Summary
الهدف من هذه المخطوطة هو وصف الخطوات الجراحية المجهرية المطلوبة لإجراء عملية زرع حنجرية غير متجانسة في الفئران. تتمثل مزايا نموذج الفأر هذا مقارنة بالنماذج الحيوانية الأخرى لزراعة الحنجرة في فعاليته من حيث التكلفة وتوافر المقايسات والبيانات المناعية.
Abstract
على الرغم من أن زراعة الحنجرة غير المتجانسة إجراء صعب تقنيا ، إلا أنها توفر تحليلا علميا وفوائد من حيث التكلفة مقارنة بالنماذج الحيوانية الأخرى. على الرغم من وصفها لأول مرة من قبل Shipchandler et al. في عام 2009 ، إلا أن هذه التقنية لا تستخدم على نطاق واسع ، ربما بسبب الصعوبات في تعلم تقنية الجراحة المجهرية والوقت اللازم لإتقانها. تصف هذه الورقة الخطوات الجراحية بالتفصيل ، بالإضافة إلى المزالق المحتملة التي يجب تجنبها ، من أجل تشجيع الاستخدام الفعال لهذه التقنية.
في هذا النموذج ، يتم مفاغرة الشرايين السباتية الثنائية للحنجرة المانحة إلى الشريان السباتي المتلقي والوريد الوداجي الخارجي ، مما يسمح بتدفق الدم عبر الكسب غير المشروع. يمكن تأكيد تدفق الدم أثناء العملية عن طريق تصور ملء الدم في الشرايين السباتية الثنائية الكسب غير المشروع ، واحمرار الغدد الدرقية في الكسب غير المشروع ، والنزيف من الأوعية الدقيقة في الكسب غير المشروع. تشمل العناصر الحاسمة للنجاح الحفاظ الدقيق على أوعية الكسب غير المشروع ، وإجراء بضع الشرايين وبضع الوريد بالحجم الصحيح ، واستخدام العدد المناسب من الغرز على مفاغرة الشرايين الشريانية والشريانية الوريدية لتأمين الأوعية دون تسرب ومنع الانسداد.
يمكن لأي شخص أن يصبح بارعا في هذا النموذج مع التدريب الكافي وتنفيذ الإجراء في حوالي 3 ساعات. إذا تم إجراؤه بنجاح ، يسمح هذا النموذج بإجراء الدراسات المناعية بسهولة وبتكلفة منخفضة.
Introduction
بالنسبة للمرضى الذين يعانون من تلف الحنجرة الذي لا يمكن إصلاحه أو سرطان الحنجرة ، غالبا ما يكون استئصال الحنجرة الكلي هو الخيارالوحيد 1. استئصال الحنجرة الكلي يترك المرضى دون القدرة على التنفس والتحدث من تلقاء أنفسهم ، بالإضافة إلى تجربة ضائقة اجتماعية ونفسية2. المرضى الذين يعانون من سرطان الحنجرة الذين يحتاجون إلى استئصال الحنجرة الكلي هم مرشحون محتملون ممتازون لزراعة الحنجرة. في حين تم إجراء زرع الحنجرة البشرية في وضع تلف الحنجرة الذي لا يمكن إصلاحه ، يتم حاليا تجنب زرع الحنجرة في هؤلاء المرضى بسبب الخوف من تكرار الورم ، وإمكانية الرفض المزمن ، والالتهابات المشتقة من المتبرع3. كبت المناعة هو السبب الرئيسي لهذه المخاوف. الخسارة الدراماتيكية لأول مريض زرع حنجري جزئي بسبب تكرار الورم بعد العلاج المثبط للمناعة التقليدي هو دليل على أنه يجب وضع نظام مناسب مثبط للمناعة قبل إجراء المزيد من المحاولات للزراعة في مرضى سرطان الحنجرة 4,5.
لفهم أفضل للاستجابة المناعية للمضيف للحنجرة المزروعة ، تم تطوير أول نموذج زرع الحنجرة في الفئران في عام 1992 بواسطة Strome ، وتم إجراء تحسينات على التقنية الجراحية في عام 2002 6,7. على الرغم من أن هذا النموذج فعال لدراسة زراعة الحنجرة ، إلا أن نقص العوامل المناعية الخاصة بالفئران والتكلفة العالية المرتبطة بنماذج الفئران أدى إلى تطوير نموذج فأر جديد لدراسة زراعة الحنجرة في عام 20098.
التطبيق الرئيسي للتقنية الموصوفة هو دراسة أنظمة الأدوية المثبطة للمناعة المختلفة في زراعة الحنجرة. قد يؤدي تحسين العلاجات المثبطة للمناعة الحالية إلى توسيع مجموعة المرشحين ويؤدي إلى زرع آمن في مرضى السرطان. فوائد نموذج الماوس هذا هي فعاليته من حيث التكلفة والتوافر الواسع للبيانات والكواشف المناعية.
يمكن للفرق التي تعمل على أنظمة العلاج المثبطة للمناعة لزراعة الحنجرة استخدام هذه الطريقة لجمع كمية كبيرة من البيانات المناعية ، ويمكن اختبار أنظمة الأدوية المختلفة ومقارنتها بسرعة. يمكن أيضا اختبار طرق العلاج المحتملة الأخرى التي يمكن أن تعدل الاستجابة المناعية لعملية الزرع ، مثل حقن الخلايا الجذعية ، باستخدام هذا النموذج. أخيرا ، يمكن ابتكار تجارب لمراقبة الآثار الجهازية طويلة المدى لزراعة الحنجرة عن طريق تمديد فترة المتابعة.
تستخدم التقنية الموصوفة هنا مفاغرة من طرف إلى جانب لتوفير التدفق الشرياني والوريدي لطعم الحنجرة غير المتجانس. الكسب غير المشروع عبارة عن مركب حنجري رغامي مريئي (LTE) يضم الحنجرة والغدد الدرقية والغدد الجار درقية والقصبة الهوائية والمريء للمتبرع ، مع الشرايين السباتية الثنائية والعنيق سليمة. يتم مفاغرة أحد الشريان السباتي المتبرع إلى الشريان السباتي المتلقي ويوفر تدفق الدم الشرياني ، بينما يتم مفاغرة الشريان السباتي للمتبرع الآخر إلى الوريد الوداجي الخارجي المتلقي ويوفر تدفق الدم الوريدي (الشكل 1).
تم إجراء العديد من التعديلات على التقنية الجراحية لنموذج الفئران لضمان النجاح في نموذج الفأر. على سبيل المثال ، تم استخدام عامل مخدر مستنشق بدلا من عامل قابل للحقن لزيادة التحكم في عمق التخدير وتقليل المضاعفات. يستخدم خياطة مستمرة في مفاغرة الشرايين الشريانية في الفئران. ومع ذلك ، نظرا لصغر حجم أوعية الماوس ، فإن هذا أمر صعب تقنيا ويمكن أن يتسبب في تضييق تجويف الوعاء7. نتيجة لذلك ، يتم استخدام الغرز المتقطعة في نموذج الماوس وتؤدي إلى تحسين سالكية السفينة. بالإضافة إلى ذلك ، في نموذج الفئران ، يتم تشريح عنيق الشريان الدرقي العلوي (STA) وتصوره. نظرا لصغر حجم STA في الفئران ، يمكن أن يؤدي هذا التشريح إلى تلف وحتى نقل STA. نتيجة لذلك ، لا يتم تشريحه في نموذج الماوس. بدلا من ذلك ، يتم الحفاظ على اللفافة القريبة لضمان الحفاظ على STA سليمة.
تشمل المزالق الرئيسية المحتملة لهذه التقنية إتلاف عناقيد LTE المعقدة المانحة ، أو إجراء بضع الشريان أو بضع الوريد بحجم غير صحيح ، أو انسداد الأوعية في مواقع المفاغرة ، أو ترك فجوات في مواقع المفاغرة التي قد تسبب النزيف. لتجنب هذه الأخطاء ، يجب توخي الحذر عند شراء الكسب غير المشروع للمتبرع عن طريق ترك صفعة من الأنسجة حول عنيق STA. يجب أن يكون بضع الشرايين وبضع الوريد كبيرا بما يكفي للسماح بتدفق الدم ولكنه صغير بما يكفي لمنع التسرب. يجب استخدام عدد مناسب من الغرز للمفاغرة لسد أي فجوات ، ولكن ليس كثيرا لسد الأوعية.
إذا تم الحصول على الإلمام بتقنيات الجراحة المجهرية ، يمكن إجراء هذا الإجراء في حوالي 3 ساعات. يمكن إجراء نموذج زرع الحنجرة هذا بشكل موثوق في الفئران واستخدامه لدراسة الاستجابة المناعية للمضيف بعد زرع الأوعية الدموية المركبة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
تم إجراء هذا البحث وفقا للجنة رعاية واستخدام الحيوان المؤسسية في Mayo Clinic (IACUC). تم استخدام فئران BalbC (10-12 أسبوعا) كمتبرعين وتم استخدام الفئران C57 / BL6 (10-12 أسبوعا) كمتلقين لأن مجمعات التوافق النسيجي الرئيسية ، H-2Db و H-2Kb ، على التوالي ، غير متوافقة مناعيا ، وبالتالي يمكن دراسة الاستجابة المناعية للكسب غير المشروع. تم تعقيم جميع الأدوات المستخدمة أثناء الجراحة (انظر الشكل التكميلي S1 والشكل التكميلي S2) ، وتم الحفاظ على المجال الجراحي معقما طوال البروتوكول وفقا لتعليمات IACUC.
1. جراحة المتبرعين وشراء الكسب غير المشروع
- حقن المتبرع بالبوبرينورفين ممتد المفعول (3.25 ملغم / كغم من وزن الجسم تحت الجلد) قبل 30 دقيقة من بدء الإجراء. ضع الماوس في صندوق تخدير القوارض لتحريض التخدير عند 3٪ إيزوفلوران يتم توصيله بتدفق 1 لتر / دقيقة O2 . بعد تخدير الحيوان بالكامل ، انقل الماوس إلى منطقة الحلاقة وقم بإدارة 1.5٪ إيزوفلوران مع تدفق 1 لتر / دقيقة O2 للحفاظ على التخدير. تأكد من عمق التخدير بقرصة إصبع القدم.
- حلق الصدر والرقبة من الماوس حتى خط الفك وتطبيق كريم مزيل الشعر. بعد 30 ثانية ، امسح الكريم بقطعة شاش معقمة مبللة بالماء وانقل الماوس إلى منطقة الجراحة.
- ضع مادة تشحيم العين على عيون الماوس. ضع الماوس على وسادة تدفئة إضافية ملفوفة لضمان درجة حرارة الجسم المناسبة.
- شل حركة الفأر ، وقم بإعداد المنطقة الجراحية ثلاث مرات باستخدام اليود البوفيدون والكحول ، ثم ثني الماوس.
ملاحظة: تحقق من عمق التخدير عن طريق قرصة إصبع القدم وحافظ على التخدير عند 1.5٪ إيزوفلوران وتدفق 1 لتر / دقيقة O2 عبر قناع الوجه طوال العملية. - قم بعمل شق أفقي صغير أعلى من الشق فوق القصي. باستخدام مقص ناعم ، ارفع الجلد بشكل ثنائي من خلال هذا الشق حتى الفك السفلي. استئصال جزء من الجلد على شكل شبه منحرف مما يؤدي إلى تعرض الغدد اللعابية الثنائية ، والعضلات القصية الخشائية ، والعضلات ثنائية المعدة ، والجانب العلوي من القص (الشكل 2 أ).
- استئصال الغدد اللعابية الثنائية باستخدام الكي في الجزء العلوي حيث يتم تصور وريد صغير ينتقل عبر الغدة (الشكل 2 أ).
ملاحظة: إذا لم يتم الحرص على كي الوعاء قبل إزالة الغدة ، يمكن مواجهة نزيف كبير في هذه الخطوة. - اسحب الأنسجة اللمفاوية والدهنية برفق بشكل جانبي لفضح عضلات القص الخشائي وعضلات الحزام. تشريح عضلات القص الخشائي الثنائية من الأنسجة المحيطة وسحبها جانبيا باستخدام المبعدات.
ملاحظة: ستكشف هذه المناورة تماما عن مجمع LTE مع عضلات الحزام وتوفر مساحة عمل مريحة لتشريح الشرايين السباتية (الشكل 2 ب). - قم بعمل شق في خط الوسط بين عضلات الحزام واستئصالها ثنائيا ، مع الحرص على عدم إتلاف الغدة الدرقية الكامنة وتركها على مركب LTE.
ملاحظة: بعد هذه الخطوة ، يجب أن تكون الشرايين السباتية الثنائية مرئية (الشكل 2C). - تشريح الشرايين السباتية المشتركة إلى مستوى الترقوة بشكل سفلي وإلى مستوى التشعب السباتي بشكل متفوق. تشريح العصب المبهم والوريد الوداجي الداخلي من الشرايين السباتية. لا تقم بتضمينها في الكسب غير المشروع الذي تم شراؤه.
ملاحظة: يمكن رؤية الشريان الدرقي العلوي أعلى تماما من التشعب الذي ينتقل وسطيا. اترك اللفافة الرقيقة المحيطة بهذا الوعاء سليمة ولا تحاول تشريحها محيطيا. يوفر هذا الوعاء تدفق الدم إلى مجمع LTE وسيكون بمثابة عنيق بعد الزرع. الحفاظ على هذه السفينة له أهمية قصوى. - تشريح الشرايين السباتية الداخلية والخارجية بما فيه الكفاية لتكون قادرة على ربط وتقسيم. إذا كانت هناك صعوبة في تصور الأوعية ، فاستخدم مبعدة منفصلة لسحب عضلات المعدة بشكل جانبي.
ملاحظة: تجنب تشريح الشريان السباتي الخارجي بالقرب من التشعب لمنع أي ضرر للشريان الدرقي العلوي. في هذه الخطوة ، يمكن مواجهة الشريان القذالي ، الذي يتفرع من الشريان السباتي الخارجي ويتبع بالتوازي مع الشريان السباتي الداخلي ، ويجب عدم الخلط بينه وبين الشريان السباتي الداخلي ، وهو أكبر ويوجد أعمق (الشكل 2 د). - باستخدام 8-0 خيوط النايلون ، ربط الشرايين السباتية الداخلية 2 إلى 3 مم أعلى من التشعب السباتي. ربط الشرايين السباتية الخارجية على الأقل 3 مم أعلى من نقطة التفرع للشريان الدرقي العلوي.
ملاحظة: بعد هذه الربطات ، سيتم نقل مركب LTE عبر الشرايين الدرقية العلوية إلى الشرايين السباتية الثنائية. - ربط الشرايين السباتية المشتركة على مستوى القص وقطع جميع الأوعية المربوطة ثنائيا. حافظ على عناقيد الأوعية الدموية أعلى مجمع LTE لتجنب التلف العرضي أثناء التشريح الإضافي. لمنع أي تسرب للغاز أو فقدان غير مقصود للتخدير ، تأكد من انتهاء صلاحية الحيوان قبل إجراء أي قطع في مجرى الهواء.
- قسم العضلات تحت اللامية على مستوى hyoid. إنشاء بضع البلعوم الأمامي فقط أدنى من hyoid. احمل الشق وصولا إلى اللفافة الفقرية لتحرير مركب LTE بشكل فائق.
- انقل القصبة الهوائية أسفل حلقة القصبة الهوائية الخامسة واحمل الشق عبر المريء وصولا إلى اللفافة الفقرية لتحرير مجمع LTE بشكل سفلي. حرر القصبة الهوائية والمريء من اللفافة الفقرية الكامنة من الاتجاه الأدنى إلى الاتجاه العلوي.
ملاحظة: احتفظ بالعناقيد الوعائية أعلى مجمع LTE لتجنب التلف العرضي أثناء التشريح الإضافي. - إنشاء بضع البلعوم الأمامي فقط أدنى من hyoid. احمل الشق وصولا إلى اللفافة الفقرية لتحرير مركب LTE بشكل فائق. قسم أي ملحقات متبقية من الأنسجة اللمفاوية أو النسيج الضام بين مركب LTE والأنسجة المحيطة. إزالة الكسب غير المشروع.
ملاحظة: يحتوي الكسب غير المشروع على الحنجرة المانحة والقصبة الهوائية والغدد الدرقية والغدد الجار درقية والمريء وعضلات الحنجرة كوحدة مركبة (الشكل 2E).
2. إعداد الكسب غير المشروع
- ضع الكسب غير المشروع الذي تم شراؤه في طبق بتري معقم واغسله بمحلول ملحي عادي للتخلص من أي جلطات دموية. باستخدام ملقط دقيق ، قم بحلب الدم والجلطات بلطف من الشرايين السباتية الثنائية. توسيع الشرايين السباتية الثنائية باستخدام موسعات دقيقة 1 مم.
- باستخدام إبرة ذات رأس حاد 30 جم ، قم بحقن ما يقرب من 2 مل من محلول ملحي هيبارين في كل شريان سباتي لطرد الطعم.
ملاحظة: يمكن رؤية الدم والمحلول الملحي يتدفقان من الشريان السباتي المقابل ونهايات الأوعية الدموية الصغيرة الحرة ، مما يؤكد سلامة الشرايين الدرقية العلوية. - استئصال adventitia بعيدا عن نهايات الشرايين بحيث يكون لها حواف نظيفة للمفاغرة.
ملاحظة: يمكن ترك الكسب غير المشروع في محلول ملحي هيبارين ويمكن أخذ استراحة قصيرة لمدة تصل إلى 3 ساعات قبل زرعه في المتلقي9.
3. جراحة المتلقي ومفاغرة الأوعية
- قم بإعداد الفأر المتلقي بنفس الطريقة الموضحة للمتبرع بعد خطوات تحريض التخدير والحلاقة والتحضير الجراحي. حقن الفأر المتلقي بمسكن ممتد المفعول تحت الجلد قبل 30 دقيقة من بدء الجراحة.
- باستخدام مشرط ، قم بعمل شق عنق في خط الوسط يمتد من خط الفك بشكل أعلى إلى القص السفلي. ارفع الجلد على الجانب الأيسر واسحبه جانبيا.
- استئصال الغدة اللعابية اليسرى ، والكي الأوعية العليا كما هو موضح سابقا. استئصال الأنسجة الدهنية واللمفاوية عن طريق تقسيم أي أوعية مرئية مع الكي درجة حرارة منخفضة ، مع الحرص على عدم إتلاف الوريد الوداجي الخارجي الأساسي (الشكل 3 أ).
- تشريح الوريد الوداجي الخارجي محيطيا. استخدم ما لا يقل عن 5 مم من الطول الواضح للوعاء للمفاغرة. استخدم الكي أو الرباط بدرجة حرارة منخفضة وقسم أي عروق كبيرة نسبيا متفرعة من الوريد الوداجي.
- تشريح العضلة القصية الخشائية وسحبها أفقيا. حافظ على الوريد المشريح محميا خلف العضلات لتجنب الاتصال المباشر مع المبعد.
- استئصال عضلات الشريط الأيسر للوصول إلى الشريان السباتي المتلقي. تشريح الشريان السباتي المشترك بشكل محيطي من الترقوة بشكل سفلي حتى التشعب السباتي بشكل متفوق (الشكل 3 ب).
- مرر مادة الخلفية تحت الوريد الوداجي الخارجي وقم بتطبيق مشابك وعاء V3 المزدوجة التقريبية.
- ضع خياطة نايلون 10-0 من خلال الجدار الأمامي للوريد الوداجي الخارجي في موقع بضع الوريد المطلوب واستخدم هذا الخيط لسحب الوعاء الأمامي وخيمته.
- قم بقص الخيط باستخدام مقص دقيق عميق بما يكفي لإنشاء بضع الوريد أحادي الشق بالحجم المناسب والتأكد من أن القطع يمر بالكامل عبر الجدار الوريدي.
- باستخدام إبرة ذات رأس حاد 30 جم ، اغسل الجزء الداخلي من الوريد بمحلول ملحي هيبارين.
- ضع مجمع LTE للمتبرع بين الشريان السباتي الأيسر للمتلقي والوريد الوداجي الخارجي الأيسر. قم بمحاذاة الطرف الحر للشريان السباتي الأيسر للمتبرع باتجاه الوريد الوداجي الأيسر الأيسر للمتلقي وقم بشطبة نهايات الأوعية بمقص حاد.
- باستخدام أربعة خيوط متقطعة من النايلون 10-0 ، مفاغرة الشريان السباتي الأيسر للمتبرع والمتلقي ترك الوريد الوداجي الخارجي بطريقة شاملة.
- حرك مادة الخلفية تحت الشريان السباتي المشترك المتلقي وضع مشابك الأوعية الدموية المزدوجة التقريبية A3 على الشريان السباتي المشترك المتلقي. إنشاء بضع الشرايين بنفس طريقة بضع الوريد.
ملاحظة: تأكد من أن بضع الشرايين هو نفس حجم تجويف الشريان السباتي المتبرع. إذا كان كبيرا جدا ، فسيحدث نزيف غزير بعد إزالة المشابك. إذا كان صغيرا جدا ، إعاقة تدفق الدم إلى الكسب غير المشروع. - مفاغرة الشريان السباتي الأيمن للمتبرع إلى الشريان السباتي الأيسر المتلقي بطريقة من طرف إلى جانب باستخدام ستة خيوط من النايلون 10-0 متقطعة.
ملاحظة: يجب احترام تقنية الأوعية الدموية الدقيقة الصحيحة في جميع أنحاء مفاغرة الوعاء الدموي. يؤدي المرور عبر الجدار الخلفي إلى تقييد تدفق الدم بشكل كبير ، مما يعرض بقاء الكسب غير المشروع للخطر. نظرا لصغر حجم الأوعية ، فإن محاولة إعادة الغرز أمر صعب للغاية. - إزالة المشابك على الجانب الوريدي. في حالة حدوث نزيف ، اضغط برفق بأطراف قطنية.
- قم بإزالة المشابك الموجودة على الشريان واضغط على الفور بأطراف قطنية.
ملاحظة: من المتوقع حدوث بعض النزيف في هذه الخطوة ، والتي تتوقف عادة بعد 1 دقيقة مع ضغط لطيف. - تحقق من سلامة تدفق الدم في الشريان والوريد.
ملاحظة: مع التدفق الشرياني السليم ، عادة ما يظهر نبض الشريان السباتي المانح ، وتتغير الغدة الدرقية المانحة من لونها الشفاف المتوهج إلى لونها المحمر الأصلي. يمكن أيضا ملاحظة اللون الأحمر للأوعية الصغيرة على مجمع LTE. - ري الحقل الجراحي بمحلول ملحي هيبارين وأغلق شق الجلد بخياطة حيدة 5-0 بطريقة جارية. ضع مرهم مضاد حيوي أو لاصق للجلد على الشق.
- حقن 1 مل من محلول ملحي دافئ تحت الجلد لحساب فقدان السوائل أثناء الجراحة.
- أوقف التخدير وانقل الماوس إلى قفص الاسترداد. راقب الماوس على وسادة التدفئة حتى يستيقظ تماما لتجنب انخفاض حرارة الجسم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
تأكيد عملية الزرع الناجحة
باستخدام البروتوكول الموصوف أعلاه ، من الممكن تقييم تدفق الدم إلى مجمع LTE من خلال مراقبة نبض الشريان السباتي المانح بعد إزالة مشابك الأوعية الدموية. عادة ما يكون النبض مرئيا ، ويؤكد اللون الأحمر الفوري للشريان المتبرع تدفق الدم النشط (الشكل 4 أ). إذا لم يكن المفاغرة فعالا ، فلن يكون للشريان نبض ، ويبدو منهارا جزئيا ، ويكون لونه شاحبا (الشكل 4 ب).
تقنية أخرى لتأكيد المباح الشرياني هي البحث عن تغير اللون على الغدة الدرقية المانحة بعد إزالة المشابك. يمكن رؤية تغير لون الغدة الدرقية من شاحب إلى أحمر في غضون دقائق. كما يحمر الفص الأيمن من الغدة الدرقية المانحة مع تدفق الشرايين. على النقيض من ذلك ، فإن الفص الأيسر ، الذي يبعد عن الجانب الشرياني ، يستغرق وقتا أطول لتلقي التدفق المناسب. يمكن اعتبار تدفق الدم عبر نهايات الأوعية الحرة الصغيرة على مجمع LTE للمتبرع بمثابة تأكيد إضافي.
شراء مجمع الحنجرة الرغامي المزروع
بعد 15 يوما ، يتم حصاد مجمعات LTE المتلقية والمزروعة. يمكن تقييم سالكية الشريان المفاغر عن طريق تشريح مركب LTE الخالي من الأنسجة المتلقية المحيطة وتصور مفاغرة من طرف إلى جانب (الشكل 4 أ). يتم تغليف مركب LTE المزروع بشكل عام في طبقة من الأنسجة الليفية في هذه المرحلة الزمنية. عادة ما يكون الطعم الخيفي غير المتطابق المستأصل أكبر مقارنة بالحنجرة الأصلية بسبب تكوين كبسولة ليفية (الشكل 5 أ). في وضع رفض الطعم الخيفي ، بعد 15 يوما في غياب كبت المناعة ، من المحتمل أن يكون لدى المتلقين تدفق دم غائب إلى الطعم الخيفيالمزروع 10.
التقييم النسيجي للحنجرة المزروعة
وفقا لنظام تصنيف رفض زرع الحنجرة في الفأر الذي تم تطويره مسبقا ، عادة ما يتم ملاحظة الرفض الكامل للحنجرة المزروعة في غياب كبت المناعة في اليوم 1510. تتدهور الغضاريف الحنجرية في الغالب مع انخفاض ملحوظ في الخلوية. تنخفض كثافة الخلايا النواة أيضا في الأنسجة الدهنية والعضلية. يمكن رؤية تسلل الخلايا اللمفاوية بوضوح ، في حين أن بصيلات الغدة الدرقية غائبة في الطعم الخيفي المزروع. يوضح الشكل التكميلي S3 أنسجة الحنجرة الأصلية المستأصلة حديثا مقارنة بالحنجرة المزروعة المرفوضة في اليوم 15.
الشكل 1: يتم زرع حنجرة المتبرع جنبا إلى جنب مع الحنجرة المتلقية. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 2: تشريح الحنجرة الرغامي المعقد وخطوات الشراء. (أ) تشريح سطحي للرقبة يظهر تراجع الغدد اللعابية جانبيا وربط العضلات. (ب) يوفر تراجع العضلات القصية الخشائية اليمنى وصولا سهلا إلى عضلات الحزام ومجمع LTE الأساسي. (ج) بعد إزالة عضلات الشريط، تظهر تراكيب الحنجرة والقصبة الهوائية والغدد الدرقية الثنائية والغمد السباتي. (د) الشريان القذالي الأيمن ينشأ من الشريان السباتي الخارجي ويتحرك خلفيا. (ه) مجمع LTE للمتبرع المستأصل مع ظهور الحنجرة والقصبة الهوائية والغدد الدرقية الثنائية والشرايين السباتية والمريء. الاختصارات: CCA = الشريان السباتي المشترك. دي = عضلة ثنائية المعدة. ECA = الشريان السباتي الخارجي ؛ Eso = المريء. Hy = عظم لامي. ICA = الشريان السباتي الداخلي ؛ IJV = الوريد الوداجي الداخلي ؛ L = الحنجرة. الزراعة العضوية = الشريان القذالي. S = الغدة اللعابية. Sm = عضلة القص الخشائي. St = عضلات الحزام. STA = الشريان الدرقي العلوي. T = القصبة الهوائية. لديك = الغدة الدرقية. V = السفن التي تنتقل عبر الغدة اللعابية. Vg = العصب المبهم. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 3: تشريح الرقبة المتلقية والموضع الصحيح لعملية الزرع . (أ) الوريد الوداجي الخارجي الأيسر المكشوف بعد تشريح الأنسجة الدهنية واللمفاوية. (ب) الشريان السباتي الأيسر الذي تم تشريحه محيطيا مع تراجع العصب المبهم والوريد الوداجي الداخلي أفقيا. الاختصارات: CCA = الشريان السباتي المشترك. EJV = الوريد الوداجي الخارجي ؛ IJV = الوريد الوداجي الداخلي ؛ L = الحنجرة. S = الغدة اللعابية. Sm = عضلة القص الخشائي. St = عضلات الحزام. T = القصبة الهوائية. Vg = العصب المبهم. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 4: نتائج مفاغرة الشرايين والوريد. (أ) نتيجة إيجابية: الحنجرة المانحة مع مفاغرة شريانية عاملة ، ولون أحمر فاتح للشريان السباتي المشترك للمتبرع ، وعدم انهيار جدران الأوعية الدموية (السهم الأزرق). (ب) النتيجة السلبية: الشريان السباتي المشترك ، مع مفاغرة شريانية معرضة للخطر ولا يوجد تدفق للدم ، شاحب ومنهار جزئيا (السهم الأزرق). الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 5: شراء مجمع LTE المزروع . (أ) التقييم الإجمالي للمفاغرة من طرف إلى جانب من الشريان السباتي الأيسر للمتبرع إلى الشريان السباتي الأيمن المتلقي ، بعد 15 يوما من الجراحة. صورة مفاغرة من طرف إلى جانب مرئية في اليوم 15 بعد الزرع (السهم الأسود). الحنجرة المزروعة مرئية أيضا بجوار المبعدة المحاطة بكبسولة ليفية (سهم أزرق). (ب) المقارنة الإجمالية للطعم الخيفي المركب LTE المزروع مع الحنجرة الأصلية. على الجانب الأيمن توجد الحنجرة المزروعة في غياب كبت المناعة في اليوم 15 وعلى الجانب الأيسر توجد الحنجرة الأصلية للمتلقي. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل التكميلي S1: الأدوات الجراحية للمتبرعين. (1) 8-0 خياطة النايلون. (2) نصائح القطن معقمة. (3) المبعدات المصنوعة من مشابك الورق وتعقيمها. (4) طبق بتري معقم 35 مم يمكن التخلص منه. (5) الضمادات المعقمة. (6) منصات شاش معقمة. (7) درجة حرارة منخفضة الصغر غرامة طرف الكي. (8) ملقط الأنسجة أدسون. (9) مقص ناعم. (10) حامل الإبرة. (11) مقص نمط فاناس منحني ، حافة قطع 7 مم. (12) مقص Adventitia مستقيم ، حافة قطع 19 مم. (13) مقص زنبركي Vannas منحني ، حافة قطع 3 مم. (14) موسع الوعاء - قطره 0.1 مم. (15) ملقط صغير مستقيم. (16) ملقط صغير بزاوية. (17) لوح تشريح معقمة. (18) 25 جرام إبرة انزلاق دقيقة. (19) 30 G إبرة حادة قياسية. (20) 3 مل حقنة طرف قفل luer. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.
الشكل التكميلي S2: الأدوات الجراحية المتلقية. (1) طبق بتري معقم 35 مم يمكن التخلص منه. (2) نصائح القطن معقمة. (3) مشبك تقريب الأوعية الدموية الدقيقة - قطر الوعاء 0.4-1 مم. (4) مشابك سفينة صغيرة واحدة. (5) غراء الجلد المصغر. (6) درجة حرارة منخفضة الصغر غرامة طرف الكي. (7) 30 G إبرة حادة القياسية. (8) 3 مل حقنة طرف قفل luer. (9) 5-0 خياطة أحادية اللون. (10) 10-0 خياطة نايلون. (11) يتم قطع الجزء المطلوب من المواد الخلفية للرؤية Mercian. (12) الضمادات المعقمة. (13) منصات شاش معقمة. (14) مبعدات مصنوعة من مشابك الورق ومعقمة. (15) ملقط ديباكي. (16) حامل الإبرة. (17) مقص ناعم. (18) المشبك تطبيق ملقط. (19) ملقط الأنسجة. (20) مقص نمط فاناس منحني ، حافة قطع 7 مم. (21) مقص Adventitia مستقيم ، حافة قطع 19 مم. (22) مقص زنبركي Vannas منحني ، حافة قطع 3 مم. (23) ملقط صغير مستقيم. (24) موسع الوعاء - قطره 0.3 مم. (25) موسع وعاء - قطر 0.1 مم. (26) ملقط صغير بزاوية. (27) لوح تشريح معقمة. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.
الشكل التكميلي S3: التقييم النسيجي للحنجرة المانحة والمتلقية باستخدام تلطيخ H&E ، بعد 15 يوما من الجراحة. (أ) الحنجرة الأصلية المستأصلة حديثا و (ب) الحنجرة بعد الزرع في اليوم 15 على اليمين. يظهر الغضروف انخفاضا ملحوظا في الخلوية (الأسهم الزرقاء). تظهر خلايا العضلات فقدان النوى في عملية الزرع مقارنة بالعضلات الأصلية (الأسهم الحمراء). بصيلات الغدة الدرقية مرئية بسهولة على الأنسجة الأصلية (السهم الأخضر) غائبة في الأنسجة المزروعة. يمكن رؤية تسلل اللمفاويات الملحوظ حول الأنسجة المزروعة على الجانب الأيمن (السهم الأسود). قضبان المقياس = 500 ميكرومتر. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
زاد معدل الإصابة بسرطان الحنجرة وانتشاره بنسبة 12٪ و 24٪ على التوالي خلال العقود الثلاثة الماضية ، ويخضع العديد من هؤلاء المرضى لاستئصال الحنجرة للعلاج10. يؤدي هذا الإجراء إلى تفاقم نوعية حياة الشخص بشكل كبير ، وبالتالي فإن العلاج البديل مطلوب. زرع الأوعية الدموية المركبة للحنجرة يمكن أن يحسن قدرة المريض على التنفس والكلام. ومع ذلك ، لا تزال هناك حاجة للبحث قبل استخدام هذه التقنية سريريا لهذه الفئة من المرضى. تقدم هذه الورقة نموذجا فعالا من حيث التكلفة لزراعة الحنجرة يمكن أن يتيح التحقيق في مختلف الأنظمة المثبطة للمناعة.
هناك العديد من الخطوات الحاسمة في هذا الإجراء التي يمكن أن تملي نجاح الجراحة. بالنسبة للمتبرع ، من المهم إبقاء التشريح بعيدا عن الشريان الدرقي العلوي لتجنب إتلاف عنيق. عند شراء الحنجرة ، من الضروري أيضا ترك صفعة من اللفافة حول الشرايين الدرقية العلوية لحماية الباديل وتجنب التواء الأوعية. يجب التحقق من سلامة الباديل عند غسل الكسب غير المشروع بالمحلول الملحي. إذا تم شراؤها بشكل صحيح ، يجب أن يتدفق الدم من الشريان السباتي المقابل والشعيرات الدموية الصغيرة التي تغطي الكسب غير المشروع.
الخطوات الحاسمة التالية هي إنشاء بضع الشرايين وبضع الوريد. عند تمرير الخيط عبر الوعاء لخيمة جدار الوعاء ، تأكد من دخوله وخروجه من خلال التجويف ، وليس فقط adventitia. بهذه الطريقة ، فإن بضع الشرايين ذو الشق الواحد وبضع الوريد سيكشفان تجويف الوعاء ويسمحان بتدفق الدم. عند إجراء بضع الشرايين وبضع الوريد ، يجب أن تكون الفتحة كبيرة بما يكفي للسماح بتدفق الدم ولكنها صغيرة بما يكفي لمنع التسرب. إذا كانت الفتحة صغيرة جدا ، فيمكن توسيعها لتتناسب مع حجم تجويف الوعاء الدموي.
أخيرا ، يعد إجراء المفاغرة الشريانية والوريدية هو الجزء الأكثر تحديا ولكنه أيضا الجزء الأكثر أهمية في الجراحة. الجانب الأكثر أهمية هو تحديد العدد المناسب من الغرز لوضعها. من الأفضل تقييم ذلك قبل وضع الخيط الأول بحيث يمكن تخطيط التباعد وفقا لذلك. يؤدي وضع الكثير من الغرز إلى إعاقة تدفق الدم ، بالإضافة إلى التسبب في المزيد من الضرر البطاني. يسمح وضع عدد قليل جدا من الغرز بتسرب الدم من خلال الفجوات الموجودة في التجويف. بالنسبة لحجم الفئران المستخدمة في هذه الدراسة ، تعمل أربعة خيوط بشكل جيد للوريد وستة خيوط تعمل بشكل جيد للشريان. يتطلب الشريان المزيد من الغرز بسبب تدفق الدم عالي الضغط.
تم إجراء العديد من التعديلات طوال فترة الدراسة لإتقان هذه الجراحة. في البداية ، تم استخدام التخدير عن طريق الحقن ، مما أدى إلى ارتفاع معدل الوفيات ، على الأرجح بسبب جرعة زائدة من التخدير ، ووقت الشفاء بعد العملية الجراحية حوالي 3 ساعات. أدى التحول إلى التخدير المستنشق إلى تقليل معدل الوفيات بشكل كبير وتقليل وقت الشفاء بعد العملية الجراحية إلى حوالي 30 دقيقة. تحسن آخر كان استخدام إبرة حادة لغسل الكسب غير المشروع. في الأصل ، تم استخدام إبرة مشطوفة ، مما أدى إلى تمزقات غير مقصودة في الشرايين السباتية المانحة ، مما تسبب في تلف الأوعية وتسربها. أخيرا ، تم إدخال استخدام مادة خلفية متباينة في هذا البروتوكول. سمح استخدام مادة خلفية خضراء أسفل الأوعية بتصور أفضل أثناء المفاغرة وساعد على رفع الأوعية وتسهيل الوصول إليها.
ركز استكشاف الأخطاء وإصلاحها أثناء العمليات الجراحية الأولية على حل مشكلة عدم تدفق الدم الشرياني إلى الكسب غير المشروع. نفترض أن هذا كان على الأرجح بسبب انسداد التدفق في موقع مفاغرة الشرايين. لإصلاح ذلك ، تم عمل شطبة أكثر دراماتيكية على الشريان السباتي المانح للتأكد من أنه يتدفق مع الشريان السباتي المتلقي. عند خياطة المفاغرة ، تم استخدام أقل عدد ممكن من الغرز وتم تأكيد عقدة مربعة لمنع الأوعية من الدوران على نفسها.
عند استخدام هذا النموذج ، هناك بعض القيود الفنية التي يجب وضعها في الاعتبار. إن تأكيد نبض الشرايين أو مراقبة إعادة الملء الأولي للغدة الدرقية بعد عملية الزرع لا يضمن دائما أن مجمع LTE سيكون له تدفق دم مستمر. للتحقق من المباح مفاغرة في نقاط زمنية مختلفة ، ينبغي استخدام تقنيات أكثر تطورا مثل التصوير بالموجات فوق الصوتية دوبلر. للتمييز بشكل أفضل بين فقدان تدفق الدم بسبب الرفض المناعي والتقنية الجراحية الفاشلة ، يمكن تنفيذ أدوات مراقبة تدفق الدم المستمر في مزيد من الدراسات. قيد آخر لهذا البروتوكول هو أنه لا يترك مجالا كبيرا للخطأ. إذا تمزق أحد أوعية المتبرع أو المتلقي ، فلا توجد طريقة لإكمال الإجراء بنجاح. علاوة على ذلك ، كزرع غير متجانس ، فإن الحنجرة المانحة ليست عضوا يعمل بكامل طاقته. هذا النموذج مفيد لدراسة الاستجابة المناعية ، ولكن نظرا لأن الكسب غير المشروع غير متصل فعليا بمجرى الهواء ولا يتم إجراء إعادة تعصيب ، فلا يمكن إجراء تقييم وظيفي للحنجرة المزروعة.
أهم مساهمة لهذا البروتوكول هي خفض التكلفة وتحسين توافر المقايسات المناعية والأجسام المضادة والبيانات. تم نشر زراعة الحنجرة سابقا في الفئران والأنياب والخنازير. ومع ذلك ، فإن هذه الحيوانات أغلى ثمنا ، وهناك عدد أقل من المقايسات المناعية والبيانات المتاحة11،12،13. تم العثور على معدل وفيات 30 يوما لهذا الإجراء في الفئران ليكون 41 ٪. في تجربتنا مع الفئران ، انخفض هذا الرقم إلى 5٪. أخيرا ، يعد استخدام التخدير المستنشق لزراعة الحنجرة فريدا لهذا البروتوكول ، حيث تستخدم معظم النماذج الحيوانية المنشورة لزراعة الحنجرة مخدرا عن طريق الحقن ، مثل بنتوباربيتال8،11،14. يقلل عامل التخدير المستنشق بشكل كبير من وقت الشفاء ويسمح بمزيد من التحكم في عمق التخدير مقارنة بالتخدير القابل للحقن. يساعد قناع التوصيل المخدر أيضا في تحديد الوضع الصحيح عن طريق تمديد الرقبة.
هناك العديد من التطبيقات لنموذج الزرع هذا. وأهمها القدرة على تقييم الاستجابة المناعية لعملية زرع مركب الأوعية الدموية واختبار أنظمة كبت المناعة المختلفة15،16،17. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن استخدام هذا النموذج لدراسة الأوعية الدموية في وضع مفاغرة شريانية غير عاملة ، أو مفاغرة الوريد غير العاملة ، أو تصلب الشرايين بسبب الرفض. توضح هذه الورقة كيفية زرع مركب LTE بشكل غير متجانس من فأر إلى آخر في ~ 3 ساعات. يوفر هذا النموذج المجدي والمنخفض التكلفة نسبيا إمكانات كبيرة في دراسة دور الجهاز المناعي في رفض مجمع LTE ، مما يوفر إمكانية علاجات جديدة في زراعة الأعضاء.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
يعلن المؤلفون أنه ليس لديهم مصالح مالية متنافسة. تم تمويل نفقات سفر ومعيشة إيجيهان ساليبسي للبحث من قبل مجلس البحوث العلمية والتكنولوجية في تركيا (TUBITAK).
Acknowledgments
نود أن نشكر راندال رايش على مساعدته الممتازة في تصوير الفيديو والتحرير.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| #1 Paperclips | Staples | OP-7404 | Clips are shaped manually to be used as retractors |
| 1 cc Insulin Syringes | BD | 329412 | 27 G 5/8 |
| 10-0 Ethilon Nylon Suture | Ethicon | 2870G | |
| 25 G Precision Glide Needle | BD | 305125 | 1 in |
| 3 mL Luer-Lok Tip Syringe | BD | 309657 | |
| 30 G Sterile Standard Blunt Needles | Cellink | NZ5300505001 | |
| 5-0 Monocryl Suture | Ethicon | Y822G | |
| 8-0 Ethilon Nylon Suture | Ethicon | 2815G | |
| Adson Forceps | Fine Science Tools | 11027-12 | Straight, 1 x 2 teeth |
| Adventitia scissors | S&T | SAS-10 | 19 mm, 10 cm, straight |
| Angled Forceps | Fine Science Tools | 00109-11 | 45/11 cm |
| Artifical Tears Lubricant Opthalmic Ointment | Akorn Animal Health | 59399-162-35 | |
| Bandaid Fabric Fingertip | Cardinal Healthcare | 299399 | |
| Betadine Solution Swabsticks | Purdue Products | 67618-153-01 | |
| Buprenex Injection | CIII | 12495-0757-1 | 0.3 mg/mL |
| Clamp applying forceps without lock | Accurate Surgical & Scientific Instruments | ASSI.CAF5 | 14 cm |
| Cotton Swabs | Puritan | 10806-001-PK | |
| DeBakey forceps | |||
| Dermabond Mini | Cardinal Healthcare | 315999 | |
| Dissecting Boards | Mopec | 22-444-314 | |
| Falcon Sterile Disposable Petri Dish | Corning | 25373-041 | 35 mm |
| Fine Scisssors | Fine Science Tools | 14029-10 | Curved Sharp-Blunt 10 cm |
| Golden A5 2-Speed Blade Clipper | Oster | 008OST-78005-140 | #10 |
| Hair Remover Sensitive Formula | Nair | 2260000033 | |
| Heparin | Meitheal Pharmaceuticals | 71288-4O2-10 | 10,000 USP units per 10 mL |
| Isoflurane | Piramal Healthcare | 66794-013-25 | |
| Low-Temp Micro Fine Tip Cautery | Bovie Medical | AA90 | |
| Mercian Visibility Background Material | Synovis Micro Companies | VB3 | Green |
| Microvascular Approximator Clamp without Frame | Accurate Surgical & Scientific Instruments | ASSI.ABB11V | 0.4-1 mm Vessel Diameter |
| Mouse face mask kit | Xenotec | XRK-S | Small |
| Needle holder | S&T | C-14 W | 5.5", 8 mm, 0.4 mm |
| Press n' Seal | Glad | 70441 | |
| Scalpel | Braun | BA210 | 10 blade |
| Single Mini Vessel Clamp | Accurate Surgical & Scientific Instruments | ASSI.ABB11M | .31 (8 mm), 3 x 1 mm Rnd. Bl., Black Pair |
| Stereomicroscope | Olympus | SZ61 | |
| Sterile Alcohol Prep Pads | Fisherbrand | 06-669-62 | |
| Sterile Disposable Drape Sheets | Dynarex | DYN4410-CASE | |
| Sterile Gauze Pads | Dukal | 1212 | |
| Sterile Saline | Hospira | 236173 | NaCl 0.9% |
| Sterile Surgical Gloves | Gammex | 851_A | |
| Straight Forceps | Fine Science Tools | 00108-11 | 11 cm |
| Tissue forceps | Accurate Surgical & Scientific Instruments | ASSI.JFLP3 | 13.5 cm, 8 mm, 0.3 mm |
| Vannas Pattern Scissors | Accurate Surgical & Scientific Instruments | ASSI.SDC15RV | 15 cm, 8 mm, curved 7mm blade |
| Vannas Spring Scissors | Fine Science Tools | 15000-10 | 3 mm cutting edge, curved |
| Vessel Dilator Tip | Fine Science Tools | 00126-11 | Diameter 0.1 mm/Angled 10/11 cm |
| Vessel Dilator, Classic line | S&T | D-5a.3 W | 9 mm, 0.3 mm, angled 10 |
References
- Strome, M., et al. Laryngeal transplantation and 40-month follow-up. The New England Journal of Medicine. 344 (22), 1676-1679 (2001).
- Hilgers, F. J. M., Ackerstaff, A. H., Aaronson, N. K., Schouwenburg, P. F., Zandwijk, N. Physical and psychosocial consequences of total laryngectomy. Clinical Otolaryngology. 15 (5), 421-425 (1990).
- Heyes, R., Iarocci, A., Tchoukalova, Y., Lott, D. G. Immunomodulatory role of mesenchymal stem cell therapy in vascularized composite allotransplantation. Journal of Transplantation. 2016, (2016).
- Kluyskens, P., Ringoir, S. Follow-up of a human larynx transplantation. Laryngoscope. 80 (8), 1244-1250 (1970).
- Krishnan, G., et al. The current status of human laryngeal transplantation in 2017: A state of the field review. Laryngoscope. 127 (8), 1861-1868 (2017).
- Strome, S., Sloman-Moll, E., Wu, J., Samonte, B. R., Strome, M. Rat model for a vascularized laryngeal allograft. Annals of Otology, Rhinology & Laryngology. 101 (11), 950-953 (1992).
- Lorenz, R. R., Dan, O., Nelson, M., Fritz, M. A., Strome, M. Rat laryngeal transplant model: technical advancements and a redefined rejection grading system. Annals of Otology, Rhinology & Laryngology. 111 (12), 1120-1127 (2002).
- Shipchandler, T. Z., et al. New mouse model for studying laryngeal transplantation. Annals of Otology, Rhinology & Laryngology. 118 (6), 465-468 (2009).
- Strome, M., Wu, J., Strome, S., Brodsky, G. A comparison of preservation techniques in a vascularized rat laryngeal transplant model. The Laryngoscope. 104 (6), 666-668 (1994).
- Nocini, R., Molteni, G., Mattiuzzi, C., Lippi, G. Updates on larynx cancer epidemiology. Chinese Journal of Cancer Research. 32 (1), 18-25 (2020).
- Strome, S., Sloman-Moll, E., Wu, J., Samonte, B. R., Strome, M. Rat model for a vascularized laryngeal allograft. Annals of Otology, Rhinology & Laryngology. 101 (11), (1992).
- Work, W. P., Boles, R.
- Birchall, M. A., et al. Model for experimental revascularized laryngeal allotransplantation. British Journal of Surgery. 89 (11), 1470-1475 (2002).
- Nakai, K., et al. Rat model of laryngeal transplantation with normal circulation maintained by combination with the tongue. Microsurgery. 23 (2), 135-140 (2003).
- Lott, D. G., Dan, O., Lu, L., Strome, M. Long-term laryngeal allograft survival using low-dose everolimus. Otolaryngology-Head and Neck Surgery. 142 (1), 72-78 (2010).
- Lott, D. G., Russell, J. O., Khariwala, S. S., Dan, O., Strome, M. Ten-month laryngeal allograft survival with use of pulsed everolimus and anti-αβ T-cell receptor antibody immunosuppression. Annals of Otology, Rhinology & Laryngology. 120 (2), 131-136 (2011).
- Lott, D. G., Dan, O., Lu, L., Strome, M. Decoy NF-κB fortified immature dendritic cells maintain laryngeal allograft integrity and provide enhancement of regulatory T cells. The Laryngoscope. 120 (1), 44-52 (2010).
