Summary
단백질체 조절 장애는 확산 침윤성 신경교종의 확산에 중요한 역할을 하지만 몇 가지 관련 단백질은 아직 확인되지 않았습니다. 디지털 공간 처리(DSP)는 침윤성 신경교종의 침습 및 이동에 기여할 수 있는 후보 단백질의 차등 발현을 특성화하기 위한 효율적인 고처리량 접근 방식을 제공합니다.
Abstract
확산 침윤성 신경 교종은 종양 확산의 침윤성 특성으로 인해 높은 이환율 및 사망률과 관련이 있습니다. 그들은 형태학적으로 복잡한 종양으로, 종양 자체와 이질적인 미세 환경 모두에서 높은 수준의 단백질체 가변성을 가지고 있습니다. 이러한 종양의 악성 잠재력은 세포 안정성을 유지하고 미세 환경의 구조적 완전성을 보존하는 과정을 포함하여 여러 주요 경로에 관여하는 단백질의 조절 장애에 의해 향상됩니다. 수많은 벌크 및 단일 세포 신경교종 분석이 있었지만 이러한 단백질체 데이터의 공간적 계층화가 상대적으로 부족합니다. 내인성 종양, 침습성 가장자리 및 미세 환경 간의 종양 발생 인자와 면역 세포 집단의 공간적 분포의 차이를 이해하면 종양 증식 및 전파의 기본 메커니즘에 대한 귀중한 통찰력을 얻을 수 있습니다. 디지털 공간 프로파일링(DSP)은 이러한 중요한 다층 분석의 토대를 형성할 수 있는 강력한 기술입니다.
DSP는 조직 표본의 사용자 지정 공간 영역 내에서 단백질 발현을 효율적으로 정량화하는 방법입니다. DSP는 구별 영역 내 및 여러 단백질의 차별적 발현을 연구하는 데 이상적이며 여러 수준의 정량적 및 정성 분석이 가능합니다. DSP 프로토콜은 체계적이고 사용자 친화적이어서 단백질체 데이터의 맞춤형 공간 분석이 가능합니다. 이 실험에서 조직 마이크로 어레이는 보관 된 교 모세포종 코어 생검으로 구성됩니다. 다음으로, 항체 패널이 선택되어 샘플 내에서 관심 단백질을 표적으로 합니다. UV 광절단 가능한 DNA 올리고뉴클레오티드에 전접합된 항체는 밤새 조직 샘플과 함께 배양됩니다. 항체의 형광 현미경 시각화에서 단백질 발현을 정량화할 관심 영역(ROI)이 샘플과 함께 정의됩니다. 그런 다음 UV 광선이 각 ROI로 향하여 DNA 올리고뉴클레오티드를 절단합니다. 올리고뉴클레오티드는 각 ROI 내에서 미세 흡기 및 계수되어 공간 기준으로 해당 단백질을 정량화합니다.
Introduction
확산 성 신경 교종은 성인에서 가장 흔한 유형의 악성 뇌종양이며 항상 치명적입니다. 신경 교종 세포가 뇌에서 광범위하게 이동하는 경향은 주요 치료 과제입니다. 그들이 확산되는 메커니즘에는 직접 이주와 확인되지 않은 침략이 포함됩니다. 침습성 신경교종 세포는 백질 관1을 따라 향성과 이동을 나타내는 것으로 나타났으며, 최근 연구에서는 이러한 관의 탈수초화를 활성 원발성 특징2으로 암시합니다. 침습은 상피에서 중간엽으로의 전이에 의해 매개되며, 여기서 신경교종 세포는 세포외 기질 단백질 및 세포 부착 분자를 코딩하는 유전자의 발현을 감소시키고, 이동을 증폭하고, 종양 미세 환경을 통한 전파를 촉진함으로써 중간엽 특성을 획득한다 3,4,5.
분자 수준에서 세포 안정성을 부여하고 면역 원성 성분과의 인터페이스를 부여하는 여러 단백질의 파괴가 입증되었습니다6. 침윤성 신경교종은 항-세포사멸(예를 들어, PTEN) 특성을 갖는 단백질의 억제를 겪는 것으로 알려져 있다7. 또한 숙주 면역 반응의 회피를 촉진하는 단백질(예: PD1/PDL1)을 과발현합니다8. 이러한 복잡한 경로의 조절 장애는 종양 유발성을 향상시키고 악성 가능성을 증가시킵니다.
침습성 신경교종 샘플 내에서 목표는 세포 성장, 생존 및 증식에 중요한 단백질의 차등 발현과 침습성 및 비침습적 구성 요소 간의 미세 환경 구조적 무결성을 평가하는 것이었습니다. 또한, 우리는 활성 면역원성 역할을 하는 단백질의 차등 조절을 연구하여 손상된 숙주 면역 방어가 신경교종의 증식 및 침습 잠재력을 향상시킬 수 있는 메커니즘에 대한 통찰력을 제공하고자 했습니다. 이것은 면역 마커와 악성 종양의 조절 장애 동인이 면역 요법의 표적이 될 수 있음을 보여주는 최근의 광범위한 연구를 고려할 때 특히 관련이 있습니다. 면역감시 및 반응성에 관여하는 많은 단백질 중에서 실행 가능한 치료 표적을 식별하려면 매우 민감하고 포괄적인 접근 방식이 필요합니다.
연구할 수 있는 다양한 후보 단백질을 감안할 때, 우리는 면역조직화학과 유사하지만 데이터 처리 효율성이 향상된 방법을 모색했습니다. 암 생물학 분야에서 DSP는 단백질체학 분석 및 정량화를 위한 대체 도구에 비해 중요한 이점을 가진 강력한 기술로 부상했습니다. DSP의 특징은 시료 내 여러 단백질을 동시에 연구할 수 있는 고처리량 멀티플렉싱 기능으로, 면역조직화학(IHC)9,10과 같은 표준이지만 낮은 플렉스 기술과 중요한 차이점을 나타냅니다. DSP의 멀티플렉스 기능은 DSP와 IHC를 비교한 연구에서 입증된 바와 같이 정량적 및 분석 도구로서의 충실도를 손상시키지 않습니다. 예를 들어 비소세포 폐암 표본의 단백질체학적 정량화에 사용되는 경우, DSP는 IHC11과 유사한 결과를 갖는 것으로 나타났다. 또한 DSP는 사용자가 단백질체 분석을 수행할 영역을 수동으로 정의할 수 있는 사용자 지정 가능한 지역 사양을 제공합니다. 이것은 전체 섹션 멀티플렉스 방법10,12에 비해 이점을 제공합니다. 따라서 DSP는 단일 처리 라운드에서 여러 관심 영역에 걸쳐 여러 단백질 표적을 조사하여 여러 계층의 분석을 제공합니다.
DSP는 여러 가지 병리학 적 환경에서 적용됩니다. DSP는 공간적 변이가 세포 형질전환 및 차등 단백질 발현과 상관관계가 있을 수 있기 때문에 종양학적 분석에서 특히 유리합니다. 예를 들어, DSP는 유방암의 단백질체학 프로파일을 인접한 종양 미세환경과 비교하는데 사용되었다. 이것은 이 종양의 자연사와 그 진행, 그리고 치료13에 대한 잠재적 반응을 이해하는 데 중요한 의미를 담고 있습니다. DSP의 다양성을 보여주는 추가 컨텍스트에는 전립선암14에서 단백질 다양성의 공간 정량화, 두경부 편평 세포 암종에서 면역 세포 마커 발현과 질병 진행의 연관성15, 전이성과 원발성 투명 세포 난소암을 구별하는 단백질 발현의 상피-중간엽 구배의 입증16 . DSP를 구현함으로써 우리는 종양 발생 및 신경교종의 침습에 영향을 미칠 수 있는 단백질의 공간 지형을 특성화합니다.
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Protocol
아래에 설명 된 프로토콜은 Dartmouth-Hitchcock Human Research Ethics Committee의 지침을 따릅니다. 이 연구에 조직 샘플이 포함 된 환자로부터 정보에 입각 한 동의를 얻었습니다. 이 프로토콜에 사용되는 모든 재료, 시약, 장비 및 소프트웨어와 관련된 자세한 내용은 재료 표 섹션을 참조하십시오.
1. 슬라이드 준비17
- 인간 성인형 미만성 침윤성 신경교종에서 포르말린 고정, 파라핀 포매 조직을 회수하거나 준비합니다.
참고: 이 실험에서는 교모세포종 환자 3명의 파라핀 포매 생검 블록을 사용했습니다. - 조직 마이크로어레이(TMA) 블록을 만듭니다. 각 생검에서 여러 개의 2mm 코어를 가져와 단일 TMA 블록에 넣습니다(그림 1, 상단). TMA 블록에서 4μm의 섹션을 절단하고 유리 슬라이드에 장착합니다. 각 슬라이드를 슬라이드 홀더 개스킷 안에 놓습니다. 슬라이드를 60°C에서 30분 동안 배양합니다.
2. 반자동 IHC 시스템 준비 및 소프트웨어 구성(슬라이드 로딩 및 실행용)17
- 시약을 설정합니다. 시약 설정 버튼을 클릭합니다. 설정 탭에서 추가를 클릭합니다.
- 이름 필드에 이름을 입력하여 세척 버퍼를 등록합니다. 유형 필드에서 보조를 선택합니다. 저장을 클릭합니다.
- 위와 동일한 단계를 반복하되(해당되는 경우 수정됨, 예: 이름 필드에서) 유형 필드에서 1차 항체를 선택하여 차단 용액을 등록합니다. 기본 염색 프로토콜 및 기본 HIER 프로토콜의 드롭다운 상자에서 원하는 프로토콜을 선택합니다. 원하는 경우 기본 효소 프로토콜 옵션을 선택합니다(이 상자는 현재 프로토콜에서 비어 있음). 저장을 클릭합니다.
- 바코드가 부착된 시약 용기 트레이로 구성된 검출 시스템을 등록합니다. 바코드를 스캔합니다.
- 연구 시약 시스템 추가 창에서 시 약 시스템 세부 정보를 입력하기 시작합니다. 감지 시스템의 이름을 입력합니다.
- 만료 날짜를 입력합니다. 시약 차트의 첫 번째 행을 강조 표시하고 새 30mL 시약 용기의 바코드를 스캔하면 바코드가 행 1을 채웁니다.
- 컨테이너를 감지 시스템의 위치 1에 놓습니다. 시약 열의 드롭다운 상자에서 세척 버퍼의 이름을 선택하고 추가를 클릭합니다. 이 단계를 반복하여 블로킹 솔루션을 포함하여 후속 행에 추가 시약을 추가합니다.
- IHC에 대한 단백질 프로토콜을 설정합니다. 프로토콜 설정을 클릭합니다. 원하는 프로토콜에 해당하는 행을 강조 표시하고 복사를 클릭합니다. 이름을 입력하고 프로토콜 속성 편집 창에서 다른 관련 필드를 입력합니다.
- 세척 단계 표시 상자를 선택합니다. Inc(분) 및 디스펜스타입 필드가 각 시약에 대해 올바른지 확인합니다(블로킹 용액의 경우 10분, 세척 버퍼의 경우 0분, 각 디스펜스타입의 경우 150μL). 저장을 클릭합니다.
- 연구를 준비하십시오. 위치 1의 용기를 세척 버퍼로 채 웁니다. 슬라이드당 150μL와 5mL의 데드 볼륨을 채웁니다. 뚜껑을 열어 두십시오. 블로킹 솔루션으로 채워야 하는 위치 2의 컨테이너에 대해 이 단계를 반복합니다. 이 용기에는 슬라이드당 150μL와 350μL의 데드 볼륨이 있어야 합니다.
- 시약 용기 트레이를 기계에 로드합니다. 시스템이 컨테이너 인식 및 볼륨 확인 조치를 수행하도록 허용합니다. 슬라이드 설정 |를 클릭합니다. 스터디 추가. 스터디 ID와 스터디 이름을 입력하고 분주 용량 | 에서 150 μL를 선택합니다. 준비 프로토콜 드롭다운에서 원하는 프로토콜(베이크 및 디왁스 제안). 연구를 강조 표시하고 슬라이드 추가를 클릭합니다.
- 분배 부피 |에서 조직 유형 | 150 μL의 테스트 조직 선택 염색 모드 드롭다운 상자의 단일 및 루틴. 프로세스 선택(현재 연구의 경우 IHC) | 마커 필드의 드롭다운 상자에 있는 차단 솔루션 이름 | 프로토콜 탭의 염색 필드에 있는 IHC DSP 프로토콜 | *준비를 위해 베이킹 및 디왁스 | *HIER용 ER20로 1분 HIER. 효소 필드를 비워 둡니다.
- 모든 슬라이드에 대해 이 과정을 반복합니다. 완료되면 닫기 를 클릭하고 레이블 인쇄를 클릭합니다. 현재 스터디에 대해 아직 인쇄되지 않은 모든 슬라이드 레이블을 선택하고 인쇄를 클릭합니다. 슬라이드 상단에 레이블을 부착합니다.
- 슬라이드를 로드하고 실행합니다. 슬라이드를 슬라이드 트레이에 올려 샘플과 라벨이 위를 향하도록 합니다. 슬라이드 위에 표지 타일 을 놓고 슬라이드의 아래쪽 탭 방향이 되도록 합니다. 슬라이드 트레이를 기기에 로드합니다.
- LED 버튼을 눌러 트레이를 내리고 기기가 슬라이드 스캔 및 인식을 시작할 수 있도록 합니다. 시작 버튼을 클릭하여 실험을 시작합니다.
- 실험을 마칩니다. LED 버튼이 녹색으로 깜박이면 실행 완료를 나타냅니다. 기기에서 트레이를 제거하고 각 슬라이드에서 커버 타일을 조심스럽게 들어 올립니다. 슬라이드를 1x 인산염 완충 식염수(PBS)에 넣고 과도한 완충액을 제거한 다음 소수성 펜으로 각 조직 섹션의 윤곽을 그리며 소수성 장벽을 만듭니다.
3. 항체 배양 및 핵 염색17
- 관심 항원을 국소화할 항체 패널을 선택합니다(이 실험에 사용된 항체에 대해서는 표 1 참조).
참고: 각 항체는 이미 이를 고유하게 식별하는 UV 광절단 세그먼트(PC-oligo)가 있는 DNA 올리고뉴클레오티드에 접합되었습니다(인덱싱 올리고, 그림 2). - 각 슬라이드에 대해 패널에 각 항체 8μL(1:40 희석)를 추가하여 작동하는 항체-PC-올리고 용액을 만듭니다. 블로킹 시약을 희석제로 사용하여 각 슬라이드에 대한 최종 부피 200μL에 도달합니다. 4°C에서 밤새 배양합니다(그림 3, 단계 1).
참고: 형태학 마커, 생물학적 염료 또는 형광 표지된 항체도 이 단계에서 용액에 첨가할 수 있습니다. - 다음날 슬라이드를 코플린 병에 넣고 3x TBS-T에서 10 x 1 분 동안 씻습니다. 실온에서 30 분 동안 4 % 파라 포름 알데히드에 후위사를 적용한 다음 1x TBS-T에서 2 x 5 분.
- 실온에서 15분 동안 SYTO13 핵 염색(1x TBS에 1:10으로 희석)을 추가합니다. 1x TBS-T로 2x를 씻은 다음 슬라이드를 1x TBS-T에 보관하십시오.
4. DSP 기기의 형광 시각화, ROI 식별 및 UV 광분해17
- 제어 센터의 데이터 수집 위로 마우스를 가져간 후 새로 만들기/계속 실행을 선택합니다.
- 슬라이드를 슬라이드 홀더에 놓고 레이블이 사용자를 향하도록 합니다. 슬라이드 트레이 cl을 내립니다.amp 길쭉한 창에 조직이 보이도록 합니다. 버퍼 S 6mL를 추가합니다.
- 제어 센터의 지시를 따릅니다. X 및 Y 슬라이더로 여러 축 사이를 확대하여 스캔할 영역을 표시합니다. 스캔을 선택합니다. 정의된 전체 대상 영역이 이미징될 때까지 스캔을 계속합니다.
- 20x 이미지를 생성합니다. ROI를 자동 또는 수동으로 정의합니다(그림 3, 2단계). 이 프로토콜을 따르려면 각 조직 코어에 대해 동일한 크기의 원형 ROI(직경 250μm) 3개를 선택합니다(그림 4, 하단).
참고: ROI는 크기와 모양이 사용자 지정할 수 있습니다. 각 섹션 내에서 여러 ROI를 선택할 수 있습니다. 이 실험에서는 순환 ROI를 수동으로 정의합니다. - 스캔 작업 영역 종료 버튼을 클릭하여 ROI를 승인합니다. UV 광선이 항체에서 올리고를 절단할 때까지 기다립니다.
- 기기 청소 프로세스가 완료되면 새 데이터 수집을 선택하여 현재 슬라이드 또는 플레이트를 계속 진행합니다. 그렇지 않으면 슬라이드 및 마이크로플레이트 제거를 선택합니다.
- 제어 센터의 오른쪽 하단에 있는 플레이트 아이콘 영역을 두 번 클릭하여 플레이트 마무리 창을 엽니다. 하이브리드화(Hyb) 코드 팩 로트 번호(#)를 알고 있는 경우 번호를 입력하고 업데이트를 클릭합니다(이 단계에서는 선택 사항). 완료를 클릭합니다.
- 프롬프트에 따라 슬라이드 홀더와 수집 플레이트를 분리합니다. 슬라이드를 TBS-T에 저장합니다. 슬라이드를 오랫동안 사용하지 않을 경우 수성 매체와 커버 슬립으로 덮으십시오.
5. 단백질 판독17
- 투과성 씰을 사용하고 상단이 열린 상태에서 열 순환기에서 65 ° C에서 흡인물을 건조시킵니다. 7μL의 디에틸 피로카보네이트 처리된 물을 넣고 혼합합니다. RT에서 10 분 동안 배양 한 다음 빠르게 스핀 다운합니다.
- 표 2에서 적절한 프로브 R 및 프로브 U 방정식을 선택하여 프로브/버퍼 믹스 생성을 안내합니다. 본 실험에서 혼성화에 필요한 Hyb Code의 개수를 기준으로 하기 수학식 1을 적용한다. 빠르게 믹스 앤 스핀 다운.
# Hyb 코드 프로브 R 워킹 풀 프로브 U 워킹 풀 하이브리드화 버퍼 n = _______ (n × 8 μL) = _____ μL + (n × 8 μL) = ______ μL + (n × 80 μL) = _____ μL (1) - 사용할 각 Hyb 코드 팩에 84μL의 프로브/버퍼 혼합물을 추가합니다. 플릭하여 믹스하고 스핀다운합니다. 새로운 96웰 하이브리드화 플레이트에서 각 Hyb 코드 마스터 믹스 8μL를 표시된 행의 모든 12웰에 추가합니다.
- 7 μL를 DSP 수집 플레이트에서 하이브리드화 플레이트의 해당 웰로 옮깁니다. 부드럽게 섞는다. 열 밀봉하고 빠른 회전을 수행하십시오. 이어서, 67°C에서 밤새 배양한다. 얼음 위에서 접시를 식히고 빠른 회전을 수행하십시오.
- 각 웰의 hyb 제품을 스트립 튜브에 모으고 각 웰을 5x 부드럽게 파이프하여 혼합합니다. 스트립 튜브를 덮고 스핀 다운하십시오. 풀링되지 않은 나머지 hyb 제품은 -80°C에서 동결합니다. 스트립 튜브를 분석 시스템에 로드합니다.
- CDF 파일을 USB 드라이브에 저장한 다음 DSP 기기에서 디지털 분석기로 데이터를 전송합니다. 다음 단계를 수행하여 설정을 완료합니다.
- 소모품과 풀링된 샘플을 준비 스테이션에 로드합니다. 화면에서 처리 시작을 누릅니다. 고감도를 선택하고 다음을 선택합니다. 샘플이 | 있는 웰 수에 대해 모두 선택을 누릅니다. 마침 | 다음 이메일 알림 | 스타트.
- 준비 스테이션이 완료되면 카트리지를 밀봉하고 디지털 분석기로 옮깁니다. 계산 시작을 누르고 스테이지 위치를 선택한 다음 기존 CDF 파일 로드를 누르고 이전에 업로드한 파일을 선택합니다. 완료를 누르고 스테이지 위치를 다시 선택한 다음 완료를 누릅니다| 프로그램 실행을 시작합니다.
- 리포터 카운트 변환 파일의 압축 파일을 분석 시스템에서 USB 드라이브에 저장한 다음 드라이브를 DSP 기기에 삽입합니다. DSP 제어 센터에서 데이터 수집 위로 마우스를 가져간 다음 업로드 횟수를 클릭합니다. 관련 압축 파일을 선택합니다.
6. 데이터 분석17
- DSP 제어 센터에서 레코드를 클릭합니다. 대기열에서 스캔을 보려면 선택한 스캔을 대기열에 추가를 선택합니다| 내 분석 대기열. 제어 센터의 데이터 분석 옵션 위로 마우스를 가져간 후 대기열에서 새 스터디를 선택합니다.
- 작업 표시줄 옵션에서 QC를 선택합니다. 기본값으로 계속하거나 원하는 경우 조정합니다. QC 실행을 선택하고 결과 표를 검토합니다. QC 실행을 클릭하여 계속 진행하고 새 데이터 세트를 만들고 값을 포지티브 하이브리드화 컨트롤로 정규화합니다.
- 새 태그를 XLSX 파일로 가져옵니다. 검사 창에서 주석 관리를 선택한 다음, 템플릿을 다운로드하고, 태그를 삽입하고, 파일을 가져옵니다.
- 선택 사항 : QC를 실행 한 후 다른 도구 모음 옵션을 사용하여 데이터를 추가로 조정하십시오. 시각화 창의 도구를 사용하여 변환된 데이터를 플로팅합니다.
- 매개변수의 회색 드롭다운 상자를 탐색하여 시각화 창에서 각 플롯을 작성합니다. 플롯 내에서 특정 영역을 선택하여 스캔 창에서 강조 표시된 해당 세그먼트를 시각화하고 마우스 오른쪽 버튼을 클릭하여 태그 또는 그룹을 생성합니다. 데이터 세트 요약 내에서 정규화, 스케일링 및 분석 및 표시를 위한 기타 옵션의 플롯을 검토합니다.
- 저장할 아이콘을 선택하여 시각화를 저장합니다. 요약 아래에 이미 저장된 시각화를 검토합니다. 내보내기(.svg) 단추를 선택하여 시각화를 .svg 형식으로 내보냅니다. 시각화의 기반이 되는 데이터를 내보내기(.xlsx) 버튼을 클릭하여 내보냅니다. 두 번째 창의 데이터 세트 이름 위에 커서를 놓고 내보내기 아이콘을 클릭하여 특정 데이터 세트에 포함된 모든 데이터를 내보냅니다.
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Representative Results
도 4 는 교모세포종의 샘플에 대해 수행된 DSP 실험으로부터의 대표적인 결과를 나타낸다. DSP 소프트웨어를 사용하여 데이터를 시각적으로 캡처하는 방법 중 하나를 보여주는 히트 맵이 제공됩니다. 행은 단백질 표적을 나타내며 각 열은 관심 영역에 해당합니다. 파란색에서 빨간색의 색상 범위는 각각 낮은 표현에서 높은 표현을 나타냅니다. 행 내 색상의 가변성은 지역 단백질 이질성을 반영하고 차등 단백질 발현과의 가능한 공간적 연관성을 시사합니다. 예를 들어, 본 실험에서 S100 및 CD56은 신경 마커이기 때문에 보편적으로 높습니다.
변동성이 가장 큰 마커에는 B7-H3, Ki-67, CD44 및 피브로넥틴이 포함되었습니다. 이러한 마커는 각각 종양 증식, 이동 및 전이와 중요한 연관성을 가지고 있습니다. 따라서 악성 코어, 악성 침범 및 비 악성 조직의 샘플 사이에 지역적 변동성을 나타내는 것이 합리적입니다. 수치 데이터 표현도 가능합니다. ROI 내에서 각 단백질 마커의 발현 값을 테이블 형식으로 포함하는 파일을 수학적 및 통계 분석을 위해 내보낼 수 있습니다. 이 발현 값은 각 ROI 내에서 미세 흡기 PC 올리고를 정량화하는 DSP를 통해 사용할 수 있는 디지털 계수 기능에 의해 생성됩니다(그림 1 및 그림 2).
그림 1: 교모세포종 생검에서 조직 마이크로어레이의 관심 영역 정의. 상단, 헤마톡실린 및 에오신-염색된 조직 마이크로어레이의 절편은 총 3명의 교모세포종 환자로부터의 여러 2 mm 직경의 코어 생검을 포함한다. 하단, 형광 이미지에 정의된 관심 영역. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 광절단 가능한 올리고뉴클레오티드. 단백질 또는 RNA 표적에 대한 항체 또는 안티센스 올리고뉴클레오티드 프로브는 각각 광절단 가능한 링커를 갖는 올리고뉴클레오티드에 공유적으로 연결된다. 조직 절편은 프로브로 염색됩니다. 그런 다음 UV 광선은 ROI로 보내져 디지털 방식으로 계산되는 PC 올리고를 방출합니다. 이 수치는 Springer Nature (저작권 2020) 의 허가를 받아9에서 수정되었습니다. 약어: PC-올리고 = 광절단가능한 올리고뉴클레오티드; ROI = 관심 영역. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: DSP 절차. 1) 조직 처리: 조직 슬라이드는 올리고-접합된 항체 또는 RNA 프로브로 염색됩니다. 2) ROI 선택: 조직 슬라이드가 이미지화되고 ROI가 특정 형광 패턴을 기반으로 수동 또는 자동으로 묘사됩니다. 3) 접합된 올리고뉴클레오티드의 절단: UV 광은 ROI를 향하여 광절단 가능한 올리고뉴클레오티드의 절단을 초래합니다. 4) PC-올리고 수집: PC-올리고는 미세모세관으로 흡인된다. 5) 도금: 흡기 PC-올리고는 마이크로타이터 플레이트에 증착됩니다. 6) 반복 : 각 ROI에 대해 3-5 단계가 반복됩니다. 각주기 사이에 세심한 세척이 수행됩니다. 7) 정량화: 공간적으로 분해된 PC-올리고 풀은 형광 바코드에 혼성화될 수 있습니다. 이를 통해 ROI당 최대 약 100만 개의 바인딩 이벤트를 디지털 카운팅할 수 있습니다. 대안적으로, PC-올리고는 NGS를 통해 정량화될 수 있으며, 여기서 전체 마이크로타이터 플레이트는 단일 튜브로 풀링되고 시퀀싱됩니다. 그런 다음 판독 값을 디지털 카운트로 변환하고 원래 ROI로 다시 매핑하여 각 조직 섹션 내에서 단백질 또는 RNA 발현의 시각적 맵을 생성합니다. 이 수치는 Springer Nature (저작권 2020) 의 허가를 받아9에서 수정되었습니다. 약어 : DSP = 디지털 공간 처리; PC-올리고 = 광절단가능한 올리고뉴클레오티드; ROI = 관심 영역; NGS = 차세대 염기서열분석. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: DSP 실험의 대표적인 히트맵. 열은 개별 관심 영역을 나타냅니다. 행은 단백질 표적을 나타냅니다. 낮은 표현은 파란색으로 표시되고 높은 표현은 빨간색으로 표시됩니다. 약어: DSP = 디지털 공간 처리. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| GeoMx 면역 세포 프로파일링 - 인간 | 범종양 모듈 |
| PD-1 | 마트1 |
| CD68 | 뉴욕-에소-1 |
| HLA-DR | S100B |
| Ki-67 | Bcl-2 |
| 베타 -2 마이크로 글로불린 | 엡캠 |
| CD11c | 허2 |
| CD20 | 증권 시세 표시기 |
| CD3 | 응급실 알파 |
| CD4 | 홍보 |
| CD45 | |
| CD56 | |
| CD8 | |
| CTLA4 | |
| 증권 시세 표시기 | |
| PD-L1 | |
| 팬씨크 | |
| 증권 시세 표시기 | |
| 피브로넥틴 | |
| Rb IgG | |
| 미스 IgG1 | |
| 미스 IgG2a | |
| 히스톤 H3 | |
| 시즌 6 | |
| 갭드 |
표 1: 사전 설계된 항체 패널을 사용하여 평가할 수 있는 대표적인 단백질 샘플.
| 프로브 U 워킹 풀 | ||||||
| 모듈 2 프로브 R | 다른 모듈 | DEPC 처리수 (마이크로 리터) | 총 부피 (마이크로 리터) | 프로브 U 마스터 스톡 (마이크로 리터) | DEPC 처리수 (마이크로 리터) | 총 볼륨 |
| 2 | ... | 16.5 | 2 | 14.5 | 16.5 | |
| 4 | ... | 33 | 4 | 29 | 33 | |
| 6 | ... | 49.5 | 6 | 43.5 | 49.5 | |
| 8 | ... | 66 | 8 | 58 | 66 |
표 2: 하이브리드화 코드와 프로브 R 및 프로브 U 작업 풀. 약어 : hyb = 하이브리드 화; DEPC = 디 에틸 파이로 카보네이트.
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Discussion
신경교종의 공격성에 잠재적으로 영향을 미칠 수 있는 단백질의 다양성과 이러한 단백질 중 일부가 발견되지 않은 상태로 남아 있다는 개념을 감안할 때 고처리량 단백질 정량 방법은 이상적인 기술적 접근 방식입니다. 또한 종양학 샘플의 공간 데이터가 종종 차등 발현18과 상관 관계가 있다는 점을 감안할 때 공간 프로파일링을 단백질 정량화 접근 방식에 통합하면 보다 효과적인 분석이 가능합니다.
DSP의 고처리량 접근 방식은 또한 산탄총과 같은 접근 방식으로 사용할 수 있으며, 이는 질병의 잠재적인 새로운 바이오마커 및 치료에 대한 반응을 발견하는 데 이상적입니다. 흑색종에 대한 두 연구에서 DSP는 이필리무맙 및 니볼루맙 대 니볼루맙 단독 요법19 과의 병용 요법과 이필리무맙 및 니볼루맙을 사용한 신보조 병용 요법과 표준 보조 요법20에 대한 반응을 평가하는 데 사용되었습니다. 두 연구 모두에서 치료 후 다양한 단백질 표적의 DSP 프로파일링은 주요 면역학적 마커의 차별적인 상대적 발현을 입증하여 치료 반응의 잠재적인 바이오마커에 대한 역할을 시사합니다.
DSP는 또한 복잡한 분자 수준 과정의 궁극적 인 병리학 적 중요성을 결정하는 것을 용이하게합니다. 예를 들어, 침습성 신경교종의 특징은 세포외 기질(ECM)을 통해 직접 이동하는 성향이며, 이동 경로는 종종 혈관 및 백질 관 1,2에 의해 안내됩니다. 조직 미세 환경의 단백질 발현의 다양성은 침습을 유발하는 상피에서 중간엽으로의 전이의 특징입니다. 여러 연구에서 신경교종이 매트릭스 금속단백분해효소(MMP)를 상향조절하여 주변 ECM을 파괴하고 침습성을 증가시키는 방법을 조사했습니다21,22,23. 이 차등 규제의 누적, 다운스트림 효과를 시각화하고 정량화함으로써 DSP는 광범위하고 전체적인 분석을 제공합니다.
신경 교종의 악성 잠재력의 핵심 결정 요인은 숙주 면역 방어와 상호 작용하고 조작하는 능력입니다. 다른 고형 종양과 마찬가지로 신경교종은 숙주 면역 감시를 회피하고 면역 반응을 일으키는 데 중요한 단백질의 활성화를 방해하기 위해 다양한 메커니즘을 사용합니다. 면역 종양학의 최근 발전은 종양에 의해 발현되거나 이용되는 면역 원성 단백질을 식별하는 데 중점을 두었습니다. 이러한 발전의 최전선에는 종양 용해 바이러스가 지시 될 수있는 면역 학적 활성 종양 항원을 검출하기위한 T 세포의 사용 24,25, 종양에 대한 숙주 면역을 강화하기위한 T 세포 억제 단백질 (예 : PD1 / PDL1 및 CTLA4)에 대한 체크 포인트 억제제의 개발이 있습니다 26,27 . 신경교종 미세환경에 두드러지게 나타나는 다른 기질 집단에는 대식세포, 미세혈관 내피 세포, 면역 세포 및 '신경교종 관련 기질 세포'(GASC)라고 하는 최근에 확인된 하위 집단이 포함됩니다.28. 이러한 세포와 케모카인, 사이토카인 및 ECM 성분의 상호 작용은 종양 증식, 침윤 및 치료 반응에 중요한 영향을 미치므로 DSP와 같은 기술을 통한 지역 정량화 및 비교를 위한 중요한 표적 역할을 합니다.
DSP 프로토콜은 사용자 친화적이며 여러 계층의 사용자 지정이 가능합니다. 정량화 프로세스의 대부분이 자동화됨에 따라 주요 사용자 종속 단계는 표적 검출의 가능한 가장 높은 감도와 특이성을 달성하는 데 맞춰져 있습니다. 따라서 프로토콜 내의 주요 단계에는 샘플의 초기 형광 시각화를 위한 염색 결정, ROI 묘사 및 항체 패널 선택이 포함됩니다.
염색 프로토콜을 설계할 때 먼저 기원 조직의 중요한 특성 또는 거동에 해당하는 샘플의 다양한 영역 간에 정량화 가능한 차이를 입증할 가능성이 있는 표적을 식별하는 것이 중요합니다. 다음으로 대상을 효과적으로 바인딩 할 에이전트를 선택해야합니다. 예를 들어, 증식 또는 핵 이형성의 영역을 시각화하기를 희망하는 경우, H & E 또는 핵 얼룩이 선택 될 수 있습니다. 대안적으로, 악성 또는 전악성 조직과 관련되는 것으로 알려진 유전자의 발현의 변화를 가시화하는 것을 목표로 하는 경우, 형광단-접합된 항체가 선택될 수 있다. 종양 세포 자체는 IDH1-R132H 돌연변이 종양의 경우에 특이적으로 표지될 수 있다. 본 프로토콜은 형태학적 마커로서 형광 표지된 IDH1-R132H를 첨가함으로써 변형될 수 있었다(프로토콜 단계 3.2). 샘플당 최대 4개의 얼룩을 사용할 수 있습니다. 염색된 조직의 시각화가 이루어지면 ROI가 지정됩니다. ROI의 선택은 단백질 표적 발현의 유의미한 차이가 발생할 것으로 예상되는 위치를 반영해야 합니다. ROI를 선택할 때 주요 고려 사항에는 크기(직경 10-600μm), 모양(원, 직사각형 또는 사용자 그리기) 및 분할(단일 ROI 내에서 하위 영역을 추가로 구분하여 추가 잠재적 분석 계층 제공)이 포함됩니다. 이러한 변수는 선택된 항체 패널을 기반으로 예상되는 표적 발현의 공간적 변화를 가장 효과적으로 포착하도록 최적화되어야 합니다.
항체 패널의 선택은 차등 항체 발현이 궁극적으로 연구 종점 역할을 하기 때문에 매우 중요합니다. 이 단계를 수행할 때 어떤 마커가 양성에서 침습성, 침습성 또는 악성에 이르기까지 종양 발달 스펙트럼의 단계와 양성 또는 음성으로 상관관계가 있는 발현을 나타낼 수 있는지 고려하는 것이 중요합니다. 마찬가지로 기원 조직과 종양 유형의 특성을 신중하게 고려하는 것이 중요한데, 이 두 가지 특징 모두 특정 마커의 발현에 영향을 미칠 수 있기 때문입니다.
프로세스의 대부분이 자동화되어 있기 때문에 절차의 결함은 일반적으로 하드웨어 또는 소프트웨어 오작동으로 인해 발생하며 제한된 사용자 문제 해결 기능을 제공합니다. 발생할 수 있는 문제에는 내장된 품질 관리(QC) 측정의 중단(낮은 신호 대 잡음비, 낮은 카운트 및 부적절한 표적 감지를 암시하는 데이터에 플래그를 지정하고 잠재적으로 생략하도록 설계됨), 비정상적인 소프트웨어 업데이트 및 절차적 문제(예: 다양한 단계의 조기 종료)가 포함됩니다. 이러한 문제의 경우 사용자가 제조업체에 원격 지원을 문의하는 것이 좋습니다. 대안적으로, 사용자가 내재적 데이터 문제(예를 들어, 전체적으로 낮은 핵 수, ROI 간 표현의 낮은 가변성)에 직면하는 경우, 절차의 초기 단계(예를 들어, 원래 TMA로부터 데이터 리풀링, ROI 재정의)를 반복하는 것을 고려할 수 있다. 조직 밀도의 변화를 항원 생산 및 항체 발현의 잠재적 인 혼란으로 고려하는 것도 중요합니다. 따라서 유사한 밀도의 조직은 분석을 위해 선택되는 것을 목표로해야합니다.
제어 조치는 프로토콜에 내장되어 있습니다. 이 프로그램은 형광 바코드에 대한 PC 올리고의 혼성화의 변화를 설명하는 내부 양성 및 음성 대조군을 모두 제공합니다. 하우스 키핑 단백질은 세포성을 기반으로 정상화 인자로 추가 작용할 수있는 또 다른 양성 대조군을 제공합니다.
정량화가 발생하는 ROI를 정의하는 기능은 DSP의 공간 프로파일링 기능의 기초입니다. ROI의 이러한 사용자 정의 가능한 경계는 프로토콜 내에서 중요하고 독특한 단계를 나타냅니다. 단일 세포만큼 작은 ROI를 생성하는 옵션은 단백질 또는 핵산 정량화에서 지역적 정밀도를 허용하며, 다중 분석을 통해 여러 ROI를 정의하고 그 내용을 동시에 정량화하는 기능은 고처리량 접근 방식을 산출합니다.
ROI가 신경교종 샘플 내에서 병리학적으로 구별되는 영역(예: 괴사성, 혈관주위)을 나타내도록 선택되면 단백질체학 프로파일링 및 지역 비교가 종양 전파 및 진행 메커니즘을 나타낼 수 있습니다. 예를 들어, IHC는 교모세포종 샘플에서 저산소증 유발 인자(HIF-1α) 발현을 국부적으로 정량화하는 데 사용되었으며 혈관주위 영역29에 비해 괴사 영역 근처에서 더 높은 발현을 나타냈습니다. 이것은 신경 교종의 종양 발생에서 저산소증의 역할을 나타내는 여러 연구와 일치합니다.
지역적 변이는 또한 종양 미세 환경의 면역 세포 성분 사이에서 널리 연구되었습니다. 대식세포/미세아교세포는 신경교종에서 우세한 면역 세포 집단을 구성하며 지역별로 포괄적으로 연구되었습니다. 종양 관련 대식세포(TAM)의 하위 집단은 종양 및 미세 환경 내에서의 위치에 따라 종양 진행에서 다른 역할을 하는 것으로 나타났습니다. 종양 침습성 가장자리 내의 사람들은 기저막을 파괴하여 확산을 촉진합니다. 저산소 영역에있는 사람들은 혈관 신생 효과를 발휘하여 성장을 촉진합니다. 종양 혈관계에 근접한 사람들은 EGF 및 관련 인자를 분비하여 기질 종양 세포를 혈관으로 향하게하여 전이를 유발합니다30. 이러한 중요하고 공간적으로 의존적인 특성은 암 생물학에서 지역 단백질체학 데이터의 가치를 입증하며 종양 및 그 미세 환경 내에서 면역 세포 집단의 특성화에 DSP의 중요한 추가 적용을 나타냅니다.
이 기술은 코어 항체 패널에서 사용할 수 있는 비용과 상대적으로 적은 수의 표적을 포함하여 몇 가지 제한 사항이 있습니다. 또한 DSP로는 세포 내 분해가 불가능하지만 곧 출시 될 신기술31에서는 가능할 것입니다. 이러한 한계에도 불구하고 DSP는 신경 교종 세포 생물학에서 이전에 답할 수 없었던 특정 유형의 표적화 된 질문에 대한 강력한 기술입니다. 이 혁신적인 기술은 다양한 단백질 표적의 정확한 평가를 통해 새로운 생물학적 관점을 밝힐 수 있는 특별한 기회를 제공합니다.
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Disclosures
저자는 공개 할 이해 상충이 없습니다.
Acknowledgments
저자는 다트머스 히치콕 건강 시스템의 병리학 및 실험실 의학과에서 임상 유전체학 및 첨단 기술 연구소의 지원을 인정합니다. 저자는 또한 NCI 암 센터 지원 보조금 5P30 CA023108-37과 함께 다트머스 암 센터의 병리학 공유 리소스를 인정합니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BOND Research Detection System | Leica Biosystems, Wetzlar, Germany | DS9455 | Open detection system containing open containers in a reagent tray |
| BOND Wash | Leica Biosystems, Wetzlar, Germany | AR950 | 10X concentrated buffer solution for washing fixed tissue |
| Buffer W | NanoString, Seattle, WA | contact company | Blocking reagent |
| Cy3 conjugation kit | Abcam, Cambridge, UK | AB188287 | Cy3 fluorescent antibody conjugation kit |
| GeoMx Digital Spatial Profiler (DSP) | NanoString, Seattle, WA | contact company | System for imaging and characterizing protein and RNA targets |
| GeoMx DSP Instrument BufferKit | NanoString, Seattle, WA | 100471 | Buffer kit for GeoMX DSP (including buffers for sample processing and preparation) |
| GeoMx Hyb Code Pack_Protein | NanoString, Seattle, WA | 121300401 | Controls for running GeoMX DSP experiemtns |
| GeoMx Immune Cell Panel (Imm Cell Pro_Hs) | NanoString, Seattle, WA | 121300101 | Protein module with targets for human immune cells and immuno-oncologic targets |
| GeoMx Pan-Tumor Panel (Pan-Tumor_Hs) | NanoString, Seattle, WA | 121300105 | Protein module with targets for multiple human tumor types and for markers of epithelial-mesenchymal transition |
| GeoMx Protein Slide Prep FFPE | NanoString, Seattle, WA | 121300308 | Sample preparation reagents for GeoMX DSP protein analysis |
| LEICA Bond RX | Leica Biosystems, Wetzlar, Germany | contact company | Fully automated IHC stainer |
| Master Kit--12 reactions | NanoString, Seattle, WA | 100052 | Materials and reagents for use with the nCounter Analysis system |
| nCounter Analysis System | NanoString, Seattle, WA | contact company | Automated system for multiplex target expression quantification (to be used with GeoMx DSP) |
| TMA Master II | 3DHistech Ltd., Budapest, Hungary | To create the tissue microarray block |
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