) Wasser in einem 1-L-Messzylinder geben. Rühren Sie die Lösung auf einer Rührplatte, bis sich das PBS auflöst.
    2. Verwenden Sie den Autoklaven, um die Glaswaren zu sterilisieren, bevor Sie PBS hinzufügen. Die Glaswaren in einen Behälter geben, die Tür schließen und 30 min bei 121 °C sterilisieren.
    3. Schließen Sie in einem Laminar-Flow-Schrank ein Vakuum an den 0,22-μm-Filter an und platzieren Sie den Filter auf der autoklavierten Flasche. Gießen Sie das PBS langsam auf den Filter und sammeln Sie das gefilterte PBS in der autoklavierten Flasche.
    4. 0,5 M Natronlauge werden durch Zugabe von 9,99 g Natronlauge zu 500 ml 1x PBS in einem 500-ml-Messzylinder hergestellt. Rühren Sie die Lösung auf einer Rührplatte, bis sich das Natriumhydroxid im PBS auflöst, und filtern Sie dann mit einem 0,22-μm-Filter in eine autoklavierte 500-ml-Flasche.
    5. 0,05% Natriumazid werden durch Zugabe von 0,25 g Natriumazid zu 500 ml 1x PBS in einem 500-ml-Messzylinder hergestellt. Rühren Sie die Lösung auf einer Rührplatte, bis sich Natriumazid im PBS auflöst, und filtrieren Sie dann mit einem 0,22-μm-Filter in eine autoklavierte 500-ml-Flasche.
  3. Herstellung von Proteinisolierungs-, Quantifizierungs- und Identifikationsreagenzien
    1. Bereiten Sie 100 ml RIPA-Lysepuffer durch Kombination von 1 ml 1 M Tris (pH 7,4), 1 ml 10% Natriumdodecylsulfat (SDS), 1 g Desoxycholat, 1 ml NP-40 und 0,89 g Natriumchlorid (NaCl) vor. Das Volumen mit destilliertemH2Oauf 100 mL bringen und bei 4 °C lagern. Um RIPA plus Phosphatase- und Proteaseinhibitorlösung herzustellen, fügen Sie 10 μL Phosphatase und Proteaseinhibitor pro 1 ml RIPA-Puffer in einem 15-ml-Röhrchen hinzu und lagern Sie die Lösung bei 4 °C.
    2. Unmittelbar vor Gebrauch wird das BCA-Assay-Arbeitsreagenz hergestellt, indem 10 ml Reagenz A und 200 μl Reagenz B des BCA-Assay-Kits in ein 15-ml-Röhrchen gegeben werden. Unmittelbar vor Gebrauch wird das Arbeitsreagenz des microBCA-Assays hergestellt, indem 25 Teile Reagenz A, 24 Teile Reagenz B und 1 Teil Reagenz C in ein 15-ml-Röhrchen gegeben werden.
    3. Bereiten Sie 10x Gelelektrophorese-Laufpuffer vor, indem Sie 30,3 g Tris-Base, 144 g Glycin und 10 g SDS in 1 L DI-Wasser hinzufügen. Lagern Sie den laufenden Puffer bei 4 °C. Bereiten Sie 1x Transferpuffer vor, indem Sie 3,03 g Tris-Base, 14,4 g Glycin und 200 ml Methanol hinzufügen und das Volumen mit DI-Wasser auf 1 L einstellen. Lagern Sie den Transferpuffer bei 4 °C.
    4. Bereiten Sie Tris-gepufferte Kochsalzlösung mit Tween-20 (TBS-Tween) zu, indem Sie 2,4 g Tris-Base, 8 g NaCl und 1 ml Tween-20 in 1 L DI-Wasser geben. Lagern Sie das TBS-Tween bei 4 °C.
    5. Bereiten Sie eine 5% ige Blockierlösung vor, indem Sie 5 g fettfreie Milchpulver zu 100 ml TBS-Tween hinzufügen. Lagern Sie den Blockierpuffer bei 4 °C.
    6. Unmittelbar vor Gebrauch Chemilumineszenzsubstrat vorbereiten, indem Sie 4 ml Peroxidlösung und 4 ml Luminol/Enhancer-Lösung in ein 15-ml-Röhrchen geben und vorsichtig umdrehen, um zu mischen.

2. Kultivierung und Behandlung von Zellen

  1. Saat von zwei T175-Zellkulturkolben mit je 2,3 x 106 humanen Oligodendrogliom-Zellen (HOG). Das Endvolumen des normalen DMEM mit hohem Glukosegehalt auf 25 ml bringen und bei 37 °C mit 5%CO2 in einem Zellkulturinkubator für 48 h inkubieren.
  2. Am Ende der 48 h warmes, exosomenarmes DMEM mit hohem Glukosegehalt in einem 37 °C warmen Wasserbad. Zur Behandlung 25 μL 10 mg/ml Tunicamycin zu 25 ml Exosomen-erschöpften Medien hinzufügen, Endkonzentration von 10 μg/ml Tunicamycin, um ER-Stress zu induzieren. Für die Kontrolle fügen Sie 25 μL DMSO zu 25 ml exosomenarmem Medium hinzu.
  3. Entfernen und entsorgen Sie das normale DMEM mit hohem Glukosegehalt aus den Zellen und spülen Sie die Zellen und den Kolben vorsichtig mit 10 ml 1x PBS aus. PBS absaugen und verwerfen.
  4. Geben Sie 25 ml Kontrollmedien in den Kolben mit der Bezeichnung Kontrolle und 25 ml 10 μg/ml Tunicamycin in Medien in den mit der Kolben gekennzeichneten Behandlungskolben. Kolben für 24 h in den Zellkulturinkubator zurückgeben.

3. Sammlung und Konzentration von konditioniertem CCM (Abbildung 1)

  1. PBS in ein 37 °C warmes Wasserbad geben. Beobachten Sie Kolben unter einem zusammengesetzten Mikroskop mit 10x und 100x Objektivlinse. Notieren Sie sich eventuelle Unterschiede zwischen den Flaschen. Führen Sie die folgenden Schritte sowohl für Kontrollkolben als auch für behandelte Kolben durch.
  2. Medien aus dem Kolben entnehmen und in ein 50-ml-Röhrchen geben. Zentrifugieren Sie das Röhrchen bei 500 x g für 5 min bei 4 °C. Übertragen Sie den Überstand in ein neues 50-ml-Röhrchen.
  3. Zentrifugieren Sie das Röhrchen bei 2.000 x g für 20 min bei 4 °C. Den Überstand in ein neues 50-ml-Röhrchen überführen und auf Eis legen.
  4. Erhalten Sie vier 15-ml-3-kDa-Cutoff-Ultrafiltrationseinheiten und fügen Sie jedem Röhrchen 5 ml PBS hinzu. Ansaugen des Filters durch Zentrifugieren der Ultrafiltrationseinheiten bei 4.000 x g für 10 min bei 4 °C.
    HINWEIS: 3 kDa Molekulargewicht-Cutoff-Ultrafiltrationseinheiten wurden im aktuellen Protokoll verwendet, um alle extrazellulären Proteine zu erhalten, die aus Zellen freigesetzt werden. Größere Molekulargewichts-Cutoff-Ultrafiltrationseinheiten (z. B. 30 kDa) würden ebenfalls mit diesem Protokoll arbeiten, jedoch würden extrazelluläre Proteine kleiner als 30 kDa herausgefiltert und aus den Probenentfernt 20,21.
  5. Entfernen Sie PBS aus den Ultrafiltrationseinheiten. Teilen Sie den Überstand aus jedem Zustand (Kontrolle und Tunicamycin-Behandlung) in zwei Ultrafiltrationseinheiten mit jeweils etwa 12,5 ml Medien auf.
  6. Zentrifugieren Sie die Röhrchen bei 4.000 x g für 1 h 45 min bei 4 °C oder bis das konzentrierte Medium (als Retentat bezeichnet) in jeder Ultrafiltrationseinheit auf 250 μL oder weniger konzentriert ist.
  7. Übertragen Sie das Retentat von beiden Kontroll-Ultrafiltrationseinheiten in ein beschriftetes 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen. Das Retentat aus beiden behandelten Ultrafiltrationseinheiten wird in ein anderes markiertes 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen überführt.
  8. Messen Sie das Gesamtvolumen des Retentats in jedem Mikrozentrifugenröhrchen auf 500 μL. Wenn die Probe weniger als 500 μl beträgt, fügen Sie 0,22 μm gefiltertes 1x PBS hinzu, bis das endgültige Volumen 500 μL beträgt.

4. Zellsammlung

  1. Trypsin, PBS und Exosom-depleted DMEM in ein 37 °C warmes Wasserbad geben. 7 ml Trypsin in Kontrollkolben und behandelte Kolben geben und für 5 min in den Inkubator geben.
  2. Sehen Sie unter das Mikroskop, um zu sehen, ob die Zellen angehoben sind. Wenn die Zellen nicht angehoben werden, klopfen Sie den Kolben fest gegen die Handfläche, um die Zellen zu entfernen.
  3. Waschen Sie den Kolben mit 7 ml DMEM mit Exosomenverbrauch. Die Zellsuspension aus dem Kolben entnehmen und in 15-ml-Röhrchen geben.
  4. Zentrifugieren Sie die Röhrchen für 10 min bei 500 x g bei 4 °C. Entfernen Sie den Überstand und fügen Sie 5 ml 1x PBS zum Zellpellet hinzu. Pipettenmischung vorsichtig, um das Pellet aufzubrechen.
  5. Zentrifugieren Sie die Röhrchen bei 500 x g für 5 min bei 4 °C. Entfernen Sie den Überstand und fügen Sie 200 μL RIPA plus Phosphatase und Proteaseinhibitorlösung zum Zellpellet hinzu, pipettieren Sie zum Mischen.
  6. Übertragen Sie die Zellen in der RIPA-Lösung in 1,5-ml-Röhrchen. Lassen Sie die Röhrchen 5 min auf Eis sitzen. Zentrifugieren Sie die Röhrchen bei 14.000 x g für 10 min bei 4 °C.
  7. Übertragen Sie den Überstand in neue 1,5-ml-Röhrchen. Beschriften Sie die Röhrchen mit Behandlungsbedingung und -datum. Legen Sie die Röhrchen in einen Gefrierschrank bei -80 °C.
    HINWEIS: Das Protokoll kann hier pausiert werden.

5. EV-Trennung mittels Größenausschlusschromatographie (Abbildung 2)

HINWEIS: Führen Sie die folgenden Schritte zweimal aus, einmal für Kontrollretentat und einmal für Tunicamycin-behandeltes Retentat.
HINWEIS: Das in diesem Abschnitt verwendete PBS ist 0,22 μm gefiltertes 1x PBS.

  1. Aktivieren Sie den automatischen Fraktionssammler (AFC) und passen Sie die Einstellungen so an, dass acht Brüche, 0,5 ml pro Fraktion und das Puffervolumen (void) auf die Standardwerte erfasst werden.
    HINWEIS: Die AFC-Betriebsbedingungen sind wie folgt: Säulen-/Bettvolumen = 10 ml; Hohlraumvolumen = 2,70 ml; Spülvolumen = 15 ml; optimale Fraktionsgröße = 500 μL; erforderlicher Puffer pro Durchlauf = 65 ml; Durchfluss bei 20 °C = 1,0 ml/min; Wiederverwendbarkeit der Spalte = fünf Verwendungen.
  2. Entfernen Sie die Säule (siehe Materialtabelle) von 4 °C und lassen Sie die Säule vor Beginn auf Raumtemperatur erwärmen (normalerweise ~30 min).
  3. Retentatproben aus dem Gefrierschrank bei -80 °C entnehmen und zum Auftauen auf Eis legen. Stellen Sie während des Wartens acht beschriftete 1,5-ml-Röhrchen in das AFC-Karussell mit Deckeln nach innen.
  4. Fügen Sie die Spalte in den AFC ein, wobei der Barcode dem Lesegerät zugewandt ist. Starten Sie die Sammlung, indem Sie den Anweisungen auf dem Bildschirm folgen, um zu überprüfen, ob sich Röhren im Karussell befinden und der Abfallsammler ordnungsgemäß funktioniert.
  5. Beginnen Sie mit dem Spülen der Säule, indem Sie 15 ml 1x PBS zur Säule hinzufügen, nachdem der Speicherpuffer vollständig in den oberen Teil der Säulenmatrix absorbiert wurde. Fügen Sie PBS nicht zu früh hinzu, da dies den Speicherpuffer verdünnt und eine ausreichende Spülung verhindert.
  6. Kurz bevor alle 15 ml PBS von der Matrix absorbiert werden, klicken Sie auf OK , um die Spülung zu stoppen und alle verbleibenden PBS von der Oberseite der Säulenmatrix mit einer Mikropipette zu entfernen. Berühren Sie die Matrix nicht.
  7. Fügen Sie 500 μL Probe in die Mitte der Säule hinzu. Klicken Sie auf OK , um die Ausführung zu starten. Beobachten Sie, wie die Probe in die Matrix absorbiert wird, und fügen Sie schnell 8 ml PBS in die Säule ein, unmittelbar nachdem die Probe vollständig absorbiert ist.
  8. AFC zerstreut das Hohlraumvolumen automatisch in die Mitte des Karussells und sammelt dann alle acht Fraktionen von jeweils 500 μL. Am Ende des Laufs Fraktionen aus dem Karussell entfernen und auf Eis legen. Die Fraktionen 1-4 enthalten EVs, während die Fraktionen 5-8 extrazelluläre Proteine enthalten. Entfernen Sie das Leerraumvolumen aus der Mitte des Karussells.
  9. Geben Sie 10 ml PBS in die Säule, nachdem die acht Fraktionen gesammelt wurden, um die Restprobe aus der Säule zu waschen. Nachdem die Retentatprobe vollständig durch die Säule gespült wurde, fügen Sie der Säule 15 ml 1x PBS hinzu.
  10. Wenn das endgültige PBS von der Matrix absorbiert wird, fügen Sie 500 μL 0,5 M Natriumhydroxid in die Mitte der Säulenmatrix hinzu. Wenn das Natronlauge absorbiert wird, geben Sie 30 mL 1x PBS in die Säule und lassen Sie sie durchspülen.
  11. Wenn Sie eine weitere Probe ausführen, fügen Sie acht markierte 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen zum Karussell hinzu und wiederholen Sie die Schritte 5.7-5.10.
  12. Wenn Sie mit allen Beispielen fertig sind, führen Sie die folgenden Schritte aus, um die Spalte für die spätere Verwendung aufzubewahren. Nachdem Sie 30 ml PBS wie in Schritt 5.10 beschrieben durch die Säule gespült haben, fügen Sie der Säule 15 ml 0,05% Natriumazid hinzu.
  13. Lassen Sie etwa 5 ml Natriumazid auf der Oberseite der Säulenmatrix. Entfernen Sie die Säule aus dem AFC und bringen Sie die obere und untere Kappe an. Stellen Sie die Säule zur Lagerung wieder auf 4 °C (Säule kann bis zu fünf Mal verwendet werden).

6. Ultrafiltration von EV- und Proteinfraktionen

  1. Pro Probe erhalten Sie zwei 2 ml, 3 kDa Cutoff-Ultrafiltrationseinheiten. Verwenden Sie eine Einheit, um die EV-Fraktionen (Fraktionen 1-4) zu konzentrieren, und die andere, um die Proteinfraktionen zu konzentrieren (Fraktionen 5-8). Jede Einheit besteht aus drei Teilen: Kegel, Filter und Durchflusszylinder; Beschriften Sie jedes Teil ordnungsgemäß.
  2. Konstruieren Sie die Ultrafiltrationseinheit und fügen Sie 1 ml 0,22 μm gefiltertes 1x PBS zum Filterteil und zur Kappe mit dem Kegelstück hinzu. Zentrifugieren Sie die Ultrafiltrationseinheit konusseitig nach oben bei 3.500 x g für 10 min bei 4 °C.
  3. Entfernen Sie das gefilterte PBS aus dem Durchflusszylinder. Die Ultrafiltrationseinheit auf den Kopf stellen (kegelseitig nach unten) und 2 min bei 1.000 x g bei 4 °C zentrifugieren. Entfernen Sie alle verbleibenden PBS aus dem Konus.
  4. Fügen Sie die entsprechenden Fraktionen (das gesamte 500-μL-Volumen) zu jeder Ultrafiltrationseinheit hinzu (das Gesamtvolumen beträgt 2 ml). Zentrifugenkolonnen mit der Kegelseite nach oben für 1 h 45 min bei 3.500 x g bei 4 °C oder bis der Retentatspiegel bei 100 μL liegt.
  5. Entfernen Sie den Durchflusszylinder, und verwerfen Sie den Durchfluss. Die Ultrafiltrationseinheit auf den Kopf stellen (kegelseitig nach unten) und 2 min bei 1.000 x g bei 4 °C zentrifugieren.
  6. Übertragen Sie das Retentat im Kegel in ein markiertes 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen und bringen Sie jedes Probenvolumen auf 150 μL mit 0,22 μm gefiltertem 1x PBS. Legen Sie die Röhrchen in den Gefrierschrank bei -80 °C.
    HINWEIS: Das Protokoll kann hier pausiert werden.

7. Mediensteuerung

  1. Es werden zwei T175-Zellkulturkolben erhalten. Beschriften Sie eine Kolbenkontrolle und die andere Behandlung. Warmes exosomenarmes DMEM mit hohem Glukosegehalt in einem 37 °C warmen Wasserbad.
  2. 25 μl Tunicamycin-Stammlösung (10 mg/ml) zu 25 ml Medium geben und in den mit der Aufschrift gekennzeichneten Kolben geben. Geben Sie 25 μL DMSO zu 25 ml Medium und legen Sie es in den Kolben mit der Bezeichnung Kontrolle. Kolben 24 h in einem Zellkulturinkubator aufbewahren.
  3. Sammeln Sie Medien und Prozesse, um Elektrofahrzeuge zu trennen, wie in den Schritten 3.2-3.8 beschrieben. Führen Sie anschließend alle in den Abschnitten 5 und 6 beschriebenen Schritte aus.

8. Western Blotting

  1. Proteinquantifizierung aus Zelllysaten und Proteinfraktionen mit BCA-Assay
    HINWEIS: Die Proteinquantifizierung sowohl aus Kontroll- als auch aus Tunicamycin-behandelten Proben wird mit den folgenden Schritten durchgeführt.
    1. Aufgetaute Zellen und Proteinfraktionen auf Eis. Machen Sie drei Verdünnungsröhrchen für jede Probe; 1:2, 1:10 und 1:100.
    2. In dreifacher Ausfertigung auf eine 96-Well-Clear-Bottom-Assay-Platte, 25 μL Rinderserumalbumin (BSA)-Proteinstandards und 25 μL jeder Probenverdünnung geladen. Geben Sie 200 μL Arbeitsreagenz mit einer Mehrkanalpipette in jede Vertiefung, die Standard oder Probe enthält.
    3. Die Platte bei 37 °C für 30 min inkubieren und dann die Platte mit einem Plattenleser bei einer Absorption von 562 nm ablesen. Berechnen Sie die Proteinkonzentration in jeder Probe und bestimmen Sie das Probenvolumen, das benötigt wird, um 20 μg Protein für Zelllysate und 15 μg Protein für Proteinfraktionen zu erhalten.
  2. Proteinquantifizierung aus EV-Fraktionen mit microBCA-Assay
    1. EV-Proben auf Eis auftauen. Für jede Probe werden zwei Verdünnungen vorgenommen: 1:50 und 1:100.
    2. Dreifach auf eine 96-Well-Clear-Bottom-Assay-Platte, 100 μL BSA-Proteinstandards und 100 μL jeder Probenverdünnung laden. Geben Sie 100 μL microBCA-Arbeitsreagenz unter Verwendung einer Mehrkanalpipette in jede Vertiefung, die Standard oder Probe enthält.
    3. Die Platte bei 37 °C für 2 h inkubieren, dann Platte mit einem Plattenleser bei einer Absorption von 562 nm ablesen. Berechnen Sie die Proteinkonzentration in jeder Probe und bestimmen Sie das Probenvolumen, das benötigt wird, um 15 μg Protein für EV-Fraktionen zu erhalten.
  3. Western Blotting
    HINWEIS: Das Western Blotting-Protokoll wurde ähnlich wie in22 beschrieben durchgeführt und wie unten beschrieben modifiziert.
    1. Stellen Sie 10% Polyacrylamid-Gele mit einem Gel-Herstellungskit nach den Anweisungen des Herstellers her.
    2. Für die Gelelektrophorese bereiten Sie Zelllysatproben vor, indem Sie in einem 1,5-ml-Röhrchen das Volumen des Zelllysats kombinieren, das für 20 μg Protein, 5 μL 4x Laemmli-Puffer erforderlich ist, und das Volumen des RIPA-Puffers, das erforderlich ist, um das Gesamtvolumen auf 20 μL zu bringen.
    3. Bereiten Sie EV- und Proteinfraktionsproben vor, indem Sie in einem 1,5-ml-Röhrchen das Probenvolumen kombinieren, das für 15 μg Protein, 5 μL 4x Laemmli-Puffer und RIPA-Puffer auf ein Volumen von 20 μL erforderlich ist.
    4. Bereiten Sie Medienkontrollproben vor, indem Sie in einem 1,5-ml-Röhrchen 15 μL Probe und 5 μL 4x Laemmli-Puffer kombinieren.
      HINWEIS: Abhängig von den zu verwendenden Antikörpern muss der Laemmli-Puffer möglicherweise ein Reduktionsmittel wie 50 mM Dithiothreitol (DTT) enthalten.
    5. Kochen Sie alle Proben bei 95 °C für 5 min, überführen Sie die Proben zum Abkühlen auf Eis und zentrifugieren Sie kurz für 30 s bei 10.000 x g, dann kehren Sie die Proben zu Eis zurück.
    6. Fügen Sie Gele in den Elektrophoresetank und fügen Sie 1x Gelelektrophorese Laufpuffer hinzu. Laden Sie 15 μL Proteinleiter und 20 μL Probe. Lassen Sie das Gel bei 200 V für 30-50 Minuten laufen oder bis die Proben den Boden des Gels erreicht haben, kurz bevor Sie ablaufen.
    7. Übertragen Sie das Protein auf eine PVDF-Membran mit 1x Transferpuffer bei 4 °C für 30 min bei 100 V oder bis der Transfer abgeschlossen ist. Die ergänzende Abbildung 1, die ergänzende Abbildung 2 und die ergänzende Abbildung 3 zeigen fleckenfreie Bilder jedes Blots nach Abschluss der Übertragung.
    8. Blockieren Sie die Membran in 5% Milch/TBS-Tween für 1 h bei Raumtemperatur auf einem Shaker. Die Membran in primärer Antikörperlösung über Nacht auf einem Shaker bei 4 °C inkubieren. Informationen zur Antikörperverdünnung sind Tabelle 1 zu entnehmen.
    9. Am nächsten Tag den primären Antikörper entfernen und die Membran 3x mit TBS-Tween für jeweils 5 min bei Raumtemperatur auf einem Shaker waschen.
    10. Bereiten Sie geeignete sekundäre Antikörper in 5% Milch/TBS-Tween vor. Siehe Tabelle 1 für Verdünnungsinformationen. Sekundäre Antikörper in die Membran geben und auf einem Shaker bei Raumtemperatur für 1 h inkubieren, dann 3x mit TBS-Tween für jeweils 5 min bei Raumtemperatur auf einem Shaker waschen.
    11. Chemilumineszenzsubstrat zur Membran geben und 5 min bei Raumtemperatur auf einem Shaker inkubieren. Bild-Blot mittels kolorimetrischer und Chemilumineszenzanalyse. Die ergänzende Abbildung 4, die ergänzende Abbildung 5 und die ergänzende Abbildung 6 zeigen unbeschnittene Bilder der einzelnen Blots.

9. TEM-Bildgebung

  1. Glimmentladung23 400 Mesh Kohlenstoff / Formvar beschichtete Gitter, um Kohlenwasserstoffe zu entfernen und die Gitter hydrophil zu machen.
  2. Fügen Sie 5 μL EV- oder Proteinfraktionsprobe zu Gittern hinzu. Gitter bei Raumtemperatur 3-5 min inkubieren.
  3. Überschüssige Lösung durch Ableiten mit Filterpapier entfernen. Waschen Sie die Gitter mit 5 μL Reinstwasser und entfernen Sie den Überschuss durch Docht.
  4. 5 μL 1% wässriges Uranylacetat auftragen und sofort abwischen. Lassen Sie die Gitter trocknen. Bildraster bei 120 kV auf einem Transmissionselektronenmikroskop und Aufnahme von Bildern mit einer geladenen Gerätekamera.

10. Nanopartikel-Tracking-Analyse (NTA)

  1. EV- und Proteinfraktionsproben von -80 °C entnehmen und auf Eis auftauen.
  2. Schalten Sie den Computer und das NTA-Gerät ein. Öffnen Sie die NTA-Software und sie wird automatisch initialisiert.
  3. Wählen Sie die entsprechende Pumpe aus, die partikelfreies Wasser enthält, und klicken Sie auf Spülen Sie das Instrument , um die Zelle zu spülen. Injizieren Sie während des Spülens 10-20 ml partikelfreies Wasser mit einer Spritze in den Injektionsanschluss an der Vorderseite des Instruments und vermeiden Sie Luftblasen.
  4. Der Bildschirm zur Überprüfung der Zellqualität wird angezeigt. Klicken Sie auf OK , und die Überprüfung der Zellqualität beginnt. Nachdem die Prüfung erfolgreich bestanden wurde, wird der Popup-Bildschirm für die automatische Ausrichtung angezeigt: Bitte füllen Sie die Zelle mit 100 nm Ausrichtungssuspension (Verdünnung 1:250.000).
    1. Die Verdünnung 1 der Ausrichtungssuspension wird durch Zugabe von 10 ml partikelfreiem Wasser und 10 μL 100 nm Polystyrolperlen in ein Röhrchen (1:1.000 Verdünnung) hergestellt. Vorsichtig umkehren, um zu mischen. Verdünnung 1 ist bei 4 °C 2-3 Tage haltbar.
    2. Die Verdünnung 2 der Ausrichtungssuspension wird durch Zugabe von 20 ml partikelfreiem Wasser und 80 μL Verdünnung 1 (1:1.000) in ein Röhrchen hergestellt, um die Verdünnung von 1:250.000 zu erzeugen. Drehen Sie das Röhrchen vorsichtig um, um es zu mischen. Verdünnung 2 hat eine Haltbarkeit von 30-60 min bei Raumtemperatur.
  5. Füllen Sie die Zelle mit 2 ml Verdünnung 2 (1:250.000). Klicken Sie auf OK und das Programm schließt die automatische Ausrichtung (Fokus) und Fokusoptimierung ab. Die Registerkarte Analyse öffnet sich und erstellt ein Profil, das Ergebnisse der Sauberkeit und Symmetrie der Messzelle in einer Parabel liefert. Ein Popup-Bildschirm mit der Meldung "View Video Microscope is now ready for experiments" (Videomikroskop anzeigen) wird angezeigt. Klicken Sie auf OK , und das Programm kehrt zur Registerkarte Zellenprüfung zurück.
  6. Spülen Sie die Polystyrolperlen aus der Zelle, indem Sie partikelfreies Wasser in den Injektionskanal injizieren, um die Zelle zu waschen. Waschen Sie weiter, bis die Anzahl der detektierten Partikel zwischen 0-10 liegt (normalerweise zwischen 5-10 ml). Fügen Sie 1 ml 0,22 μm gefiltertes PBS hinzu, um die Zelle für die erste Probe vorzubereiten.
  7. Verdünnen Sie die erste Probe mit 0,22 μm gefiltertem PBS (beginnen Sie mit einer Verdünnung von 1:1000) und geben Sie den Verdünnungsfaktor in das Programm ein. Führen Sie 1 ml Probe in die Zelle ein und warten Sie 5 Minuten, bis sich die Partikelbewegung verlangsamt hat, da sie sich zunächst sehr schnell über den Bildschirm bewegen. Stellen Sie die Empfindlichkeit und den Verschluss auf 75,0 bzw. 100 ein.
  8. Die Anzahl der detektierten Partikel für eine ideale Probenverdünnung beträgt 50-200 Partikel. Wenn weniger als 50 oder mehr als 200 Partikel gemeldet werden, ist die Verdünnung der Probe anzupassen. Wenn eine neue Verdünnung erforderlich ist, waschen Sie die Zelle mit partikelfreiem Wasser, bis 0-10 Partikel detektiert sind. Wiederholen Sie die Zugabe der verdünnten Probe und das Waschen, bis die ideale Verdünnung gefunden ist.
  9. Überprüfen Sie alle 11 Kamerapositionen, um zu visualisieren, dass sich die Partikelbewegung verlangsamt hat, und stellen Sie sicher, dass die Anzahl der erkannten Partikel zwischen allen Kamerapositionen ähnlich ist. Wenn die Anzahl der Partikel zwischen den Kamerapositionen stark variiert, fügen Sie weitere Proben hinzu.
  10. Klicken Sie auf die Registerkarte Messung und führen Sie die Videoaufnahme durch. Geben Sie auf der Registerkarte Videoerfassung einen benutzerdefinierten Namen für das Beispiel ein, und identifizieren Sie einen sicheren Speicherort. Aktivieren Sie die Kontrollkästchen Autosave.txt und Autosave.pdf, um Daten zu speichern.
  11. Stellen Sie die Temperatur auf 25 °C ein, klicken Sie auf 488 nm , um den Laser einzustellen, und klicken Sie auf 11 für die Kamerapositionen. Klicken Sie auf OK , um die Datensammlung auszuführen. Das Programm beginnt mit der Analyse der Anzahl der Partikel und der Größe in allen 11 Positionen. Auf der Registerkarte Analyse wird ein Balkendiagramm mit Durchmesser/nm auf der x-Achse und Partikeln/ml auf der y-Achse angezeigt.
  12. Nachdem die Daten gesammelt wurden, erscheint ein Popup-Fenster mit dem Titel Positionsübersicht mit Daten für jede der 11 Positionen. Wenn mehr als zwei Positionen aus der Analyse entfernt wurden, wiederholen Sie den Vorgang mit einer weiteren Probe. Wenn nicht, klicken Sie auf die Schaltfläche Weiter . Es öffnet sich eine PDF- und TXT-Datei mit den Ergebnissen. Speichern Sie die Dateien an einem sicheren Ort.
  13. Um ein weiteres Beispiel auszuführen, wechseln Sie zur Registerkarte Zellenprüfung , und wiederholen Sie die Schritte 10.6 bis 10.12. Wenn dies geschehen ist, waschen Sie die Zelle mit partikelfreiem Wasser, bis die Anzahl der detektierten Partikel 0-10 (ca. 5-10 ml) beträgt. Spülen Sie die Zelle mit 1 ml 0,22 μm gefiltertem PBS, schließen Sie das Programm und schalten Sie den Computer aus.

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Representative Results

Western Blotting zeigt ausreichende Trennung von Elektrofahrzeugen von CCM
Um die Wirksamkeit von SEC bei der Trennung von EVs aus Zellkulturmedien zu bewerten, wurde ein Western Blot unter Verwendung jeder einzelnen Fraktion aus den Kontrollproben durchgeführt, um die Expression der drei kanonischen EV-Marker CD9, CD63 und CD81 sowie GM130 und Calnexin18 zu untersuchen, die als Negativkontrollen verwendet wurden (Abbildung 3). Die Albuminexpression18 wurde ebenfalls untersucht, um sicherzustellen, dass extrazelluläre Proteine im CCM ausreichend von EVs getrennt werden können. Eine starke Expression von CD9, CD63 und CD81 wurde in den Fraktionen 1-4 beobachtet, mit wenig bis gar keiner Expression in den Fraktionen 5-8; weder GM130 noch Calnexin wurden in irgendeiner Fraktion beobachtet. Albumin war nur in den Bruchteilen 6-8 vorhanden. Zusammengenommen deuten diese Daten darauf hin, dass Vesikel überwiegend in Fraktionen von 1-4 eluieren, so dass die Fraktionen 5-8 extrazelluläre Proteine enthalten. Aus diesem Grund wurden die Fraktionen 1-4 kombiniert und konzentriert und als EV-Fraktion betrachtet, während die Fraktionen 5-8 kombiniert und konzentriert und als Proteinfraktion bezeichnet wurden.

Als nächstes wurden zusätzliche westliche Blots durchgeführt, um die Wirksamkeit der Konzentration der EV- und Proteinfraktionen durch Ultrafiltration sowohl in Kontroll- als auch in behandelten Proben zu bewerten. Die Expression von CD9, CD63 und CD81 wurde in den Zelllysaten und EV-Fraktionen sowohl von Kontroll- als auch von Tunicamycin-behandelten Proben beobachtet, nicht jedoch in den Proteinfraktionen (Abbildung 4). Das Tumor-Suszeptibilitäts-Gen 101 (TSG101) ist mit dem für den Transport erforderlichen endosomalen Sortierkomplex (ESCRT)24 assoziiert und wird häufig als Marker für Exosomen25 verwendet. Dieses Protein war in Zelllysaten vorhanden, aber nicht in EV- oder Proteinfraktionen. Darüber hinaus wurden GM130 und Calnexin nur in den Zelllysatproben beobachtet. Daher deuten die Daten darauf hin, dass EVs effektiv von Zellkulturmedien getrennt wurden.

Um sicherzustellen, dass das positive Signal, das in den EV-Fraktionen beobachtet wurde, von EVs stammte, die von den Zellen und nicht von den Medien selbst freigesetzt wurden, durchliefen die Exosomen-depleted Media das gleiche Ultrafiltrations- und SEC-Protokoll wie konditioniertes CCM und wurden dann über Western Blot analysiert (Abbildung 5). Sowohl Kontroll- als auch Tunicamycin-haltige Medien wurden verarbeitet und Zelllysate wurden als Positivkontrolle an den westlichen Blots verwendet. In den Medienproben wurden keine EV-Marker (CD9, CD63, CD81 oder TSG101) beobachtet, waren aber in den Zelllysaten vorhanden. Die Albuminexpression wurde innerhalb der Proteinfraktionen und eine minimale Expression in den Zelllysaten beobachtet, wahrscheinlich Reste aus dem Medium. Da für keinen der EV-Marker in den EV-Fraktionen ein Signal beobachtet wird, zeigen diese Daten, dass exosomenarme Medien keine EVs enthalten, die das Signal von zellabgeleiteten EVs maskieren.

TEM zeigt erwartete Morphologie von Elektrofahrzeugen
TEM-Bilder wurden sowohl von den Kontroll- als auch von Tunicamycin-behandelten EV- und Proteinfraktionen aufgenommen (Abbildung 6). Sphärische Strukturen können in den EV-Fraktionen sowohl der Kontroll- als auch der Tunicamycin-behandelten Proben beobachtet werden, was auf das Vorhandensein von EVs hinweist. Diese Strukturen werden in den Proteinfraktionen beider Probentypen nicht beobachtet, die stattdessen eine signifikante dunkle Färbung aufweisen, was auf ein Protein in der EM-Bildgebung hinweist.

NTA zeigt Unterschiede in den Konzentrationen in Kontroll- und behandelten Fraktionen
Partikelkonzentrationen von Kontroll- und Tunicamycin-behandelten EV- und Proteinfraktionen (n = 3) wurden mit Nanopartikel-Tracking-Analyse (NTA; Abbildung 7). Abbildung 7A zeigt Partikelkonzentrationen für die Kontroll- und Tunicamycin-behandelten EV-Fraktionen, wobei bei der Tunicamycin-Behandlung im Vergleich zur Kontrolle etwas mehr Partikel vorhanden sind. Die Spitzenpartikelkonzentrationen lagen zwischen 105-165 nm. Abbildung 7B zeigt die Konzentrationen für Partikel, die in der Proteinfraktion sowohl von Kontroll- als auch von Tunicamycin-behandelten Proteinfraktionen nachgewiesen wurden. In der Proteinfraktion wurden insgesamt weniger Partikel im Vergleich zu EVs nachgewiesen (109 vs. 10 13), und die Spitzenkonzentrationen waren ebenfalls geringer, zwischen 75-135 nm. Interessanterweise hatte die Tunicamycin-Proteinfraktion mehr Partikel als die Kontrolle. Die Mehrheit der EV-großen Partikel (ca. 50-200 nm) wird in der EV-Fraktion sowohl von Kontroll- als auch von Tunicamycin-behandelten Zellen beobachtet, was die Verwendung von SEC als wirksames Mittel zur EV-Trennung von konditionierten Zellkulturmedien weiter unterstützt.

Figure 1
Abbildung 1: Differentielle Zentrifugation und Ultrafiltration konditionierter Zellkulturmedien. Schematische Darstellung der Schritte der differentiellen Zentrifugation und Ultrafiltration von Medien, die 24 h nach der Kontrolle oder 10 μg/ml Tunicamycin-Behandlung aus kultivierten Zellen gewonnen wurden. Das Medium wird zentrifugiert und konzentriert, so dass 500 μL konzentriertes Retentat für SEC geeignet sind. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 2
Abbildung 2: Größenausschlusschromatographie. Schematische Darstellung der Trennung von EVs und Proteinen mittels SEC. Die ersten 3 ml (sechs Fraktionen von je 500 μL) werden als Hohlraumvolumen verworfen. Fraktionen 1-4 eluieren als EVs, während Fraktionen 5-8 als Proteine eluieren. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Figure 3
Abbildung 3: Repräsentative Western-Blot-Analyse einzelner SEC-Fraktionen. Ein Volumen von 15 μL wird von jeder einzelnen SEC-Fraktion der Kontrollzellen verwendet und auf CD9, CD63, CD81, GM130, Calnexin und Albuminexpression untersucht. CD9, CD63 und CD81 wurden am stärksten in den Fraktionen 1-4 beobachtet, während GM130 und Calnexin in keiner Fraktion beobachtet wurden. Albumin wurde nur in den Fraktionen 6-8 beobachtet. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Figure 4
Abbildung 4: Repräsentative Western-Blot-Bilder für kanonische EV-Hersteller. Eine Endkonzentration von 20 μg Protein aus Zelllysaten und 15 μg Protein aus den gepoolten und konzentrierten SEC EV (1-4) und Proteinfraktionen (5-8) aus Kontroll- und 10 μg/ml Tunicamycin-behandelten Zellen wurde auf CD9, CD63, CD81, TSG101, Calnexin und GM130 untersucht. Alle Marker waren in den Zelllysaten vorhanden. CD9, CD63 und CD81 wurden in allen EV-Fraktionen beobachtet, TSG101 nicht. Die negativen EV-Marker Calnexin und GM130 fehlten in den EV- und Proteinfraktionen. Kontrollzelllysat bezieht sich auf Lysate von Zellen, die einer Kontrollbehandlung unterzogen wurden, während 10 μg / ml Zelllysat sich auf Lysate von Zellen bezieht, die einer Tunicamycin-Behandlung unterzogen wurden. Kontroll-EV zeigt EVs aus Kontrollproben an. 10 μg/ml EV repräsentieren EVs aus Tunicamycin-behandelten Proben. Kontrollprotein impliziert, dass extrazelluläre Proteine aus Kontrollproben stammen, während 10 μg / ml Protein extrazelluläre Proteine aus Tunicamycin-behandelten Proben bedeuten. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Figure 5
Abbildung 5: Repräsentative Western-Blot-Bilder von Exosom-depleted cell culture media. Kontroll- und 10 μg/ml Tunicamycin-Exosom-depleted Zellkulturmedien wurden SEC und Ultrafiltration unterzogen. Ein Gesamtvolumen von 15 μL SEC EV- und Proteinfraktionen und 20 μg Protein aus Zelllysaten wurden auf CD9, CD63, CD81, TSG101, Calnexin und Albumin untersucht. Es wurden keine EV-Marker in den EV- oder Proteinfraktionen beobachtet, sondern in den Zelllysaten, die als Positivkontrollen verwendet wurden. Albumin wurde in den Proteinfraktionen beobachtet, aber nicht in der EV-Fraktion. Steuer-EV zeigt EVs aus Steuermedienproben an. 10 μg/ml EV repräsentieren EVs aus Tunicamycin-behandelten Proben. Kontrollprotein impliziert, dass extrazelluläre Proteine aus Kontrollproben stammen. 10 μg/ml Protein bezeichnet extrazelluläre Proteine aus Tunicamycin-behandelten Proben. Kontrollzelllysat steht für Zellen in der Kontrollbehandlung, die lysiert wurden, während 10 μg / ml Zelllysat bedeutet, dass lysierte Zellen aus der Tunicamycin-Behandlung stammen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Figure 6
Abbildung 6: Repräsentative TEM-Bilder für die Morphologie von EVs. Die SEC-Fraktionen 1-4 und 5-8 wurden gepoolt und als EV- bzw. Proteinfraktionen sowohl aus Kontroll- als auch aus 10 μg/ml Tunicamycin-behandelten Zellen konzentriert. EVs werden in den EV-Fraktionen sowohl der Kontroll- als auch der Tunicamycin-Proben als kleine kugelförmige Partikel mit einem Durchmesser von weniger als 200 nm beobachtet und werden in den Proteinproben nicht beobachtet. Maßstabsbalken = 200 nm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Figure 7
Abbildung 7: Partikelgröße und -konzentrationen aus der Nanopartikel-Tracking-Analyse. Partikelgröße und -menge in (A) EV-Fraktionen und (B) Proteinfraktionen aus Kontroll- und Tunicamycin-behandelten Zellen (n = 3). Kontroll-EVs zeigen EV aus Kontrollproben an, während behandelte EVs EVs aus Tunicamycin-behandelten Proben darstellen. Kontrollprotein impliziert extrazelluläre Proteine aus Kontrollproben, und behandeltes Protein bedeutet extrazelluläre Proteine aus Tunicamycin-behandelten Proben. Fehlerbalken sind ± einer Standardabweichung. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Ergänzende Abbildung 1: Fleckenfreies Bild von PVDF-Membranen aus Abbildung 3. Jede PVDF-Membran wurde abgebildet, um den erfolgreichen Proteintransfer am Ende von Schritt 8.3.7 zu visualisieren. Die einzelnen SEC-Fraktionen (1-8) wurden für Blots visualisiert, die später auf (A) CD9, (B) CD63, (C) CD81, (D) GM130, (E), Calnexin und (F ) Albumin untersucht wurden. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Abbildung 2: Fleckenfreies Bild von PBDF-Membranen aus Abbildung 4. Jede PVDF-Membran wurde abgebildet, um den erfolgreichen Proteintransfer am Ende von Schritt 8.3.7 zu visualisieren. Blots wurden später auf (A) CD9, (B) CD63, (C) CD81, (D) TSG101, (E) GM130 und (F ) Calnexin untersucht. Kontrollzelllysat bezieht sich auf Zelllysate aus kontrollierten Zellen, während 10 μg / ml Zelllysat sich auf Zelllysate aus der Tunicamycin-Behandlung bezieht. Kontroll-EV zeigt EVs aus Kontrollproben an und 10 μg/ml EV repräsentiert EVs aus Tunicamycin-behandelten Proben. Kontrollprotein bezieht sich auf extrazelluläre Proteine aus Kontrollproben, und 10 μg / ml Protein bedeutet extrazelluläre Proteine aus Tunicamycin-behandelten Proben. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Abbildung 3: Fleckenfreies Bild von PVDF-Membranen aus Abbildung 5. Jede PVDF-Membran wurde abgebildet, um den erfolgreichen Proteintransfer am Ende von Schritt 8.3.7 zu visualisieren. Blots wurden später auf (A) CD9, (B) CD63, (C) CD81, (D) TSG101, (E) Calnexin und (F ) Albumin untersucht. Control EV zeigt EVs aus Kontrollmedien an und 10 μg/ml EV repräsentiert EVs aus Tunicamycin-behandelten Medien. Kontrollprotein bezieht sich auf extrazelluläre Proteine aus Kontrollmedien, und 10 μg / ml Protein bedeutet extrazelluläre Proteine aus Tunicamycin-behandelten Medien. Kontrollzelllysat bezieht sich auf Zelllysate aus kontrollierten Zellen, während 10 μg / ml Zelllysat sich auf Zelllysate aus der Tunicamycin-Behandlung bezieht. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Abbildung 4: Nicht zugeschnittene Western-Blot-Bilder, die zur Erstellung von Abbildung 3 verwendet wurden. Unbeschnittene zusammengesetzte chemilumineszierende und kolorimetrische Bilder von westlichen Blots, untersucht auf (A) CD9, (B) CD63, (C) CD81, (D) GM130, (E) Calnexin und (F) Albumin für jede einzelne SEC-Fraktion (Fraktionen 1-8). Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Abbildung 5: Uncropped Western Blot-Bilder aus Abbildung 4. Unbeschnittene zusammengesetzte chemilumineszierende und kolorimetrische Bilder von westlichen Blots, untersucht auf (A) CD9, (B) CD63, (C) CD81, (D) TSG101, (E) GM130 und (F ) Calnexin. Kontrollzelllysat bezieht sich auf Zelllysate aus kontrollierten Zellen, während 10 μg / ml Zelllysat sich auf Zelllysate aus der Tunicamycin-Behandlung bezieht. Kontroll-EV zeigt EVs aus Kontrollproben an und 10 μg/ml EV repräsentiert EVs aus Tunicamycin-behandelten Proben. Kontrollprotein impliziert, dass extrazelluläre Proteine aus Kontrollproben stammen, während 10 μg / ml Protein extrazelluläre Proteine aus Tunicamycin-behandelten Proben bedeuten. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Abbildung 6: Unbeschnittene Western-Blot-Bilder aus Abbildung 5. Unbeschnittene zusammengesetzte chemilumineszierende und kolorimetrische Bilder von westlichen Blots, untersucht auf (A) CD9, (B) CD63, (C) CD81, (D) TSG101, (E) Calnexin und (F ) Albumin. Control EV zeigt EVs von Kontrollmedien an, während 10 μg / ml EV EVs aus Tunicamycin-behandelten Medien darstellt. Kontrollprotein impliziert, dass extrazelluläre Proteine aus Kontrollmedien stammen und 10 μg / ml Protein extrazelluläre Proteine aus Tunicamycin-behandelten Medien bedeuten. Kontrollzelllysat bezieht sich auf Zelllysate aus kontrollierten Zellen, während 10 μg / ml Zelllysat sich auf Zelllysate aus der Tunicamycin-Behandlung bezieht. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Antikörper Wirtsarten Verdünnung
CD9 Maus 1 : 500
CD63 Maus 1 : 1000
CD81 Maus 1 : 500
GM130 Kaninchen 1 : 500
Albumin Kaninchen 1 : 1000
TSG101* Kaninchen 1 : 1000
Calnexin* Kaninchen 1 : 1000
Anti-Maus^ Pferd 1 : 1000
Anti-Kaninchen^ Ziege 1 : 1000

Tabelle 1: Antikörperverdünnungen. Verdünnungen für Antikörper. Stammantikörper wurden in 5% Milch in TBS-Tween verdünnt. *Stellt Antikörper dar, bei denen Proben unter reduzierenden Bedingungen durchgeführt werden müssen; ^ steht für sekundäre Antikörper.

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Discussion

SEC ist eine benutzerfreundliche Methode zur adäquaten Trennung von Elektrofahrzeugen von konditioniertem CCM. Um zellabgeleitete EVs spezifisch zu isolieren, muss eine sorgfältige Berücksichtigung der Art des CCM und seiner Ergänzungen berücksichtigt werden. Viele Zellkulturmedien müssen mit FBS ergänzt werden, das EVs enthält, die von dem Tier stammen, bei dem das Serum geerntet wurde. Diese Serum-EVs können jedes Signal sättigen und maskieren, das von EVs erzeugt wird, die von Zellen in Kultur26 stammen. Daher sollten bei der Durchführung von Experimenten EV-abgereicherte FBS nach Möglichkeit verwendet werden, um sicherzustellen, dass die gefundenen EVs auf von Zellen und nicht von Rindern abgeleitete EVs zurückgeführt werden können. Dies kann entweder kommerziell erworben oder intern durch verschiedene Techniken hergestellt werden, die an anderer Stelle überprüftwerden 26,27.

Beim Ausführen von Beispielen durch eine SEC-Spalte muss unbedingt gefiltertes PBS verwendet werden. Andernfalls wird jede Fraktion durch Partikel aus dem PBS kontaminiert, anstatt ausschließlich durch zellabgeleitete EVs und extrazelluläre Proteine. Durch das Filtern von PBS durch einen 0,22-μm-Filter vor seiner Verwendung für SEC kann sichergestellt werden, dass alle Partikel in den Fraktionen aus den Zellen selbst stammen und nicht mit PBS kontaminiert sind.

Das hier beschriebene Protokoll kann auch geändert werden, um die Anzahl und Größe der gesammelten Fraktionen zu ändern. Zum Beispiel könnten Fraktionen größer gemacht werden (1 ml vs. 500 μL), oder es könnten mehr Fraktionen gesammelt werden, da es wahrscheinlich extrazelluläre Proteine gibt, die über das hinausgehen, was in diesem Protokoll als Fraktion 8 gilt. Dies gilt insbesondere für andere Probentypen wie Blutplasma oder andere Säulenzusammensetzungen28,29. Diese kleinen extrazellulären Proteine, die möglicherweise in den späteren Fraktionen eluieren, können wichtige Signalmoleküle enthalten, die mit der aktuellen Methodik nicht gesammelt oder untersucht werden. Darüber hinaus verringert die Verwendung des AFC zum Sammeln von Brüchen potenzielle Benutzerfehler, die durch die manuelle Fraktionserfassung auftreten können. Da die Fraktionen Tröpfchen für Tröpfchen eluieren, muss sehr darauf geachtet werden, dass jedes Tröpfchen in der entsprechenden Fraktion gesammelt wird, was bei manueller Durchführung eine Herausforderung darstellen kann.

Eine wesentliche Einschränkung der SEC ist das begrenzte Probenvolumen, das durch die Spalte geführt werden kann. Mit den kommerziell erhältlichen Säulen, die in diesem Protokoll verwendet werden, sind 500 μL Probe das maximale Volumen, das verwendet werden kann. Andere kommerziell erhältliche Säulen oder intern hergestellte Säulen können andere Probenvolumina aufnehmen, dies sind jedoch immer noch relativ kleine Volumina29,30. Andere Methoden, wie zum Beispiel dUC, können größere Probenvolumina aufnehmen, aber diese Technik kann EVs nicht leicht von anderen extrazellulären Komponenten trennen. Gradienten von Saccharose oder Jodixanol können nützlich sein, um Partikel basierend auf der Dichte zu trennen, aber diese Technik ist zeitaufwendig und erfordert ruhige Hände und sehr starke Pipettierfähigkeiten31,32.

Insgesamt ist SEC eine wichtige Methode für die EV-Forschung, die eine ausreichende Trennung von EVs von konditioniertem CCM ermöglicht. Dies gilt insbesondere für kommerzielle Säulen, da sie eine größere Reproduzierbarkeit zwischen biologischen Replikaten ermöglichen und die Fraktionierung automatisiert werden kann, wodurch die Wahrscheinlichkeit von Benutzerfehlern verringert wird. Das hier skizzierte Protokoll zeigt, dass EVs überwiegend in frühen Fraktionen eluieren (1-4), während spätere Fraktionen extrazelluläre Proteine enthalten. Diese Fraktionen können dann kombiniert und einer Ultrafiltration unterzogen werden, um die Probe für nachgeschaltete Analysen einschließlich Western Blotting, TEM-Bildgebung und NTA-Partikelgrößenbestimmung und -quantifizierung effektiv zu konzentrieren.

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Disclosures

Die Autoren erklären keine Interessenkonflikte.

Acknowledgments

Die Autoren danken Penn State Behrend und der Hamot Health Foundation für die Finanzierung sowie der Penn State Microscopy Facility in University Park, PA.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2-Mercaptoethanol VWR 97064-588
4X Laemmli Sample Buffer BioRad 1610747
Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Unit, Ultracel, 3 KDa, 15mL Sigma-Aldrich UFC900308 3 kDa cutoff
Amicon Ultra-2 Centrifugal Filter Unit with Ultracel-3 membrane Sigma-Aldrich UFC200324 3 kDa cutoff
Ammonium Persulfate Sigma-Aldrich A3678-100G
Anti rabbit IgG, HRP linked Antibody Cell Signaling Technology 7074V 1:1000 Dilution
Anti-Calnexin antibody Abcam  ab22595 1:500 Dilution
Anti-CD9 Mouse Monoclonal Antibody BioLegend 312102 1:500 Dilution
Anti-GM130 antibody [EP892Y] - cis-Golgi Marker Abcam ab52649 1:500 Dilution
Anti-mouse IgG, HRP-linked Antibody Cell Signaling Technology 7076V 1:1000 Dilution
Automatic Fraction Collector Izon Science
BCA assay Kit Bio-Rad
CCD camera Gatan Orius SC200
Cd63 Mouse anti Human BD 556019 1:1000 Dilution
CD81 Antibody Santa Cruz Biotechnology sc-23962 1:1000 Dilution
Cellstar Filter Cap Cell Culture Flasks Greiner Bio-One 660175
ChemiDoc MP Imager BioRad
Clarity Western ECL Substrate BioRad 1705061
deoxycholate Sigma-Aldrich D6750-10G
dithiothreitol Sigma 3483-12-3
DMEM/High glucose with L-glutamine; without sodium Cytiva SH300022.FS
Fetal Bovine Serum Premium grade VWR 97068-085
Fetal Bovine Serum, exosome-depleted Thermo Scientific A2720801
Glycine BioRad 1610718
Great Value Nonfat Dry Milk Amazon B076NRD2TZ
HOG Human Oligodendroglioma Cell Line Sigma-Aldrich SCC163
Izon Science Usa Ltd qev Size Exclusion Columns 5pk Izon Science
Methanol >99.8% ACS VWR BDH1135-4LP
Mini-PROTEAN Glass plates BioRad 1653310 with 0.75mm spacers
Mini-PROTEAN Short plates BioRad 1653308
NP-40 Sigma-Aldrich 492016
Penicillin-Streptomycin,Solution Sigma-Aldrich P4458-100mL
Phosphate Buffered Saline PBS Fisher Scientific BP66150
Pierce BCA Protein Assay Kits and Reagents Thermo Fisher Scientific 23227
Pierce PVDF Transfer Membranes Thermo Scientific 88518
Pierce Western Blotting Filter Paper Thermo Scientific 84783
Polyoxyethylene-20 (TWEEN 20), 500mL Bio Basic TB0560
Protease/phosphatase Inhibitor Cocktail (100X) Cell Signaling Technology 5872S
Recombinant Anti-TSG101 antibody [EPR7130(B)] ABCam ab125011 1:1000 dilution
Slodium hydroxide Sigma-Aldrich SX0603
Sodium azide Fisher Scientific BP922I-500
Sodium Chloride Sigma-Aldrich S9888-500G
Sodium dodecyl sulfate,≥99.0% (GC), dust-free pellets Sigma-Aldrich 75746-1KG
Tetramethylethylenediamine Sigma-Aldrich T9281-25ML
TGX Stain-Free FastCast Acrylamide Kit, 10% BioRad 1610183
Transmission Electron Microscope FEI Tecnai 12 Biotwin
Tris BioRad 1610716
Trypsin 0.25% protease with porcine trypsin, HBSS, EDTA; without calcium, magnesium Cytiva SH30042.01
Tunicamycin Tocris 3516
Zeta View software Analytik NTA software

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References

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Neurowissenschaften Ausgabe 183
Größenausschlusschromatographie zur Trennung extrazellulärer Vesikel aus konditionierten Zellkulturmedien
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Jones, M. T., Manioci, S. W.,… More

Jones, M. T., Manioci, S. W., Russell, A. E. Size Exclusion Chromatography for Separating Extracellular Vesicles from Conditioned Cell Culture Media. J. Vis. Exp. (183), e63614, doi:10.3791/63614 (2022).

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