Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

كروماتوغرافيا استبعاد الحجم لفصل الحويصلات خارج الخلية عن وسائط زراعة الخلايا المشروطة

Published: May 13, 2022 doi: 10.3791/63614
Automatic Translation
1, 1, 1,2
1Department of Biology, School of Science, Penn State Erie, The Behrend College, 2Magee Womens Research Institute—Allied Member

Summary

يوضح البروتوكول هنا أنه يمكن فصل الحويصلات خارج الخلية بشكل كاف عن وسائط زراعة الخلايا المشروطة باستخدام كروماتوغرافيا استبعاد الحجم.

Abstract

الحويصلات خارج الخلية (EVs) هي هياكل مرتبطة بالغشاء الدهني بحجم النانو يتم إطلاقها من جميع الخلايا ، وهي موجودة في جميع السوائل الحيوية ، وتحتوي على بروتينات وأحماض نووية ودهون تعكس الخلية الأم التي تشتق منها. يسمح الفصل السليم للمركبات الكهربائية عن المكونات الأخرى في العينة بتوصيف البضائع المرتبطة بها ويضفي نظرة ثاقبة على إمكاناتها كجهات اتصال بين الخلايا ومؤشرات حيوية غير غازية للعديد من الأمراض. في الدراسة الحالية ، تم عزل المركبات الكهربائية المشتقة من oligodendrocyte من وسائط زراعة الخلايا باستخدام مزيج من أحدث التقنيات ، بما في ذلك الترشيح الفائق وكروماتوغرافيا استبعاد الحجم (SEC) لفصل EVs عن البروتينات الأخرى خارج الخلية ومجمعات البروتين. باستخدام أعمدة SEC المتاحة تجاريا ، تم فصل EVs عن البروتينات خارج الخلية التي تم إطلاقها من خلايا oligodendroglioma البشرية تحت ظروف الإجهاد الضابطة والشبكة الإندوبلازمية (ER). لوحظت علامات EV الأساسية CD9 و CD63 و CD81 في الكسور 1-4 ، ولكن ليس في الكسور 5-8. تم استخدام GM130 ، وهو بروتين من جهاز Golgi ، و calnexin ، وهو بروتين متكامل من ER ، كعلامات EV سلبية ، ولم يتم ملاحظتها في أي جزء. علاوة على ذلك ، عند تجميع وتركيز الكسور 1-4 ككسر EV ، والكسور 5-8 ككسر البروتين ، لوحظ التعبير عن CD63 و CD81 و CD9 في جزء EV. لم يلاحظ التعبير عن GM130 أو calnexin في أي من أنواع الكسور. تم تصور الكسور المجمعة من كل من ظروف التحكم وإجهاد ER باستخدام المجهر الإلكتروني الناقل ولوحظت الحويصلات في كسور EV ، ولكن ليس في أجزاء البروتين. كما تم قياس الجسيمات الموجودة في أجزاء EV والبروتين من كلتا الحالتين كميا باستخدام تحليل تتبع الجسيمات النانوية. معا ، تظهر هذه البيانات أن SEC هي طريقة فعالة لفصل EVs عن وسائط زراعة الخلايا المشروطة.

Introduction

وقد ترافق انفجار الاهتمام بدراسة الحويصلات خارج الخلية (EVs) مع تطورات كبيرة في التقنيات والتقنيات المستخدمة لفصل ودراسة هذه الجسيمات غير المتجانسة ذات الحجم النانوي. في الوقت منذ اكتشافها منذ ما يقرب من أربعة عقود 1,2 ، تم العثور على هذه الهياكل الغشائية الصغيرة التي تحتوي على الدهون النشطة بيولوجيا والأحماض النووية والبروتينات ، وتلعب أدوارا رئيسية في التواصل بين الخلايا 3,4. يتم إطلاق EVs من جميع أنواع الخلايا وبالتالي فهي موجودة في جميع السوائل البيولوجية ، بما في ذلك بلازما الدم والمصل واللعاب والبول. تحمل المركبات الكهربائية داخل هذه السوائل وعدا كبيرا لتكون بمثابة مؤشرات حيوية غير غازية لمختلف الأمراض ، بما في ذلك الأمراض العصبية الالتهابية والتنكسية العصبية والسرطانات واضطرابات المناعة الذاتية5،6،7. علاوة على ذلك ، يمكن إجراء الدراسات الميكانيكية في المختبر من خلال تقنيات زراعة الخلايا عن طريق فصل المركبات الكهربائية التي يتم إطلاقها في وسط الثقافة3،8،9.

لفهم دور المركبات الكهربائية في الفيزيولوجيا المرضية للمرض ، فإن الفصل الكافي عن السائل الذي توجد فيه أمر بالغ الأهمية. لطالما كان المعيار الذهبي لفصل المركبات الكهربائية هو الطرد المركزي التفاضلي (dUC)10 ، ومع ذلك فقد نشأت تقنيات أكثر تطورا لتحقيق فصل أفضل للمركبات الكهربائية عن المكونات الأخرى خارج الخلية. وتشمل بعض هذه التقنيات تدرجات الكثافة، وجزء التدفق الميداني غير المتماثل (A4F)، وقياس التدفق الخلوي، والالتقاط المناعي، وهطول الأمطار من البولي إيثيلين غليكول، وكروماتوغرافيا استبعاد الحجم (SEC) 11،12،13. كل تقنية لها مجموعة خاصة بها من المزايا والعيوب. ومع ذلك ، فقد ثبت أن SEC على وجه الخصوص يفصل المركبات الكهربائية عن كل من السوائل البيولوجية وsupernatants زراعة الخلايا بشكل فعال للغاية8،14،15. لدى SEC أيضا مكافأة إضافية تتمثل في كونها مباشرة نسبيا وسهلة الاستخدام.

SEC هي طريقة تفصل مكونات السائل بناء على الحجم. باستخدام هذه التقنية ، يتم استخدام عمود من الراتنج (إما مصنوع داخليا أو يتم شراؤه تجاريا) لتجزئة العينة. يتم احتجاز الجسيمات الصغيرة في العينة بين الخرز داخل الراتنج ، في حين أن الجسيمات الأكبر قادرة على المرور عبر الراتنج بحرية أكبر ، وبالتالي تتلاشى في وقت مبكر من العملية. نظرا لأن المركبات الكهربائية أكبر حجما من العديد من البروتينات خارج الخلية ومجاميع البروتينات ، فإن المركبات الكهربائية تمر عبر العمود بشكل أسرع وتضعف في أجزاء سابقة من البروتينات خارج الخلية14.

في ورقة الأساليب هذه ، يتم تحديد استخدام SEC لفصل EVs عن وسائط زراعة الخلايا (CCM) من الخلايا قليلة التغصن البشرية تحت كل من ظروف الإجهاد الرقابي والشبكة الإندوبلازمية (ER). باستخدام هذا البروتوكول ، تبين أن المركبات الكهربائية المنفصلة بهذه التقنية موجودة داخل أجزاء محددة يمكن تجميعها معا وتركيزها للتوصيف النهائي ، وأن المركبات الكهربائية المنفصلة مشتقة من الخلايا وليس من مصدر خارجي مثل مصل البقر الجنيني (FBS) المستخدم لتكملة CCM. يظهر وجود علامات EV الأساسية ، CD63 و CD81 و CD916،17،18،19 في كسور EV ، وغيابها في كسور البروتين مع النشاف الغربي. باستخدام المجهر الإلكتروني الناقل (TEM) ، يتم تصور EVs وعرض المورفولوجيا المتوقعة ويتم ملاحظتها فقط في جزء EV. يتم حساب الجسيمات أيضا في أجزاء EV والبروتين في كل من ظروف الإجهاد الضابطة و ER ، ويلاحظ عدد كبير من الجسيمات ضمن نطاق الحجم المتوقع الذي يتراوح قطره بين 50-200 نانومتر في عينات EV. تدعم هذه البيانات معا فكرة أن SEC هي طريقة فعالة وفعالة لفصل EVs عن وسائط زراعة الخلايا.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. إعداد المخازن المؤقتة والكواشف

ملاحظة: اصنع كواشف زراعة الخلايا في غطاء محرك السيارة للحفاظ على العقم.

  1. تحضير كواشف زراعة الخلايا
    1. قم بتحضير DMEM الطبيعي عالي الجلوكوز عن طريق إضافة 50 مل من FBS و 5 مل من البنسلين العقدية (Pen-Strep) إلى 500 مل من DMEM عالي الجلوكوز وتخزينها في 4 درجات مئوية. استخدم هذه الوسائط لزراعة الخلايا وتوسيعها.
    2. قم بتحضير DMEM عالي الجلوكوز المستنفد من الإكسوسوم عن طريق إضافة 50 مل من FBS المستنفدة من الإكسوسوم و 5 مل من Pen-Strep إلى 500 مل من DMEM عالي الجلوكوز وتخزينها في 4 درجات مئوية. استخدم هذه الوسائط لعلاجات الخلايا قبل عزل EV.
    3. تحضير تونيكاميسين عن طريق إضافة 10 ملغ من تونيكاميسين إلى 1 مل من ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO). اصنع 50 ميكرولتر من الأليكوتات في أنابيب 0.2 مل وخزنها عند -20 درجة مئوية.
  2. إعداد كواشف فصل EV
    1. قم بإعداد 1x محلول ملحي مخزن مؤقتا بالفوسفات (PBS) عن طريق إضافة 9.89 جم من مسحوق PBS إلى 1 لتر من الماء منزوع الأيونات (DI) في أسطوانة متدرجة سعة 1 لتر. حرك المحلول على طبق تحريك حتى يذوب PBS.
    2. استخدم الأوتوكلاف لتعقيم الأواني الزجاجية قبل إضافة PBS. ضع الأواني الزجاجية في سلة المهملات ، وأغلق الباب ، وقم بالتعقيم لمدة 30 دقيقة عند 121 درجة مئوية.
    3. داخل خزانة التدفق الرقائقي ، قم بتوصيل فراغ بمرشح 0.22 ميكرومتر ووضع المرشح فوق الزجاجة المعقمة. صب PBS ببطء على المرشح وجمع PBS المصفى في زجاجة معقمة.
    4. قم بتحضير هيدروكسيد الصوديوم 0.5 م عن طريق إضافة 9.99 جم من هيدروكسيد الصوديوم إلى 500 مل من 1x PBS في أسطوانة متدرجة سعة 500 مل. حرك المحلول على صفيحة تحريك حتى يذوب هيدروكسيد الصوديوم في PBS ثم قم بالتصفية باستخدام مرشح 0.22 ميكرومتر في زجاجة 500 مل معقمة.
    5. تحضير 0.05٪ أزيد الصوديوم عن طريق إضافة 0.25 غرام من أزيد الصوديوم إلى 500 مل من 1x PBS في اسطوانة 500 مل متخرجة. حرك المحلول على طبق تحريك حتى يذوب أزيد الصوديوم في PBS ، ثم قم بالتصفية باستخدام مرشح 0.22 ميكرومتر في زجاجة 500 مل معقمة.
  3. تحضير كواشف عزل البروتين وتحديده كميا وتحديد هويته
    1. قم بإعداد 100 مل من المخزن المؤقت لتحلل RIPA عن طريق الجمع بين 1 مل من 1 M Tris (الرقم الهيدروجيني 7.4) ، و 1 مل من 10٪ من كبريتات دوديسيل الصوديوم (SDS) ، و 1 غرام من deoxycholate ، و 1 مل من NP-40 ، و 0.89 جم من كلوريد الصوديوم (NaCl). ارفع الحجم إلى 100 مل باستخدام H2O المقطر وخزنه عند 4 درجات مئوية. لصنع محلول مثبط للفوسفاتيز والفوسفاتيز والفوسفاتيز RIPA بالإضافة إلى ذلك ، أضف 10 ميكرولتر من مثبطات الفوسفاتيز والأنزيم البروتيني لكل 1 مل من مخزن RIPA المؤقت في أنبوب 15 مل وقم بتخزين المحلول عند 4 درجات مئوية.
    2. قبل الاستخدام مباشرة ، قم بإعداد كاشف عمل مقايسة BCA عن طريق إضافة 10 مل من الكاشف A و 200 ميكرولتر من الكاشف B الذي توفره مجموعة فحص BCA في أنبوب 15 مل. قبل الاستخدام مباشرة ، قم بإعداد كاشف عمل فحص microBCA عن طريق إضافة 25 جزءا من الكاشف A ، و 24 جزءا من الكاشف B ، وجزء واحد من الكاشف C إلى أنبوب 15 مل.
    3. تحضير 10x هلام الكهربائي تشغيل المخزن المؤقت عن طريق إضافة 30.3 غرام من قاعدة تريس ، 144 غرام من الجلايسين ، و 10 غرام من SDS في 1 لتر من الماء DI. قم بتخزين المخزن المؤقت قيد التشغيل عند 4 درجات مئوية. قم بإعداد مخزن مؤقت لنقل 1x بإضافة 3.03 جم من قاعدة Tris و 14.4 جم من الجلايسين و 200 مل من الميثانول واضبط الحجم على 1 لتر بماء DI. قم بتخزين مخزن النقل المؤقت عند 4 درجات مئوية.
    4. قم بتحضير محلول ملحي مخزن مؤقتا من Tris مع Tween-20 (TBS-Tween) عن طريق إضافة 2.4 جم من قاعدة Tris و 8 جم من كلوريد الصوديوم و 1 مل من Tween-20 إلى 1 لتر من ماء DI. قم بتخزين TBS-Tween على درجة حرارة 4 درجات مئوية.
    5. تحضير محلول حجب 5٪ عن طريق إضافة 5 غرام من الحليب المجفف الخالي من الدسم إلى 100 مل من TBS-Tween. قم بتخزين المخزن المؤقت للحظر عند 4 درجات مئوية.
    6. قبل الاستخدام مباشرة ، قم بإعداد الركيزة الكيميائية عن طريق إضافة 4 مل من محلول البيروكسيد و 4 مل من محلول اللومينول / المحسن إلى أنبوب 15 مل وقلبه بلطف للخلط.

2. زراعة وعلاج الخلايا

  1. زرع قوارير زراعة الخلايا T175 مع 2.3 × 106 خلايا الورم الدبقي الليلي البشري (HOG) لكل منهما. أحضر الحجم النهائي من DMEM الطبيعي عالي الجلوكوز إلى 25 مل واحتضنه عند 37 درجة مئوية مع 5٪ CO2 في حاضنة زراعة الخلايا لمدة 48 ساعة.
  2. في نهاية 48 ساعة ، دافئ مستنفد من الإكسوسوم عالي الجلوكوز DMEM في حمام مائي 37 درجة مئوية. للعلاج ، أضف 25 ميكرولتر من 10 ملغ / مل من التونيكاميسين إلى 25 مل من الوسائط المستنفدة للإكسوسوم ، والتركيز النهائي ل 10 ميكروغرام / مل من التونيكاميسين للحث على الإجهاد ER. بالنسبة للتحكم، أضف 25 ميكرولتر من DMSO إلى 25 مل من الوسائط المستنفدة للإكسوسوم.
  3. قم بإزالة DMEM عالي الجلوكوز الطبيعي والتخلص منه من الخلايا وشطف الخلايا والقارورة بلطف باستخدام 10 مل من 1x PBS. شفط وتجاهل PBS.
  4. أضف 25 مل من وسائط التحكم إلى عنصر التحكم المسمى بالقارورة ، و 25 مل من 10 ميكروغرام / مل تونيكاميسين في الوسائط إلى العلاج المسمى بالقارورة. إعادة القوارير إلى حاضنة زراعة الخلايا لمدة 24 ساعة.

3. جمع وتركيز CCM المشروط (الشكل 1)

  1. ضع PBS في حمام مائي 37 درجة مئوية. راقب القوارير تحت المجهر المركب باستخدام عدسة موضوعية 10x و 100x. تدوين ملاحظات عن أي اختلافات بين القوارير. نفذ الخطوات التالية لكل من القوارير الضابطة والمعالجة.
  2. قم بإزالة الوسائط من القارورة وضعها في أنبوب سعة 50 مل. جهاز طرد مركزي للأنبوب عند 500 × g لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية. انقل السوبرناتانت إلى أنبوب جديد سعة 50 مل.
  3. جهاز طرد مركزي للأنبوب عند 2000 × g لمدة 20 دقيقة عند 4 درجات مئوية. انقل المادة الفائقة إلى أنبوب جديد سعة 50 مل وضعها على الجليد.
  4. احصل على أربع وحدات ترشيح فائق القطع 15 مل 3 كيلو دال وأضف 5 مل من PBS إلى كل أنبوب. قم بتشغيل الفلتر عن طريق الطرد المركزي لوحدات الترشيح الفائق عند 4000 × g لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية.
    ملاحظة: تم استخدام وحدات الترشيح الفائق لقطع الوزن الجزيئي 3 kDa في البروتوكول الحالي للاحتفاظ بجميع البروتينات خارج الخلية المنبعثة من الخلايا. كما ستعمل وحدات الترشيح الفائق للوزن الجزيئي الأكبر حجما (على سبيل المثال ، 30 كيلو دالتون) مع هذا البروتوكول ، ولكن سيتم تصفية البروتينات خارج الخلية الأصغر من 30 كيلو دال وإزالتها من العينات20,21.
  5. قم بإزالة PBS من وحدات الترشيح الفائق. قسم السوبرناتانت من كل حالة (التحكم والتونيكاميسين المعالج) إلى وحدتي ترشيح فائقة لكل منهما ، حوالي 12.5 مل من الوسائط في كل منهما.
  6. قم بطرد الأنابيب مركزيا عند 4000 × g لمدة 1 ساعة و 45 دقيقة عند 4 درجات مئوية ، أو حتى تتركز الوسائط المركزة (المشار إليها باسم retentate) في كل وحدة ترشيح فائق إلى 250 ميكرولتر أو أقل.
  7. انقل الخيمة من وحدتي الترشيح الفائق للتحكم إلى أنبوب طرد مركزي دقيق 1.5 مل. انقل الارتداد من وحدتي الترشيح الفائق المعالجتين إلى أنبوب طرد مركزي آخر بسعة 1.5 مل.
  8. قياس الحجم الإجمالي لل retentate في كل أنبوب الطرد المركزي الدقيق ليكون 500 ميكرولتر. إذا كانت العينة أقل من 500 ميكرولتر، أضف 0.22 ميكرومتر مصفى 1x PBS حتى يصبح الحجم النهائي 500 ميكرولتر.

4. جمع الخلايا

  1. ضع التربسين و PBS و DMEM المستنفد للإكسوسوم في حمام مائي 37 درجة مئوية. أضف 7 مل من التربسين إلى كل من القوارير الضابطة والمعالجة وضعها في الحاضنة لمدة 5 دقائق.
  2. عرض تحت المجهر لمعرفة ما إذا تم رفع الخلايا. إذا لم يتم رفع الخلايا ، فاضغط بقوة على القارورة على راحة اليد لإزاحة الخلايا.
  3. اغسل القارورة ب 7 مل من DMEM المستنفد للإكسوسوم. جمع تعليق الخلية من القارورة ووضعها في أنابيب 15 مل.
  4. الطرد المركزي للأنابيب لمدة 10 دقائق عند 500 × غرام عند 4 درجات مئوية. قم بإزالة supernatant وإضافة 5 مل من 1x PBS إلى بيليه الخلية. مزيج ماصة بلطف لتفتيت الكريات.
  5. الطرد المركزي للأنابيب عند 500 × g لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية. قم بإزالة supernatant وإضافة 200 ميكرولتر من RIPA بالإضافة إلى محلول مثبط الفوسفاتيز والأنزيم البروتيني إلى حبيبات الخلايا ، ماصة للخلط.
  6. انقل الخلايا الموجودة في محلول RIPA إلى أنابيب 1.5 مل. دع الأنابيب تجلس على الجليد لمدة 5 دقائق. الطرد المركزي للأنابيب عند 14000 × g لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية.
  7. انقل السوبرناتانت إلى أنابيب جديدة سعة 1.5 مل. قم بتسمية الأنابيب بحالة العلاج وتاريخه. ضع الأنابيب في ثلاجة -80 درجة مئوية.
    ملاحظة: يمكن إيقاف البروتوكول مؤقتا هنا.

5. فصل EV باستخدام كروماتوغرافيا استبعاد الحجم (الشكل 2)

ملاحظة: قم بتنفيذ الخطوات التالية مرتين، مرة واحدة للتحكم في الثبات ومرة واحدة للتنكامايسين المعالج بالتينيكامايسين.
ملاحظة: PBS المستخدمة في هذا القسم هو 0.22 ميكرومتر تصفية 1x PBS.

  1. قم بتشغيل جامع الكسور التلقائي (AFC) واضبط الإعدادات لجمع ثمانية كسور، 0.5 مل لكل كسر، وحجم المخزن المؤقت (الفارغ) إلى الوضع الافتراضي.
    ملاحظة: شروط تشغيل الاتحاد الآسيوي لكرة القدم هي كما يلي: حجم العمود/السرير = 10 مل؛ حجم الفراغ = 2.70 مل ؛ حجم التدفق = 15 مل ؛ حجم الكسر الأمثل = 500 ميكرولتر ؛ المخزن المؤقت المطلوب لكل تشغيل = 65 مل ؛ معدل التدفق عند 20 درجة مئوية = 1.0 مل / دقيقة ؛ قابلية إعادة استخدام العمود = خمسة استخدامات.
  2. قم بإزالة العمود (انظر جدول المواد) من 4 درجات مئوية واترك العمود يسخن إلى درجة حرارة الغرفة قبل البدء (عادة ~ 30 دقيقة).
  3. قم بإزالة العينات الاحتياطية من الفريزر -80 درجة مئوية وضعها على الجليد لإذابتها. أثناء الانتظار، ضع ثمانية أنابيب بسعة 1.5 مل في دوار الاتحاد الآسيوي لكرة القدم مع أغطية متجهة إلى الداخل.
  4. أدخل عمودا في الاتحاد الآسيوي لكرة القدم مع الباركود المواجه للقارئ. ابدأ عملية الجمع باتباع الإرشادات التي تظهر على الشاشة للتحقق من وجود أنابيب في الدوار وأن جامع النفايات يعمل بشكل صحيح.
  5. ابدأ في مسح العمود بإضافة 15 مل من 1x PBS إلى العمود بعد امتصاص المخزن المؤقت للتخزين بالكامل في الجزء العلوي من مصفوفة العمود. لا تقم بإضافة PBS في وقت مبكر جدا لأن هذا سيؤدي إلى تخفيف المخزن المؤقت للتخزين ومنع التنظيف الكافي.
  6. قبل أن تمتص المصفوفة كل 15 مل من PBS ، انقر فوق موافق لإيقاف التنظيف وإزالة أي PBS المتبقية من أعلى مصفوفة العمود باستخدام ماصة دقيقة. لا تلمس المصفوفة.
  7. أضف 500 ميكرولتر من العينة إلى وسط العمود. انقر فوق موافق لبدء التشغيل. شاهد العينة تمتص في المصفوفة وأضف بسرعة 8 مل من PBS إلى العمود مباشرة بعد امتصاص العينة بالكامل.
  8. سيقوم الاتحاد الآسيوي لكرة القدم تلقائيا بتبديد حجم الفراغ في وسط الدوار ثم جمع جميع الكسور الثمانية من 500 ميكرولتر لكل منها. في ختام الجري ، قم بإزالة الكسور من الدوار ووضعها على الجليد. تحتوي الكسور 1-4 على EVs بينما تحتوي الكسور 5-8 على بروتينات خارج الخلية. إزالة حجم الفراغ من مركز الدوار.
  9. أضف 10 مل من PBS إلى العمود بعد جمع الكسور الثمانية لغسل أي عينة متبقية من العمود. بعد مسح عينة retentate بالكامل عبر العمود ، أضف 15 مل من 1x PBS إلى العمود.
  10. عندما يتم امتصاص PBS النهائي بواسطة المصفوفة ، أضف 500 ميكرولتر من 0.5 M هيدروكسيد الصوديوم إلى مركز مصفوفة العمود. عندما يتم امتصاص هيدروكسيد الصوديوم ، أضف 30 مل من 1x PBS إلى العمود واتركه يتدفق.
  11. في حالة تشغيل عينة أخرى، أضف ثمانية أنابيب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 مل إلى دائري وكرر الخطوات من 5.7 إلى 5.10.
  12. بمجرد الانتهاء من جميع العينات ، أكمل الخطوات التالية للحفاظ على العمود للاستخدام لاحقا. بعد مسح 30 مل من PBS عبر العمود كما هو موضح في الخطوة 5.10 ، أضف 15 مل من 0.05٪ من أزيد الصوديوم إلى العمود.
  13. اترك حوالي 5 مل من أزيد الصوديوم في الجزء العلوي من مصفوفة العمود. قم بإزالة العمود من الاتحاد الآسيوي لكرة القدم وإرفاق الأحرف الكبيرة العلوية والسفلية. ضع العمود مرة أخرى عند 4 درجات مئوية للتخزين (يمكن استخدام العمود حتى خمس مرات).

6. الترشيح الفائق لكسور EV والبروتين

  1. احصل على وحدتي ترشيح فائق القطع 2 مل و 3 كيلو دال لكل عينة. استخدم وحدة واحدة لتركيز كسور EV (الكسور 1-4) ، والأخرى لتركيز كسور البروتين (الكسور 5-8). تتكون كل وحدة من ثلاثة أجزاء: مخروط ، مرشح ، وأسطوانة تدفق من خلال. تسمية كل جزء بشكل صحيح.
  2. قم ببناء وحدة الترشيح الفائق وأضف 1 مل من 0.22 ميكرومتر مصفى 1x PBS إلى جزء المرشح والغطاء باستخدام قطعة المخروط. قم بالطرد المركزي لوحدة الترشيح الفائق، من الجانب المخروطي لأعلى عند 3500 × جم لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية.
  3. قم بإزالة PBS المصفى من أسطوانة التدفق من خلال. اقلب وحدة الترشيح الفائق رأسا على عقب (الجانب المخروطي لأسفل) وأجهزة الطرد المركزي لمدة 2 دقيقة عند 1000 × g عند 4 درجات مئوية. قم بإزالة أي PBS متبقي من المخروط.
  4. أضف الكسور المناسبة (حجم 500 ميكرولتر بأكمله) إلى كل وحدة ترشيح فائق (سيكون الحجم الإجمالي 2 مل). أعمدة أجهزة الطرد المركزي مخروطية الجانب لأعلى لمدة 1 ساعة 45 دقيقة عند 3500 × غرام عند 4 درجات مئوية ، أو حتى يكون مستوى الارتداد عند 100 ميكرولتر.
  5. قم بإزالة أسطوانة التدفق وتجاهل التدفق من خلالها. اقلب وحدة الترشيح الفائق رأسا على عقب (الجانب المخروطي لأسفل) وأجهزة الطرد المركزي لمدة 2 دقيقة عند 1000 × g عند 4 درجات مئوية.
  6. انقل الارتداد في المخروط إلى أنبوب طرد مركزي دقيق 1.5 مل مسمى واجعل كل حجم عينة إلى 150 ميكرولتر مع 0.22 ميكرومتر مصفى 1x PBS. ضع الأنابيب في الفريزر -80 درجة مئوية.
    ملاحظة: يمكن إيقاف البروتوكول مؤقتا هنا.

7. عناصر التحكم في الوسائط

  1. احصل على قارورتين لزراعة الخلايا T175. ضع علامة على أحد عناصر التحكم في القارورة والعلاج الآخر. DMEM عالي الجلوكوز الدافئ المستنفد للإكسوسوم في حمام مائي 37 درجة مئوية.
  2. أضف 25 ميكرولتر من محلول مخزون التونيكاميسين (10 مجم / مل) إلى 25 مل من الوسائط وضعها في العلاج المسمى بالقارورة. أضف 25 ميكرولتر من DMSO إلى 25 مل من الوسائط وضعها في عنصر التحكم المسمى بالقارورة. احتفظ بالقوارير في حاضنة زراعة الخلايا لمدة 24 ساعة.
  3. جمع الوسائط ومعالجتها لفصل المركبات الكهربائية كما هو موضح في الخطوات 3.2-3.8. بعد ذلك ، قم بتنفيذ جميع الخطوات الموضحة في القسمين 5 و 6.

8. النشاف الغربي

  1. تحديد كمية البروتين من محللات الخلايا وكسور البروتين باستخدام فحص BCA
    ملاحظة: يتم إجراء تحديد كمية البروتين من كل من العينات المعالجة بالتونيكاميسين والتونيكاميسين بالخطوات التالية.
    1. إذابة الخلايا المحللة وأجزاء البروتين على الجليد. جعل ثلاثة أنابيب تخفيف لكل عينة; 1:2 و 1:10 و 1:100.
    2. قم بالتحميل في ثلاثة أضعاف على لوحة فحص ذات قاع واضح من 96 بئرا ، و 25 ميكرولتر من معايير بروتين ألبومين مصل البقر (BSA) و 25 ميكرولتر من كل تخفيف عينة. أضف كاشف عمل 200 ميكرولتر إلى كل بئر يحتوي على معيار أو عينة ، باستخدام ماصة متعددة القنوات.
    3. احتضن اللوحة عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة ، ثم اقرأ اللوحة باستخدام قارئ لوحة بامتصاص 562 نانومتر. احسب تركيز البروتين في كل عينة وحدد حجم العينة اللازمة للحصول على 20 ميكروغرام من البروتين لمحللات الخلايا و 15 ميكروغرام من البروتين لكسور البروتين.
  2. تحديد كمية البروتين من كسور EV باستخدام فحص microBCA
    1. ذوبان عينات EV على الجليد. قم بعمل تخفيفين لكل عينة: 1:50 و 1:100.
    2. قم بالتحميل ثلاث مرات على لوحة فحص واضحة القاع من 96 بئرا ، و 100 ميكرولتر من معايير بروتين BSA ، و 100 ميكرولتر من كل تخفيف عينة. أضف 100 ميكرولتر من كاشف عمل microBCA إلى كل بئر يحتوي على معيار أو عينة ، باستخدام ماصة متعددة القنوات.
    3. احتضن اللوحة عند 37 درجة مئوية لمدة 2 ساعة ، ثم اقرأ اللوحة باستخدام قارئ لوحة بامتصاص 562 نانومتر. احسب تركيز البروتين في كل عينة وحدد حجم العينة اللازمة للحصول على 15 ميكروغرام من البروتين لكسور EV.
  3. نشاف غربي
    ملاحظة: تم تنفيذ بروتوكول النشاف الغربي على غرار ما هو موضح في22 ، وتم تعديله كما هو موضح أدناه.
    1. اصنع 10٪ من المواد الهلامية المصنوعة من البولي أكريلاميد باستخدام مجموعة صنع الجل ، باستخدام تعليمات الشركة المصنعة.
    2. بالنسبة للرحلان الكهربائي الهلامي ، قم بإعداد عينات من محللات الخلايا عن طريق الجمع في أنبوب 1.5 مل ، وحجم الخلية اللازمة ل 20 ميكروغرام من البروتين ، و 5 ميكرولتر من المخزن المؤقت 4x Laemmli ، وحجم مخزن RIPA العازل الضروري لرفع الحجم الإجمالي إلى 20 ميكرولتر.
    3. قم بإعداد عينات من أجزاء EV والبروتين عن طريق الجمع في أنبوب 1.5 مل حجم العينة اللازمة ل 15 ميكروغرام من البروتين ، و 5 ميكرولتر من المخزن المؤقت 4x Laemmli ، والمخزن المؤقت RIPA إلى حجم 20 ميكرولتر.
    4. قم بإعداد عينات التحكم في الوسائط عن طريق الجمع في أنبوب 1.5 مل 15 ميكرولتر من العينة و 5 ميكرولتر من المخزن المؤقت 4x Laemmli.
      ملاحظة: اعتمادا على الأجسام المضادة التي سيتم استخدامها، قد يحتاج مخزن Laemmli المؤقت أو لا يحتاج إلى احتواء عامل مختزل، مثل 50 mM dithiothreitol (DTT).
    5. تغلي جميع العينات عند 95 درجة مئوية لمدة 5 دقائق، وتنقل العينات إلى الجليد لتبرد، وترسل الطرد المركزي لفترة وجيزة لمدة 30 ثانية عند 10000 × جم، ثم تعيد العينات إلى الجليد.
    6. أضف المواد الهلامية إلى خزان الرحلان الكهربائي وأضف 1x هلام الكهربائي الذي يعمل العازل. تحميل 15 ميكرولتر من سلم البروتين و 20 ميكرولتر من العينة. قم بتشغيل الجل على 200 فولت لمدة 30-50 دقيقة ، أو حتى تصل العينات إلى قاع الجل ، قبل النفاد مباشرة.
    7. انقل البروتين إلى غشاء PVDF مع مخزن مؤقت لنقل 1x عند 4 درجات مئوية لمدة 30 دقيقة عند 100 فولت ، أو حتى اكتمال النقل. ويبين الشكل التكميلي 1 والشكل التكميلي 2 والشكل التكميلي 3 صورا خالية من البقع لكل بقعة بعد اكتمال النقل.
    8. قم بسد الغشاء في 5٪ من الحليب / TBS-Tween لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة على شاكر. حضانة الغشاء في محلول الأجسام المضادة الأولية بين عشية وضحاها على شاكر عند 4 درجات مئوية. انظر الجدول 1 للحصول على معلومات تخفيف الأجسام المضادة.
    9. في اليوم التالي ، قم بإزالة الجسم المضاد الأساسي واغسل الغشاء 3x باستخدام TBS-Tween لمدة 5 دقائق لكل منهما في درجة حرارة الغرفة على شاكر.
    10. تحضير الأجسام المضادة الثانوية المناسبة في 5٪ حليب / TBS-Tween. انظر الجدول 1 للحصول على معلومات عن التخفيف. أضف جسما مضادا ثانويا إلى الغشاء واحتضنه على شاكر في درجة حرارة الغرفة لمدة 1 ساعة ، ثم اغسل 3x باستخدام TBS-Tween لمدة 5 دقائق لكل منها في درجة حرارة الغرفة على شاكر.
    11. أضف الركيزة الكيميائية إلى الغشاء واحتضنها لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة على شاكر. لطخة الصورة باستخدام التحليل اللوني والكيميائي المضيء. ويبين الشكل التكميلي 4 والشكل التكميلي 5 والشكل التكميلي 6 صورا غير مقتصة لكل لطخة.

9. التصوير TEM

  1. تفريغ التوهج23 400 شبكة كربون / فورمفار الشبكات المغلفة لإزالة الهيدروكربونات وجعل الشبكات محبة للماء.
  2. أضف 5 ميكرولتر من عينة EV أو جزء البروتين إلى الشبكات. احتضان الشبكات في درجة حرارة الغرفة لمدة 3-5 دقائق.
  3. قم بإزالة المحلول الزائد عن طريق الفتل باستخدام ورق التصفية. اغسل الشبكات ب 5 ميكرولتر من الماء النقي النانوي وأزل الفائض عن طريق الفتيل.
  4. ضع 5 ميكرولتر من 1٪ من خلات اليورانيل المائية وقم بإزالتها على الفور. اترك الشبكات حتى تجف. شبكات الصور بسرعة 120 كيلو فولت على المجهر الإلكتروني الناقل والتقاط الصور باستخدام كاميرا جهاز مشحونة.

10. تحليل تتبع الجسيمات النانوية (NTA)

  1. احصل على عينات من EV وأجزاء البروتين من -80 درجة مئوية وتذوب على الجليد.
  2. قم بتشغيل الكمبيوتر وأداة NTA. افتح برنامج NTA وسيبدأ في التهيئة تلقائيا.
  3. حدد المضخة المناسبة التي تحتوي على مياه خالية من الجسيمات وانقر فوق شطف الأداة لشطف الخلية. أثناء الشطف ، حقن 10-20 مل من الماء الخالي من الجسيمات في منفذ الحقن في الجزء الأمامي من الأداة باستخدام حقنة وتجنب فقاعات الهواء.
  4. ستظهر شاشة فحص جودة الخلية ؛ انقر فوق موافق وسيبدأ فحص جودة الخلية. بعد اجتياز الفحص بنجاح، ستظهر شاشة المحاذاة التلقائية المنبثقة التي تقول: يرجى ملء الخلية بتعليق محاذاة 100 نانومتر (تخفيف 1:250,000).
    1. قم بإعداد التخفيف 1 من تعليق المحاذاة عن طريق إضافة 10 مل من الماء الخالي من الجسيمات و 10 ميكرولتر من حبات البوليسترين 100 نانومتر إلى أنبوب (تخفيف 1: 1000). يقلب بلطف للمزج. التخفيف 1 له عمر افتراضي من 2-3 أيام عند 4 درجات مئوية.
    2. قم بإنشاء تخفيف 2 من تعليق المحاذاة عن طريق إضافة 20 مل من الماء الخالي من الجسيمات و 80 ميكرولتر من التخفيف 1 (1: 1000) في أنبوب لإنشاء تخفيف 1: 250،000. اقلب الأنبوب بلطف للخلط. التخفيف 2 له عمر افتراضي يتراوح بين 30 و 60 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
  5. املأ الخلية ب 2 مل من التخفيف 2 (1:250,000). انقر فوق موافق وسيقوم البرنامج بإكمال المحاذاة التلقائية (التركيز) وتحسين التركيز البؤري. ستفتح علامة تبويب التحليل لإنشاء ملف تعريف يوفر نتائج نظافة وتماثل خلية القياس في القطع المكافئ. شاشة منبثقة تقول: عرض مجهر الفيديو جاهز الآن للتجارب ، وسوف تظهر. انقر فوق موافق وسيعود البرنامج إلى علامة التبويب فحص الخلية.
  6. شطف حبات البوليسترين من الخلية عن طريق حقن الماء الخالي من الجسيمات في منفذ الحقن لغسل الخلية. استمر في الغسيل حتى يتراوح عدد الجسيمات المكتشفة بين 0-10 (عادة ما بين 5-10 مل). أضف 1 مل من 0.22 ميكرومتر PBS المصفى لتمهيد الخلية للعينة الأولى.
  7. قم بتخفيف العينة الأولى باستخدام PBS المصفى بمقدار 0.22 ميكرومتر (ابدأ بتخفيف 1:1000) وأدخل عامل التخفيف في البرنامج. أدخل 1 مل من العينة في الخلية وانتظر 5 دقائق حتى تتباطأ حركة الجسيمات ، لأنها ستتحرك في البداية بسرعة كبيرة عبر الشاشة. اضبط الحساسية والغالق على 75.0 و100 على التوالي.
  8. عدد الجسيمات المكتشفة لتخفيف العينة المثالي هو 50-200 جسيم. إذا تم الإبلاغ عن أقل من 50 أو أكثر من 200 جسيم ، فاضبط تخفيف العينة. إذا كانت هناك حاجة إلى تخفيف جديد ، اغسل الخلية بالماء الخالي من الجسيمات حتى يكون هناك 0-10 جسيمات مكتشفة. كرر إضافة عينة مخففة وغسلها حتى يتم العثور على التخفيف المثالي.
  9. تحقق من جميع مواضع الكاميرا ال 11 لتصور أن حركة الجسيمات قد تباطأت وتأكد من أن عدد الجسيمات المكتشفة متشابه بين جميع مواضع الكاميرا. إذا كان عدد الجسيمات يختلف اختلافا كبيرا عبر مواضع الكاميرا، فأضف المزيد من العينات.
  10. انقر فوق علامة التبويب قياس وقم بتشغيل اكتساب الفيديو. ضمن علامة التبويب اكتساب الفيديو، أدخل اسما مخصصا للعينة وحدد موقعا آمنا. حدد مربعي الحفظ التلقائي.txt والحفظ التلقائي.pdf لحفظ البيانات.
  11. اضبط درجة الحرارة على 25 درجة مئوية ، وانقر فوق 488 نانومتر لضبط الليزر ، وانقر فوق 11 لمواضع الكاميرا. انقر فوق موافق لتشغيل جمع البيانات. سيبدأ البرنامج في تحليل عدد الجسيمات وحجمها في جميع المواضع ال 11. تحت علامة التبويب التحليل، سيظهر رسم بياني شريطي بقطر/نانومتر على المحور x وجسيمات/مل على المحور y.
  12. بعد جمع البيانات، ستظهر شاشة منبثقة بعنوان نظرة عامة على المواضع توفر بيانات لكل موضع من المواضع ال 11. إذا كان هناك أكثر من موضعين تمت إزالتهما من التحليل، فكرر الإجراء مع المزيد من العينات. إذا لم يكن الأمر كذلك ، فانقر فوق الزر "متابعة ". سيتم فتح ملف PDF و txt يحتوي على النتائج. احفظ الملفات في مكان آمن.
  13. لتشغيل عينة أخرى، انتقل إلى علامة التبويب فحص الخلية وكرر الخطوات من 10.6 إلى 10.12. إذا تم ذلك ، اغسل الخلية بالماء الخالي من الجسيمات حتى يكون عدد الجسيمات المكتشفة 0-10 (حوالي 5-10 مل). شطف الخلية مع 1 مل من 0.22 ميكرومتر PBS المصفاة، وإغلاق البرنامج، وإيقاف تشغيل الكمبيوتر.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

النشاف الغربي يكشف عن فصل كاف للمركبات الكهربائية عن CCM
لتقييم فعالية SEC لفصل المركبات الكهربائية عن وسائط زراعة الخلايا ، تم تشغيل لطخة غربية باستخدام كل جزء فردي من عينات التحكم للتحقيق في التعبير عن علامات EV الأساسية الثلاثة ، CD9 و CD63 و CD81 ، بالإضافة إلى GM130 و calnexin18 ، والتي تم استخدامها كعناصر تحكم سلبية (الشكل 3). كما تم فحص تعبير الألبومين18 للتأكد من أن البروتينات خارج الخلية في CCM يمكن فصلها بشكل كاف عن المركبات الكهربائية. لوحظ التعبير القوي عن CD9 و CD63 و CD81 في الكسور 1-4 ، مع تعبير ضئيل أو معدوم في الكسور 5-8 ؛ لم يلاحظ GM130 ولا الكالنكسين في أي كسر. كان الألبومين موجودا فقط في الكسور 6-8. معا ، تشير هذه البيانات إلى أن الحويصلات تتلاشى في الغالب إلى كسور 1-4 ، تاركة الكسور 5-8 لتحتوي على بروتينات خارج الخلية. ولهذا السبب ، تم دمج الكسور 1-4 وتركيزها واعتبرت جزء EV ، في حين تم دمج الكسور 5-8 وتركيزها ويشار إليها باسم جزء البروتين.

بعد ذلك ، تم تشغيل بقع غربية إضافية لتقييم فعالية تركيز أجزاء EV والبروتين عن طريق الترشيح الفائق في كل من العينات الضابطة والمعالجة. لوحظ التعبير عن CD9 و CD63 و CD81 في أجزاء الخلايا المحللة و EV لكل من العينات المعالجة بالكونيكاميسين والتونيكاميسين ، ولكن ليس في كسور البروتين (الشكل 4). يرتبط جين قابلية الورم 101 (TSG101) بمجمع الفرز الداخلي المطلوب للنقل (ESCRT)24 ويستخدم عادة كعلامة على الإكسوسومات25. كان هذا البروتين موجودا في التحلل الخلوي ولكن ليس في أجزاء EV أو البروتين. بالإضافة إلى ذلك ، لوحظ GM130 و calnexin فقط في عينات تحلل الخلايا. لذلك ، تشير البيانات إلى أن المركبات الكهربائية تم فصلها بشكل فعال عن وسائط زراعة الخلايا.

للتأكد من أن الإشارة الإيجابية التي لوحظت في كسور EV كانت قادمة من المركبات الكهربائية التي تطلقها الخلايا وليس من الوسائط نفسها ، خضعت الوسائط المستنفدة للإكسوسوم لنفس الترشيح الفائق وبروتوكول SEC مثل CCM المشروط ثم تم تحليلها عبر اللطخة الغربية (الشكل 5). تمت معالجة كل من التحكم والتونيكاميسين المحتوي على وسائط وتم استخدام محللات الخلايا كعنصر تحكم إيجابي على البقع الغربية. لم تلاحظ أي علامات EV (CD9 أو CD63 أو CD81 أو TSG101) في عينات الوسائط ، ولكنها كانت موجودة في lysates الخلوية. لوحظ تعبير الألبومين داخل أجزاء البروتين والحد الأدنى من التعبير في الليزات الخلوية ، ومن المحتمل أن يكون متبقيا من الوسائط. وبما أنه لا توجد إشارة لأي من علامات EV في كسور EV ، فإن هذه البيانات توضح أن الوسائط المستنفدة من الإكسوسوم لا تحتوي على EVs التي تخفي إشارة EVs المشتقة من الخلايا.

يوضح TEM التشكل المتوقع للمركبات الكهربائية
تم التقاط صور TEM لكل من أجزاء EV والبروتين المعالجة بالتونيكاميسين والتونيكاميسين (الشكل 6). يمكن ملاحظة الهياكل الكروية في كسور EV لكل من عينات التحكم والتونيكامايسين المعالجة ، مما يشير إلى وجود EVs. لا يتم ملاحظة هذه الهياكل في أجزاء البروتين من أي من نوعي العينتين ، والتي بدلا من ذلك لها تلطيخ داكن كبير ، مما يدل على البروتين في التصوير الكهرومغناطيسي.

NTA يكشف عن اختلافات في التركيزات في الفصائل الضابطة والمعالجة
تم تحديد تركيزات الجسيمات من السيطرة والتونيكاميسين المعالجة EV وكسور البروتين (n = 3) مع تحليل تتبع الجسيمات النانوية (NTA; الشكل 7). ويبين الشكل 7 ألف تركيزات الجسيمات للكسور الكهربائية الضابطة والمعالجة بالتونيكامايسين، مع وجود جسيمات أكثر قليلا في معالجة التونيكامايسين بالنسبة إلى السيطرة. كانت تركيزات الجسيمات القصوى بين 105-165 نانومتر. ويبين الشكل 7 باء تركيزات الجسيمات المكتشفة في جزء البروتين من كل من أجزاء البروتين المعالجة بالتونيكاميسين والتونيكاميسين. في جزء البروتين ، تم اكتشاف عدد أقل من الجسيمات بشكل عام بالنسبة إلى EVs (109 مقابل 10 13) ، وكانت تركيزات الذروة أصغر أيضا ، بين 75-135 نانومتر. ومن المثير للاهتمام أن جزء بروتين التونيكامايسين كان يحتوي على جزيئات أكثر من عنصر التحكم. لوحظت غالبية الجسيمات بحجم EV (حوالي 50-200 نانومتر) في جزء EV من كل من الخلايا المعالجة بالتحكم والتونيكاميسين مما يدعم استخدام SEC كوسيلة فعالة لفصل EV عن وسائط زراعة الخلايا المشروطة.

Figure 1
الشكل 1: الطرد المركزي التفاضلي والترشيح الفائق لوسائط زراعة الخلايا المشروطة. مخطط تخطيطي لخطوات الطرد المركزي التفاضلي والترشيح الفائق للوسائط التي تم جمعها من الخلايا المستزرعة بعد 24 ساعة من التحكم أو معالجة التونيكاميسين 10 ميكروغرام / مل. يتم طرد الوسائط مركزيا وتركيزها ، تاركة 500 ميكرولتر من الارتداد المركز مناسبا ل SEC. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 2
الشكل 2: كروماتوغرافيا استبعاد الحجم. مخطط لفصل المركبات الكهربائية والبروتينات عبر SEC. يتم التخلص من أول 3 مل (ستة أجزاء من 500 ميكرولتر لكل منهما) كحجم الفراغ. الكسور 1-4 العجة كمركبات كهربائية ، في حين أن الكسور 5-8 العجة كبروتينات. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 3
الشكل 3: تحليل اللطخة الغربية التمثيلية لكسور SEC الفردية. يتم استخدام حجم 15 ميكرولتر من كل جزء SEC فردي من خلايا التحكم ويتم فحصه لتعبير CD9 و CD63 و CD81 و GM130 و calnexin و albumin. تم ملاحظة CD9 و CD63 و CD81 بقوة في الكسور 1-4 بينما لم يتم ملاحظة GM130 و calnexin في أي كسر. لوحظ الألبومين فقط في الكسور 6-8. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 4
الشكل 4: صور اللطخة الغربية التمثيلية لصانعي السيارات الكهربائية الأساسية. تم فحص التركيز النهائي ل 20 ميكروغرام من البروتين من محللات الخلايا و 15 ميكروغرام من البروتين من SEC EV المجمعة والمركزة (1-4) وكسور البروتين (5-8) من التحكم و 10 ميكروغرام / مل من الخلايا المعالجة بالتونيكاميسين ل CD9 و CD63 و CD81 و TSG101 و calnexin و GM130. كانت جميع العلامات موجودة في الليزات الخلوية. لوحظت CD9 و CD63 و CD81 في جميع كسور EV ، في حين أن TSG101 لم يكن كذلك. كانت علامات EV السلبية كالنكسين و GM130 غائبة في أجزاء EV والبروتين. يشير محلل خلية التحكم إلى محللات الخلايا التي خضعت لعلاج التحكم ، في حين يشير محللات الخلايا 10 ميكروغرام / مل إلى محللات الخلايا التي خضعت لعلاج التونيكاميسين. يشير التحكم EV إلى المركبات الكهربائية من عينات التحكم. 10 ميكروغرام / مل EV يمثل EVs من العينات المعالجة من التونيكاميسين المعالجة. يشير بروتين التحكم إلى أن البروتينات خارج الخلية كانت من عينات التحكم ، في حين أن بروتين 10 ميكروغرام / مل يدل على البروتينات خارج الخلية من العينات المعالجة بالتونيكاماسين. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 5
الشكل 5: صور اللطخة الغربية التمثيلية لوسائط زراعة الخلايا المستنفدة للإكسوزوم. التحكم و 10 ميكروغرام / مل تونيكاميسين استزراع الخلايا المستنفدة للإكسوسوم خضعت وسائط SEC والترشيح الفائق. تم فحص الحجم الإجمالي البالغ 15 ميكرولتر من أجزاء SEC EV والبروتين ، و 20 ميكروغرام من البروتين من محللات الخلايا ل CD9 و CD63 و CD81 و TSG101 و calnexin و albumin. لم تلاحظ أي علامات EV في أجزاء EV أو البروتين ولكن لوحظت في محللات الخلايا المستخدمة كضوابط إيجابية. لوحظ الألبومين في كسور البروتين ولكن ليس في جزء EV. يشير التحكم EV إلى EVs من عينات وسائط التحكم. 10 ميكروغرام / مل EV يمثل EVs من العينات المعالجة من التونيكاميسين المعالجة. بروتين التحكم يعني أن البروتينات خارج الخلية كانت من عينات التحكم. 10 ميكروغرام / مل بروتين يدل على البروتينات خارج الخلية من العينات المعالجة بالتونيكاميسين. تشير نسبة تحلل خلايا التحكم إلى الخلايا الموجودة في علاج التحكم التي تم تحليلها ، في حين أن 10 ميكروغرام / مل من الخلايا المحللة تعني أن الخلايا المحللة جاءت من علاج التونيكاميسين. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 6
الشكل 6: صور TEM التمثيلية لمورفولوجيا المركبات الكهربائية. تم تجميع كسور SEC 1-4 و 5-8 وتركيزها كأجزاء EV والبروتين ، على التوالي ، من كل من الخلايا المعالجة بالتحكم و 10 ميكروغرام / مل من التونيكاميسين المعالج. لوحظت المركبات الكهربائية في كسور EV لكل من عينات التحكم والتونيكاميسين كجزيئات كروية صغيرة يقل قطرها عن 200 نانومتر ولا يتم ملاحظتها في عينات البروتين. أشرطة المقياس = 200 نانومتر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 7
الشكل 7: حجم الجسيمات وتركيزاتها من تحليل تتبع الجسيمات النانوية. حجم الجسيمات وكميتها في (A) كسور EV و (B) أجزاء البروتين من الخلايا المعالجة بالتونيكاميسين (n = 3). تشير EVs التحكم إلى EV من عينات التحكم ، بينما تمثل EVs المعالجة EVs من العينات المعالجة بالتونيكاميسين. يتضمن بروتين التحكم البروتينات خارج الخلية من عينات التحكم ، ويشير البروتين المعالج إلى البروتينات خارج الخلية من العينات المعالجة بالتونيكاماسين. أشرطة الخطأ هي ± انحراف معياري واحد. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل التكميلي 1: صورة خالية من البقع لأغشية PVDF من الشكل 3. تم تصوير كل غشاء PVDF لتصور نقل البروتين الناجح في ختام الخطوة 8.3.7. تم تصور كسور SEC الفردية (1-8) للبقع التي تم فحصها لاحقا ل (A) CD9 و (B) CD63 و (C) CD81 و (D) GM130 و (E) و calnexin و (F ) الألبومين. يرجى النقر هنا لتنزيل هذا الملف.

الشكل التكميلي 2: صورة خالية من البقع لأغشية PBDF من الشكل 4. تم تصوير كل غشاء PVDF لتصور نقل البروتين الناجح في ختام الخطوة 8.3.7. تم فحص البقع لاحقا بحثا عن (A) CD9 و (B) CD63 و (C) CD81 و (D) TSG101 و (E) GM130 و (F ) calnexin. يشير محلل خلية التحكم إلى تحلل الخلايا من الخلايا المعالجة بالتحكم ، بينما يشير محللات الخلايا 10 ميكروغرام / مل إلى محللات الخلايا من علاج تونيكامايسين. يشير التحكم EV إلى المركبات الكهربائية من عينات التحكم و 10 ميكروغرام / مل EV يمثل EVs من العينات المعالجة بالتونيكاميسين. يشير بروتين التحكم إلى البروتينات خارج الخلية من عينات التحكم ، ويشير بروتين 10 ميكروغرام / مل إلى البروتينات خارج الخلية من العينات المعالجة بالتونيكاماسين. يرجى النقر هنا لتنزيل هذا الملف.

الشكل التكميلي 3: صورة خالية من البقع لأغشية PVDF من الشكل 5. تم تصوير كل غشاء PVDF لتصور نقل البروتين الناجح في ختام الخطوة 8.3.7. تم فحص البقع لاحقا بحثا عن (A) CD9 و (B) CD63 و (C) CD81 و (D) TSG101 و (E) calnexin و (F ) ألبومين. يشير التحكم EV إلى المركبات الكهربائية من وسائط التحكم ويمثل 10 ميكروغرام / مل EV المركبات الكهربائية من الوسائط المعالجة بالتونيكاميسين. يشير بروتين التحكم إلى البروتينات خارج الخلية من وسائط التحكم ، ويشير بروتين 10 ميكروغرام / مل إلى البروتينات خارج الخلية من الوسائط المعالجة بالتونيكاماكين. يشير محلل خلية التحكم إلى تحلل الخلايا من الخلايا المعالجة بالتحكم ، بينما يشير محللات الخلايا 10 ميكروغرام / مل إلى محللات الخلايا من علاج تونيكامايسين. يرجى النقر هنا لتنزيل هذا الملف.

الشكل التكميلي 4: صور اللطخة الغربية غير المقصوصة المستخدمة لإنشاء الشكل 3. صور كيميائية وملونة مركبة غير مقتصة للبقع الغربية التي تم فحصها ل (A) CD9 و (B) CD63 و (C) CD81 و (D) GM130 و (E) calnexin و (F) ألبومين لكل جزء SEC فردي (الكسور 1-8). يرجى النقر هنا لتنزيل هذا الملف.

الشكل التكميلي 5: صور اللطخة الغربية غير المقطوعة من الشكل 4. صور كيميائية وملونة مركبة غير مقتصة للبقع الغربية التي تم فحصها ل (A) CD9 و (B) CD63 و (C) CD81 و (D) TSG101 و (E) GM130 و (F ) calnexin. يشير محلل خلية التحكم إلى تحلل الخلايا من الخلايا المعالجة بالتحكم ، بينما يشير محللات الخلايا 10 ميكروغرام / مل إلى محللات الخلايا من علاج تونيكامايسين. يشير التحكم EV إلى المركبات الكهربائية من عينات التحكم و 10 ميكروغرام / مل EV يمثل EVs من العينات المعالجة بالتونيكاميسين. يشير بروتين التحكم إلى أن البروتينات خارج الخلية كانت من عينات التحكم ، في حين أن بروتين 10 ميكروغرام / مل يدل على البروتينات خارج الخلية من العينات المعالجة بالتونيكاماسين. يرجى النقر هنا لتنزيل هذا الملف.

الشكل التكميلي 6: صور اللطخة الغربية غير المقطوعة من الشكل 5. صور كيميائية وملونة مركبة غير مقتصة للبقع الغربية تم فحصها بحثا عن (A) CD9 و (B) CD63 و (C) CD81 و (D) TSG101 و (E) calnexin و (F ) ألبومين. يشير التحكم EV إلى EVs من وسائط التحكم بينما يمثل 10 ميكروغرام / مل EV EVs من الوسائط المعالجة بالتونيكاميسين. بروتين التحكم يعني أن البروتينات خارج الخلية كانت من وسائط التحكم وبروتين 10 ميكروغرام / مل يدل على البروتينات خارج الخلية من الوسائط المعالجة بالتونيكاماسين. يشير محلل خلية التحكم إلى تحلل الخلايا من الخلايا المعالجة بالتحكم ، بينما يشير محللات الخلايا 10 ميكروغرام / مل إلى محللات الخلايا من علاج تونيكامايسين. يرجى النقر هنا لتنزيل هذا الملف.

جسم الأنواع المضيفة التخفيف
CD9 فأر 1 : 500
CD63 فأر 1 : 1000
CD81 فأر 1 : 500
جي إم 130 أرنب 1 : 500
الزلال أرنب 1 : 1000
TSG101* أرنب 1 : 1000
كالنكسين* أرنب 1 : 1000
مكافحة الماوس ^ حصان 1 : 1000
مكافحة الأرنب ^ ماعز 1 : 1000

الجدول 1: تخفيفات الأجسام المضادة. التخفيفات المستخدمة للأجسام المضادة. تم تخفيف الأجسام المضادة للمخزون في حليب 5٪ في TBS-Tween. * يمثل الأجسام المضادة التي تتطلب تشغيل العينات في ظل ظروف الاختزال ؛ ^ يمثل الأجسام المضادة الثانوية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

SEC هي طريقة سهلة الاستخدام لفصل EVs بشكل كاف عن CCM المشروطة. من أجل عزل المركبات الكهربائية المشتقة من الخلايا على وجه التحديد ، يجب أن يؤخذ في الاعتبار بعناية نوع CCM وملحقاته. تحتاج العديد من وسائط زراعة الخلايا إلى استكمالها ب FBS ، والتي تحتوي على EVs مشتقة من الحيوان الذي تم حصاد المصل فيه. قد تشبع هذه المركبات الكهربائية المصلية وتخفي أي إشارة تنتجها المركبات الكهربائية المشتقة من الخلايا في المزرعة26. لذلك ، عند إجراء التجارب ، يجب استخدام FBS المستنفدة للمركبات الكهربائية كلما أمكن ذلك للتأكد من أن المركبات الكهربائية التي تم العثور عليها يمكن أن تعزى إلى الخلايا المشتقة ، وليس المشتقة من الأبقار ، EVs يمكن شراؤها تجاريا أو صنعها داخليا من خلال تقنيات مختلفة تمت مراجعتها في مكان آخر26,27.

عند تشغيل العينات من خلال عمود SEC ، من الضروري استخدام PBS الذي تمت تصفيته. خلاف ذلك ، سيتم تلوث كل جزء بجزيئات من PBS بدلا من EVs المشتقة من الخلايا والبروتينات خارج الخلية فقط. من خلال تصفية PBS من خلال مرشح 0.22 ميكرومتر قبل استخدامه ل SEC ، يمكن للمرء أن يضمن أن أي جسيم في الكسور هو من الخلايا نفسها وليس PBS الملوثة.

يمكن أيضا تعديل البروتوكول الموضح هنا لتغيير عدد وحجم الكسور التي تم جمعها. على سبيل المثال ، يمكن جعل الكسور أكبر (1 مل مقابل 500 ميكرولتر) ، أو يمكن جمع المزيد من الكسور حيث من المحتمل أن تكون هناك بروتينات خارج الخلية تتجاوز ما يعتبر الكسر 8 في هذا البروتوكول. هذا ينطبق بشكل خاص على أنواع العينات الأخرى مثل بلازما الدم ، أو تركيبات الأعمدة الأخرى28,29. قد تحتوي هذه البروتينات الصغيرة خارج الخلية التي يحتمل أن تتلاشى في الكسور اللاحقة على جزيئات إشارات مهمة لا يتم جمعها أو فحصها باستخدام المنهجية الحالية. بالإضافة إلى ذلك، فإن استخدام الاتحاد الآسيوي لكرة القدم لجمع الكسور يخفف من أي أخطاء محتملة للمستخدم قد يتم إدخالها من خلال جمع الكسور يدويا. نظرا لأن الكسور تحذف قطرة تلو الأخرى ، يجب توخي الحذر الشديد لضمان جمع كل قطرة في الكسر المناسب ، والذي يمكن أن يكون تحديا عند الأداء يدويا.

أحد القيود الرئيسية ل SEC هو الحجم المحدود للعينة التي يمكن تشغيلها من خلال العمود. مع الأعمدة المتاحة تجاريا المستخدمة في هذا البروتوكول ، فإن 500 ميكرولتر من العينة هي الحد الأقصى للحجم الذي يمكن استخدامه. قد تستوعب الأعمدة الأخرى المتاحة تجاريا أو الأعمدة المصنوعة داخليا مجلدات أخرى من العينات ، ومع ذلك لا تزال هذه الأعمدة صغيرة نسبيا29,30. يمكن أن تستوعب طرق أخرى ، مثل dUC على سبيل المثال ، أحجام عينات أكبر ، ولكن هذه التقنية لا يمكنها بسهولة فصل EVs عن المكونات الأخرى خارج الخلية. يمكن أن تكون تدرجات السكروز أو اليوديكسانول مفيدة لفصل الجسيمات بناء على الكثافة ، ولكن هذه التقنية تستغرق وقتا طويلا وتتطلب أيدي ثابتة ومهارات سحب قوية جدا31,32.

بشكل عام ، تعد SEC طريقة مهمة لأبحاث EV تسمح بفصل كاف للمركبات الكهربائية عن CCM المشروطة. وينطبق هذا بشكل خاص على الأعمدة التجارية لأنها تسمح بتكرار أكبر بين النسخ المتماثلة البيولوجية ، ويمكن أتمتة التجزئة ، مما يقلل من فرص خطأ المستخدم. يوضح البروتوكول الموضح هنا أن المركبات الكهربائية تضعف في الغالب في الكسور المبكرة (1-4) ، بينما تحتوي الكسور اللاحقة على بروتينات خارج الخلية. يمكن بعد ذلك دمج هذه الكسور والخضوع للترشيح الفائق لتركيز العينة بشكل فعال للتحليلات النهائية بما في ذلك النشاف الغربي وتصوير TEM وتحجيم جسيمات NTA وقياسها كميا.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

ويعلن صاحبا البلاغ عدم وجود تضارب في المصالح.

Acknowledgments

يود المؤلفون أن يشكروا ولاية بنسلفانيا بيرند ومؤسسة هاموت الصحية على التمويل ، وكذلك مرفق الفحص المجهري لولاية بنسلفانيا في يونيفرسيتي بارك ، بنسلفانيا.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2-Mercaptoethanol VWR 97064-588
4X Laemmli Sample Buffer BioRad 1610747
Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Unit, Ultracel, 3 KDa, 15mL Sigma-Aldrich UFC900308 3 kDa cutoff
Amicon Ultra-2 Centrifugal Filter Unit with Ultracel-3 membrane Sigma-Aldrich UFC200324 3 kDa cutoff
Ammonium Persulfate Sigma-Aldrich A3678-100G
Anti rabbit IgG, HRP linked Antibody Cell Signaling Technology 7074V 1:1000 Dilution
Anti-Calnexin antibody Abcam  ab22595 1:500 Dilution
Anti-CD9 Mouse Monoclonal Antibody BioLegend 312102 1:500 Dilution
Anti-GM130 antibody [EP892Y] - cis-Golgi Marker Abcam ab52649 1:500 Dilution
Anti-mouse IgG, HRP-linked Antibody Cell Signaling Technology 7076V 1:1000 Dilution
Automatic Fraction Collector Izon Science
BCA assay Kit Bio-Rad
CCD camera Gatan Orius SC200
Cd63 Mouse anti Human BD 556019 1:1000 Dilution
CD81 Antibody Santa Cruz Biotechnology sc-23962 1:1000 Dilution
Cellstar Filter Cap Cell Culture Flasks Greiner Bio-One 660175
ChemiDoc MP Imager BioRad
Clarity Western ECL Substrate BioRad 1705061
deoxycholate Sigma-Aldrich D6750-10G
dithiothreitol Sigma 3483-12-3
DMEM/High glucose with L-glutamine; without sodium Cytiva SH300022.FS
Fetal Bovine Serum Premium grade VWR 97068-085
Fetal Bovine Serum, exosome-depleted Thermo Scientific A2720801
Glycine BioRad 1610718
Great Value Nonfat Dry Milk Amazon B076NRD2TZ
HOG Human Oligodendroglioma Cell Line Sigma-Aldrich SCC163
Izon Science Usa Ltd qev Size Exclusion Columns 5pk Izon Science
Methanol >99.8% ACS VWR BDH1135-4LP
Mini-PROTEAN Glass plates BioRad 1653310 with 0.75mm spacers
Mini-PROTEAN Short plates BioRad 1653308
NP-40 Sigma-Aldrich 492016
Penicillin-Streptomycin,Solution Sigma-Aldrich P4458-100mL
Phosphate Buffered Saline PBS Fisher Scientific BP66150
Pierce BCA Protein Assay Kits and Reagents Thermo Fisher Scientific 23227
Pierce PVDF Transfer Membranes Thermo Scientific 88518
Pierce Western Blotting Filter Paper Thermo Scientific 84783
Polyoxyethylene-20 (TWEEN 20), 500mL Bio Basic TB0560
Protease/phosphatase Inhibitor Cocktail (100X) Cell Signaling Technology 5872S
Recombinant Anti-TSG101 antibody [EPR7130(B)] ABCam ab125011 1:1000 dilution
Slodium hydroxide Sigma-Aldrich SX0603
Sodium azide Fisher Scientific BP922I-500
Sodium Chloride Sigma-Aldrich S9888-500G
Sodium dodecyl sulfate,≥99.0% (GC), dust-free pellets Sigma-Aldrich 75746-1KG
Tetramethylethylenediamine Sigma-Aldrich T9281-25ML
TGX Stain-Free FastCast Acrylamide Kit, 10% BioRad 1610183
Transmission Electron Microscope FEI Tecnai 12 Biotwin
Tris BioRad 1610716
Trypsin 0.25% protease with porcine trypsin, HBSS, EDTA; without calcium, magnesium Cytiva SH30042.01
Tunicamycin Tocris 3516
Zeta View software Analytik NTA software

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Pan, B. T., Teng, K., Wu, C., Adam, M., Johnstone, R. M. Electron microscopic evidence for externalization of the transferrin receptor in vesicular form in sheep reticulocytes. The Journal of Cell Biology. 101 (3), 942-948 (1985).
  2. Harding, C., Heuser, J., Stahl, P. Receptor-mediated endocytosis of transferrin and recycling of the transferrin receptor in rat reticulocytes. The Journal of Cell Biology. 97 (2), 329-339 (1983).
  3. Valadi, H., et al. Exosome-mediated transfer of mRNAs and microRNAs is a novel mechanism of genetic exchange between cells. Nature Cell Biology. 9 (6), 654-659 (2007).
  4. Raposo, G., Stoorvogel, W. Extracellular vesicles: Exosomes, microvesicles, and friends. The Journal of Cell Biology. 200 (4), 373-383 (2013).
  5. Rontogianni, S., et al. Proteomic profiling of extracellular vesicles allows for human breast cancer subtyping. Communications Biology. 2 (1), 1-13 (2019).
  6. Lane, R. E., Korbie, D., Hill, M. M., Trau, M. Extracellular vesicles as circulating cancer biomarkers: opportunities and challenges. Clinical and Translational Medicine. 7 (1), 14 (2018).
  7. Thompson, A. G., et al. Extracellular vesicles in neurodegenerative disease-pathogenesis to biomarkers. Nature Reviews Neurology. 12 (6), 346-357 (2016).
  8. O'Brien, K., Ughetto, S., Mahjoum, S., Nair, A. V., Breakefield, X. O. Uptake, functionality, and re-release of extracellular vesicle-encapsulated cargo. Cell Reports. 39 (2), 110651 (2022).
  9. Joshi, B. S., de Beer, M. A., Giepmans, B. N. G., Zuhorn, I. S. Endocytosis of extracellular vesicles and release of their cargo from endosomes. ACS Nano. 14 (4), 4444-4455 (2020).
  10. Théry, C., Amigorena, S., Raposo, G., Clayton, A. Isolation and characterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids. Current Protocols in Cell Biology. 30 (1), 3-22 (2006).
  11. Willms, E., Cabañas, C., Mäger, I., Wood, M. J. A., Vader, P. Extracellular vesicle heterogeneity: Subpopulations, isolation techniques, and diverse functions in cancer progression. Frontiers in Immunology. 9, 738 (2018).
  12. Tzaridis, T., et al. Extracellular vesicle separation techniques impact results from human blood samples: Considerations for diagnostic applications. International Journal of Molecular Sciences. 22 (17), 9211 (2021).
  13. Liangsupree, T., Multia, E., Riekkola, M. L. Modern isolation and separation techniques for extracellular vesicles. Journal of Chromatography A. 1636, 461773 (2021).
  14. Gámez-Valero, A., et al. Size-exclusion chromatography-based isolation minimally alters extracellular vesicles' characteristics compared to precipitating agents. Scientific Reports. 6 (1), 1-9 (2016).
  15. Mol, E. A., Goumans, M. J., Doevendans, P. A., Sluijter, J. P. G., Vader, P. Higher functionality of extracellular vesicles isolated using size-exclusion chromatography compared to ultracentrifugation. Nanomedicine: Nanotechnology, Biology, and Medicine. 13 (6), 2061-2065 (2017).
  16. Campos-Silva, C., et al. High sensitivity detection of extracellular vesicles immune-captured from urine by conventional flow cytometry. Scientific Reports. 9 (1), 2042 (2019).
  17. Norman, M., et al. L1CAM is not associated with extracellular vesicles in human cerebrospinal fluid or plasma. Nature methods. 18 (6), 631-634 (2021).
  18. Théry, C., et al. Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines. Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1535750 (2018).
  19. Mathieu, M., et al. Specificities of exosome versus small ectosome secretion revealed by live intracellular tracking of CD63 and CD9. Nature Communications. 12 (1), 1-18 (2021).
  20. Guo, J., et al. Establishment of a simplified dichotomic size-exclusion chromatography for isolating extracellular vesicles toward clinical applications. Journal of Extracellular Vesicles. 10 (11), 12145 (2021).
  21. Benedikter, B. J., et al. Ultrafiltration combined with size exclusion chromatography efficiently isolates extracellular vesicles from cell culture media for compositional and functional studies. Scientific Reports. 7 (1), 1-13 (2017).
  22. Eslami, A., Lujan, J. Western blotting: sample preparation to detection. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (44), e2359 (2010).
  23. Grassucci, R. A., Taylor, D. J., Frank, J. Preparation of macromolecular complexes for cryo-electron microscopy. Nature Protocols. 2 (12), 3239 (2007).
  24. Williams, R. L., Urbé, S. The emerging shape of the ESCRT machinery. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 8 (5), 355-368 (2007).
  25. Willms, E., et al. Cells release subpopulations of exosomes with distinct molecular and biological properties. Scientific Reports. 6 (1), 1-12 (2016).
  26. Lehrich, B. M., Liang, Y., Fiandaca, M. S. Foetal bovine serum influence on in vitro extracellular vesicle analyses. Journal of Extracellular Vesicles. 10 (3), 12061 (2021).
  27. Kornilov, R., et al. Efficient ultrafiltration-based protocol to deplete extracellular vesicles from fetal bovine serum. Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1422674 (2018).
  28. Böing, A. N., et al. Single-step isolation of extracellular vesicles by size-exclusion chromatography. Journal of Extracellular Vesicles. 3 (1), (2014).
  29. Zhang, X., Borg, E. G. F., Liaci, A. M., Vos, H. R., Stoorvogel, W. A novel three step protocol to isolate extracellular vesicles from plasma or cell culture medium with both high yield and purity. Journal of Extracellular Vesicles. 9 (1), 1791450 (2020).
  30. Guerreiro, E. M., et al. Efficient extracellular vesicle isolation by combining cell media modifications, ultrafiltration, and size-exclusion chromatography. PLoS ONE. 13 (9), 02024276 (2018).
  31. Onódi, Z., et al. Isolation of high-purity extracellular vesicles by the combination of iodixanol density gradient ultracentrifugation and bind-elute chromatography from blood plasma. Frontiers in Physiology. 9, 1479 (2018).
  32. Yuana, Y., Levels, J., Grootemaat, A., Sturk, A., Nieuwland, R. Co-isolation of extracellular vesicles and high-density lipoproteins using density gradient ultracentrifugation. Journal of Extracellular Vesicles. 3 (1), (2014).

Tags

علم الأعصاب ، العدد 183 ،
كروماتوغرافيا استبعاد الحجم لفصل الحويصلات خارج الخلية عن وسائط زراعة الخلايا المشروطة
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Jones, M. T., Manioci, S. W.,… More

Jones, M. T., Manioci, S. W., Russell, A. E. Size Exclusion Chromatography for Separating Extracellular Vesicles from Conditioned Cell Culture Media. J. Vis. Exp. (183), e63614, doi:10.3791/63614 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter