Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Grootte-uitsluitingschromatografie voor het scheiden van extracellulaire blaasjes van geconditioneerde celkweekmedia

Published: May 13, 2022 doi: 10.3791/63614
Automatic Translation
1, 1, 1,2
1Department of Biology, School of Science, Penn State Erie, The Behrend College, 2Magee Womens Research Institute—Allied Member

Summary

Het protocol hier toont aan dat extracellulaire blaasjes adequaat kunnen worden gescheiden van geconditioneerde celkweekmedia met behulp van grootte-uitsluitingschromatografie.

Abstract

Extracellulaire blaasjes (EV's) zijn nano-sized lipide-membraan gebonden structuren die vrijkomen uit alle cellen, aanwezig zijn in alle biovloeistoffen en eiwitten, nucleïnezuren en lipiden bevatten die een weerspiegeling zijn van de moedercel waaruit ze zijn afgeleid. Een goede scheiding van EV's van andere componenten in een monster maakt karakterisering van hun bijbehorende lading mogelijk en geeft inzicht in hun potentieel als intercellulaire communicatoren en niet-invasieve biomarkers voor tal van ziekten. In de huidige studie werden van oligodendrocyten afgeleide EV's geïsoleerd uit celkweekmedia met behulp van een combinatie van state-of-the-art technieken, waaronder ultrafiltratie en grootte-uitsluitingschromatografie (SEC) om EV's te scheiden van andere extracellulaire eiwitten en eiwitcomplexen. Met behulp van in de handel verkrijgbare SEC-kolommen werden EV's gescheiden van extracellulaire eiwitten die vrijkwamen uit menselijke oligodendroglioomcellen onder zowel controle- als endoplasmatisch reticulum (ER) stressomstandigheden. De canonieke EV-markers CD9, CD63 en CD81 werden waargenomen in fracties 1-4, maar niet in fracties 5-8. GM130, een eiwit van het Golgi-apparaat, en calnexin, een integraal eiwit van de ER, werden gebruikt als negatieve EV-markers en werden in geen enkele fractie waargenomen. Verder werd bij het poolen en concentreren van fracties 1-4 als de EV-fractie en fracties 5-8 als de eiwitfractie expressie van CD63, CD81 en CD9 in de EV-fractie waargenomen. De expressie van GM130 of calnexin werd niet waargenomen in een van de fractietypen. De gepoolde fracties van zowel controle- als ER-stresscondities werden gevisualiseerd met transmissie-elektronenmicroscopie en blaasjes werden waargenomen in de EV-fracties, maar niet in de eiwitfracties. Deeltjes in de EV en eiwitfracties van beide omstandigheden werden ook gekwantificeerd met nanodeeltjes tracking analyse. Samen tonen deze gegevens aan dat SEC een effectieve methode is voor het scheiden van EV's van geconditioneerde celkweekmedia.

Introduction

De explosie van interesse in het bestuderen van extracellulaire blaasjes (EV's) is gepaard gegaan met grote vooruitgang in de technologieën en technieken die worden gebruikt om deze nanogrote, heterogene deeltjes te scheiden en te bestuderen. In de tijd sinds hun ontdekking bijna vier decennia geleden 1,2, zijn deze kleine vliezige structuren gevonden om bioactieve lipiden, nucleïnezuren en eiwitten te bevatten en een belangrijke rol te spelen in intercellulaire communicatie 3,4. EV's komen vrij uit alle celtypen en zijn daarom aanwezig in alle biologische vloeistoffen, inclusief bloedplasma en serum, speeksel en urine. EV's in deze vloeistoffen houden een grote belofte in om te dienen als niet-invasieve biomarkers voor verschillende ziekten, waaronder neuro-inflammatoire en neurodegeneratieve ziekten, kankers en auto-immuunziekten 5,6,7. Verder kunnen in vitro mechanistische studies worden uitgevoerd door middel van celkweektechnieken door EV's te scheiden die vrijkomen in het kweekmedium 3,8,9.

Om de rol van EV's in de pathofysiologie van ziekten te begrijpen, is een adequate scheiding van de vloeistof waarin ze worden aangetroffen van het grootste belang. De gouden standaard voor EV-scheiding is al lang differentiële ultracentrifugatie (dUC)10, maar er zijn meer geavanceerde technieken ontstaan om een betere scheiding van EV's van andere extracellulaire componenten te bereiken. Sommige van deze technieken omvatten dichtheidsgradiënten, asymmetrische-flow veldstroomfractie (A4F), flowcytometrie, immunocapture, polyethyleenglycolprecipitatie en grootte-uitsluitingschromatografie (SEC)11,12,13. Elke techniek heeft zijn eigen voor- en nadelen; van SEC in het bijzonder is echter aangetoond dat het EV's vrij effectief scheidt van zowel biologische vloeistoffen als supernatanten van celkweek 8,14,15. SEC heeft ook de toegevoegde bonus dat het relatief eenvoudig en gebruiksvriendelijk is.

SEC is een methode die componenten van een vloeistof scheidt op basis van grootte. Met deze techniek wordt een kolom hars (in eigen huis gemaakt of commercieel gekocht) gebruikt om een monster te fractioneren. Kleine deeltjes in het monster komen vast te zitten tussen de kralen in de hars, terwijl grotere deeltjes vrijer door de hars kunnen gaan en dus eerder in het proces kunnen elueren. Omdat EV's groter zijn dan veel extracellulaire eiwitten en eiwitaggregaten, passeren EV's sneller de kolom en elueren ze in eerdere fracties dan extracellulaire eiwitten14.

In dit methodepaper wordt het gebruik van SEC voor scheiding van EV's van celkweekmedia (CCM) van menselijke oligodendrocyten onder zowel controle- als endoplasmatisch reticulum (ER) stressomstandigheden geschetst. Met behulp van dit protocol wordt aangetoond dat EV's gescheiden met deze techniek worden gevonden in specifieke fracties die kunnen worden samengevoegd en geconcentreerd voor downstream karakterisatie, en dat de gescheiden EV's zijn afgeleid van cellen en niet van een exogene bron zoals foetaal runderserum (FBS) dat wordt gebruikt om de CCM aan te vullen. De aanwezigheid van de canonieke EV-markers, CD63, CD81 en CD9 16,17,18,19 in de EV-fracties, en hun afwezigheid in de eiwitfracties wordt aangetoond met western blotting. Met behulp van transmissie-elektronenmicroscopie (TEM) worden EV's gevisualiseerd en geven ze de verwachte morfologie weer en worden ze alleen waargenomen in de EV-fractie. Deeltjes worden ook geteld in de EV- en eiwitfracties van zowel controle- als ER-stressomstandigheden, en een groot aantal deeltjes binnen het verwachte groottebereik van 50-200 nm in diameter wordt waargenomen in de EV-monsters. Samen ondersteunen deze gegevens het idee dat SEC een efficiënte en effectieve methode is voor het scheiden van EV's van celkweekmedia.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Bereiding van buffers en reagentia

OPMERKING: Maak celkweekreagentia in celkweekkap om de steriliteit te behouden.

  1. Bereiding van celkweekreagentia
    1. Bereid normale dmem met een hoog glucosegehalte door 50 ml FBS en 5 ml penicilline-streptokokken (Pen-Strep) toe te voegen aan 500 ml dmem met een hoog glucosegehalte en bewaar bij 4 °C. Gebruik deze media voor het kweken en uitbreiden van cellen.
    2. Bereid exosoom-uitgeputte dmem met hoge glucose door 50 ml exosoom-uitgeputte FBS en 5 ml pen-strep toe te voegen aan 500 ml dmem met een hoog glucosegehalte en bewaar bij 4 °C. Gebruik deze media voor celbehandelingen voorafgaand aan EV-isolatie.
    3. Bereid tunicamycine door 10 mg tunicamycine toe te voegen aan 1 ml dimethylsulfoxide (DMSO). Maak 50 μL aliquots in 0,2 ml buisjes en bewaar bij -20 °C.
  2. Bereiding van EV-scheidingsreagentia
    1. Bereid 1x fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) door 9,89 g PBS-poeder toe te voegen aan 1 L gedeïoniseerd (DI) water in een maatcilinder van 1 L. Roer de oplossing op een roerplaat totdat de PBS is opgelost.
    2. Gebruik de autoclaaf om het glaswerk te steriliseren voordat u PBS toevoegt. Doe het glaswerk in een bak, sluit de deur en steriliseer gedurende 30 minuten bij 121 °C.
    3. Sluit in een laminaire flowkast een vacuüm aan op het filter van 0,22 μm en plaats het filter bovenop de geautoclaveerde fles. Giet de PBS langzaam op het filter en verzamel de gefilterde PBS in de geautoclaveerde fles.
    4. Bereid 0,5 M natriumhydroxide door 9,99 g natriumhydroxide toe te voegen aan 500 ml 1x PBS in een cilinder met schaalverdeling van 500 ml. Roer de oplossing op een roerplaat totdat het natriumhydroxide oplost in de PBS en filtreer vervolgens met een filter van 0,22 μm in een geautoclaveerde fles van 500 ml.
    5. Bereid 0,05% natriumazide door 0,25 g natriumazide toe te voegen aan 500 ml 1x PBS in een cilinder van 500 ml. Roer de oplossing op een roerplaat totdat natriumazide oplost in de PBS en filtreer vervolgens met een filter van 0,22 μm in een geautoclaveerde fles van 500 ml.
  3. Bereiding van eiwitisolatie, kwantificering en identificatiereagentia
    1. Bereid 100 ml RIPA-lysisbuffer door 1 ml 1 M Tris (pH 7,4), 1 ml 10% natriumdodecylsulfaat (SDS), 1 g deoxycholaat, 1 ml NP-40 en 0,89 g natriumchloride (NaCl) te combineren. Breng het volume op 100 ml met gedestilleerd H2O en bewaar bij 4 °C. Om RIPA plus fosfatase en proteaseremmeroplossing te maken, voegt u 10 μL fosfatase en proteaseremmer toe voor elke 1 ml RIPA-buffer in een buis van 15 ml en bewaart u de oplossing bij 4 °C.
    2. Bereid onmiddellijk voor gebruik het BCA-testwerkreagens door 10 ml reagens A en 200 μL reagens B van de BCA-testkit toe te voegen aan een buis van 15 ml. Bereid onmiddellijk voor gebruik het microBCA-testwerkreagens door 25 delen reagens A, 24 delen reagens B en 1 deel reagens C toe te voegen aan een buis van 15 ml.
    3. Bereid 10x gel elektroforese lopende buffer door 30,3 g Tris base, 144 g glycine en 10 g SDS toe te voegen in 1 L DI-water. Bewaar de loopbuffer bij 4 °C. Bereid 1x transferbuffer voor door 3,03 g Tris-base, 14,4 g g glycine en 200 ml methanol toe te voegen en pas het volume aan op 1 l met DI-water. Bewaar de transferbuffer bij 4 °C.
    4. Bereid Tris gebufferde zoutoplossing met Tween-20 (TBS-Tween) door 2,4 g Tris-base, 8 g NaCl en 1 ml Tween-20 toe te voegen aan 1 l DI-water. Bewaar de TBS-Tween bij 4 °C.
    5. Bereid 5% blokkerende oplossing door 5 g vette melkpoeder toe te voegen aan 100 ml TBS-Tween. Bewaar de blokkeerbuffer bij 4 °C.
    6. Bereid onmiddellijk voor gebruik chemiluminescent substraat door 4 ml peroxideoplossing en 4 ml luminol/enhancer-oplossing toe te voegen aan een buis van 15 ml en keer voorzichtig om om te mengen.

2. Kweken en behandelen van cellen

  1. Zaai twee T175 celkweekkolven met elk 2,3 x 106 humane oligodendroglioom (HOG) cellen. Breng het uiteindelijke volume van normale hoge glucose DMEM op 25 ml en incubeer bij 37 °C met 5% CO2 in een celkweekincubator gedurende 48 uur.
  2. Aan het einde van de 48 uur, warme exosoom-uitgeputte hoge glucose DMEM in een 37 °C waterbad. Voeg voor de behandeling 25 μL van 10 mg/ml tunicamycine toe aan 25 ml exosoomarme media, eindconcentratie van 10 μg/ml tunicamycine om ER-stress te induceren. Voeg voor de controle 25 μL DMSO toe aan 25 ml exosoomarme media.
  3. Verwijder en gooi de normale hoge glucose DMEM uit de cellen en spoel de cellen voorzichtig af en kolf met 10 ml 1x PBS. Aspirateer en gooi PBS weg.
  4. Voeg 25 ml controlemedia toe aan de met de kolf gelabelde controle en 25 ml 10 μg/ml tunicamycine in media in de met de kolf geëtiketteerde behandeling. Breng kolven terug naar de celkweekincubator gedurende 24 uur.

3. Verzameling en concentratie van geconditioneerde CCM (figuur 1)

  1. Plaats PBS in een waterbad van 37 °C. Observeer kolven onder een samengestelde microscoop met een objectief van 10x en 100x objectief. Noteer eventuele verschillen tussen de kolven. Voer de volgende stappen uit voor zowel controle- als behandelde kolven.
  2. Verwijder de media uit de kolf en plaats deze in een buis van 50 ml. Centrifugeer de buis bij 500 x g gedurende 5 min bij 4 °C. Breng het supernatant over op een nieuwe buis van 50 ml.
  3. Centrifugeer de buis bij 2.000 x g gedurende 20 minuten bij 4 °C. Breng het supernatant over in een nieuwe buis van 50 ml en plaats het op ijs.
  4. Verkrijg vier 15 ml 3 kDa cutoff ultrafiltratie-eenheden en voeg 5 ml PBS toe aan elke buis. Bereid het filter voor door de ultrafiltratie-eenheden gedurende 10 minuten bij 4°C op 4.000 x g te centrifugeren.
    OPMERKING: 3 kDa moleculaire gewicht cutoff ultrafiltratie-eenheden werden gebruikt in het huidige protocol om alle extracellulaire eiwitten die vrijkomen uit cellen te behouden. Grotere moleculaire afsnijdingseenheden (bijv. 30 kDa) zouden ook met dit protocol werken, maar extracellulaire eiwitten kleiner dan 30 kDa zouden worden uitgefilterd en uit de monstersworden verwijderd 20,21.
  5. Verwijder PBS uit de ultrafiltratie-eenheden. Verdeel het supernatant van elke aandoening (controle en behandeld met tunicamycine) in twee ultrafiltratie-eenheden elk, ongeveer 12,5 ml media in elk.
  6. Centrifugeer de buizen bij 4.000 x g gedurende 1 h en 45 min bij 4 °C, of totdat het geconcentreerde medium (het retentaat genoemd) in elke ultrafiltratie-eenheid is geconcentreerd tot 250 μL of minder.
  7. Breng het retentaat van beide controle-ultrafiltratie-eenheden over in één gelabelde microcentrifugebuis van 1,5 ml. Breng het retentaat van beide behandelde ultrafiltratie-eenheden over in een andere gelabelde 1,5 ml microcentrifugebuis.
  8. Meet het totale volume van het retentaat in elke microcentrifugebuis op 500 μL. Als het monster minder dan 500 μL is, voeg dan 0,22 μm gefilterd 1x PBS toe tot het uiteindelijke volume 500 μL is. Plaats de buizen in een vriezer van -80 °C.

4. Celverzameling

  1. Plaats trypsine, PBS en exosoom-uitgeputte DMEM in een waterbad van 37 °C. Voeg 7 ml trypsine toe aan zowel de controle als de behandelde kolven en plaats deze gedurende 5 minuten in de couveuse.
  2. Bekijk onder de microscoop of de cellen zijn opgetild. Als de cellen niet worden opgetild, tikt u de kolf stevig tegen de palm van de hand om cellen los te maken.
  3. Was de kolf met 7 ml exosoom-uitgeput DMEM. Verzamel de celsuspensie uit de kolf en plaats deze in buizen van 15 ml.
  4. Centrifugeer de buizen gedurende 10 minuten bij 500 x g bij 4 °C. Verwijder het supernatant en voeg 5 ml 1x PBS toe aan de celpellet. Pipet voorzichtig mengen om de pellet te breken.
  5. Centrifugeer de buizen bij 500 x g gedurende 5 min bij 4 °C. Verwijder het supernatant en voeg 200 μL RIPA plus fosfatase en proteaseremmeroplossing toe aan celpellet, pipet om te mengen.
  6. Breng de cellen in de RIPA-oplossing over in buizen van 1,5 ml. Laat de buizen 5 min op ijs zitten. Centrifugeer de buizen bij 14.000 x g gedurende 10 min bij 4 °C.
  7. Breng het supernatant over in nieuwe buizen van 1,5 ml. Label de buisjes met de behandelingsconditie en -datum. Plaats de tubes in een vriezer van -80 °C.
    OPMERKING: Het protocol kan hier worden gepauzeerd.

5. EV-scheiding met behulp van grootte-uitsluitingschromatografie (figuur 2)

OPMERKING: Voer de volgende stappen twee keer uit, één keer voor controleretentaat en één keer voor met tunicamycine behandeld retentaat.
OPMERKING: De PBS die in deze sectie wordt gebruikt, is 0,22 μm gefilterd 1x PBS.

  1. Schakel de automatische fraction collector (AFC) in en pas de instellingen aan om acht fracties, 0,5 ml per fractie en buffervolume (void) te verzamelen naar standaard.
    OPMERKING: De AFC-bedrijfsomstandigheden zijn als volgt: kolom/ bedvolume = 10 ml; leegte volume = 2,70 ml; spoelvolume = 15 ml; optimale fractiegrootte = 500 μL; vereiste buffer per run = 65 ml; debiet bij 20 °C = 1,0 ml/min; herbruikbaarheid van de kolom = vijf toepassingen.
  2. Verwijder de kolom (zie Tabel met materialen) van 4 °C en laat de kolom opwarmen tot kamertemperatuur voordat u begint (meestal ~ 30 min).
  3. Verwijder retentaatmonsters uit de vriezer -80 °C en leg op ijs om te ontdooien. Zet tijdens het wachten acht gelabelde 1,5 ml buizen in de AFC-carrousel met deksels naar binnen gericht.
  4. Plaats de kolom in de AFC met de streepjescode naar de lezer gericht. Start de inzameling door de instructies op het scherm te volgen om te controleren of er buizen in de carrousel zitten en of de afvalinzamelaar goed functioneert.
  5. Begin met het spoelen van de kolom door 15 ml 1x PBS aan de kolom toe te voegen nadat de opslagbuffer volledig is geabsorbeerd in het bovenste gedeelte van de kolommatrix. Voeg PBS niet te vroeg toe, omdat dit de opslagbuffer verdunt en voldoende spoeling voorkomt.
  6. Net voordat alle 15 ml PBS door de matrix wordt geabsorbeerd, klikt u op OK om het blozen te stoppen en eventuele resterende PBS van de bovenkant van de kolommatrix te verwijderen met een micropipette. Raak de matrix niet aan.
  7. Voeg 500 μL monster toe aan het midden van de kolom. Klik op OK om de uitvoering te starten. Kijk hoe het monster in de matrix absorbeert en voeg snel 8 ml PBS toe aan de kolom onmiddellijk nadat het monster volledig is geabsorbeerd.
  8. AFC zal automatisch het leegtevolume in het midden van de carrousel verdrijven en vervolgens alle acht fracties van elk 500 μL verzamelen. Verwijder aan het einde van de run fracties uit de carrousel en plaats ze op ijs. Fracties 1-4 bevatten EV's, terwijl fracties 5-8 extracellulaire eiwitten bevatten. Verwijder het lege volume uit het midden van de carrousel.
  9. Voeg 10 ml PBS toe aan de kolom nadat de acht fracties zijn verzameld om het resterende monster uit de kolom te wassen. Nadat het retentaatmonster volledig door de kolom is gespoeld, voegt u 15 ml 1x PBS toe aan de kolom.
  10. Terwijl de uiteindelijke PBS door de matrix wordt geabsorbeerd, voegt u 500 μL 0,5 M natriumhydroxide toe aan het midden van de matrix van de kolom. Terwijl het natriumhydroxide wordt geabsorbeerd, voegt u 30 ml 1x PBS toe aan de kolom en laat u deze doorspoelen.
  11. Als u een ander monster uitvoert, voegt u acht gelabelde microcentrifugebuizen van 1,5 ml toe aan de carrousel en herhaalt u stap 5.7-5.10.
  12. Als u klaar bent met alle voorbeelden, voert u de volgende stappen uit om de kolom te behouden voor later gebruik. Nadat u 30 ml PBS door de kolom hebt gespoeld zoals beschreven in stap 5.10, voegt u 15 ml 0,05% natriumazide toe aan de kolom.
  13. Laat ongeveer 5 ml natriumazide achter op de bovenkant van de kolommatrix. Verwijder de kolom van de AFC en bevestig de boven- en onderkappen. Plaats de kolom terug bij 4 °C voor opslag (kolom kan tot vijf keer worden gebruikt).

6. Ultrafiltratie van EV- en eiwitfracties

  1. Verkrijg twee 2 ml, 3 kDa cutoff ultrafiltratie-eenheden per monster. Gebruik één eenheid om de EV-fracties te concentreren (fracties 1-4) en de andere om de eiwitfracties te concentreren (fracties 5-8). Elke eenheid bestaat uit drie delen: kegel, filter en doorstroomcilinder; label elk onderdeel goed.
  2. Bouw de ultrafiltratie-eenheid en voeg 1 ml van 0,22 μm gefilterd 1x PBS toe aan het filtergedeelte en dop met het conusstuk. Centrifugeer de ultrafiltratie-eenheid, kegelzijde omhoog bij 3.500 x g gedurende 10 minuten bij 4 °C.
  3. Verwijder de gefilterde PBS uit de doorstroomcilinder. Draai de ultrafiltratie-eenheid ondersteboven (kegelzijde naar beneden) en centrifugeer gedurende 2 minuten bij 1.000 x g bij 4 °C. Verwijder eventuele resterende PBS uit de kegel.
  4. Voeg de juiste fracties (het volledige volume van 500 μL) toe aan elke ultrafiltratie-eenheid (het totale volume is 2 ml). Centrifugekolommen kegelzijde omhoog gedurende 1 h 45 min bij 3.500 x g bij 4 °C, of totdat het retentaatniveau op 100 μL is.
  5. Verwijder de doorstroomcilinder en gooi de doorstroom weg. Draai de ultrafiltratie-eenheid ondersteboven (kegelzijde naar beneden) en centrifugeer gedurende 2 minuten bij 1.000 x g bij 4 °C.
  6. Breng het retentaat in de conus over in een gelabelde microcentrifugebuis van 1,5 ml en breng elk monstervolume op 150 μL met 0,22 μm gefilterd 1x PBS. Plaats de tubes in de vriezer van -80 °C.
    OPMERKING: Het protocol kan hier worden gepauzeerd.

7. Mediabediening

  1. Verkrijg twee T175 celkweekkolven. Label de ene kolf controle en de andere behandeling. Warme exosoom-uitgeputte hoge glucose DMEM in een waterbad van 37 °C.
  2. Voeg 25 μL tunicamycine stockoplossing (10 mg/ml) toe aan 25 ml media en doe in de met de erlenmeyer gelabelde behandeling. Voeg 25 μL DMSO toe aan 25 ml media en doe het met het opschrift in de kolf. Bewaar kolven in een celkweekincubator gedurende 24 uur.
  3. Verzamel media en verwerk om EV's te scheiden zoals beschreven in stappen 3.2-3.8. Voer vervolgens alle stappen uit die in secties 5 en 6 worden beschreven.

8. Western blotting

  1. Eiwitkwantificering van cellysaten en eiwitfracties met BCA-test
    OPMERKING: Eiwitkwantificering van zowel controle- als tunicamycinebemonsteringsmonsters wordt uitgevoerd met de volgende stappen.
    1. Ontdooi gelyseerde cellen en eiwitfracties op ijs. Maak drie verdunningsbuizen voor elk monster; 1:2, 1:10 en 1:100.
    2. Belasting in drievoud op een testplaat met heldere bodem van 96, 25 μL runderserumalbumine (BSA) eiwitstandaarden en 25 μL van elke monsterverdunning. Voeg 200 μL werkreagens toe aan elke put die standaard of monster bevat, met behulp van een meerkanaals pipet.
    3. Incubeer de plaat bij 37 °C gedurende 30 minuten en lees vervolgens de plaat af met een plaatlezer bij een absorptie van 562 nm. Bereken de eiwitconcentratie in elk monster en bepaal het monstervolume dat nodig is om 20 μg eiwit voor cellysaten en 15 μg eiwit voor eiwitfracties te verkrijgen.
  2. Eiwitkwantificering van EV-fracties met microBCA-test
    1. Ontdooi EV-monsters op ijs. Maak twee verdunningen voor elk monster: 1:50 en 1:100.
    2. Laad in drievoud op een testplaat met heldere bodem, 100 μL BSA-eiwitstandaarden en 100 μL van elke monsterverdunning. Voeg 100 μL microBCA-werkreagens toe aan elke put die standaard of monster bevat, met behulp van een meerkanaals pipet.
    3. Incubeer de plaat bij 37 °C gedurende 2 uur en lees vervolgens de plaat af met een plaatlezer bij een absorptie van 562 nm. Bereken de eiwitconcentratie in elk monster en bepaal het volume van het monster dat nodig is om 15 μg eiwit voor EV-fracties te verkrijgen.
  3. Western blotting
    OPMERKING: Het Western blotting-protocol is uitgevoerd op dezelfde manier als beschreven in22 en gewijzigd zoals hieronder beschreven.
    1. Maak 10% polyacrylamide gels met een gel making kit, met behulp van de instructies van de fabrikant.
    2. Bereid voor gel-elektroforese cellysaatmonsters door in een buis van 1,5 ml het volume cellysaat te combineren dat nodig is voor 20 μg eiwit, 5 μL 4x Laemmli-buffer en het volume RIPA-buffer dat nodig is om het totale volume op 20 μL te brengen.
    3. Bereid EV- en eiwitfractiemonsters voor door in een buis van 1,5 ml het monstervolume te combineren dat nodig is voor 15 μg eiwit, 5 μL 4x Laemmli-buffer en RIPA-buffer tot een volume van 20 μL.
    4. Bereid mediacontrolemonsters door in een buis van 1,5 ml 15 μL monster en 5 μL 4x Laemmli-buffer te combineren.
      OPMERKING: Afhankelijk van de te gebruiken antilichamen kan de Laemmli-buffer al dan niet een reductiemiddel bevatten, zoals 50 mM dithiothreitol (DTT).
    5. Kook alle monsters gedurende 5 minuten bij 95 °C, breng monsters over op ijs om af te koelen en centrifugeer kort gedurende 30 s bij 10.000 x g en breng de monsters terug naar ijs.
    6. Voeg gels toe aan de elektroforesetank en voeg 1x gel elektroforese lopende buffer toe. Laad 15 μL eiwitladder en 20 μL monster. Laat de gel 30-50 minuten op 200 V draaien, of totdat de monsters de bodem van de gel hebben bereikt, net voordat ze weglopen.
    7. Breng het eiwit over naar een PVDF-membraan met 1x overdrachtsbuffer bij 4 °C gedurende 30 minuten bij 100 V, of totdat de overdracht is voltooid. Aanvullende figuur 1, aanvullende figuur 2 en aanvullende figuur 3 tonen vlekvrije afbeeldingen van elke vlek nadat de overdracht is voltooid.
    8. Blokkeer het membraan in 5% melk/TBS-Tween gedurende 1 uur bij kamertemperatuur op een shaker. Incubeer membraan in primaire antilichaamoplossing 's nachts op een shaker bij 4 °C. Zie tabel 1 voor informatie over de verdunning van antilichamen.
    9. Verwijder de volgende dag het primaire antilichaam en was het membraan 3x met TBS-Tween gedurende 5 minuten elk op kamertemperatuur op een shaker.
    10. Bereid geschikte secundaire antilichamen in 5% melk/TBS-Tween. Zie tabel 1 voor verdunningsinformatie. Voeg secundair antilichaam toe aan het membraan en incubeer op een shaker bij kamertemperatuur gedurende 1 uur en was vervolgens 3x met TBS-Tween gedurende 5 minuten elk op kamertemperatuur op een shaker.
    11. Voeg chemiluminescent substraat toe aan het membraan en incubeer gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur op een shaker. Image blot door gebruik te maken van colorimetrische en chemiluminescente analyse. Aanvullende figuur 4, aanvullende figuur 5 en aanvullende figuur 6 tonen niet-bijgesneden afbeeldingen van elke vlek.

9. TEM beeldvorming

  1. Gloeiend ontlading23 400 mesh koolstof/ formvar gecoate roosters om koolwaterstoffen te verwijderen en de roosters hydrofiel te maken.
  2. Voeg 5 μL EV of eiwitfractiemonster toe aan roosters. Incubeer roosters bij kamertemperatuur gedurende 3-5 min.
  3. Verwijder overtollige oplossing door te voeren met filtreerpapier. Was de roosters met 5 μL nanopoerwater en verwijder het teveel door af te voeren.
  4. Breng 5 μL van 1% waterig uranylacetaat aan en spoel onmiddellijk af. Laat roosters drogen. Beeldrasters bij 120 kV op een transmissie-elektronenmicroscoop en leggen beelden vast met een camera van een opgeladen apparaat.

10. Nanodeeltjes tracking analyse (NTA)

  1. Verkrijg EV- en eiwitfractiemonsters van -80 °C en ontdooi op ijs.
  2. Schakel de computer en het NTA-instrument in. Open de NTA-software en deze begint automatisch te initialiseren.
  3. Selecteer de juiste pomp die deeltjesvrij water bevat en klik op Het instrument spoelen om de cel te spoelen. Injecteer tijdens het spoelen 10-20 ml deeltjesvrij water in de injectiepoort aan de voorkant van het instrument met behulp van een spuit en vermijd luchtbellen.
  4. Het scherm voor de controle van de celkwaliteit verschijnt; klik op OK en de celkwaliteitscontrole begint. Nadat de controle met succes is doorstaan, verschijnt het pop-upscherm voor automatische uitlijning met de tekst: Vul de cel met 100 nm uitlijningssuspensie (verdunning 1:250.000).
    1. Bereid verdunning 1 van de uitlijningssuspensie voor door 10 ml deeltjesvrij water en 10 μL 100 nm polystyreenparels aan een buis toe te voegen (1:1.000 verdunning). Keer voorzichtig om om te mengen. Verdunning 1 heeft een houdbaarheid van 2-3 dagen bij 4 °C.
    2. Maak verdunning 2 van uitlijningssuspensie door 20 ml deeltjesvrij water en 80 μL verdunning 1 (1:1.000) in een buis toe te voegen om de verdunning van 1:250.000 te creëren. Keer de buis voorzichtig om om te mengen. Verdunning 2 heeft een houdbaarheid van 30-60 min bij kamertemperatuur.
  5. Vul cel met 2 ml verdunning 2 (1:250.000). Klik op OK en het programma voltooit de automatische uitlijning (focus) en focusoptimalisatie. Het tabblad Analyse opent het maken van een profiel dat resultaten biedt van de reinheid en symmetrie van de meetcel in een parabool. Een pop-up scherm met de tekst: View Video Microscope is nu klaar voor experimenten, zal verschijnen; klik op OK en het programma keert terug naar het tabblad Celcontrole.
  6. Spoel de polystyreenparels uit de cel door deeltjesvrij water in de injectiepoort te injecteren om de cel te wassen. Blijf wassen totdat het aantal gedetecteerde deeltjes tussen 0-10 ligt (meestal tussen 5-10 ml). Voeg 1 ml gefilterd PBS van 0,22 μm toe om de cel voor te bereiden op het eerste monster.
  7. Verdun het eerste monster met 0,22 μm gefilterd PBS (begin met 1:1000 verdunning) en voer de verdunningsfactor in het programma in. Steek 1 ml monster in de cel en wacht 5 minuten tot de deeltjesbeweging vertraagt, omdat ze in eerste instantie heel snel over het scherm zullen bewegen. Stel de gevoeligheid en sluiter in op respectievelijk 75,0 en 100.
  8. Het aantal gedetecteerde deeltjes voor ideale monsterverdunning is 50-200 deeltjes. Als minder dan 50 of meer dan 200 deeltjes worden gemeld, past u de verdunning van het monster aan. Als een nieuwe verdunning nodig is, wast u de cel met deeltjesvrij water totdat er 0-10 gedetecteerde deeltjes zijn. Herhaal het toevoegen van verdund monster en wassen totdat de ideale verdunning is gevonden.
  9. Controleer alle 11 cameraposities om te visualiseren dat de deeltjesbeweging is vertraagd en zorg ervoor dat het aantal gedetecteerde deeltjes vergelijkbaar is tussen alle cameraposities. Als het aantal deeltjes sterk verschilt tussen de cameraposities, voegt u meer monster toe.
  10. Klik op het tabblad Meting en Voer video-acquisitie uit. Voer op het tabblad video-acquisitie de aangepaste naam voor voorbeeld in en identificeer een veilige locatie. Schakel de selectievakjes autosave.txt en autosave.pdf in om gegevens op te slaan.
  11. Stel de temperatuur in op 25 °C, klik op 488 nm om de laser in te stellen en klik op 11 voor de cameraposities. Klik op OK om gegevensverzameling uit te voeren. Het programma zal beginnen met het analyseren van het aantal deeltjes en de grootte in alle 11 posities. Onder het tabblad Analyse verschijnt een staafdiagram met diameter/nm op de x-as en deeltjes/ml op de y-as.
  12. Nadat gegevens zijn verzameld, verschijnt er een pop-upscherm met de titel Positiesoverzicht met gegevens voor elk van de 11 posities. Als er meer dan twee posities uit de analyse zijn verwijderd, herhaalt u de procedure met meer monster. Zo niet, klik dan op de knop Doorgaan . Er wordt een PDF- en txt-bestand geopend met de resultaten. Sla de bestanden op een veilige locatie op.
  13. Als u nog een voorbeeld wilt uitvoeren, gaat u naar het tabblad Celcontrole en herhaalt u stap 10.6 tot en met 10.12. Als dit gebeurt, wast u de cel met deeltjesvrij water totdat het aantal gedetecteerde deeltjes 0-10 is (ongeveer 5-10 ml). Spoel de cel met 1 ml gefilterde PBS van 0,22 μm, sluit het programma en schakel de computer uit.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Western blotting onthult adequate scheiding van EV's van CCM
Om de effectiviteit van SEC voor het scheiden van EV's van celkweekmedia te evalueren, werd een western blot uitgevoerd met behulp van elke afzonderlijke fractie uit de controlemonsters om de expressie van de drie canonieke EV-markers, CD9, CD63 en CD81, evenals GM130 en calnexin18, die werden gebruikt als negatieve controles te onderzoeken (figuur 3). Albumine-expressie18 werd ook onderzocht om ervoor te zorgen dat extracellulaire eiwitten in de CCM adequaat kunnen worden gescheiden van EV's. Sterke expressie van CD9, CD63 en CD81 werd waargenomen in breuken 1-4, met weinig tot geen expressie in breuken 5-8; noch GM130 noch calnexin werden in welke fractie dan ook waargenomen. Albumine was alleen aanwezig in fracties 6-8. Samen geven deze gegevens aan dat blaasjes voornamelijk elueren in fracties 1-4, waardoor fracties 5-8 extracellulaire eiwitten bevatten. Hierdoor werden fracties 1-4 gecombineerd en geconcentreerd en beschouwd als de EV-fractie, terwijl fracties 5-8 werden gecombineerd en geconcentreerd en aangeduid als de eiwitfractie.

Vervolgens werden aanvullende western blots uitgevoerd om de effectiviteit van het concentreren van de EV- en eiwitfracties via ultrafiltratie in zowel controle- als behandelde monsters te evalueren. Expressie van CD9, CD63 en CD81 werd waargenomen in de cellysaten en EV-fracties van zowel met controle als met tunicamycine behandelde monsters, maar niet in de eiwitfracties (figuur 4). Tumorgevoeligheidsgen 101 (TSG101) is geassocieerd met het endosomale sorteercomplex dat nodig is voor transport (ESCRT)24 en wordt vaak gebruikt als marker voor exosomen25. Dit eiwit was aanwezig in cellysaten, maar niet in EV- of eiwitfracties. Bovendien werden GM130 en calnexin alleen waargenomen in de cellysaatmonsters. Daarom geven de gegevens aan dat EV's effectief werden gescheiden van celkweekmedia.

Om ervoor te zorgen dat het positieve signaal dat in de EV-fracties werd waargenomen afkomstig was van EV's die door de cellen werden vrijgegeven en niet door de media zelf, ondergingen de exosoomarme media hetzelfde ultrafiltratie- en SEC-protocol als geconditioneerde CCM en werden vervolgens geanalyseerd via western blot (figuur 5). Zowel controle als tunicamycine bevattende media werden verwerkt en cellysaten werden gebruikt als een positieve controle op de western blots. Er werden geen EV-markers (CD9, CD63, CD81 of TSG101) waargenomen in de mediamonsters, maar wel in de cellysaten. Albumine-expressie werd waargenomen in de eiwitfracties en minimale expressie in de cellysaten, waarschijnlijk resterend van de media. Aangezien er geen signaal wordt waargenomen voor een van de EV-markers in de EV-fracties, tonen deze gegevens aan dat exosoomarme media geen EV's bevatten die het signaal van van cellen afgeleide EV's maskeren.

TEM demonstreert verwachte morfologie van EV's
TEM-beelden werden gemaakt van zowel de met controle als met tunicamycine behandelde EV- en eiwitfracties (figuur 6). Sferische structuren kunnen worden waargenomen in de EV-fracties van zowel de met controle als met tunicamycine behandelde monsters, wat wijst op de aanwezigheid van EV's. Deze structuren worden niet waargenomen in de eiwitfracties van beide monstertypen, die in plaats daarvan significante donkere kleuring hebben, wat wijst op eiwit in EM-beeldvorming.

NTA onthult verschillen in concentraties in controle- en behandelde facties
Deeltjesconcentraties van controle en met tunicamycine behandelde EV- en eiwitfracties (n = 3) werden gekwantificeerd met nanodeeltjestraceringsanalyse (NTA; Figuur 7). Figuur 7A toont deeltjesconcentraties voor de met controle en tunicamycine behandelde EV-fracties, waarbij iets meer deeltjes aanwezig zijn in de behandeling met tunicamycine ten opzichte van de controle. Piekdeeltjesconcentraties lagen tussen 105-165 nm. Figuur 7B toont concentraties voor deeltjes gedetecteerd in de eiwitfractie van zowel controle- als tunicamycine behandelde eiwitfracties. In de eiwitfractie werden in het algemeen minder deeltjes gedetecteerd ten opzichte van EV's (109 versus 1013), en piekconcentraties waren ook kleiner, tussen 75-135 nm. Interessant is dat de tunicamycine-eiwitfractie meer deeltjes had dan de controle. De meerderheid van de deeltjes van EV-grootte (ongeveer 50-200 nm) wordt waargenomen in de EV-fractie van zowel controle- als tunicamycine-behandelde cellen die het gebruik van SEC als een effectief middel voor EV-scheiding van geconditioneerde celkweekmedia verder ondersteunen.

Figure 1
Figuur 1: Differentiële centrifugatie en ultrafiltratie van geconditioneerde celkweekmedia. Schematische schets van de stappen van differentiële centrifugatie en ultrafiltratie van media verzameld uit gekweekte cellen 24 uur na controle of 10 μg / ml tunicamycinebehandeling. Media worden gecentrifugeerd en geconcentreerd, waardoor 500 μL geconcentreerd retentaat geschikt is voor SEC. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figure 2
Figuur 2: Grootte-uitsluitingschromatografie. Schematische van de scheiding van EV's en eiwitten via SEC. De eerste 3 ml (zes fracties van elk 500 μL) worden weggegooid als het lege volume. Fracties 1-4 elueren als EV's, terwijl fracties 5-8 elueren als eiwitten. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 3
Figuur 3: Representatieve western blot analyse van individuele SEC fracties. Een volume van 15 μL wordt gebruikt van elke afzonderlijke SEC-fractie van de controlecellen en onderzocht op CD9, CD63, CD81, GM130, calnexin en albumine-expressie. CD9, CD63 en CD81 werden het sterkst waargenomen in fracties 1-4, terwijl GM130 en calnexin in geen enkele fractie werden waargenomen. Albumine werd alleen waargenomen in fracties 6-8. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 4
Figuur 4: Representatieve western blot-afbeeldingen voor canonieke EV-makers. Een eindconcentratie van 20 μg eiwit uit cellysaten en 15 μg eiwit uit de gepoolde en geconcentreerde SEC EV (1-4) en eiwit (5-8) fracties uit controle en 10 μg/ml tunicamycine behandelde cellen werden onderzocht op CD9, CD63, CD81, TSG101, calnexin en GM130. Alle markers waren aanwezig in de cellysaten. CD9, CD63 en CD81 werden waargenomen in alle EV-fracties, terwijl TSG101 dat niet was. De negatieve EV-markers calnexin en GM130 waren afwezig in de EV- en eiwitfracties. Controlecellysaat verwijst naar lysaten van cellen die een controlebehandeling hebben ondergaan, terwijl 10 μg / ml cellysaat verwijst naar lysaten van cellen die een tunicamycinebehandeling hebben ondergaan. Control EV geeft EV's aan uit besturingsmonsters. 10 μg/ml EV vertegenwoordigt EV's van met tunicamycine behandelde monsters. Controle-eiwit impliceert dat extracellulaire eiwitten afkomstig waren van controlemonsters, terwijl 10 μg / ml eiwit extracellulaire eiwitten uit met manteldier behandelde monsters betekent. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 5
Figuur 5: Representatieve western blot beelden van exosoom-uitgeputte celkweekmedia. Controle en 10 μg/ml tunicamycine exosoom-uitgeputte celkweekmedia ondergingen SEC- en ultrafiltratie. Een totaal volume van 15 μL SEC EV en eiwitfracties en 20 μg eiwit uit cellysaten werden onderzocht op CD9, CD63, CD81, TSG101, calnexin en albumine. Er werden geen EV-markers waargenomen in de EV- of eiwitfracties, maar werden waargenomen in de cellysaten die als positieve controles werden gebruikt. Albumine werd waargenomen in de eiwitfracties, maar niet in de EV-fractie. Control EV geeft EV's aan op basis van monsters van besturingsmedia. 10 μg/ml EV vertegenwoordigt EV's van met tunicamycine behandelde monsters. Controle-eiwit impliceert dat extracellulaire eiwitten afkomstig waren van controlemonsters. 10 μg /ml eiwit betekent extracellulaire eiwitten uit met tunicamycine behandelde monsters. Controlecellysaat staat voor cellen in de controlebehandeling die werden gelyseerd, terwijl 10 μg / ml cellysaat betekent dat gelyseerde cellen afkomstig zijn van tunicamycinebehandeling. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 6
Figuur 6: Representatieve TEM-beelden voor morfologie van EV's. SEC-fracties 1-4 en 5-8 werden gepoold en geconcentreerd als respectievelijk de EV- en eiwitfracties van zowel controle- als 10 μg / ml met tunicamycine behandelde cellen. EV's worden waargenomen in de EV-fracties van zowel de controle- als de tunicamycinemonsters als kleine bolvormige deeltjes met een diameter van minder dan 200 nm en worden niet waargenomen in de eiwitmonsters. Schaalstaven = 200 nm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 7
Figuur 7: Deeltjesgrootte en concentraties van nanodeeltjes tracking analyse. Deeltjesgrootte en -hoeveelheid in (A) EV-fracties en (B) eiwitfracties uit met controle en tunicamycine behandelde cellen (n = 3). Controle-EV's geven EV aan van controlemonsters, terwijl behandelde EV's EV's vertegenwoordigen van met tunicamycine behandelde monsters. Controle-eiwit impliceert extracellulaire eiwitten uit controlemonsters en behandeld eiwit betekent extracellulaire eiwitten uit met tunicamycine behandelde monsters. Foutbalken zijn ± één standaarddeviatie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Aanvullende figuur 1: Vlekvrij beeld van PVDF-membranen uit figuur 3. Elk PVDF-membraan werd in beeld gebracht om een succesvolle eiwitoverdracht aan het einde van stap 8.3.7 te visualiseren. De individuele SEC-fracties (1-8) werden gevisualiseerd voor vlekken die later werden onderzocht op (A) CD9, (B) CD63, (C) CD81, (D) GM130, (E), calnexin en (F) albumine. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende figuur 2: Vlekvrije afbeelding van PBDF-membranen uit figuur 4. Elk PVDF-membraan werd in beeld gebracht om een succesvolle eiwitoverdracht aan het einde van stap 8.3.7 te visualiseren. Vlekken werden later onderzocht op (A) CD9, (B) CD63, (C) CD81, (D) TSG101, (E) GM130 en (F) calnexin. Controlecellysaat verwijst naar cellysaten van controle behandelde cellen, terwijl 10 μg / ml cellysaat verwijst naar cellysaten van de tunicamycinebehandeling. Control EV geeft EV's aan van controlemonsters en 10 μg / ml EV vertegenwoordigt EV's van met mantelmycine behandelde monsters. Controle-eiwit verwijst naar extracellulaire eiwitten uit controlemonsters en 10 μg / ml eiwit betekent extracellulaire eiwitten uit met tunicamycine behandelde monsters. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende figuur 3: Vlekvrij beeld van PVDF-membranen uit figuur 5. Elk PVDF-membraan werd in beeld gebracht om een succesvolle eiwitoverdracht aan het einde van stap 8.3.7 te visualiseren. Vlekken werden later onderzocht op (A) CD9, (B) CD63, (C) CD81, (D) TSG101, (E) calnexin en (F) albumine. Control EV geeft EV's aan van controlemedia en 10 μg/ml EV vertegenwoordigt EV's van met mantelmycine behandelde media. Controle-eiwit verwijst naar extracellulaire eiwitten uit controlemedia en 10 μg / ml eiwit betekent extracellulaire eiwitten uit met tunicamycine behandelde media. Controlecellysaat verwijst naar cellysaten van controle behandelde cellen, terwijl 10 μg / ml cellysaat verwijst naar cellysaten van de tunicamycinebehandeling. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende figuur 4: Niet-bijgesneden western blot-afbeeldingen die worden gebruikt om figuur 3 te maken. Niet-gecropte samengestelde chemiluminescente en colorimetrische afbeeldingen van western blots onderzocht op (A) CD9, (B) CD63, (C) CD81, (D) GM130, (E) calnexin en (F) albumine voor elke afzonderlijke SEC-fractie (fracties 1-8). Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende figuur 5: Niet-bijgesneden western blot-afbeeldingen uit figuur 4. Niet-gecropte samengestelde chemiluminescente en colorimetrische afbeeldingen van western blots onderzocht op (A) CD9, (B) CD63, (C) CD81, (D) TSG101, (E) GM130 en (F) calnexin. Controlecellysaat verwijst naar cellysaten van controle behandelde cellen, terwijl 10 μg / ml cellysaat verwijst naar cellysaten van de tunicamycinebehandeling. Control EV geeft EV's aan van controlemonsters en 10 μg / ml EV vertegenwoordigt EV's van met mantelmycine behandelde monsters. Controle-eiwit impliceert dat extracellulaire eiwitten afkomstig waren van controlemonsters, terwijl 10 μg / ml eiwit extracellulaire eiwitten uit met manteldier behandelde monsters betekent. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende figuur 6: Niet-bijgesneden western blot-afbeeldingen uit figuur 5. Niet-bijgesneden samengestelde chemiluminescente en colorimetrische afbeeldingen van western blots onderzocht op (A) CD9, (B) CD63, (C) CD81, (D) TSG101, (E) calnexin en (F) albumine. Control EV geeft EV's aan van controlemedia, terwijl 10 μg / ml EV EV vertegenwoordigt van met manteldieren behandelde media. Controle-eiwit impliceert dat extracellulaire eiwitten afkomstig waren van controlemedia en 10 μg / ml eiwit betekent extracellulaire eiwitten uit met tunicamycine behandelde media. Controlecellysaat verwijst naar cellysaten van controle behandelde cellen, terwijl 10 μg / ml cellysaat verwijst naar cellysaten van de tunicamycinebehandeling. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Antistof Gastheer soorten Verdunning
Cd9 Muis 1 : 500
cd63 Muis 1 : 1000
cd81 Muis 1 : 500
GM130 Konijn 1 : 500
Albumine Konijn 1 : 1000
TSG101 Konijn 1 : 1000
Calnexin* Konijn 1 : 1000
Anti-muis^ Paard 1 : 1000
Anti-konijn^ Geit 1 : 1000

Tabel 1: Antilichaamverdunningen. Verdunningen gebruikt voor antilichamen. Stockantistoffen werden verdund in 5% melk in TBS-Tween. * Vertegenwoordigt antilichamen die vereisen dat monsters worden uitgevoerd onder reducerende omstandigheden; ^ vertegenwoordigt secundaire antilichamen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

SEC is een gebruiksvriendelijke methode om EV's adequaat te scheiden van geconditioneerde CCM. Om specifiek van cellen afgeleide EV's te isoleren, moet zorgvuldig rekening worden gehouden met het type CCM en de supplementen ervan. Veel celkweekmedia moeten worden aangevuld met FBS, dat EV's bevat die zijn afgeleid van het dier waarin het serum is geoogst. Deze serum-EV's kunnen elk signaal dat wordt geproduceerd door EV's afkomstig van cellen in cultuur verzadigen en maskeren26. Daarom moet bij het uitvoeren van experimenten waar mogelijk EV-uitgeputte FBS worden gebruikt om ervoor te zorgen dat de gevonden EV's kunnen worden toegeschreven aan van cellen afgeleide, en niet van runderen afgeleide, EV's Dit kan commercieel worden gekocht of in eigen huis worden gemaakt met behulp van verschillende technieken die elders zijn beoordeeld26,27.

Bij het uitvoeren van monsters door een SEC-kolom is het noodzakelijk dat gefilterde PBS wordt gebruikt. Anders wordt elke fractie besmet door deeltjes uit de PBS in plaats van alleen van cellen afgeleide EV's en extracellulaire eiwitten. Door PBS door een filter van 0,22 μm te filteren voordat het voor SEC wordt gebruikt, kan men ervoor zorgen dat elk deeltje in de fracties afkomstig is van de cellen zelf en niet besmet PBS.

Het hier beschreven protocol kan ook worden gewijzigd om het aantal en de grootte van de verzamelde fracties te wijzigen. Fracties kunnen bijvoorbeeld groter worden gemaakt (1 ml versus 500 μl), of er kunnen meer fracties worden verzameld omdat er waarschijnlijk extracellulaire eiwitten zijn die elueren voorbij wat in dit protocol als fractie 8 wordt beschouwd. Dit geldt vooral voor andere monstertypen zoals bloedplasma of andere kolomsamenstellingen28,29. Deze kleine extracellulaire eiwitten die mogelijk elueren in de latere fracties kunnen belangrijke signaalmoleculen bevatten die niet worden verzameld of getest met de huidige methodologie. Bovendien verlicht het gebruik van de AFC om fracties te verzamelen eventuele gebruikersfouten die kunnen worden geïntroduceerd door handmatige fractieverzameling. Aangezien de fracties druppel voor druppel elueren, moet er grote zorg aan worden besteed om ervoor te zorgen dat elke druppel wordt verzameld in de juiste fractie, wat een uitdaging kan zijn bij handmatig uitvoeren.

Een belangrijke beperking van SEC is het beperkte volume van het monster dat door de kolom kan worden geleid. Met de in de handel verkrijgbare kolommen die in dit protocol worden gebruikt, is 500 μL monster het maximale volume dat kan worden gebruikt. Andere in de handel verkrijgbare kolommen of in eigen beheer gemaakte kolommen kunnen andere volumes van het monster herbergen, maar dit zijn nog steeds relatief kleine volumes29,30. Andere methoden, zoals dUC bijvoorbeeld, kunnen grotere monstervolumes accommoderen, maar deze techniek kan EV's niet gemakkelijk scheiden van andere extracellulaire componenten. Gradiënten van sucrose of jodidinenol kunnen nuttig zijn voor het scheiden van deeltjes op basis van dichtheid, maar deze techniek is tijdrovend en vereist vaste handen en zeer sterke pipetteervaardigheden31,32.

Over het algemeen is SEC een belangrijke methode voor EV-onderzoek die voldoende scheiding van EV's van geconditioneerde CCM mogelijk maakt. Dit geldt met name voor commerciële kolommen, omdat ze een grotere reproduceerbaarheid tussen biologische replicaties mogelijk maken en fractionering kan worden geautomatiseerd, waardoor de kans op gebruikersfouten wordt verkleind. Het hier geschetste protocol toont aan dat EV's voornamelijk in vroege fracties (1-4) eluteren, terwijl latere fracties extracellulaire eiwitten bevatten. Deze fracties kunnen vervolgens worden gecombineerd en ultrafiltratie ondergaan om het monster effectief te concentreren voor downstream-analyses, waaronder western blotting, TEM-beeldvorming en NTA-deeltjesgrootte en kwantificering.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs verklaren geen belangenconflicten.

Acknowledgments

De auteurs willen Penn State Behrend en de Hamot Health Foundation bedanken voor financiering, evenals de Penn State Microscopy Facility in University Park, PA.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2-Mercaptoethanol VWR 97064-588
4X Laemmli Sample Buffer BioRad 1610747
Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Unit, Ultracel, 3 KDa, 15mL Sigma-Aldrich UFC900308 3 kDa cutoff
Amicon Ultra-2 Centrifugal Filter Unit with Ultracel-3 membrane Sigma-Aldrich UFC200324 3 kDa cutoff
Ammonium Persulfate Sigma-Aldrich A3678-100G
Anti rabbit IgG, HRP linked Antibody Cell Signaling Technology 7074V 1:1000 Dilution
Anti-Calnexin antibody Abcam  ab22595 1:500 Dilution
Anti-CD9 Mouse Monoclonal Antibody BioLegend 312102 1:500 Dilution
Anti-GM130 antibody [EP892Y] - cis-Golgi Marker Abcam ab52649 1:500 Dilution
Anti-mouse IgG, HRP-linked Antibody Cell Signaling Technology 7076V 1:1000 Dilution
Automatic Fraction Collector Izon Science
BCA assay Kit Bio-Rad
CCD camera Gatan Orius SC200
Cd63 Mouse anti Human BD 556019 1:1000 Dilution
CD81 Antibody Santa Cruz Biotechnology sc-23962 1:1000 Dilution
Cellstar Filter Cap Cell Culture Flasks Greiner Bio-One 660175
ChemiDoc MP Imager BioRad
Clarity Western ECL Substrate BioRad 1705061
deoxycholate Sigma-Aldrich D6750-10G
dithiothreitol Sigma 3483-12-3
DMEM/High glucose with L-glutamine; without sodium Cytiva SH300022.FS
Fetal Bovine Serum Premium grade VWR 97068-085
Fetal Bovine Serum, exosome-depleted Thermo Scientific A2720801
Glycine BioRad 1610718
Great Value Nonfat Dry Milk Amazon B076NRD2TZ
HOG Human Oligodendroglioma Cell Line Sigma-Aldrich SCC163
Izon Science Usa Ltd qev Size Exclusion Columns 5pk Izon Science
Methanol >99.8% ACS VWR BDH1135-4LP
Mini-PROTEAN Glass plates BioRad 1653310 with 0.75mm spacers
Mini-PROTEAN Short plates BioRad 1653308
NP-40 Sigma-Aldrich 492016
Penicillin-Streptomycin,Solution Sigma-Aldrich P4458-100mL
Phosphate Buffered Saline PBS Fisher Scientific BP66150
Pierce BCA Protein Assay Kits and Reagents Thermo Fisher Scientific 23227
Pierce PVDF Transfer Membranes Thermo Scientific 88518
Pierce Western Blotting Filter Paper Thermo Scientific 84783
Polyoxyethylene-20 (TWEEN 20), 500mL Bio Basic TB0560
Protease/phosphatase Inhibitor Cocktail (100X) Cell Signaling Technology 5872S
Recombinant Anti-TSG101 antibody [EPR7130(B)] ABCam ab125011 1:1000 dilution
Slodium hydroxide Sigma-Aldrich SX0603
Sodium azide Fisher Scientific BP922I-500
Sodium Chloride Sigma-Aldrich S9888-500G
Sodium dodecyl sulfate,≥99.0% (GC), dust-free pellets Sigma-Aldrich 75746-1KG
Tetramethylethylenediamine Sigma-Aldrich T9281-25ML
TGX Stain-Free FastCast Acrylamide Kit, 10% BioRad 1610183
Transmission Electron Microscope FEI Tecnai 12 Biotwin
Tris BioRad 1610716
Trypsin 0.25% protease with porcine trypsin, HBSS, EDTA; without calcium, magnesium Cytiva SH30042.01
Tunicamycin Tocris 3516
Zeta View software Analytik NTA software

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Pan, B. T., Teng, K., Wu, C., Adam, M., Johnstone, R. M. Electron microscopic evidence for externalization of the transferrin receptor in vesicular form in sheep reticulocytes. The Journal of Cell Biology. 101 (3), 942-948 (1985).
  2. Harding, C., Heuser, J., Stahl, P. Receptor-mediated endocytosis of transferrin and recycling of the transferrin receptor in rat reticulocytes. The Journal of Cell Biology. 97 (2), 329-339 (1983).
  3. Valadi, H., et al. Exosome-mediated transfer of mRNAs and microRNAs is a novel mechanism of genetic exchange between cells. Nature Cell Biology. 9 (6), 654-659 (2007).
  4. Raposo, G., Stoorvogel, W. Extracellular vesicles: Exosomes, microvesicles, and friends. The Journal of Cell Biology. 200 (4), 373-383 (2013).
  5. Rontogianni, S., et al. Proteomic profiling of extracellular vesicles allows for human breast cancer subtyping. Communications Biology. 2 (1), 1-13 (2019).
  6. Lane, R. E., Korbie, D., Hill, M. M., Trau, M. Extracellular vesicles as circulating cancer biomarkers: opportunities and challenges. Clinical and Translational Medicine. 7 (1), 14 (2018).
  7. Thompson, A. G., et al. Extracellular vesicles in neurodegenerative disease-pathogenesis to biomarkers. Nature Reviews Neurology. 12 (6), 346-357 (2016).
  8. O'Brien, K., Ughetto, S., Mahjoum, S., Nair, A. V., Breakefield, X. O. Uptake, functionality, and re-release of extracellular vesicle-encapsulated cargo. Cell Reports. 39 (2), 110651 (2022).
  9. Joshi, B. S., de Beer, M. A., Giepmans, B. N. G., Zuhorn, I. S. Endocytosis of extracellular vesicles and release of their cargo from endosomes. ACS Nano. 14 (4), 4444-4455 (2020).
  10. Théry, C., Amigorena, S., Raposo, G., Clayton, A. Isolation and characterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids. Current Protocols in Cell Biology. 30 (1), 3-22 (2006).
  11. Willms, E., Cabañas, C., Mäger, I., Wood, M. J. A., Vader, P. Extracellular vesicle heterogeneity: Subpopulations, isolation techniques, and diverse functions in cancer progression. Frontiers in Immunology. 9, 738 (2018).
  12. Tzaridis, T., et al. Extracellular vesicle separation techniques impact results from human blood samples: Considerations for diagnostic applications. International Journal of Molecular Sciences. 22 (17), 9211 (2021).
  13. Liangsupree, T., Multia, E., Riekkola, M. L. Modern isolation and separation techniques for extracellular vesicles. Journal of Chromatography A. 1636, 461773 (2021).
  14. Gámez-Valero, A., et al. Size-exclusion chromatography-based isolation minimally alters extracellular vesicles' characteristics compared to precipitating agents. Scientific Reports. 6 (1), 1-9 (2016).
  15. Mol, E. A., Goumans, M. J., Doevendans, P. A., Sluijter, J. P. G., Vader, P. Higher functionality of extracellular vesicles isolated using size-exclusion chromatography compared to ultracentrifugation. Nanomedicine: Nanotechnology, Biology, and Medicine. 13 (6), 2061-2065 (2017).
  16. Campos-Silva, C., et al. High sensitivity detection of extracellular vesicles immune-captured from urine by conventional flow cytometry. Scientific Reports. 9 (1), 2042 (2019).
  17. Norman, M., et al. L1CAM is not associated with extracellular vesicles in human cerebrospinal fluid or plasma. Nature methods. 18 (6), 631-634 (2021).
  18. Théry, C., et al. Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines. Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1535750 (2018).
  19. Mathieu, M., et al. Specificities of exosome versus small ectosome secretion revealed by live intracellular tracking of CD63 and CD9. Nature Communications. 12 (1), 1-18 (2021).
  20. Guo, J., et al. Establishment of a simplified dichotomic size-exclusion chromatography for isolating extracellular vesicles toward clinical applications. Journal of Extracellular Vesicles. 10 (11), 12145 (2021).
  21. Benedikter, B. J., et al. Ultrafiltration combined with size exclusion chromatography efficiently isolates extracellular vesicles from cell culture media for compositional and functional studies. Scientific Reports. 7 (1), 1-13 (2017).
  22. Eslami, A., Lujan, J. Western blotting: sample preparation to detection. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (44), e2359 (2010).
  23. Grassucci, R. A., Taylor, D. J., Frank, J. Preparation of macromolecular complexes for cryo-electron microscopy. Nature Protocols. 2 (12), 3239 (2007).
  24. Williams, R. L., Urbé, S. The emerging shape of the ESCRT machinery. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 8 (5), 355-368 (2007).
  25. Willms, E., et al. Cells release subpopulations of exosomes with distinct molecular and biological properties. Scientific Reports. 6 (1), 1-12 (2016).
  26. Lehrich, B. M., Liang, Y., Fiandaca, M. S. Foetal bovine serum influence on in vitro extracellular vesicle analyses. Journal of Extracellular Vesicles. 10 (3), 12061 (2021).
  27. Kornilov, R., et al. Efficient ultrafiltration-based protocol to deplete extracellular vesicles from fetal bovine serum. Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1422674 (2018).
  28. Böing, A. N., et al. Single-step isolation of extracellular vesicles by size-exclusion chromatography. Journal of Extracellular Vesicles. 3 (1), (2014).
  29. Zhang, X., Borg, E. G. F., Liaci, A. M., Vos, H. R., Stoorvogel, W. A novel three step protocol to isolate extracellular vesicles from plasma or cell culture medium with both high yield and purity. Journal of Extracellular Vesicles. 9 (1), 1791450 (2020).
  30. Guerreiro, E. M., et al. Efficient extracellular vesicle isolation by combining cell media modifications, ultrafiltration, and size-exclusion chromatography. PLoS ONE. 13 (9), 02024276 (2018).
  31. Onódi, Z., et al. Isolation of high-purity extracellular vesicles by the combination of iodixanol density gradient ultracentrifugation and bind-elute chromatography from blood plasma. Frontiers in Physiology. 9, 1479 (2018).
  32. Yuana, Y., Levels, J., Grootemaat, A., Sturk, A., Nieuwland, R. Co-isolation of extracellular vesicles and high-density lipoproteins using density gradient ultracentrifugation. Journal of Extracellular Vesicles. 3 (1), (2014).

Tags

Neurowetenschappen Nummer 183
Grootte-uitsluitingschromatografie voor het scheiden van extracellulaire blaasjes van geconditioneerde celkweekmedia
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Jones, M. T., Manioci, S. W.,… More

Jones, M. T., Manioci, S. W., Russell, A. E. Size Exclusion Chromatography for Separating Extracellular Vesicles from Conditioned Cell Culture Media. J. Vis. Exp. (183), e63614, doi:10.3791/63614 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter