Summary
يلعب خلل التنظيم البروتيني دورا مهما في انتشار الأورام الدبقية المتسللة بشكل منتشر ، لكن العديد من البروتينات ذات الصلة لا تزال مجهولة الهوية. توفر المعالجة المكانية الرقمية (DSP) نهجا فعالا وعالي الإنتاجية لتوصيف التعبير التفاضلي للبروتينات المرشحة التي قد تساهم في غزو وهجرة الأورام الدبقية الارتشاحية.
Abstract
ترتبط الأورام الدبقية المتسللة بشكل منتشر بارتفاع معدلات المراضة والوفيات بسبب الطبيعة الارتشاحية لانتشار الورم. إنها أورام معقدة شكليا ، مع درجة عالية من التباين البروتيني عبر كل من الورم نفسه وبيئته المكروية غير المتجانسة. يتم تعزيز الإمكانات الخبيثة لهذه الأورام من خلال عدم تنظيم البروتينات المشاركة في العديد من المسارات الرئيسية ، بما في ذلك العمليات التي تحافظ على الاستقرار الخلوي وتحافظ على السلامة الهيكلية للبيئة المكروية. على الرغم من وجود العديد من تحليلات الورم الدبقي السائب وحيد الخلية ، إلا أن هناك ندرة نسبية في التقسيم الطبقي المكاني لهذه البيانات البروتينية. إن فهم الاختلافات في التوزيع المكاني للعوامل السرطانية ومجموعات الخلايا المناعية بين الورم الجوهري والحافة الغازية والبيئة المكروية يوفر نظرة ثاقبة قيمة للآليات الكامنة وراء تكاثر الورم وانتشاره. يمثل التنميط المكاني الرقمي (DSP) تقنية قوية يمكن أن تشكل الأساس لهذه التحليلات المهمة متعددة الطبقات.
DSP هي طريقة تحدد بكفاءة تعبير البروتين داخل المناطق المكانية المحددة من قبل المستخدم في عينة الأنسجة. يعد DSP مثاليا لدراسة التعبير التفاضلي للبروتينات المتعددة داخل وعبر مناطق التمييز ، مما يتيح مستويات متعددة من التحليل الكمي والنوعي. بروتوكول DSP منهجي وسهل الاستخدام ، مما يسمح بالتحليل المكاني المخصص للبيانات البروتينية. في هذه التجربة ، يتم إنشاء المصفوفات الدقيقة للأنسجة من الخزعات الأساسية للورم الأرومي الدبقي المؤرشفة. بعد ذلك ، يتم اختيار مجموعة من الأجسام المضادة ، تستهدف البروتينات ذات الأهمية داخل العينة. ثم يتم تحضين الأجسام المضادة ، التي يتم اقترانها مسبقا بقليل النيوكليوتيدات DNA القابل للأشعة فوق البنفسجية ، مع عينة الأنسجة طوال الليل. تحت التصور المجهري الفلوري للأجسام المضادة ، يتم تحديد مناطق الاهتمام (ROIs) التي يمكن من خلالها تحديد تعبير البروتين مع العينات. ثم يتم توجيه ضوء الأشعة فوق البنفسجية إلى كل عائد استثمار ، مما يؤدي إلى شق قليل النيوكليوتيدات DNA. يتم استنشاق قليل النوكليوتيدات وحسابها داخل كل عائد استثمار ، مع تحديد البروتين المقابل على أساس مكاني.
Introduction
الأورام الدبقية المتسللة بشكل منتشر هي النوع الأكثر شيوعا من أورام الدماغ الخبيثة لدى البالغين وهي قاتلة دائما. يمثل ميل خلايا الورم الدبقي إلى الهجرة على نطاق واسع في الدماغ تحديا علاجيا كبيرا. وتنطوي الآلية التي تنتشر بها على الهجرة الموجهة والغزو دون رادع. وقد تبين أن خلايا الورم الدبقي الغازية تظهر الانتحاء والهجرة على طول مساحات المادة البيضاء1 ، مع الأبحاث الحديثة التي تنطوي على إزالة الميالين من هذه المسالك كميزة نشطة ، protumorigenic2. يتم التوسط في الغزو من خلال الانتقال من الظهارة إلى اللحمة المتوسطة ، حيث تكتسب خلايا الورم الدبقي خصائص اللحمة المتوسطة عن طريق تقليل التعبير عن الجينات التي تشفر بروتينات المصفوفة خارج الخلية وجزيئات التصاق الخلايا ، وتضخيم الهجرة وتسهيل الانتشار من خلال البيئة المكروية للورم3،4،5.
على المستوى الجزيئي ، تم إثبات اضطراب العديد من البروتينات التي تمنح الاستقرار الخلوي والتفاعل مع المكونات المناعية6. من المعروف أن الأورام الدبقية الارتشاحية تخضع لقمع البروتينات ذات الخصائص المضادة للموت المبرمج (على سبيل المثال ، PTEN)7. كما أنها تفرط في التعبير عن البروتينات التي تعزز التهرب من الاستجابة المناعية للمضيف (على سبيل المثال ، PD1 / PDL1)8. يعزز عدم تنظيم هذه المسارات المعقدة الورم ويزيد من الإمكانات الخبيثة.
ضمن عينات الورم الدبقي الغازي ، كان الهدف هو تقييم التعبير التفاضلي للبروتينات الرئيسية لنمو الخلايا وبقائها وانتشارها ، والتكامل الهيكلي للبيئة المكروية بين المكونات الغازية وغير الغازية. بالإضافة إلى ذلك ، سعينا إلى دراسة التنظيم التفاضلي للبروتينات ذات الدور المناعي النشط ، وتقديم نظرة ثاقبة للآلية التي يمكن من خلالها للدفاعات المناعية للمضيف المخترقة أن تعزز الإمكانات التكاثرية والغازية للأورام الدبقية. هذا مهم بشكل خاص بالنظر إلى اتساع نطاق الأبحاث الحديثة التي توضح كيف يمكن أن تكون علامات المناعة ودوافع عدم التنظيم في الورم الخبيث بمثابة أهداف للعلاج المناعي. يتطلب تحديد الأهداف العلاجية القابلة للتطبيق بين العديد من البروتينات المشاركة في المراقبة المناعية والتفاعل نهجا حساسا وشاملا للغاية.
بالنظر إلى المجموعة الواسعة من البروتينات المرشحة التي يمكن دراستها ، سعينا إلى طريقة أقرب إلى الكيمياء الهيستولوجية المناعية ولكن مع كفاءة معالجة البيانات المحسنة. في مجال بيولوجيا السرطان ، برزت DSP كتقنية قوية ذات مزايا مهمة على الأدوات البديلة للتحليل البروتيني والقياس الكمي. السمة المميزة ل DSP هي قدرتها على تعدد الإرسال عالية الإنتاجية ، مما يسمح بالدراسة المتزامنة للعديد من البروتينات المختلفة داخل العينة ، مما يمثل تمييزا مهما عن التقنيات القياسية ولكن الأقل تكرارا مثل الكيمياء الهيستولوجية المناعية (IHC) 9,10. لا تؤثر ميزة تعدد الإرسال في DSP على دقتها كأداة كمية وتحليلية ، كما يتضح من الدراسات التي تقارن DSP ب IHC. عند استخدامه للقياس الكمي البروتيني لعينات سرطان الرئة ذات الخلايا غير الصغيرة ، على سبيل المثال ، فقد ثبت أن DSP له نتائج مماثلة ل IHC11. بالإضافة إلى ذلك ، يوفر DSP مواصفات إقليمية قابلة للتخصيص ، حيث يمكن للمستخدمين تحديد المناطق يدويا لإجراء تحليل بروتيني. هذا يمثل ميزة على طرق تعدد الإرسال ذات القسم الكامل10,12. في جولة واحدة من المعالجة ، يقدم DSP طبقات متعددة من التحليل من خلال مسح العديد من أهداف البروتين عبر مناطق متعددة ذات أهمية.
DSP له تطبيقات في العديد من الإعدادات المرضية المختلفة. يعد DSP مفيدا بشكل خاص في تحليل الأورام ، حيث يمكن أن يرتبط التباين المكاني بالتحول الخلوي والتعبير التفاضلي للبروتين. على سبيل المثال ، تم استخدام DSP لمقارنة الملف البروتيني لسرطان الثدي بالبيئة المكروية للورم المجاورة. هذا يحمل آثارا مهمة لفهم التاريخ الطبيعي لهذا الورم وتطوره ، وكذلك الاستجابة المحتملة للعلاج13. تشمل السياقات الإضافية التي توضح تنوع DSP القياس الكمي المكاني لتنوع البروتين في سرطان البروستاتا14 ، وارتباط تعبير علامة الخلايا المناعية بتطور المرض في سرطان الخلايا الحرشفية في الرأس والرقبة 15 ، وإظهار التدرج الظهاري - الوسيطة لتعبير البروتين الذي يميز سرطان المبيض النقيلي عن سرطان المبيض الأولي الصافي16 . من خلال تنفيذ DSP ، نقوم بتوصيف التضاريس المكانية للبروتينات التي يمكن أن تؤثر على تكوين الورم وغزو الأورام الدبقية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
يتبع البروتوكول الموضح أدناه إرشادات لجنة أخلاقيات البحوث البشرية في دارتموث-هيتشكوك. تم الحصول على موافقة مستنيرة من المرضى الذين تم تضمين عينات أنسجتهم في هذه الدراسة. راجع قسم جدول المواد للحصول على التفاصيل المتعلقة بجميع المواد والكواشف والمعدات والبرامج المستخدمة في هذا البروتوكول.
1. إعداد الشرائح17
- استرجع أو أعد الأنسجة المثبتة بالفورمالين والمضمنة بالبارافين من الأورام الدبقية البشرية من النوع البالغ المتسلل بشكل منتشر.
ملاحظة: في هذه التجربة ، تم استخدام كتل خزعات مدمجة بالبارافين من ثلاثة مرضى يعانون من الورم الأرومي الدبقي. - إنشاء كتلة ميكروأري الأنسجة (TMA). خذ عدة نوى 2 مم من كل خزعة وضعها في كتلة TMA واحدة (الشكل 1 ، أعلى). قم بقص المقاطع من كتلة TMA عند 4 ميكرومتر وقم بتركيبها على شرائح زجاجية. ضع كل شريحة داخل حشية حامل المنزلق. احتضان الشريحة عند 60 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
2. إعداد نظام IHC شبه الآلي وتكوين البرامج (لتحميل وتشغيل الشرائح)17
- قم بإعداد الكواشف. انقر فوق الزر "إعداد الكاشف ". انقر فوق إضافة في علامة التبويب الإعداد .
- قم بتسجيل مخزن مؤقت للغسيل عن طريق كتابة اسم له في حقل الاسم . حدد ملحق في حقل النوع . انقر فوق حفظ.
- قم بتسجيل حل حظر عن طريق تكرار نفس الخطوات المذكورة أعلاه (تم تعديلها حسب الاقتضاء ، على سبيل المثال ، في حقل الاسم) ، ولكن مع تحديد الجسم المضاد الأساسي في حقل النوع. حدد البروتوكولات المطلوبة في المربعات المنسدلة لبروتوكول التلوين الافتراضي وبروتوكول HIER الافتراضي. حدد خيار بروتوكول الإنزيم الافتراضي إذا رغبت في ذلك (تم ترك هذا المربع فارغا في البروتوكول الحالي). انقر فوق حفظ.
- سجل نظام الكشف ، الذي يتكون من علبة حاوية كاشف مشفرة بالباركود. امسح الرمز الشريطي ضوئيا.
- ابدأ في إدخال تفاصيل نظام الكاشف في نافذة إضافة نظام كاشف البحوث . اكتب اسما لنظام الكشف.
- اكتب تاريخ انتهاء الصلاحية. قم بتمييز الصف الأول من مخطط الكواشف وامسح الرمز الشريطي لحاوية كاشف جديدة سعة 30 مل ، وفي ذلك الوقت سيتم ملء الرمز الشريطي بالصف 1.
- ضع الحاوية في الموضع 1 من نظام الكشف. حدد اسم المخزن المؤقت للغسيل في المربع المنسدل لعمود الكاشف وانقر فوق إضافة. كرر هذه الخطوات لإضافة أي كواشف إضافية في الصفوف اللاحقة ، بما في ذلك حل الحظر.
- قم بإعداد بروتوكول البروتين ل IHC. انقر فوق إعداد البروتوكول. قم بتمييز الصف المقابل للبروتوكول المطلوب وانقر فوق نسخ. أدخل الاسم واملأ أي حقول أخرى ذات صلة في نافذة تحرير خصائص البروتوكول .
- حدد المربع لإظهار خطوات الغسيل. تأكد من صحة حقلي Inc (min) و DispenseType لكل كاشف (10 دقائق لمحلول الحجب ، و 0 دقيقة للمخزن المؤقت للغسيل ، و 150 ميكرولتر لكل DispenseType). انقر فوق حفظ.
- تحضير الدراسة. املأ الحاوية في الموضع 1 بمخزن غسيل مؤقت. املأ 150 ميكرولتر لكل شريحة و 5 مل من الحجم الميت ؛ اترك الغطاء مفتوحا. كرر هذه الخطوات للحاوية في الموضع 2 ، والتي يجب ملؤها بمحلول حظر. يجب أن تحتوي هذه الحاوية على 150 ميكرولتر لكل شريحة و 350 ميكرولتر من الحجم الميت.
- قم بتحميل درج حاوية الكاشف على الجهاز. اسمح للنظام بإجراء إجراءات التعرف على الحاوية وتأكيد الحجم. انقر فوق إعداد الشريحة | إضافة دراسة. أدخل معرف الدراسة واسم الدراسة وحدد 150 ميكرولتر ضمن حجم التوزيع | البروتوكول المطلوب في القائمة المنسدلة لبروتوكول التحضير (يقترح Bake and Dewax ). قم بتمييز الدراسة وانقر فوق إضافة شريحة.
- حدد أنسجة الاختبار تحت نوع الأنسجة | 150 ميكرولتر تحت حجم الاستغناء | مفرد وروتيني من مربعات القائمة المنسدلة وضع التلطيخ . حدد عملية (IHC للدراسة الحالية) | اسم حل الحظر في المربع المنسدل لحقل العلامة | بروتوكول IHC DSP في حقل التلوين في علامة التبويب البروتوكولات | * اخبز وأزيل الشمع للتحضير | * HIER 20 دقيقة مع ER1 ل HIER. اترك حقل الإنزيم فارغا.
- كرر هذه العملية لكل شريحة. انقر فوق إغلاق بمجرد الانتهاء ، ثم انقر فوق طباعة الملصقات. تحقق من جميع ملصقات الشرائح التي لم تتم طباعتها بعد للدراسة الحالية وانقر فوق طباعة. قم بتثبيت الملصقات على أعلى الشرائح.
- تحميل وتشغيل الشرائح. قم بتحميل الشرائح على درج الشرائح ، مع التأكد من أن العينة والملصق متجهان لأعلى. ضع بلاط الغطاء فوق الشرائح ، مع التأكد من توجيه الشرائح بعلامات تبويب في الأسفل. قم بتحميل صواني الشرائح على الجهاز.
- اضغط على زر LED لخفض الدرج والسماح للأداة ببدء المسح الضوئي والتعرف على الشرائح. انقر فوق الزر " ابدأ" لبدء التجربة.
- قم بإنهاء التجربة. اضغط على زر LED عندما يومض باللون الأخضر ، مما يشير إلى اكتمال التشغيل. قم بإزالة الدرج من الجهاز ، وارفع بلاط الغطاء بعناية من كل شريحة. ضع الشرائح في محلول ملحي 1x مخزن بالفوسفات (PBS) ، وقم بإزالة المخزن المؤقت الزائد ، وحدد كل قسم من الأنسجة بقلم كاره للماء لإنشاء حاجز كاره للماء.
3. حضانة الأجسام المضادة وتلطيخ النوى17
- حدد لوحة من الأجسام المضادة لتحديد موقع المستضدات ذات الأهمية (انظر الجدول 1 للأجسام المضادة المستخدمة في هذه التجربة).
ملاحظة: تم بالفعل اقتران كل جسم مضاد بقليل النوكليوتيد DNA مع مقطع قابل للأشعة فوق البنفسجية (PC-oligo) يحدده بشكل فريد (فهرسة oligos، الشكل 2). - اصنع حلا فعالا للأجسام المضادة PC-oligo عن طريق إضافة ، لكل شريحة ، 8 ميكرولتر من كل جسم مضاد (مخفف 1:40) في اللوحة. استخدم كاشف الحجب كمخفف للوصول إلى الحجم النهائي البالغ 200 ميكرولتر لكل شريحة. احتضان بين عشية وضحاها عند 4 درجات مئوية (الشكل 3 ، الخطوة 1).
ملاحظة: يمكن أيضا إضافة علامات التشكل أو الأصباغ البيولوجية أو الأجسام المضادة الموسومة بالفلورسنت إلى المحلول في هذه الخطوة. - في اليوم التالي ، ضع الشريحة في جرة كوبلين واغسلها 3 × 10 دقائق في 1x TBS-T. Postfix في 4٪ بارافورمالدهيد لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة ، تليها 2 × 5 دقائق في 1x TBS-T.
- أضف صبغة SYTO13 النووية (مخففة 1:10 في 1x TBS) لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. اغسل 2x ب 1x TBS-T ، ثم قم بتخزين الشريحة في 1x TBS-T.
4. التصور الفلوري ، وتحديد عائد الاستثمار ، والانقسام الضوئي للأشعة فوق البنفسجية على أداة DSP17
- بعد تمرير الماوس فوق جمع البيانات في مركز التحكم ، حدد جديد / متابعة تشغيل.
- ضع الشريحة في حامل الشريحة، مع وضع التسمية باتجاه المستخدم. قم بخفض مشبك درج الشريحة ، وتأكد من أن الأنسجة مرئية في النافذة الممدودة. أضف 6 مل من Buffer S.
- اتبع المطالبات في مركز التحكم. قم بالتكبير/التصغير بين المحاور المختلفة باستخدام منزلقات X وY لتحديد منطقة للمسح الضوئي. حدد مسح ضوئي. اسمح للفحص بالمتابعة حتى يتم تصوير المنطقة المستهدفة المحددة بالكامل.
- قم بإنشاء صورة 20x. حدد عائد الاستثمار إما تلقائيا أو يدويا (الشكل 3 ، الخطوة 2). لاتباع هذا البروتوكول ، حدد ثلاثة عائد استثمار دائري متساوي الحجم (قطر 250 ميكرومتر) لكل نواة نسيج (الشكل 4 ، أسفل).
ملاحظة: عائد الاستثمار قابل للتخصيص من حيث الحجم والشكل. يمكن تحديد العديد من عائد الاستثمار داخل كل قسم. في هذه التجربة ، يتم تحديد عائد الاستثمار الدائري يدويا. - وافق على عائد الاستثمار بالنقر فوق الزر "الخروج من مساحة عمل المسح الضوئي ". انتظر حتى يشق ضوء الأشعة فوق البنفسجية oligos من الأجسام المضادة.
- عند اكتمال عملية أداة التنظيف ، حدد جمع بيانات جديد لمتابعة الشرائح أو اللوحة الحالية. وإلا، فحدد إزالة الشرائح واللوحة الدقيقة.
- افتح نافذة إنهاء اللوحة بالنقر المزدوج على منطقة أيقونة اللوحة في أسفل يمين مركز التحكم. إذا كان رقم حزمة رمز التهجين (Hyb) معروفا ، فأدخل الرقم وانقر فوق تحديث (اختياري أثناء هذه الخطوة). انقر فوق إنهاء.
- افصل حامل الشريحة ولوحة التجميع باتباع المطالبات. قم بتخزين الشرائح في TBS-T. إذا لم يتم استخدام الشرائح لفترة طويلة ، فقم بتغطيتها بوسط مائي وغطاء غطاء.
5. قراءات البروتين17
- استخدم ختما قابلا للنفاذ وجفف الفتحات عند 65 درجة مئوية في دورة حرارية مع فتح الجزء العلوي. أضف 7 ميكرولتر من المياه المعالجة بثنائي إيثيل بيروكربونات واخلطها. احتضن في RT لمدة 10 دقائق ، ثم قم بالدوران بسرعة.
- اختر معادلات المسبار R والمسبار U المناسبة من الجدول 2 لتوجيه إنشاء مزيج المسبار / المخزن المؤقت. بناء على عدد رموز Hyb اللازمة للتهجين في التجربة الحالية ، قم بتطبيق المعادلة (1) على النحو التالي. تخلط وتدور بسرعة.
# Hyb رموز مسبار R مسبار تجمع العمل U مخزن تهجين تجمع العمل n = _____ (n × 8 ميكرولتر) = _____ μL + (n × 8 μL) = ______ μL + (n × 80 μL) = _____ μL (1) - أضف 84 ميكرولتر من مزيج المسبار / المخزن المؤقت إلى كل حزمة Hyb Code لاستخدامها. نفض الغبار لخلط وتدور لأسفل. في لوحة تهجين جديدة مكونة من 96 بئرا ، أضف 8 ميكرولتر من كل Hyb Code Master Mix إلى جميع الآبار ال 12 في الصف المشار إليه.
- انقل 7 ميكرولتر من لوحة تجميع DSP إلى البئر المقابل في لوحة التهجين. تخلط بلطف. ختم الحرارة وإجراء تدور سريع. ثم احتضنها طوال الليل عند 67 درجة مئوية. تبريد لوحة على الجليد وإجراء تدور سريع.
- قم بتجميع منتجات hyb من كل بئر في أنبوب شريطي ، وقم بضخ كل بئر برفق 5x للخلط. قم بتغطية أنبوب الشريط وقم بتدويره. قم بتجميد أي منتجات hyb غير مجمعة متبقية عند -80 درجة مئوية. قم بتحميل أنابيب الشريط في نظام التحليل.
- احفظ ملف CDF على محرك أقراص USB ، ثم انقل البيانات من أداة DSP إلى المحلل الرقمي. أكمل الإعداد عن طريق تنفيذ الخطوات التالية.
- قم بتحميل المواد الاستهلاكية والعينات المجمعة على محطة الإعداد. على الشاشة، اضغط على بدء المعالجة. حدد حساسية عالية، متبوعا بالتالي. اضغط على اختيار الكل لعدد الآبار التي تحتوي على عينات | إنهاء | التالي على إشعار البريد الإلكتروني | بداية.
- بمجرد الانتهاء من محطة التحضير ، أغلق الخرطوشة وانقلها إلى المحلل الرقمي. اضغط على بدء العد ، وحدد موضع المرحلة ، واضغط على تحميل ملف CDF الحالي وحدد الملف الذي تم تحميله مسبقا. اضغط على تم، وحدد موضع المرحلة مرة أخرى، واضغط على تم | ابدأ في تشغيل البرنامج.
- احفظ الملف المضغوط لملفات تحويل عدد المراسلين من نظام التحليل إلى محرك أقراص USB ثم قم بإدراج محرك الأقراص في جهاز DSP. في مركز تحكم DSP ، مرر مؤشر الماوس فوق جمع البيانات ، ثم انقر فوق تحميل التهم. حدد الملف المضغوط ذي الصلة.
6. تحليل البيانات17
- انقر فوق السجلات في مركز تحكم DSP. لعرض عمليات الفحص في قائمة الانتظار، حدد إضافة عمليات المسح الضوئي المحددة إلى قائمة الانتظار | قائمة انتظار التحليل الخاصة بي. حدد دراسة جديدة من قائمة الانتظار بعد التمرير فوق خيار تحليل البيانات في مركز التحكم.
- اختر مراقبة الجودة من خيارات شريط المهام. استمر في القيم الافتراضية أو اضبطها إذا رغبت في ذلك. حدد تشغيل مراقبة الجودة وراجع شبكة النتائج. انقر فوق تشغيل مراقبة الجودة للمتابعة وإنشاء مجموعة بيانات جديدة ، وتطبيع القيم إلى عناصر التحكم في التهجين الإيجابي.
- قم باستيراد العلامات الجديدة إلى ملف XLSX. حدد إدارة التعليقات التوضيحية في جزء عمليات الفحص ، ثم قم بتنزيل قالب، وأدخل العلامات، واستورد الملف.
- اختياري: بعد تشغيل QC ، اضبط البيانات بشكل أكبر باستخدام خيارات شريط الأدوات الأخرى. استخدم الأدوات الموجودة في جزء المرئيات لرسم البيانات المحولة.
- انتقل إلى مربع القائمة المنسدلة الرمادي للمعلمات لإنشاء كل مخطط في جزء المرئيات . حدد منطقة معينة داخل مخطط لتصور المقاطع المميزة المقابلة في جزء عمليات المسح وانقر بزر الماوس الأيمن لإنشاء علامات أو مجموعات. ضمن ملخص مجموعة البيانات، راجع المخططات من التسوية والقياس والخيارات الأخرى للتحليل والعرض.
- احفظ تصورا عن طريق تحديد الرمز المراد حفظه ؛ راجع المرئيات المحفوظة بالفعل ضمن الملخص. حدد الزر تصدير (.svg) لتصدير مرئيات بتنسيق .svg. تصدير البيانات التي يعتمد عليها التصور بالنقر فوق الزر تصدير (.xlsx). قم بتصدير جميع البيانات الموجودة في مجموعة بيانات محددة عن طريق تحريك المؤشر فوق اسم مجموعة البيانات في الجزء الثاني والنقر فوق رمز التصدير .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
يوضح الشكل 4 النتائج التمثيلية من تجربة DSP التي أجريت على عينات من الورم الأرومي الدبقي. يتم تقديم خريطة حرارية توضح إحدى الطرق التي يمكن من خلالها التقاط البيانات بصريا باستخدام برنامج DSP. تمثل الصفوف أهداف البروتين ، ويتوافق كل عمود مع منطقة الاهتمام. يشير نطاق الألوان من الأزرق إلى الأحمر إلى تعبير منخفض إلى مرتفع ، على التوالي. يعكس تباين اللون داخل الصف عدم تجانس البروتين الإقليمي ويشير إلى ارتباط مكاني محتمل مع تعبير البروتين التفاضلي. على سبيل المثال ، في التجربة الحالية ، S100 و CD56 مرتفعان عالميا لأنهما علامات عصبية.
تضمنت العلامات الأكثر تباينا B7-H3 و Ki-67 و CD44 و fibronectin. هذه العلامات لها ارتباطات مهمة مع انتشار الورم ، والهجرة ، وورم خبيث ، على التوالي. وبالتالي فمن المعقول أن تظهر تباينا إقليميا بين عينات من النواة الخبيثة والغزو الخبيث والأنسجة غير الخبيثة. تمثيل البيانات الرقمية ممكن أيضا ؛ يمكن تصدير ملف يحتوي على قيمة التعبير لكل علامة بروتين ضمن عائد استثمار في شكل جدول للتحليل الرياضي والإحصائي. يتم إنتاج قيمة التعبير هذه من خلال ميزة العد الرقمي المتاحة من خلال DSP ، والتي تحدد كمية PC-oligos ذات الاستنشاق الدقيق داخل كل عائد استثمار (الشكل 1 والشكل 2).
الشكل 1: تحديد المناطق ذات الأهمية في ميكروأري الأنسجة من خزعات الورم الأرومي الدبقي. الجزء العلوي ، الهيماتوكسيلين واليوزين الملطخ من ميكروأري الأنسجة يحتوي على عدة خزعات أساسية قطرها 2 مم من إجمالي ثلاثة مرضى بالورم الأرومي الدبقي. أسفل ، مناطق الاهتمام المحددة على صورة مضان. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 2: قليلات النيوكليوتيدات القابلة للانفصال الضوئي. ترتبط مجسات الأجسام المضادة أو مجسات قليل النوكليوتيد المضادة للحساسية لأهداف البروتين أو الحمض النووي الريبي ، على التوالي ، تساهميا بقليل النيوكليوتيدات مع روابط ضوئية. أقسام الأنسجة ملطخة بالمجسات. ثم يتم توجيه ضوء الأشعة فوق البنفسجية إلى عائد الاستثمار لتحرير أقلية الكمبيوتر ، والتي يتم حسابها رقميا. تم تعديل هذا الرقم من9 ، بإذن من Springer Nature (حقوق الطبع والنشر 2020). الاختصارات: PC-oligos = قليل النوكليوتيدات القابلة للضوئية ؛ عائد الاستثمار = مناطق الاهتمام. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 3: إجراء DSP. 1) معالجة الأنسجة: شريحة الأنسجة ملطخة بالأجسام المضادة المترافقة أو مجسات الحمض النووي الريبي. 2) اختيار عائد الاستثمار: يتم تصوير شريحة الأنسجة ، ويتم تحديد عائد الاستثمار ، إما يدويا أو تلقائيا بناء على أنماط مضان معينة. 3) انشقاق قليل النيوكليوتيدات المترافق: يتم توجيه ضوء الأشعة فوق البنفسجية إلى عائد الاستثمار ، مما يؤدي إلى انشقاق قليل النيوكليوتيدات القابلة للضوئية. 4) مجموعة PC-oligo: يتم استنشاق PC-oligos في أنبوب microcapillary. 5) الطلاء: تودع PC-oligos المستنشقة في لوحة microtiter. 6) كرر: يتم تكرار الخطوات 3-5 لكل عائد استثمار ؛ بين كل دورة ، يتم إجراء الغسيل الدقيق. 7) القياس الكمي: يمكن تهجين برك PC-oligos التي تم حلها مكانيا إلى الرموز الشريطية الفلورية ؛ يسمح ذلك بالعد الرقمي لما يصل إلى حوالي 1 مليون حدث ملزم لكل عائد استثمار. بدلا من ذلك ، يمكن قياس PC-oligos عبر NGS ، حيث يتم تجميع لوحة المعايرة الدقيقة بأكملها في أنبوب واحد وتسلسلها. ثم تتم ترجمة القراءات إلى أعداد رقمية وتعيينها مرة أخرى إلى عائد الاستثمار الأصلي ، مما يؤدي إلى إنشاء خريطة مرئية للبروتين أو تعبير الحمض النووي الريبي داخل كل قسم من الأنسجة. تم تعديل هذا الرقم من9 ، بإذن من Springer Nature (حقوق الطبع والنشر 2020). الاختصارات: DSP = المعالجة المكانية الرقمية ؛ PC-oligos = قليل النيوكليوتيدات القابلة للضوئية ؛ عائد الاستثمار = مناطق الاهتمام ؛ NGS = تسلسل الجيل التالي. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 4: خريطة حرارية تمثيلية من تجربة DSP. تمثل الأعمدة مناطق الاهتمام الفردية. تمثل الصفوف هدفا للبروتين. يظهر التعبير المنخفض باللون الأزرق، ويظهر التعبير العالي باللون الأحمر. اختصار: DSP = المعالجة المكانية الرقمية. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
| GeoMx تنميط الخلايا المناعية - الإنسان | وحدة عموم الورم |
| بي دي-1 | مارت 1 |
| سي دي 68 | NY-ESO-1 |
| HLA-DR | S100B |
| كي -67 | بي سي إل-2 |
| بيتا-2 ميكروغلوبولين | إبكام |
| سي دي 11 سي | هير2 |
| سي دي 20 | بتن |
| سي دي 3 | إي آر ألفا |
| سي دي 4 | علاقات عامه |
| سي دي 45 | |
| سي دي 56 | |
| سي دي 8 | |
| CTLA4 | |
| GZMB | |
| PD-L1 | |
| بانك | |
| سما | |
| فيبرونيكتين | |
| آر بي آي جي | |
| السيدة IgG1 | |
| السيدة IgG2a | |
| هيستون H3 | |
| م6 | |
| غابده |
الجدول 1: عينة تمثيلية من البروتينات التي يمكن تقييمها باستخدام ألواح الأجسام المضادة المصممة مسبقا.
| مسبار U تجمع العمل | ||||||
| الوحدة 2 مسبار R | وحدات أخرى | المياه المعالجة DEPC (ميكرولتر) | الحجم الكلي (ميكرولتر) | مسبار يو ماستر ستوك (ميكرولتر) | المياه المعالجة DEPC (ميكرولتر) | الحجم الكلي |
| 2 | ... | 16.5 | 2 | 14.5 | 16.5 | |
| 4 | ... | 33 | 4 | 29 | 33 | |
| 6 | ... | 49.5 | 6 | 43.5 | 49.5 | |
| 8 | ... | 66 | 8 | 58 | 66 |
الجدول 2: رموز التهجين ومجمعات عمل المسبار R والمسبار U. اختصار: hyb = تهجين. DEPC = ثنائي إيثيل بيروكربونات.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
نظرا لتنوع البروتينات التي يمكن أن تؤثر على عدوانية الأورام الدبقية وفكرة أن العديد من هذه البروتينات لا تزال غير مكتشفة ، فإن طريقة قياس كمية البروتين عالية الإنتاجية هي نهج تكنولوجي مثالي. بالإضافة إلى ذلك ، بالنظر إلى أن البيانات المكانية في عينات الأورام غالبا ما ترتبط بالتعبير التفاضلي18 ، فإن دمج التنميط المكاني في نهج تحديد كمية البروتين يسمح بإجراء تحليل أكثر فعالية.
يتيح النهج عالي الإنتاجية ل DSP أيضا استخدامه في نهج يشبه البندقية ، وهو مثالي لاكتشاف المؤشرات الحيوية الجديدة المحتملة للمرض والاستجابة للعلاج. في دراستين عن سرطان الجلد ، تم استخدام DSP لتقييم الاستجابات للعلاج المركب مع ipilimumab و nivolumab مقابل العلاج الأحادي nivolumab19 والعلاج المركب المساعد الجديد مع ipilimumab و nivolumab مقابل العلاج المساعد القياسي20. في كلتا الدراستين ، أظهر تنميط DSP لمجموعة متنوعة من أهداف البروتين بعد العلاج تعبيرا نسبيا تفاضليا للعلامات المناعية الرئيسية ، مما يشير إلى دور المؤشرات الحيوية المحتملة للاستجابة العلاجية.
يسهل DSP أيضا تحديد الأهمية المرضية النهائية للعمليات المعقدة على المستوى الجزيئي. على سبيل المثال ، السمة المميزة للأورام الدبقية الغازية هي ميلها إلى الهجرة مباشرة من خلال المصفوفة خارج الخلية (ECM) ، وغالبا ما يسترشد مسار هجرتها بمساحات الأوعية الدموية والمادة البيضاء 1,2. التباين في التعبير البروتيني للبيئة المكروية للأنسجة هو السمة المميزة للانتقال الظهاري إلى اللحمة المتوسطة الذي يدفع الغزو. درست العديد من الدراسات كيف يمكن للأورام الدبقية أن تنظم مصفوفة البروتينات المعدنية (MMPs) ، مما يؤدي إلى انهيار ECM المحيط وزيادة الغزو21،22،23. من خلال تصور وقياس التأثير التراكمي المصب لهذا التنظيم التفاضلي ، يوفر DSP تحليلا شاملا واسع النطاق.
أحد المحددات الرئيسية للإمكانات الخبيثة للأورام الدبقية هو قدرتها على التفاعل مع الدفاعات المناعية للمضيف والتلاعب بها. على غرار الأورام الصلبة الأخرى ، تستخدم الأورام الدبقية مجموعة متنوعة من الآليات للتهرب من المراقبة المناعية للمضيف وتعطيل تنشيط البروتينات الضرورية لتكوين استجابة مناعية. ركزت التطورات الحديثة في علم الأورام المناعي على تحديد البروتينات المناعية التي يتم التعبير عنها أو استغلالها بواسطة الأورام. في طليعة هذه التطورات استخدام الخلايا التائية للكشف عن مستضدات الورم النشطة مناعيا والتي يمكن توجيه فيروسات الأورام ضدها 24،25 ، وتطوير مثبطات نقاط التفتيش ضد البروتينات المثبطة للخلايا التائية (على سبيل المثال ، PD1 / PDL1 و CTLA4) لتحفيز مناعة المضيف ضد الأورام26,27 . تشمل مجموعات اللحمية الأخرى التي تظهر بشكل بارز في البيئة المكروية للورم الدبقي الضامة ، والخلايا البطانية الوعائية الدقيقة ، والخلايا المناعية ، ومجموعة فرعية تم تحديدها مؤخرا تسمى "الخلايا اللحمية المرتبطة بالورم الدبقي" (GASCs)28. إن تفاعلات هذه الخلايا مع الكيموكينات والسيتوكينات ومكونات ECM لها آثار مهمة على انتشار الورم وغزوه والاستجابة للعلاج ، وبالتالي فهي بمثابة أهداف مهمة للقياس الكمي الإقليمي والمقارنة من خلال تقنيات مثل DSP.
بروتوكول DSP سهل الاستخدام ويسمح بطبقات متعددة من التخصيص. نظرا لأن الكثير من عملية القياس الكمي تتم آليا ، فإن الخطوات الرئيسية التي تعتمد على المستخدم موجهة نحو تحقيق أعلى حساسية وخصوصية ممكنة للكشف عن الهدف. وبالتالي ، تشمل الخطوات الرئيسية داخل البروتوكول تحديد بقعة للتصور الفلوري الأولي للعينة ، وتحديد عائد الاستثمار ، واختيار لوحات الأجسام المضادة.
عند تصميم بروتوكول تلطيخ ، من المهم أولا تحديد الهدف الذي من المحتمل أن يظهر اختلافات قابلة للقياس الكمي بين مناطق مختلفة من العينة ، بما يتوافق مع خاصية أو سلوك حرج لنسيج المنشأ. بعد ذلك ، يجب تحديد وكيل يربط الهدف بشكل فعال. على سبيل المثال ، إذا كان المرء يأمل في تصور مناطق تضخم أو اللانمطية النووية ، فقد يتم اختيار H&E أو بقعة نووية. بدلا من ذلك ، إذا كان يهدف إلى تصور التغييرات في التعبير عن جين معروف أنه مرتبط بالأنسجة الخبيثة أو ما قبل الخبيثة ، فيمكن اختيار جسم مضاد مقترن بالفلوروفور. يمكن تسمية الخلايا السرطانية نفسها على وجه التحديد في حالة الأورام الطافرة IDH1-R132H. يمكن تعديل البروتوكول الحالي بإضافة علامة فلورية IDH1-R132H كعلامة مورفولوجية (خطوة البروتوكول 3.2). يمكن استخدام ما يصل إلى أربع بقع لكل عينة. بمجرد حدوث تصور للأنسجة الملطخة ، يتم تعيين عائد الاستثمار. يجب أن يعكس اختيار عائد الاستثمار المكان الذي يتوقع أن تحدث فيه اختلافات كبيرة في التعبير المستهدف للبروتين. تشمل الاعتبارات الرئيسية عند اختيار عائد الاستثمار الحجم (قطر 10-600 ميكرومتر) والشكل (دائرة أو مستطيل أو مرسوم من قبل المستخدم) والتجزئة (مزيد من ترسيم المناطق الفرعية داخل عائد استثمار واحد ، مما يوفر طبقة إضافية محتملة من التحليل). يجب تحسين هذه المتغيرات لالتقاط التباين المكاني في التعبير المستهدف المتوقع بشكل أكثر فاعلية بناء على لوحة الأجسام المضادة المحددة.
يعد اختيار لوحة الأجسام المضادة ذا أهمية حاسمة ، حيث أن التعبير التفاضلي للأجسام المضادة يعمل في النهاية كنقطة نهاية للدراسة. عند تنفيذ هذه الخطوة ، من المهم مراعاة العلامات التي قد تظهر تعبيرا يرتبط إما بشكل إيجابي أو سلبي بمراحل على طول طيف تطور الورم ، من حميدة ، إلى ما قبل الغازية ، إلى الغازية أو الخبيثة. من المهم أيضا التفكير بعناية في خصائص كل من نسيج المنشأ ونوع الورم ، حيث قد تؤثر كلتا هاتين الميزتين على التعبير عن علامات معينة.
نظرا لأن الكثير من العملية مؤتمتة ، فإن أي عيوب في الإجراء ترجع عموما إلى خلل في الأجهزة أو البرامج ، مما يوفر قدرة محدودة على استكشاف الأخطاء وإصلاحها للمستخدم. تشمل المشكلات التي قد تنشأ تعطيل مقياس مراقبة الجودة المدمج (QC) (المصمم للإشارة إلى البيانات التي تشير إلى انخفاض نسبة الإشارة إلى الضوضاء ، والأعداد المنخفضة ، وعدم كفاية الكشف عن الهدف ، وربما حذفها) ، وتحديثات البرامج الشاذة ، والقضايا الإجرائية (على سبيل المثال ، الإنهاء المبكر للخطوات المختلفة). بالنسبة لهذه المشكلات، يوصى بأن يتصل المستخدم بالشركة المصنعة للحصول على الدعم عن بعد. بدلا من ذلك ، إذا واجه المستخدم مشكلات في البيانات الجوهرية (على سبيل المثال ، انخفاض عدد النوى بشكل عام ، وانخفاض التباين في التعبير بين عائد الاستثمار) ، فقد يفكر في تكرار الخطوات السابقة في الإجراء (على سبيل المثال ، إعادة تجميع البيانات من التحليل الحراري الميكانيكي (TMA) الأصلي ، وإعادة تعريف عائد الاستثمار). من المهم أيضا النظر في الاختلافات في كثافة الأنسجة باعتبارها مربكة محتملة لإنتاج المستضدات وبالتالي التعبير عن الأجسام المضادة. ومن ثم ، يجب أن تهدف الأنسجة ذات الكثافة المماثلة إلى اختيارها للتحليل.
تدابير الرقابة مدمجة في البروتوكول. يوفر البرنامج تحكما داخليا إيجابيا وسلبيا يمثل الاختلافات في تهجين PC-oligos إلى الرموز الشريطية الفلورية. توفر بروتينات التدبير المنزلي تحكما إيجابيا آخر يمكن أن يكون بمثابة عامل تطبيع على أساس الخلوية.
القدرة على تحديد عائد الاستثمار الذي يحدث فيه القياس الكمي هو أساس قدرة التنميط المكاني ل DSP. يمثل هذا الترسيم القابل للتخصيص لعائد الاستثمار خطوة حاسمة ومميزة داخل البروتوكول. يسمح خيار إنشاء عائد استثمار صغير مثل خلية واحدة بالدقة الإقليمية في تحديد كمية البروتين أو الحمض النووي ، والقدرة على تحديد عائد استثمار متعدد وتحديد محتوياتها جنبا إلى جنب من خلال تحليل تعدد الإرسال ينتج عنه نهج عالي الإنتاجية.
عندما يتم اختيار عائد الاستثمار لتمثيل مناطق متميزة مرضيا داخل عينة الورم الدبقي (على سبيل المثال ، نخرية ، محيطة بالأوعية الدموية) ، قد يكشف التنميط البروتيني والمقارنة الإقليمية عن آليات انتشار الورم وتقدمه. على سبيل المثال ، تم استخدام IHC لتحديد تعبير العامل المحرض لنقص الأكسجة (HIF-1α) إقليميا في عينات الورم الأرومي الدبقي وكشف عن تعبير أعلى بالقرب من المناطق الميتة مقارنة بالمناطق المحيطة بالأوعية الدموية29. هذا يتفق مع العديد من الدراسات التي تشير إلى دور نقص الأكسجة في تكوين الورم الدبقي.
كما تمت دراسة التباين الإقليمي على نطاق واسع بين مكونات الخلايا المناعية للبيئة المكروية للورم. تشكل الضامة / الخلايا الدبقية الصغيرة مجموعة الخلايا المناعية السائدة في الأورام الدبقية وقد تمت دراستها بشكل شامل على أساس إقليمي. تبين أن المجموعات السكانية الفرعية من البلاعم المرتبطة بالورم (TAMs) تلعب أدوارا مختلفة في تطور الورم اعتمادا على موقعها داخل الورم والبيئة المكروية. تلك الموجودة داخل حافة الورم الغازية تكسر الغشاء القاعدي ، مما يعزز الانتشار. تلك الموجودة في مناطق نقص الأكسجين تمارس تأثيرا وعائيا ، مما يسهل النمو ؛ أولئك الذين يقربون من الأوعية الدموية للورم يفرزون EGF والعوامل المرتبطة به لتوجيه الخلايا السرطانية اللحمية نحو الأوعية الدموية ، مما يؤدي إلى ورم خبيث30. توضح هذه الخصائص الحرجة المعتمدة مكانيا قيمة البيانات البروتينية الإقليمية في بيولوجيا السرطان وتمثل تطبيقا إضافيا مهما ل DSP لتوصيف مجموعات الخلايا المناعية داخل الورم وبيئته المكروية.
تحتوي هذه التقنية على بعض القيود ، بما في ذلك التكلفة والعدد الصغير نسبيا من الأهداف المتوفرة في لوحات الأجسام المضادة الأساسية. بالإضافة إلى ذلك ، على الرغم من أن الدقة دون الخلوية غير ممكنة مع DSP ، إلا أنها ستكون ممكنة مع التقنيات الجديدة القادمة31. على الرغم من هذه القيود ، يعد DSP تقنية قوية لأنواع معينة من الأسئلة المستهدفة التي لم يكن من الممكن الإجابة عليها سابقا في بيولوجيا خلايا الورم الدبقي. تقدم هذه التكنولوجيا المبتكرة فرصة استثنائية للكشف عن وجهات نظر بيولوجية جديدة من خلال التقييم الدقيق لأهداف البروتين المختلفة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح للكشف عنه.
Acknowledgments
يقر المؤلفون بدعم مختبر علم الجينوم السريري والتكنولوجيا المتقدمة في قسم علم الأمراض والطب المخبري في نظام دارتموث هيتشكوك الصحي. يقر المؤلفون أيضا بالمورد المشترك لعلم الأمراض في مركز دارتموث للسرطان مع منحة دعم مركز السرطان NCI 5P30 CA023108-37.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BOND Research Detection System | Leica Biosystems, Wetzlar, Germany | DS9455 | Open detection system containing open containers in a reagent tray |
| BOND Wash | Leica Biosystems, Wetzlar, Germany | AR950 | 10X concentrated buffer solution for washing fixed tissue |
| Buffer W | NanoString, Seattle, WA | contact company | Blocking reagent |
| Cy3 conjugation kit | Abcam, Cambridge, UK | AB188287 | Cy3 fluorescent antibody conjugation kit |
| GeoMx Digital Spatial Profiler (DSP) | NanoString, Seattle, WA | contact company | System for imaging and characterizing protein and RNA targets |
| GeoMx DSP Instrument BufferKit | NanoString, Seattle, WA | 100471 | Buffer kit for GeoMX DSP (including buffers for sample processing and preparation) |
| GeoMx Hyb Code Pack_Protein | NanoString, Seattle, WA | 121300401 | Controls for running GeoMX DSP experiemtns |
| GeoMx Immune Cell Panel (Imm Cell Pro_Hs) | NanoString, Seattle, WA | 121300101 | Protein module with targets for human immune cells and immuno-oncologic targets |
| GeoMx Pan-Tumor Panel (Pan-Tumor_Hs) | NanoString, Seattle, WA | 121300105 | Protein module with targets for multiple human tumor types and for markers of epithelial-mesenchymal transition |
| GeoMx Protein Slide Prep FFPE | NanoString, Seattle, WA | 121300308 | Sample preparation reagents for GeoMX DSP protein analysis |
| LEICA Bond RX | Leica Biosystems, Wetzlar, Germany | contact company | Fully automated IHC stainer |
| Master Kit--12 reactions | NanoString, Seattle, WA | 100052 | Materials and reagents for use with the nCounter Analysis system |
| nCounter Analysis System | NanoString, Seattle, WA | contact company | Automated system for multiplex target expression quantification (to be used with GeoMx DSP) |
| TMA Master II | 3DHistech Ltd., Budapest, Hungary | To create the tissue microarray block |
References
- Pedersen, P. H., et al. Migratory patterns of lac-z transfected human glioma cells in the rat brain. International Journal of Cancer. 62 (6), 767-771 (1995).
- Wang, J., et al. Invasion of white matter tracts by glioma stem cells is regulated by a NOTCH1-SOX2 positive-feedback loop. Nature Neuroscience. 22 (1), 91-105 (2019).
- Iwadate, Y.
- Tao, C., et al. Genomics and prognosis analysis of epithelial-mesenchymal transition in glioma. Frontiers in Oncology. 10, 183 (2020).
- Cuddapah, V. A., Robel, S., Watkins, S., Sontheimer, H. A neurocentric perspective on glioma invasion. Nature Reviews Neuroscience. 15 (7), 455-465 (2014).
- Barthel, L., et al. Glioma: molecular signature and crossroads with tumor microenvironment. Cancer and Metastasis Reviews. 1 (1), 53-75 (2021).
- Ziegler, D. S., Kung, A. L., Kieran, M. W.
- Berghoff, A. S., et al. Programmed death ligand 1 expression and tumor-infiltrating lymphocytes in glioblastoma. Neuro-Oncology. 17 (8), 1064-1075 (2015).
- Merritt, C. R., et al. Multiplex digital spatial profiling of proteins and RNA in fixed tissue. Nature Biotechnology. 38 (5), 586-599 (2020).
- Van, T. M., Blank, C. U. A user's perspective on GeoMxTM digital spatial profiling. Immuno-Oncology Technology. 1, 11-18 (2019).
- Garcia-Pardo, M., Calles, A. ROS-1 NSCLC therapy resistance mechanism. Precision Cancer Medicine. , Online (2021).
- Ye, L., et al. Digital spatial profiling of individual glomeruli from patients with anti-neutrophil cytoplasmic autoantibody-associated glomerulonephritis. Frontiers in Immunology. 13, 831253 (2022).
- Bergholtz, H., et al. Best practices for spatial profiling for breast cancer research with the GeoMx digital spatial profiler. Cancers. 13 (17), 4456 (2021).
- Brady, L., et al. Inter- and intra-tumor heterogeneity of metastatic prostate cancer determined by digital spatial gene expression profiling. Nature Communications. 12 (1), 1426 (2021).
- Kulasinghe, A., et al. Highly multiplexed digital spatial profiling of the tumor microenvironment of head and neck squamous cell carcinoma patients. Frontiers in Oncology. 10, 607349 (2021).
- Wang, D. Y. -T., et al. Case study: Digital spatial profiling of metastatic clear cell carcinoma reveals intra-tumor heterogeneity in epithelial-mesenchymal gradient. bioRxiv. , (2021).
- GeoMx DSP. Automated slide preparation user manual. GeoMx DSP. , nanoString Technologies. Seattle, Washington. (2022).
- Allam, M., Cai, S., Coskun, A. F. Multiplex bioimaging of single-cell spatial profiles for precision cancer diagnostics and therapeutics. NPJ Precision Oncology. 4, 11 (2020).
- Wolchok, J. D., et al. Overall survival with combined nivolumab and ipilimumab in advanced melanoma. New England Journal of Medicine. 377 (14), 1345-1356 (2017).
- Blank, C. U., et al. Neoadjuvant versus adjuvant ipilimumab plus nivolumab in macroscopic stage III melanoma. Nature Medicine. 24 (11), 1655-1661 (2018).
- Matthews, R. T., et al. Brain-enriched hyaluronan binding (BEHAB)/brevican cleavage in a glioma cell line is mediated by a disintegrin and metalloproteinase with thrombospondin motifs (ADAMTS) family member. Journal of Biological Chemistry. 275 (30), 22695-22703 (2000).
- Paganetti, P. A., Caroni, P., Schwab, M. E. Glioblastoma infiltration into central nervous system tissue in vitro: involvement of a metalloprotease. Journal of Cell Biology. 107, 2281-2291 (1988).
- Beliën, A. T., Paganetti, P. A., Schwab, M. E. Membrane-type 1 matrix metalloprotease (MT1-MMP) enables invasive migration of glioma cells in central nervous system white matter. Journal of Cell Biology. 144 (2), 373-384 (1999).
- Coulie, P. G., Vanden Eynde, B. J., vander Bruggen, P., Boon, T. Tumour antigens recognized by T lymphocytes: At the core of cancer immunotherapy. Nature Reviews Cancer. 14 (2), 135-146 (2014).
- Finn, O. J. Vaccines for cancer prevention: a practical and feasible approach to the cancer epidemic. Cancer Immunology Research. 2 (8), 708-713 (2014).
- Sharma, P., Allison, J. P. The future of immune checkpoint therapy. Science. 348 (6230), 56-61 (2015).
- Chen, L., Han, X. Anti-PD-1/PD-L1 therapy of human cancer: past, present, and future. Journal of Clinical Investigation. 125 (9), 3384-3391 (2015).
- Cai, X., et al. Glioma-Associated stromal cells stimulate glioma malignancy by regulating the tumor immune microenvironment. Frontiers in Oncology. 11, 672928 (2021).
- Ishii,, et al. Histological characterization of the tumorigenic "peri-necrotic niche" harboring quiescent stem-like tumor cells in glioblastoma. PLoS One. 11 (1), 0147366 (2016).
- Lewis, C. E., Pollard, J. W. Distinct role of macrophages in different tumor microenvironments. Cancer Research. 66 (2), 605-612 (2006).
- NanoString. CosMx Spatial Molecular Imager: True Single-Cell In Situ Solution. NanoString. , (2022).
