Summary
プロテオミクス調節不全は、びまん性浸潤性神経膠腫の蔓延に重要な役割を果たしますが、いくつかの関連タンパク質は未同定のままです。デジタル空間処理(DSP)は、浸潤性神経膠腫の浸潤および遊走に寄与する可能性のある候補タンパク質の発現差を特徴付けるための効率的でハイスループットなアプローチを提供します。
Abstract
びまん性浸潤性神経膠腫は、腫瘍転移の浸潤性の性質のために、高い罹患率および死亡率と関連している。それらは形態学的に複雑な腫瘍であり、腫瘍自体とその不均一な微小環境の両方にわたって高度なプロテオミクス変動性を有する。これらの腫瘍の悪性化の可能性は、細胞の安定性を維持し、微小環境の構造的完全性を維持するプロセスを含む、いくつかの重要な経路に関与するタンパク質の調節不全によって増強されます。バルクおよび単一細胞神経膠腫の解析は数多く行われていますが、これらのプロテオミクスデータの空間層別化は比較的不足しています。内因性腫瘍、浸潤端、微小環境の間の腫瘍形成因子と免疫細胞集団の空間分布の違いを理解することは、腫瘍の増殖と伝播の根底にあるメカニズムへの貴重な洞察を提供します。デジタル空間プロファイリング(DSP)は、これらの重要な多層解析の基盤を形成できる強力なテクノロジーです。
DSPは、組織標本中のユーザー指定の空間領域内のタンパク質発現を効率的に定量化する方法です。DSPは、区別領域内および領域間での複数のタンパク質の発現差を研究するのに理想的であり、複数のレベルの定量的および定性的分析を可能にします。DSPプロトコルは体系的でユーザーフレンドリーであり、プロテオミクスデータのカスタマイズされた空間分析を可能にします。この実験では、組織マイクロアレイは、アーカイブされた膠芽腫コア生検から構築されます。次に、サンプル内の目的のタンパク質を標的とする抗体のパネルが選択されます。次に、UV光切断可能なDNAオリゴヌクレオチドにプレコンジュゲートされた抗体を組織サンプルとともに一晩インキュベートします。抗体の蛍光顕微鏡による可視化下で、タンパク質発現を定量するための関心領域(ROI)がサンプルとともに定義されます。次に、UV光が各ROIに向けられ、DNAオリゴヌクレオチドが切断されます。オリゴヌクレオチドはマイクロ吸引され、各ROI内でカウントされ、対応するタンパク質を空間ベースで定量します。
Introduction
びまん性浸潤性神経膠腫は、成人の悪性脳腫瘍の最も一般的なタイプであり、常に致命的です。神経膠腫細胞が脳内で広範囲に移動する傾向は、主要な治療上の課題です。それらが広がるメカニズムには、指示された移動とチェックされていない侵入が含まれます。浸潤性グリオーマ細胞は、白質路に沿った向性と遊走を示すことが示されており1、最近の研究では、これらの管の脱髄が活性で腫瘍形成性の特徴として関与しています2。浸潤は上皮から間葉への移行によって媒介され、グリオーマ細胞は、細胞外マトリックスタンパク質および細胞接着分子をコードする遺伝子の発現を低下させ、遊走を増幅し、腫瘍微小環境を介した増殖を促進することによって間葉系特性を獲得する3,4,5。
分子レベルでは、細胞の安定性と免疫原性成分との界面を付与するいくつかのタンパク質の破壊が実証されています6。浸潤性神経膠腫は、抗アポトーシス性(PTENなど)特性を有するタンパク質の抑制を受けることが知られている7。また、宿主の免疫応答の回避を促進するタンパク質(PD1/PDL1など)を過剰発現しています8。これらの複雑な経路の調節不全は、腫瘍形成性を高め、悪性の可能性を高めます。
浸潤性神経膠腫のサンプル内で、目的は、細胞の成長、生存、増殖、および侵襲性成分と非侵襲性成分の間の微小環境構造的完全性に鍵となるタンパク質の発現差を評価することでした。さらに、能動的免疫原性の役割を持つタンパク質の異なる制御を研究し、宿主の免疫防御の損なわれが神経膠腫の増殖性および侵襲性の可能性を高めるメカニズムへの洞察を提供しようとしました。これは、悪性腫瘍の免疫マーカーと調節不全のドライバーが免疫療法の標的としてどのように役立つかを示す最近の幅広い研究を考えると、特に重要です。免疫監視と反応性に関与する多くのタンパク質の中から実行可能な治療標的を特定するには、高感度で包括的なアプローチが必要です。
研究可能な候補タンパク質が多岐にわたることから、免疫組織化学に類似し、データ処理効率を高めた方法を探しました。がん生物学の分野では、DSPはプロテオミクス解析と定量のための代替ツールよりも重要な利点を持つ強力な技術として浮上しています。DSPの特徴は、サンプル内の複数の異なるタンパク質を同時に研究できるハイスループットマルチプレックス機能であり、免疫組織化学(IHC)9,10などの標準的ではあるが低プレックス技術との重要な違いを示しています。DSPのマルチプレックス機能は、DSPとIHCを比較した研究で示されているように、定量的および分析ツールとしての忠実度を損なうことはありません。非小細胞肺癌標本のプロテオミクス定量に用いた場合、例えば、DSPはIHC11と同様の結果を有することが示されている。さらに、DSPはカスタマイズ可能な地域仕様を提供し、ユーザーはプロテオーム解析を実行する領域を手動で定義できます。これは、全セクション多重化方式10、12よりも有利である。したがって、DSPは、1回の処理で、複数の関心領域にわたる複数のタンパク質ターゲットを調査することにより、複数の分析層を提供します。
DSPは、いくつかの異なる病理学的設定でアプリケーションを持っています。DSPは、空間的変動が細胞形質転換および異なるタンパク質発現と相関する可能性があるため、腫瘍学的分析において特に有利です。例えば、DSPは、乳癌のプロテオミクスプロファイルを隣接する腫瘍微小環境と比較するために使用されている。これは、この腫瘍とその進行の自然史、および治療に対する潜在的な反応を理解する上で重要な意味を持ちます13。DSPの多様性を示す追加のコンテキストには、前立腺癌におけるタンパク質多様性の空間的定量化14、頭頸部扁平上皮癌における免疫細胞マーカー発現と疾患進行との関連15、および原発性明細胞卵巣癌から転移性を区別するタンパク質発現の上皮間葉系勾配の実証が含まれます16.DSPを実装することにより、腫瘍形成と神経膠腫の浸潤に影響を与える可能性のあるタンパク質の空間的トポグラフィーを特徴付けます。
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Protocol
以下に概説するプロトコルは、ダートマス-ヒッチコック人間研究倫理委員会のガイドラインに従います。インフォームドコンセントは、組織サンプルがこの研究に含まれた患者から得られました。このプロトコルで使用されるすべての材料、試薬、機器、およびソフトウェアに関連する詳細については、「 材料の表 」セクションを参照してください。
1. スライド準備17
- ヒト成人型びまん性浸潤性神経膠腫からホルマリン固定パラフィン包埋組織を採取または調製します。
注:この実験では、膠芽腫の3人の患者からの生検のパラフィン包埋ブロックが使用されました。 - 組織マイクロアレイ(TMA)ブロックを作成します。各生検からいくつかの2 mmコアを取り出し、それらを単一のTMAブロックに入れます(図1、上)。TMAブロックから切片を4 μmで切り取り、スライドガラスに取り付けます。各スライドをスライドホルダーガスケットの内側に配置します。スライドを60°Cで30分間インキュベートします。
2. 半自動IHCシステムの準備とソフトウェア構成(スライドのロードと実行用)17
- 試薬をセットアップします。試薬のセットアップボタンをクリックします。[セットアップ] タブの [追加] をクリックします。
- 洗浄バッファーを登録するには、[名前] フィールドに名前を入力します。[タイプ] フィールドで [補助] を選択します。[保存]をクリックします。
- 上記と同じ手順を繰り返してブロッキング溶液を登録します(必要に応じて、名前フィールドなどを変更します)が、[タイプ]フィールドで[一次抗体]を選択します。デフォルト染色プロトコルとデフォルトHIERプロトコルのドロップダウンボックスで目的のプロトコルを選択します。必要に応じて、デフォルトの酵素プロトコルオプションを選択します(現在のプロトコルでは、このボックスは空白のままでした)。[保存]をクリックします。
- バーコード化された試薬容器トレイで構成される検出システムを登録します。バーコードをスキャンします。
- 「研究用試薬システムの追加」ウィンドウで試薬システムの詳細の入力を開始します。検出システムの名前を入力します。
- 有効期限を入力します。試薬チャートの最初の行を強調表示し、新しい30 mL試薬容器のバーコードをスキャンすると、バーコードが行1に入力されます。
- 検出システムのポジション1にコンテナを置きます。試薬列のドロップダウンボックスで洗浄バッファーの名前を選択し、追加をクリックします。これらの手順を繰り返して、ブロッキング溶液を含む後続の行に試薬を追加します。
- IHCのタンパク質プロトコルを設定します。[プロトコルのセットアップ]をクリックします。目的のプロトコルに対応する行を強調表示し、[コピー]をクリックします。名前を入力し、[プロトコルのプロパティの編集]ウィンドウで他の関連フィールドに入力します。
- [洗浄ステップを表示]のボックスを選択します。各試薬のInc(分)フィールドとディスペンスタイプフィールドが正しいことを確認します(ブロッキング溶液の場合は10分、洗浄バッファーの場合は0分、各ディスペンスタイプの場合は150 μL)。 [保存]をクリックします。
- 研究を準備します。位置1の容器に 洗浄バッファーを入れます。スライドあたり150 μL、デッドボリューム5 mLを満たします。蓋を開けたままにします。 ブロックソリューションで満たされている位置2のコンテナに対して、これらの手順を繰り返します。この容器には、スライドあたり150μL、デッドボリューム350μLが必要です。
- 試薬容器トレイを機械にロードします。システムがコンテナ認識とボリューム確認の手段を実行できるようにします。スライド設定|をクリックしますスタディを追加します。試験IDと試験名を入力し、分注容量|で150 μLを選択します。[準備プロトコル]ドロップダウンの目的のプロトコル(ベイクとデワックスが推奨されます)。調査を強調表示し、[スライドの追加]をクリックします。
- 組織タイプでテスト組織を選択します | 分注容量|の下で150 μL 単一およびルーチンを染色モードドロップダウンボックスから選択します。工程(現在の試験のIHC)を選択します|[マーカー] フィールドのドロップダウン ボックスの [ブロック ソリューション名] |[プロトコル]タブの[染色]フィールドにあるIHC DSPプロトコル| *準備のためのベイクとデワックス| *HIERのER1で20分。[酵素] フィールドは空白のままにします。
- スライドごとにこのプロセスを繰り返します。完了したら[ 閉じる ]をクリックし、[ ラベルの印刷]をクリックします。 現在のスタディでまだ印刷されていないすべてのスライドラベル をチェックし、 印刷をクリックします。スライドの上部にラベルを貼り付けます。
- スライドを読み込んで実行します。スライドをスライドトレイにセットし、サンプルとラベルが上向きであることを確認します。 カバータイル をスライドの上に置き、スライドの下部にタブがあることを確認します。スライドトレイを機器にセットします。
- LEDボタンを押してトレイを下げ、機器がスライドのスキャンと認識を開始できるようにします。[開始] ボタンをクリックして、実験を開始します。
- 実験を終了します。 LED ボタンが緑色に点滅したら押して、実行が完了したことを示します。トレイを機器から取り外し、各スライドからカバータイルを慎重に持ち上げます。スライドを1xリン酸緩衝生理食塩水(PBS)に入れ、余分な緩衝液を取り除き、疎水性ペンで各組織切片の輪郭を描き、疎水性バリアを作成します。
3. 抗体インキュベーションと核染色17
- 目的の抗原を局在化するための抗体のパネルを選択します(この実験で使用した抗体については 表1 を参照してください)。
注:各抗体は、それを一意に識別するUV光切断性セグメント(PCオリゴ)を持つDNAオリゴヌクレオチドにすでに結合されています(インデックスオリゴ、 図2)。 - パネルに各スライドに8 μLの各抗体(1:40希釈)を加えて、有効な抗体-PC-オリゴ溶液を作ります。ブロッキング試薬を希釈剤として使用して、各スライドの最終容量200 μLに到達します。4°Cで一晩インキュベートします(図3、ステップ1)。
注:このステップでは、形態マーカー、生物学的色素、または蛍光標識抗体も溶液に添加できます。 - 翌日、スライドをコプリンジャーに入れ、1x TBS-Tで3 x 10分洗浄します。室温で4%パラホルムアルデヒドに30分間ポストフィックスした後、1x TBS-Tで2 x 5分間ポストフィックスします。
- SYTO13核染色剤(1x TBSで1:10に希釈)を室温で15分間加えます。1x TBS-Tで2回洗浄してから、スライドを1x TBS-Tに保管します。
4. DSP装置での蛍光可視化、ROI同定、UVフォトカット17
- コントロールセンターの データ収集 の上にマウスを置いた後、[ 新規/実行の続行]を選択します。
- スライドをスライドホルダーに置き、ラベルをユーザーの方に向けて配置します。スライドトレイクランプを下げ、細長いウィンドウに組織が見えるようにします。 6 mLのバッファーSを追加します。
- コントロールセンターのプロンプトに従います。XスライダーとYスライダーで異なる軸間をズームし、スキャンする領域を描きます。[スキャン] を選択します。定義されたターゲット領域全体が画像化されるまで、スキャンを続行します。
- 20 倍の画像を生成します。ROIを自動または手動で定義します(図3、ステップ2)。このプロトコルに従うには、各組織コアに3つの等しいサイズの円形ROI(直径250 μm)を選択します(図4、下)。
注:ROIはサイズと形状をカスタマイズできます。各セクション内で複数のROIを選択できます。この実験では、循環 ROI を手動で定義します。 - ROI を承認するには、[ スキャン ワークスペースの終了 ] ボタンをクリックします。UV光が抗体からオリゴを切断するのを待ちます。
- クリーニング機器のプロセスが完了したら、[新しいデータ収集]を選択して、現在のスライドまたはプレートを続行します。それ以外の場合は、[スライドとマイクロプレートの削除] を選択します。
- コントロールセンターの右下にあるプレートアイコン領域をダブルクリックして、[プレートのファイナライズ]ウィンドウを開きます。ハイブリダイゼーション(Hyb)コードパックのロット番号(#)がわかっている場合は、番号を入力して[更新]をクリックします(この手順ではオプション)。[確定]をクリックします。
- プロンプトに従って、スライドホルダーと収集プレートを取り外します。スライドをTBS-Tに保存します。スライドを長期間使用しない場合は、水性媒体とカバーガラスで覆います。
5. タンパク質読み出し17
- 透過性シールを使用し、上部を開いた状態でサーマルサイクラーで65°Cで吸引液を乾燥させます。7μLのジエチルピロカーボネート処理水を加えて混合する。RTで10分間インキュベートした後、すばやくスピンダウンします。
- 表2から適切なプローブRおよびプローブUの式を選択して、プローブ/バッファーミックスの作成をガイドします。本実験におけるハイブリダイゼーションに必要なHybコードの数に基づいて、式(1)を以下のように適用する。すばやく混ぜてスピンダウンします。
# Hyb コード プローブ R ワーキングプール プローブ U ワーキングプール ハイブリダイゼーションバッファー n = _______ (n × 8 μL) = ______ μL + (n × 8 μL) = ______ μL + (n × 80 μL) = _____ μL (1) - 使用する各Hybコードパックに84 μLのプローブ/バッファーミックスを追加します。フリックしてミックスし、スピンダウンします。新鮮な96ウェルハイブリダイゼーションプレートで、各Hyb Codeマスターミックス8 μLを、示された行の12ウェルすべてに追加します。
- DSP収集プレートからハイブリダイゼーションプレート内の対応するウェルに7 μLを移します。穏やかに混ぜる。ヒートシールしてすばやく回転させます。その後、67°Cで一晩インキュベートします。 プレートを氷上で冷却し、すばやく回転させます。
- 各ウェルのhyb製品をストリップチューブにプールし、各ウェルを5倍に穏やかにパイプして混合します。ストリップチューブにキャップをしてスピンダウンします。プールされていない残りのhyb製品を-80°Cで凍結します。 ストリップチューブを分析システムにロードします。
- CDFファイルをUSBドライブに保存し、DSP計測器からデジタルアナライザにデータを転送します。次の手順を実行して、セットアップを完了します。
- 消耗品とプールされたサンプルを準備ステーションにロードします。画面で、[ 処理の開始]を押します。[ 高感度]、[ 次へ] の順に選択します。[ すべて選択] を押して、サンプルを含むウェルの数を表示します ||を終えるメール通知|の次 スタート。
- 準備ステーションが完了したら、カートリッジを密封してデジタルアナライザに移します。カウント 開始を押し、 ステージ位置を選択し、既存のCDFファイルを ロード を押して、以前にアップロードしたファイルを選択します。 [完了]を押し、ステージ位置をもう一度選択し、[ 完了]を押します| プログラムの実行を開始します。
- 解析システムからのレポーターカウント変換ファイルのzipファイルをUSBドライブに保存し、DSPマシンに挿入します。 DSPコントロールセンターで、[ データ収集]にカーソルを合わせ、[ アップロード数]をクリックします。関連する zip ファイルを選択します。
6.データ分析17
- DSPコントロールセンターの[レコード]をクリックします。キュー内のスキャンを表示するには、「選択したスキャンをキューに追加」を選択します|自分の分析キュー。コントロールセンターのデータ分析オプションにカーソルを合わせた後、キューから新しいスタディを選択します。
- タスクバーのオプションからQCを選択します。デフォルト値で続行するか、必要に応じて調整します。[QC の実行] を選択し、結果グリッドを確認します。[QCの実行]をクリックして続行し、新しいデータセットを作成し、値をポジティブハイブリダイゼーションコントロールに正規化します。
- 新しいタグを XLSX ファイルにインポートします。「スキャン」ペインで「アノテーションの管理」を選択し、テンプレートをダウンロードしてタグを挿入し、ファイルをインポートします。
- オプション: QC を実行した後、他のツールバー オプションを使用してデータをさらに調整します。 [視覚化 ] ウィンドウのツールを使用して、変換されたデータをプロットします。
- パラメータの灰色のドロップダウンボックスに移動して、 視覚化 ペインの各プロットを作成します。プロット内の特定の領域を選択して、対応するハイライトされたセグメントを スキャン ペインで視覚化し、右クリックしてタグまたはグループを生成します。 データセットサマリー内で、 正規化、 スケーリング、およびその他の分析と表示のオプションからプロットを確認します。
- ビジュアライゼーションを保存するには、 保存するアイコンを選択します。 [概要] に既に保存されているビジュアライゼーションを確認します。[ エクスポート] (.svg) ボタンを選択して、ビジュアリゼーションを.svg形式でエクスポートします。ビジュアリゼーションの基になるデータをエクスポートするには 、[エクスポート] (.xlsx) ボタンをクリックします。特定のデータセットに含まれるすべてのデータをエクスポートするには、2 番目のペインのデータセット名の上にカーソルを置き、 エクスポート アイコンをクリックします。
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Representative Results
図4 は、膠芽腫のサンプルに対して実施されたDSP実験の代表的な結果を示す。ヒートマップが表示され、DSPソフトウェアを使用してデータを視覚的にキャプチャする方法の1つが示されています。行はタンパク質ターゲットを表し、各列は関心領域に対応します。青から赤の色の範囲は、それぞれ低表現から高表現を示します。列内の色のばらつきは、地域のタンパク質の不均一性を反映しており、タンパク質発現の違いとの空間的関連の可能性を示唆しています。例えば、本実験では、S100とCD56は神経マーカーであるため普遍的に高い。
最も変動性の高いマーカーには、B7-H3、Ki-67、CD44、およびフィブロネクチンが含まれていました。これらのマーカーは、それぞれ腫瘍の増殖、遊走、および転移と重要な関連があります。したがって、悪性コア、悪性浸潤、および非悪性組織のサンプル間で地域変動を示すことは合理的です。数値データ表現も可能です。ROI内の各タンパク質マーカーの発現値を表形式で含むファイルは、数学的および統計的分析のためにエクスポートできます。この発現値は、DSPを介して利用可能なデジタルカウント機能によって生成され、各ROI内の微量吸引PCオリゴを定量化します(図1 および 図2)。
図1:膠芽腫生検からの組織マイクロアレイにおける関心領域の定義。 上、ヘマトキシリンおよびエオジン染色切片は、合計3人の膠芽腫患者からの直径2mmのコア生検数個を含む組織マイクロアレイの。下段は、蛍光画像上に定義された関心領域である。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図2:光分解可能なオリゴヌクレオチド。 タンパク質またはRNA標的用の抗体またはアンチセンスオリゴヌクレオチドプローブは、それぞれ、光分解可能なリンカーを有するオリゴヌクレオチドに共有結合で連結されている。組織切片はプローブで染色されます。次に、UV光がROIに向けられてPCオリゴが放出され、デジタルカウントされます。この図は、シュプリンガーネイチャー(著作権2020)の許可を得て、9から変更されました。略語:PC-オリゴ=光分解性オリゴヌクレオチド;ROI = 関心領域。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図3:DSPの手順 。 1)組織処理:組織スライドをオリゴ結合抗体またはRNAプローブで染色します。2)ROIの選択:組織スライドが画像化され、ROIが特定の蛍光パターンに基づいて手動または自動で描写されます。3)コンジュゲートオリゴヌクレオチドの切断:UV光がROIに向けられ、光切断可能なオリゴヌクレオチドが切断されます。4)PCオリゴ収集:PCオリゴをマイクロキャピラリーチューブに吸引します。5)めっき:吸引したPCオリゴをマイクロタイタープレートに堆積させる。6)繰り返し:ROIごとに手順3〜5が繰り返されます。各サイクルの間に、細心の注意を払った洗浄が行われます。7)定量化:空間的に分解されたPC-オリゴのプールは、蛍光バーコードにハイブリダイズできます。これにより、ROIごとに最大約100万のバインディングイベントのデジタルカウントが可能になります。あるいは、PC-オリゴは、マイクロタイタープレート全体を単一のチューブにプールして配列決定するNGS を介して 定量することができます。次に、リードはデジタルカウントに変換され、元のROIにマッピングされ、各組織セクション内のタンパク質またはRNA発現の視覚的なマップが作成されます。この図は、シュプリンガーネイチャー(著作権2020)の許可を得て、9から変更されました。略語:DSP =デジタル空間処理。PCオリゴ=光分解可能なオリゴヌクレオチド;ROI = 関心領域。NGS = 次世代シーケンシング。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図4:DSP実験の代表的なヒートマップ 列は、個々の関心領域を表します。行はタンパク質ターゲットを表す。低発現は青で示され、高発現は赤で示されます。略称: DSP = デジタル空間処理。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
| GeoMx免疫細胞プロファイリング-ヒト | 汎腫瘍モジュール |
| PD-1 | マルト1 |
| CD68 | ニューヨーク-ESO-1 |
| HLA-DR | S100B |
| キ-67 | Bcl-2 |
| ベータ2ミクログロブリン | エプカム |
| CD11c | ハー2 |
| CD20 | ティッカー |
| CD3 | ERアルファ |
| CD4 | 広報 |
| CD45 | |
| CD56 | |
| CD8 | |
| CTLA4 | |
| ティッカー | |
| PD-L1 | |
| パンク | |
| ティッカー | |
| フィブロネクチン | |
| Rb IgG | |
| IgG1さん | |
| IgG2a さん | |
| ヒストンH3 | |
| S6 | |
| ギャップ |
表1:事前に設計された抗体パネルを使用して評価できるタンパク質の代表的なサンプル。
| プローブ U 作業プール | ||||||
| モジュール 2 プローブ R | その他のモジュール | DEPC処理水(マイクロリットル) | 総容量(マイクロリットル) | プローブUマスターストック(マイクロリットル) | DEPC処理水(マイクロリットル) | 総量 |
| 2 | ... | 16.5 | 2 | 14.5 | 16.5 | |
| 4 | ... | 33 | 4 | 29 | 33 | |
| 6 | ... | 49.5 | 6 | 43.5 | 49.5 | |
| 8 | ... | 66 | 8 | 58 | 66 |
表2:ハイブリダイゼーションコードとプローブRおよびプローブUワーキングプール。 略語:hyb =ハイブリダイゼーション;DEPC = ピロ炭酸ジエチル。
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Discussion
神経膠腫の攻撃性に影響を与える可能性のあるタンパク質の多様性と、これらのタンパク質のいくつかが未発見のままであるという考えを考えると、ハイスループットタンパク質定量法は理想的な技術的アプローチです。さらに、腫瘍学的サンプル中の空間データは示差的発現18と相関することが多いため、空間プロファイリングをタンパク質定量アプローチに組み込むことで、より効果的な分析が可能になります。
DSPのハイスループットアプローチにより、ショットガンのようなアプローチでの使用も可能になり、疾患や治療への反応の潜在的な新しいバイオマーカーを発見するのに理想的です。黒色腫に関する2件の研究では、DSPを使用して、イピリムマブとニボルマブの併用療法とニボルマブ単剤療法の比較19 、およびイピリムマブとニボルマブのネオアジュバント併用療法と標準的なアジュバント療法に対する反応を評価しました20。どちらの研究でも、治療後のさまざまなタンパク質標的のDSPプロファイリングは、主要な免疫学的マーカーの異なる相対的発現を示し、治療反応の潜在的なバイオマーカーの役割を示唆しています。
DSPはまた、複雑な分子レベルのプロセスの究極の病理学的意義の決定を容易にします。例えば、浸潤性神経膠腫の特徴は、細胞外マトリックス(ECM)を直接移動する傾向であり、それらの移動経路はしばしば血管および白質路によって導かれる1,2。組織の微小環境のタンパク質発現の変動性は、浸潤を促進する上皮から間葉への移行の特徴です。いくつかの研究では、神経膠腫がマトリックスメタロプロテイナーゼ(MMP)をアップレギュレートし、周囲のECMが破壊され、侵襲性が増加する方法を調べています21,22,23。DSPは、この差動規制の累積的な下流効果を視覚化および定量化することにより、広範囲で包括的な分析を提供します。
神経膠腫の悪性の可能性の重要な決定要因は、宿主の免疫防御と相互作用し、操作する能力です。他の固形腫瘍と同様に、神経膠腫はさまざまなメカニズムを採用して宿主の免疫監視を回避し、免疫応答の開始に不可欠なタンパク質の活性化を破壊します。免疫腫瘍学における最近の進歩は、腫瘍によって発現または利用される免疫原性タンパク質の同定に焦点を合わせています。これらの開発の最前線にあるのは、腫瘍溶解性ウイルスを標的とする免疫学的に活性な腫瘍抗原を検出するためのT細胞の使用24,25、および腫瘍に対する宿主免疫を増強するためのT細胞阻害タンパク質(PD1 / PDL1およびCTLA4など)に対するチェックポイント阻害剤の開発です26,27。.神経膠腫微小環境に顕著に現れる他の間質集団には、マクロファージ、微小血管内皮細胞、免疫細胞、および「神経膠腫関連間質細胞」(GASC)と呼ばれる最近特定された亜集団が含まれます28。これらの細胞とケモカイン、サイトカイン、およびECMの成分との相互作用は、腫瘍の増殖、浸潤、および治療への反応に重要な意味を持ち、DSPなどの技術による局所定量と比較の重要な標的として機能します。
DSPプロトコルはユーザーフレンドリーで、複数のレイヤーのカスタマイズが可能です。定量プロセスの多くは自動化されているため、ユーザーに依存する主なステップは、ターゲット検出の可能な限り最高の感度と特異性を達成することを目的としています。したがって、プロトコル内の重要なステップには、サンプルの初期蛍光可視化のための染色の決定、ROIの描写、および抗体パネルの選択が含まれます。
染色プロトコルを設計する際には、まず、起源組織の重要な特性または挙動に対応する、サンプルのさまざまな領域間の定量化可能な違いを示す可能性が高いターゲットを特定することが重要です。次に、ターゲットを効果的にバインドするエージェントを選択する必要があります。たとえば、過形成または核異型の領域を視覚化したい場合は、H&Eまたは核染色を選択できます。あるいは、悪性または前癌組織に関連することが知られている遺伝子の発現の変化を可視化することを目指す場合は、蛍光色素標識抗体が選択され得る。IDH1-R132H変異型腫瘍の場合、腫瘍細胞自体を特異的に標識することができる。本プロトコルは、形態学的マーカーとして蛍光標識されたIDH1−R132Hを添加することによって改変され得る(プロトコルステップ3.2)。サンプルごとに最大4つの染色を使用できます。染色された組織の視覚化が行われると、ROIが指定されます。ROIの選択は、タンパク質の標的発現に有意差が生じると予想される場所を反映する必要があります。ROIを選択する際の重要な考慮事項には、サイズ(直径10〜600 μm)、形状(円、長方形、またはユーザー描画)、およびセグメンテーション(単一のROI内のサブ領域をさらに境界付け、追加の潜在的な分析レイヤーを提供する)が含まれます。これらの変数は、選択された抗体パネルに基づいて予想される標的発現の空間的変動を最も効果的に捕捉するように最適化されるべきである。
抗体パネルの選択は、抗体差差発現が最終的に研究の終点となるため、非常に重要です。このステップを実行する場合、どのマーカーが、良性から前浸潤性、侵襲性または悪性まで、腫瘍発生のスペクトルに沿った段階と正または負のいずれかに相関する発現を示す可能性があるかを考慮することが重要です。これらの特徴の両方が特定のマーカーの発現に影響を与える可能性があるため、起源の組織と腫瘍の種類の両方の特性を慎重に検討することも同様に重要です。
プロセスの多くは自動化されているため、手順の欠陥は通常、ハードウェアまたはソフトウェアの誤動作が原因であり、ユーザーのトラブルシューティング機能は限られています。発生する可能性のある問題には、組み込みの品質管理(QC)測定の中断(信号対雑音比が低い、カウントが少ない、ターゲット検出が不十分であることを示唆するデータにフラグを立て、潜在的に省略するように設計されています)、異常なソフトウェアアップデート、および手順の問題(さまざまなステップの早期終了など)が含まれます。これらの問題については、ユーザーがリモート サポートについて製造元に問い合わせることをお勧めします。あるいは、ユーザーが固有のデータの問題(例えば、全体的な核数が少ない、ROI間の発現の変動性が低い)に遭遇した場合、手順の前のステップを繰り返すことを検討できます(例えば、元のTMAからのデータの再プール、ROIの再定義)。組織密度の変動を抗原産生、ひいては抗体発現の潜在的な交絡因子として考慮することも重要です。したがって、同様の密度の組織は、分析のために選択されることを目指すべきである。
制御手段はプロトコルに組み込まれています。このプログラムは、蛍光バーコードへのPCオリゴのハイブリダイゼーションの変動を説明する内部ポジティブコントロールとネガティブコントロールの両方を提供します。ハウスキーピングタンパク質は、細胞性に基づいて正規化因子としてさらに役立つことができる別のポジティブコントロールを提供します。
定量化が発生するROIを定義する機能は、DSPの空間プロファイリング機能の基盤です。ROIのこのカスタマイズ可能な境界は、プロトコル内の重要で特徴的なステップを示しています。単一細胞と同じくらい小さいROIを作成するオプションにより、タンパク質または核酸の定量における領域精度が可能になり、複数のROIを定義し、マルチプレックス分析を通じてそれらの含有量を並行して定量できるため、ハイスループットアプローチが得られます。
神経膠腫サンプル内の病理学的に異なる領域(壊死、血管周囲など)を表すためにROIが選択されている場合、プロテオミクスプロファイリングと地域比較により、腫瘍の伝播と進行のメカニズムが明らかになる可能性があります。例えば、IHCは、膠芽腫サンプルにおける低酸素誘導因子(HIF-1α)発現を局所的に定量するために使用されており、血管周囲領域と比較して壊死領域付近でより高い発現を明らかにしています29。これは、神経膠腫の腫瘍形成における低酸素症の役割を示すいくつかの研究と一致しています。
腫瘍微小環境の免疫細胞成分間の地域変動も広く研究されている。マクロファージ/ミクログリアは、神経膠腫の主要な免疫細胞集団を構成し、地域ベースで包括的に研究されています。腫瘍関連マクロファージ(TAM)の亜集団は、腫瘍内の位置および微小環境に応じて、腫瘍の進行において異なる役割を果たすことが示されています。腫瘍浸潤性エッジ内のものは基底膜を破壊し、広がりを促進します。低酸素地域の人々は血管新生効果を発揮し、成長を促進します。腫瘍血管系に近接しているものは、EGFおよび関連因子を分泌して間質腫瘍細胞を血管に向け、転移を引き起こす30。これらの重要な空間依存特性は、がん生物学における局所プロテオミクスデータの価値を実証し、腫瘍とその微小環境内の免疫細胞集団の特性評価へのDSPの重要な追加アプリケーションを表しています。
この技術には、コストやコア抗体パネルで利用可能なターゲットの数が比較的少ないなど、いくつかの制限があります。また、DSPでは細胞内分解能は不可能ですが、今後の新技術では可能になります31。これらの制限にもかかわらず、DSPは、グリオーマ細胞生物学における特定のタイプの標的化された、以前は答えられなかった質問に対する強力な技術です。この革新的な技術は、さまざまなタンパク質標的の正確な評価を通じて、新しい生物学的視点を発見するための特別な機会を提供します。
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Disclosures
著者は開示する利益相反を持っていません。
Acknowledgments
著者らは、ダートマスヒッチコックヘルスシステムの病理学および検査医学部門の臨床ゲノミクスおよび先端技術研究所の支援を認めています。著者らはまた、ダートマスがんセンターの病理学共有リソースとNCIがんセンターサポート助成金5P30 CA023108-37を認めています。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BOND Research Detection System | Leica Biosystems, Wetzlar, Germany | DS9455 | Open detection system containing open containers in a reagent tray |
| BOND Wash | Leica Biosystems, Wetzlar, Germany | AR950 | 10X concentrated buffer solution for washing fixed tissue |
| Buffer W | NanoString, Seattle, WA | contact company | Blocking reagent |
| Cy3 conjugation kit | Abcam, Cambridge, UK | AB188287 | Cy3 fluorescent antibody conjugation kit |
| GeoMx Digital Spatial Profiler (DSP) | NanoString, Seattle, WA | contact company | System for imaging and characterizing protein and RNA targets |
| GeoMx DSP Instrument BufferKit | NanoString, Seattle, WA | 100471 | Buffer kit for GeoMX DSP (including buffers for sample processing and preparation) |
| GeoMx Hyb Code Pack_Protein | NanoString, Seattle, WA | 121300401 | Controls for running GeoMX DSP experiemtns |
| GeoMx Immune Cell Panel (Imm Cell Pro_Hs) | NanoString, Seattle, WA | 121300101 | Protein module with targets for human immune cells and immuno-oncologic targets |
| GeoMx Pan-Tumor Panel (Pan-Tumor_Hs) | NanoString, Seattle, WA | 121300105 | Protein module with targets for multiple human tumor types and for markers of epithelial-mesenchymal transition |
| GeoMx Protein Slide Prep FFPE | NanoString, Seattle, WA | 121300308 | Sample preparation reagents for GeoMX DSP protein analysis |
| LEICA Bond RX | Leica Biosystems, Wetzlar, Germany | contact company | Fully automated IHC stainer |
| Master Kit--12 reactions | NanoString, Seattle, WA | 100052 | Materials and reagents for use with the nCounter Analysis system |
| nCounter Analysis System | NanoString, Seattle, WA | contact company | Automated system for multiplex target expression quantification (to be used with GeoMx DSP) |
| TMA Master II | 3DHistech Ltd., Budapest, Hungary | To create the tissue microarray block |
References
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