Summary
Proteomisk dysregulering spiller en viktig rolle i spredningen av diffust infiltrerende gliomer, men flere relevante proteiner forblir uidentifiserte. Digital romlig prosessering (DSP) tilbyr en effektiv, høy gjennomstrømningsmetode for å karakterisere differensialuttrykket av kandidatproteiner som kan bidra til invasjon og migrasjon av infiltrative gliomer.
Abstract
Diffust infiltrerende gliomer er forbundet med høy morbiditet og dødelighet på grunn av den infiltrative karakteren av tumorspredning. De er morfologisk komplekse svulster, med en høy grad av proteomisk variabilitet over både selve svulsten og dens heterogene mikromiljø. Det ondartede potensialet til disse svulstene forbedres av dysreguleringen av proteiner involvert i flere viktige veier, inkludert prosesser som opprettholder cellulær stabilitet og bevarer mikromiljøets strukturelle integritet. Selv om det har vært mange bulk- og encellede gliomanalyser, er det en relativ mangel på romlig stratifisering av disse proteomiske dataene. Å forstå forskjeller i romlig fordeling av tumorogene faktorer og immuncellepopulasjoner mellom den indre svulsten, invasiv kant og mikromiljø gir verdifull innsikt i mekanismene som ligger til grunn for tumorproliferasjon og forplantning. Digital romprofilering (DSP) representerer en kraftig teknologi som kan danne grunnlaget for disse viktige flerlagsanalysene.
DSP er en metode som effektivt kvantifiserer proteinuttrykk innenfor brukerspesifiserte romlige regioner i en vevsprøve. DSP er ideell for å studere differensialuttrykket av flere proteiner innenfor og på tvers av skilleregioner, noe som muliggjør flere nivåer av kvantitativ og kvalitativ analyse. DSP-protokollen er systematisk og brukervennlig, noe som muliggjør tilpasset romlig analyse av proteomiske data. I dette eksperimentet er vevsmikromatriser konstruert fra arkiverte glioblastomkjernebiopsier. Deretter velges et panel av antistoffer, rettet mot proteiner av interesse i prøven. Antistoffene, som er prekonjugert til UV-fotospaltbare DNA-oligonukleotider, inkuberes deretter med vevsprøven over natten. Under fluorescensmikroskopi visualisering av antistoffene, regioner av interesse (ROIs) innenfor hvilke å kvantifisere proteinuttrykk er definert med prøvene. UV-lys blir deretter rettet mot hver avkastning, og spalter DNA-oligonukleotidene. Oligonukleotidene mikroaspireres og telles innenfor hver avkastning, og kvantifiserer det tilsvarende proteinet på romlig basis.
Introduction
Diffust infiltrerende gliomer er den vanligste typen ondartet hjernesvulst hos voksne og er alltid dødelig. Tilbøyeligheten til gliomceller til å migrere mye i hjernen er en stor terapeutisk utfordring. Mekanismen som de sprer innebærer rettet migrasjon og ukontrollert invasjon. Invasive gliomceller har vist seg å utvise tropisme og migrasjon langs hvite substanskanaler1, med nyere forskning som impliserer demyelinisering av disse kanalene som en aktiv, protumorigen funksjon2. Invasjon er mediert av en epitel-til-mesenkymal overgang, hvor gliomceller oppnår mesenkymale egenskaper ved å redusere uttrykket av gener som koder for ekstracellulære matriksproteiner og celleadhesjonsmolekyler, forsterker migrasjon og letter forplantning gjennom tumormikromiljøet 3,4,5.
På molekylært nivå erdet påvist forstyrrelse av flere proteiner som gir cellulær stabilitet og grensesnitt med immunogene komponenter. Infiltrative gliomer er kjent for å gjennomgå undertrykkelse av proteiner med anti-apoptotiske (f.eks. PTEN) egenskaper7. De overuttrykker også proteiner som fremmer unnvikelse av vertsimmunresponsen (f.eks. PD1 / PDL1)8. Dysreguleringen av disse komplekse banene forbedrer tumorigenitet og øker ondartet potensial.
Innenfor prøver av invasive gliomer var målet å evaluere differensialuttrykket av proteiner som er nøkkelen til cellevekst, overlevelse og spredning, og til mikromiljøets strukturelle integritet mellom invasive og ikke-invasive komponenter. I tillegg søkte vi å studere differensialreguleringen av proteiner med en aktiv immunogen rolle, og ga innsikt i mekanismen der kompromittert vertsimmunforsvar kan forbedre det proliferative og invasive potensialet til gliomer. Dette er spesielt relevant gitt den siste bredden av forskning som viser hvordan immunmarkører og drivere for dysregulering i malignitet kan tjene som mål for immunterapi. Å identifisere levedyktige terapeutiske mål blant de mange proteinene som er involvert i immunovervåkning og reaktivitet krever en svært sensitiv og omfattende tilnærming.
Gitt det brede utvalget av kandidatproteiner som kan studeres, søkte vi en metode som ligner på immunhistokjemi, men med forbedret databehandlingseffektivitet. Innen kreftbiologi har DSP dukket opp som en kraftig teknologi med viktige fordeler i forhold til alternative verktøy for proteomisk analyse og kvantifisering. Kjennetegnet ved DSP er dens høykapasitetsmultipleksingsevne, noe som muliggjør samtidig studier av flere forskjellige proteiner i en prøve, og markerer et viktig skille fra standard, men lavere plex-teknologier som immunhistokjemi (IHC) 9,10. Multiplex-funksjonen til DSP kompromitterer ikke dens troskap som et kvantitativt og analytisk verktøy, som demonstrert av studier som sammenligner DSP med IHC. Når det brukes til proteomisk kvantifisering av ikke-småcellede lungekreftprøver, har DSP for eksempel vist seg å ha lignende resultater som IHC11. I tillegg tilbyr DSP tilpassbar regional spesifikasjon, der brukere manuelt kan definere regioner innenfor hvilke de skal utføre proteomisk analyse. Dette gir en fordel i forhold til helseksjonsmultipleksmetoder10,12. I en enkelt runde med behandling tilbyr DSP dermed flere lag med analyse ved å kartlegge flere proteinmål på tvers av flere interesseområder.
DSP har applikasjoner i flere forskjellige patologiske innstillinger. DSP er spesielt fordelaktig i onkologisk analyse, da romlig variasjon kan korrelere med cellulær transformasjon og differensial proteinuttrykk. For eksempel har DSP blitt brukt til å sammenligne den proteomiske profilen til brystkreft med det tilstøtende tumormikromiljøet. Dette har viktige implikasjoner for å forstå den naturlige historien til denne svulsten og dens progresjon, samt potensiell respons på behandling13. Ytterligere kontekster som illustrerer allsidigheten til DSP inkluderer romlig kvantifisering av proteindiversitet i prostatakreft14, assosiasjon av immuncellemarkøruttrykk med sykdomsprogresjon i hode- og nakkeplateepitelkarsinom 15, og demonstrasjon av en epitel-mesenkymal gradient av proteinuttrykk som skiller metastatisk fra primær klarcellet eggstokkreft16 . Ved å implementere DSP karakteriserer vi den romlige topografien til proteiner som kan påvirke tumorigenese og invasjon av gliomer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Protokollen som er skissert nedenfor følger retningslinjene til Dartmouth-Hitchcock Human Research Ethics Committee. Informert samtykke ble innhentet fra pasientene som fikk vevsprøver inkludert i denne studien. Se delen Materialtabell for detaljer knyttet til alle materialer, reagenser, utstyr og programvare som brukes i denne protokollen.
1. Lysbilde forberedelse17
- Hent eller klargjør formalinfast, parafin-innebygd vev fra humane voksne type diffust infiltrerende gliomer.
MERK: I dette eksperimentet ble paraffin-innebygde blokker av biopsier fra tre pasienter med glioblastom brukt. - Lag en tissue microarray (TMA) blokk. Ta flere 2 mm kjerner fra hver biopsi og legg dem i en enkelt TMA-blokk (figur 1, øverst). Klipp seksjoner fra TMA-blokken ved 4 μm og monter på glassglass. Plasser hvert lysbilde inne i lysbildeholderpakningen. Inkuber lysbildet ved 60 °C i 30 minutter.
2. Halvautomatisk IHC-systemforberedelse og programvarekonfigurasjon (for lasting og kjøring av lysbilder)17
- Sett opp reagensene. Klikk på Reagent Setup-knappen . Klikk på Legg til i kategorien Oppsett .
- Registrer en vaskebuffer ved å skrive inn et navn for den i Navn-feltet . Velg Tillegg i Type-feltet . Klikk på Lagre.
- Registrer en blokkerende løsning ved å gjenta de samme trinnene som ovenfor (endret etter behov, for eksempel i Navn-feltet ), men velg Primærantistoff i Type-feltet . Velg de ønskede protokollene i rullegardinboksene for Standard Staining Protocol og Default HIER Protocol. Velg alternativet Standard enzymprotokoll hvis ønskelig (denne boksen ble stående tom i gjeldende protokoll). Klikk på Lagre.
- Registrer deteksjonssystemet, som består av en strekkodet reagensbeholderbrett. Skann strekkoden.
- Begynn å angi detaljer om reagenssystemet i vinduet Legg til forskningsreagenssystem . Skriv inn et navn for gjenkjenningssystemet.
- Skriv inn en utløpsdato. Merk den første raden i Reagents-diagrammet og Skann strekkoden til en ny 30 ml reagensbeholder, og da vil strekkoden fylle ut rad 1.
- Plasser beholderen i posisjon 1 i deteksjonssystemet. Velg navnet på vaskebufferen i rullegardinlisten i Reagens-kolonnen og klikk på Legg til. Gjenta disse trinnene for å legge til eventuelle ekstra reagenser i etterfølgende rader, inkludert blokkeringsløsningen.
- Sett opp proteinprotokollen for IHC. Klikk på Protokolloppsett. raden som tilsvarer ønsket protokoll og klikk på Kopier. Skriv inn Navn og fyll ut andre relevante felt i vinduet Rediger protokollegenskaper .
- Merk av for Vis vasketrinn. Bekreft at feltene Inc (min) og DispenseType er korrekte for hvert reagens (10 min for blokkeringsløsningen, 0 min for vaskebufferen og 150 μL for hver dispensertype). Klikk på Lagre.
- Forbered studien. Fyll beholderen i posisjon 1 med en vaskebuffer. Fyll 150 μL per lysbilde og 5 ml dødt volum; La lokket stå åpent. Gjenta disse trinnene for beholderen i posisjon 2, som skal fylles med en blokkeringsløsning. Denne beholderen skal ha 150 μL per lysbilde og 350 μL dødvolum.
- Legg reagensbeholderbrettet på maskinen. La systemet utføre beholdergjenkjenning og volumbekreftelsestiltak. Klikk på Slide Setup | Legg til studie. Skriv inn studie-ID og studienavn og velg 150 μL under Dispense Volume | den ønskede protokollen i rullegardinmenyen Forberedelsesprotokoll (Bake og Dewax er foreslått). Fremhev studien og klikk på Legg til lysbilde.
- Velg Test vev under Tissue Type | 150 μL under Dispense Volume | Enkelt og rutinemessig fra rullegardinmenyene Fargemodus . Velg en prosess (IHC for den aktuelle studien) | Navn på blokkerende løsning i rullegardinlisten i Markør-feltet | IHC DSP-protokoll i fargefeltet i kategorien Protokoller | * Stek og devoks til forberedelse | * HIER 20 min med ER1 for HIER. La enzymfeltet stå tomt.
- Gjenta denne prosessen for hvert lysbilde. Klikk på Lukk når du er ferdig, og klikk deretter på Skriv ut etiketter. Sjekk alle lysbildeetiketter som ennå ikke er skrevet ut for nåværende studie, og klikk på Skriv ut. Fest etiketter på toppen av lysbildene.
- Last inn og kjør lysbilder. Legg lysbildene på glidebrettet, og sørg for at prøven og etiketten vender oppover. Plasser omslagsflisene over lysbildene, slik at lysbildene er orientert med faner nederst. Legg glidebrettene på instrumentet.
- Trykk på LED-knappen for å senke skuffen og la instrumentet starte skanning og gjenkjenning av lysbilder. Klikk på Start-knappen for å starte eksperimentet.
- Fullfør eksperimentet. Trykk på LED-knappen når den blinker grønt, noe som indikerer at kjøringen er fullført. Fjern brettet fra instrumentet, og løft dekselflisene forsiktig fra hvert lysbilde. Plasser lysbildene i 1x fosfatbufret saltvann (PBS), fjern overflødig buffer og skisser hver vevsseksjon med en hydrofob penn for å skape en hydrofob barriere.
3. Antistoffinkubasjon og kjernefarging17
- Velg et panel av antistoffer for å lokalisere antigenene av interesse (se tabell 1 for antistoffer brukt i dette eksperimentet).
MERK: Hvert antistoff har allerede blitt konjugert til et DNA-oligonukleotid med et UV-fotospaltbart segment (PC-oligo) som unikt identifiserer det (indeksering av oligoer, figur 2). - Lag en fungerende antistoff-PC-oligo-løsning ved å tilsette, for hvert lysbilde, 8 μL av hvert antistoff (fortynnet 1:40) i panelet. Bruk blokkeringsreagenset som fortynningsmiddel for å nå det endelige volumet på 200 μL for hvert lysbilde. Inkuber over natten ved 4 °C (figur 3, trinn 1).
MERK: Morfologimarkører, biologiske fargestoffer eller fluorescerende merkede antistoffer kan også tilsettes løsningen på dette trinnet. - Neste dag plasserer du lysbildet i en Coplin-krukke og vasker 3 x 10 minutter i 1x TBS-T. Postfix i 4% paraformaldehyd i 30 minutter ved romtemperatur, etterfulgt av 2 x 5 min i 1x TBS-T.
- Tilsett SYTO13 kjernefysisk flekk (fortynnet 1:10 i 1x TBS) i 15 minutter ved romtemperatur. Vask 2x med 1x TBS-T, og oppbevar deretter lysbildet i 1x TBS-T.
4. Fluorescensvisualisering, ROI-identifikasjon og UV-fotospalting på DSP-instrumentet17
- Når du har holdt musen over Datainnsamling i kontrollsenteret, velger du Ny/fortsett kjøring.
- Plasser lysbildet i lysbildeholderen med etiketten mot brukeren. Senk glidebrettklemmen, slik at vevet er synlig i det langstrakte vinduet. Tilsett 6 ml buffer S.
- Følg instruksjonene i kontrollsenteret. Zoom mellom forskjellige akser med X- og Y-glidebryterne for å avgrense et område for skanning. Velg Skann. La skanningen fortsette til hele det definerte målområdet er avbildet.
- Generer et 20x bilde. Definer avkastningen enten automatisk eller manuelt (figur 3, trinn 2). For å følge denne protokollen, velg tre like store, sirkulære avkastninger (diameter på 250 μm) for hver vevskjerne (figur 4, nederst).
MERK: Avkastningen kan tilpasses i størrelse og form. Flere avkastninger kan velges i hver seksjon. I dette eksperimentet defineres sirkulære avkastninger manuelt. - Godkjenn avkastningen ved å klikke på Avslutt skannearbeidsområde-knappen . Vent til UV-lys spalter oligoene fra antistoffene.
- Når rengjøringsinstrumentprosessen er fullført, velger du Ny datainnsamling for å fortsette med gjeldende lysbilder eller plater. Ellers velger du Fjern lysbilder og mikroplate.
- Åpne vinduet Fullfør plate ved å dobbeltklikke på plateikonområdet nederst til høyre i kontrollsenteret. Hvis Hybridization (Hyb) Code Pack-partinummeret (#) er kjent, skriver du inn nummeret og klikker på Oppdater (valgfritt i løpet av dette trinnet). Klikk på Fullfør.
- Koble fra lysbildeholderen og oppsamlingsplaten ved å følge instruksjonene. Lagre lysbildene i TBS-T. Hvis lysbildene ikke skal brukes på lenge, dekk dem med et vandig medium og deksel.
5. Proteinavlesning17
- Bruk en permeabel forsegling og tørk aspiratene ved 65 °C i en termisk syklus med toppen åpen. Tilsett 7 μL dietylpyrokarbonatbehandlet vann og bland. Inkuber ved RT i 10 minutter, og spinn deretter raskt ned.
- Velg de riktige Probe R- og Probe U-ligningene fra tabell 2 for å veilede opprettelsen av sonde-/bufferblandingen. Basert på antall Hyb-koder som er nødvendige for hybridisering i det nåværende eksperimentet, bruk ligning (1) som nedenfor. Bland og spinn raskt ned.
# Hyb Koder Probe R Working Pool Probe U Working Pool Hybridization Buffer n = _______ (n × 8 μL) = _____ μL + (n × 8 μL) = ______ μL + (n × 80 μL) = _____ μL (1) - Tilsett 84 μL sonde/bufferblanding i hver Hyb Code Pack som skal brukes. Sveip for å mikse og spinne ned. I en fersk 96-brønns hybridiseringsplate, tilsett 8 μL av hver Hyb Code Master Mix i alle de 12 brønnene i den angitte raden.
- Overfør 7 μL fra DSP-oppsamlingsplaten til den tilsvarende brønnen i hybridiseringsplaten. Bland forsiktig. Varmeforsegle og utføre en rask spinn. Deretter ruger du over natten ved 67 °C. Avkjøl tallerkenen på is og utfør et raskt spinn.
- Samle hybproduktene fra hver brønn inn i et striperør, og rør forsiktig hver brønn 5x for å blande. Dekk striperøret og spinn ned. Frys ned eventuelle gjenværende ubundne hybprodukter ved -80 °C. Legg strimmelrørene inn i analysesystemet.
- Lagre CDF-filen på en USB-stasjon, og overfør deretter dataene fra DSP-instrumentet til Digital Analyzer. Fullfør oppsettet ved å utføre følgende trinn.
- Last forbruksvarer og samlede prøver på prep-stasjonen. Trykk på Start behandling på skjermen. Velg Høy følsomhet, etterfulgt av Neste. Trykk på Velg alle for antall brønner med prøver | Fullfør | Neste på e-postvarsling | Start.
- Når prep-stasjonen er ferdig, forsegler du kassetten og overfører til den digitale analysatoren. Trykk på Start Counting, velg Stage Position, trykk Last inn eksisterende CDF-fil og velg tidligere opplastet fil. Trykk på Ferdig, velg sceneposisjon igjen, trykk på Ferdig | Begynn å kjøre programmet.
- Lagre den zippede filen i konverteringsfilene for reporterantall fra analysesystemet på en USB-stasjon, og sett deretter stasjonen inn i DSP-maskinen. Hold markøren over Datainnsamling i DSP Control Center, og klikk deretter på Last opp teller. Velg den aktuelle zippede filen.
6. Dataanalyse17
- Klikk på Records i DSP Control Center. Hvis du vil vise skanninger i køen, velger du Legg til valgte skanninger i kø | Min analysekø. Velg Ny studie fra kø etter å ha holdt musepekeren over alternativet Dataanalyse i kontrollsenteret.
- Velg QC fra Alternativer for oppgavelinje. Fortsett med standardverdiene eller juster om ønskelig. Velg Kjør QC og se gjennom resultatrutenettet. Klikk på Kjør QC for å fortsette og opprette et nytt datasett, og normalisere verdiene til de positive hybridiseringskontrollene.
- Importer de nye kodene til en XLSX-fil. Velg Behandle merknader i Søk-ruten , og last deretter ned en mal, sett inn kodene og importer filen.
- VALGFRITT: Når du har kjørt QC, justerer du dataene ytterligere ved hjelp av andre verktøylinjealternativer. Bruk verktøy i Visualiseringer-ruten til å tegne inn de transformerte dataene.
- Naviger i den grå rullegardinlisten med parametere for å komponere hvert plott i Visualiseringer-ruten . Velg et bestemt område i et plott for å visualisere de tilsvarende uthevede segmentene i Skanninger-ruten , og høyreklikk for å generere koder eller grupper. I Datasettsammendrag går du gjennom plott fra Normalisering, Skalering og andre alternativer for analyse og visning.
- Lagre en visualisering ved å velge ikonet for å lagre. se gjennom visualiseringer som allerede er lagret under Sammendrag. Velg Eksporter (.svg)- knappen for å eksportere en visualisering i .svg format. Eksporter data som en visualisering er basert på ved å klikke på Eksporter (.xlsx)- knappen. Eksporter alle dataene i et bestemt datasett ved å holde markøren over datasettnavnet i den andre ruten og klikke på eksportikonet .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 4 viser de representative resultatene fra et DSP-eksperiment utført på prøver av glioblastom. Et varmekart presenteres, som illustrerer en av metodene for å fange data visuelt ved hjelp av DSP-programvaren. Rader representerer proteinmål, og hver kolonne tilsvarer et område av interesse. Et fargeområde fra blått til rødt angir henholdsvis lavt til høyt uttrykk. Variabilitet av farge i en rad reflekterer regional protein heterogenitet og antyder en mulig romlig tilknytning til differensial proteinuttrykk. For eksempel, i det nåværende eksperimentet, er S100 og CD56 universelt høye fordi de er nevrale markører.
Markører med mest variabilitet inkluderte B7-H3, Ki-67, CD44 og fibronektin. Disse markørene har viktige assosiasjoner til henholdsvis tumorproliferasjon, migrasjon og metastase. Det er derfor rimelig at de vil vise regional variasjon mellom prøver av ondartet kjerne, ondartet invasjon og ikke-ondartet vev. Numerisk datarepresentasjon er også mulig; en fil som inneholder ekspresjonsverdien til hver proteinmarkør innenfor en avkastning i tabellform, kan eksporteres for matematisk og statistisk analyse. Denne uttrykksverdien produseres av den digitale tellefunksjonen som er tilgjengelig gjennom DSP, som kvantifiserer de mikroaspirerte PC-oligoene innenfor hver ROI (figur 1 og figur 2).
Figur 1: Definere regioner av interesse for vevsmikromatrise fra glioblastombiopsier. Topp, Hematoxylin og eosinfarget seksjon av vevsmikromatrise som inneholder flere kjernebiopsier med 2 mm diameter fra totalt tre glioblastompasienter. Nederst, regioner av interesse definert på fluorescensbilde. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Fotokløvbare oligonukleotider. Antistoff- eller antisense oligonukleotidprober for henholdsvis protein- eller RNA-mål er kovalent forbundet med oligonukleotider med fotoklyvbare linkere. Vevsseksjoner er farget med sonderne. UV-lys rettes deretter mot ROI for å frigjøre PC-oligoene, som telles digitalt. Dette tallet ble endret fra9, med tillatelse fra Springer Nature (copyright 2020). Forkortelser: PC-oligoer = fotokløvbare oligonukleotider; Avkastning = regioner av interesse. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: DSP-prosedyre. 1) Vevsbehandling: Et vevsskred er farget med oligokonjugerte antistoff- eller RNA-prober. 2) Valg av avkastning: Vevslysbildet er avbildet, og avkastningen er avgrenset, enten manuelt eller automatisk basert på visse fluorescensmønstre. 3) Spaltning av konjugerte oligonukleotider: UV-lys er rettet mot avkastningen, noe som resulterer i spaltning av de fotospaltbare oligonukleotidene. 4) PC-oligo-oppsamling: PC-oligoene aspireres inn i et mikrokapillærrør. 5) Plating: Aspirerte PC-oligoer deponeres i en mikrotiterplate. 6) Gjenta: Trinn 3-5 gjentas for hver avkastning; Mellom hver syklus utføres grundig vask. 7) Kvantifisering: Romlig oppløste bassenger av PC-oligoer kan hybridiseres til fluorescerende strekkoder; Dette muliggjør digital telling av opptil ca. 1 million bindende hendelser per avkastning. Alternativt kan PC-oligoer kvantifiseres via NGS, hvor hele mikrotiterplaten samles i et enkelt rør og sekvenseres. Lesningene blir deretter oversatt til digitale tellinger og kartlagt tilbake til deres opprinnelige avkastning, og skaper et visuelt kart over protein- eller RNA-uttrykk i hver vevsseksjon. Dette tallet ble endret fra9, med tillatelse fra Springer Nature (copyright 2020). Forkortelser: DSP = digital romlig behandling; PC-oligoer = fotokløvbare oligonukleotider; Avkastning = regioner av interesse; NGS = neste generasjons sekvensering. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Representativt varmekart fra et DSP-eksperiment. Kolonner representerer individuelle interesseområder. Rader representerer et proteinmål. Lavt uttrykk vises i blått, og høyt uttrykk vises i rødt. Forkortelse: DSP = digital romlig behandling. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
| GeoMx immuncelleprofilering - menneskelig | Pan-tumor modul |
| PD-1 | MART1 |
| CD68 | NY-ESO-1 |
| HLA-DR | S100B |
| Ki-67 | BCL-2 |
| Beta-2 mikroglobulin | EpCAM |
| CD11c | Her2 |
| CD20 | PTEN |
| CD3 | ER-alfa |
| CD4 | PR |
| CD45 | |
| CD56 | |
| CD8 | |
| CTLA4 | |
| GZMB | |
| PD-L1 | |
| Panck | |
| SMA | |
| Fibronectin | |
| Rb IgG | |
| Ms IgG1 | |
| Ms IgG2a | |
| Histon H3 | |
| S6 | |
| GAPDH |
Tabell 1: Et representativt utvalg av proteiner som kan vurderes ved hjelp av forhåndsdesignede antistoffpaneler.
| Sonde U Arbeidsbasseng | ||||||
| Modul 2 Sonde R | Andre moduler | DEPC-behandlet vann (mikroliter) | totalt volum (mikroliter) | Sonde U Master Stock (mikroliter) | DEPC-behandlet vann (mikroliter) | totalt volum |
| 2 | ... | 16.5 | 2 | 14.5 | 16.5 | |
| 4 | ... | 33 | 4 | 29 | 33 | |
| 6 | ... | 49.5 | 6 | 43.5 | 49.5 | |
| 8 | ... | 66 | 8 | 58 | 66 |
Tabell 2: Hybridiseringskoder og Probe R- og Probe U-arbeidsbassenger. Forkortelse: hyb = hybridisering; DEPC = dietylpyrokarbonat.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Gitt mangfoldet av proteiner som potensielt kan påvirke aggressiviteten til gliomer og forestillingen om at flere av disse proteinene forblir uoppdaget, er en proteinkvantifiseringsmetode med høy gjennomstrømning en ideell teknologisk tilnærming. I tillegg, gitt at romlige data i onkologiske prøver ofte korrelerer med differensialuttrykk18, gir inkorporering av romlig profilering i proteinkvantifiseringsmetoden mer effektiv analyse.
Den høye gjennomstrømningsmetoden til DSP gjør det også mulig å bruke den i en haglelignende tilnærming, som er ideell for å oppdage potensielle nye biomarkører av sykdom og respons på terapi. I to studier av melanom ble DSP brukt til å evaluere responsen på kombinasjonsbehandling med ipilimumab og nivolumab versus nivolumab monoterapi19 og på neoadjuvant kombinasjonsbehandling med ipilimumab og nivolumab versus standard adjuvant behandling20. I begge studiene viste DSP-profilering av en rekke proteinmål etter behandling differensiell relativ ekspresjon av viktige immunologiske markører, noe som tyder på en rolle for potensielle biomarkører for terapeutisk respons.
DSP letter også bestemmelsen av den ultimate patologiske betydningen av komplekse prosesser på molekylært nivå. For eksempel er et karakteristisk trekk ved invasive gliomer deres tilbøyelighet til å migrere direkte gjennom den ekstracellulære matrisen (ECM), og deres trekkvei styres ofte av vaskulære og hvite substanskanaler 1,2. Variabilitet i proteinuttrykk i vevsmikromiljøet er et kjennetegn på epithelial-til-mesenkymal overgang som driver invasjon. Flere studier har undersøkt hvordan gliomer kan oppregulere matriksmetalloproteinaser (MMP), noe som resulterer i nedbrytning av den omkringliggende ECM og økende invasivitet21,22,23. Ved å visualisere og kvantifisere den kumulative, nedstrøms effekten av denne differensialreguleringen, gir DSP en bredskala, helhetlig analyse.
En viktig determinant for det ondartede potensialet til gliomer er deres evne til å samhandle med og manipulere vertsimmunforsvar. I likhet med andre solide svulster, bruker gliomer en rekke mekanismer for å unngå vertsimmunovervåkning og forstyrre aktiveringen av proteiner som er kritiske for å montere en immunrespons. Nylige fremskritt innen immuno-onkologi har fokusert på å identifisere immunogene proteiner som uttrykkes eller utnyttes av svulster. I forkant av denne utviklingen er bruk av T-celler for å oppdage immunologisk aktive tumorantigener som onkolytiske virus kan rettes mot 24,25, og utvikling av sjekkpunkthemmere mot T-cellehemmende proteiner (f.eks. PD1 / PDL1 og CTLA4) for å potensere vertsimmunitet mot svulster 26,27 . Andre stromale populasjoner som figurerer fremtredende i gliommikromiljøet inkluderer makrofager, mikrovaskulære endotelceller, immunceller og en nylig identifisert underpopulasjon kalt 'glioma-assosierte stromale celler' (GASCs)28. Interaksjonene mellom disse cellene og kjemokiner, cytokiner og komponenter i ECM har viktige implikasjoner for tumorproliferasjon, invasjon og respons på behandling, og tjener dermed som viktige mål for regional kvantifisering og sammenligning gjennom teknologier som DSP.
DSP-protokollen er brukervennlig og tillater flere lag med tilpasning. Ettersom mye av kvantifiseringsprosessen er automatisert, er de viktigste brukeravhengige trinnene rettet mot å oppnå høyest mulig følsomhet og spesifisitet for måldeteksjon. Viktige trinn i protokollen inkluderer dermed bestemmelse av en flekk for innledende fluorescerende visualisering av prøven, avgrensning av avkastninger og valg av antistoffpanelene.
Ved utforming av en fargeprotokoll er det viktig å først identifisere et mål som sannsynligvis vil demonstrere kvantifiserbare forskjeller mellom ulike regioner i prøven, tilsvarende en kritisk egenskap eller oppførsel av opprinnelsesvevet. Deretter må en agent som effektivt binder målet velges. For eksempel, hvis man håper å visualisere regioner med hyperplasi eller nukleær atypi, kan H&E eller en kjernefysisk flekk velges; Alternativt, hvis man tar sikte på å visualisere endringer i uttrykket av et gen som er kjent for å være assosiert med ondartet eller premalignt vev, kan et fluoroforkonjugert antistoff velges. Tumorcellene selv kan være spesielt merket i tilfelle av IDH1-R132H mutante svulster. Den nåværende protokollen kan modifiseres ved tilsetning av fluorescerende merket IDH1-R132H som en morfologisk markør (protokolltrinn 3.2). Opptil fire flekker per prøve kan brukes. Når visualisering av det fargede vevet har skjedd, er avkastningen utpekt. Valg av avkastning bør gjenspeile hvor signifikante forskjeller i proteinmåluttrykk forventes å forekomme. Viktige hensyn ved valg av avkastning inkluderer størrelse (10-600 μm diameter), form (sirkel, rektangel eller brukertegnet) og segmentering (ytterligere avgrensning av underregioner innenfor en enkelt avkastning, noe som gir et ekstra potensielt analyselag). Disse variablene bør optimaliseres for å mest effektivt fange opp romlig variasjon i måluttrykk som forventes basert på det valgte antistoffpanelet.
Valg av antistoffpanelet er av kritisk betydning, da differensielt antistoffuttrykk til slutt fungerer som studiens sluttpunkt. Når du utfører dette trinnet, er det viktig å vurdere hvilke markører som kan vise uttrykk som korrelerer enten positivt eller negativt med stadier langs spekteret av tumorutvikling, fra godartet, til preinvasiv, til invasiv eller ondartet. Det er også viktig å nøye vurdere egenskapene til både opprinnelsesvevet og tumortypen, da begge disse funksjonene kan påvirke uttrykket av visse markører.
Fordi mye av prosessen er automatisert, er eventuelle feil i prosedyren vanligvis på grunn av maskinvare- eller programvarefeil, og tilbyr begrenset brukerfeilsøkingsevne. Problemer som kan oppstå inkluderer forstyrrelse av det innebygde kvalitetskontrolltiltaket (QC) (designet for å flagge og potensielt utelate data som tyder på lavt signal-til-støy-forhold, lave tellinger og utilstrekkelig måldeteksjon), avvikende programvareoppdateringer og prosedyreproblemer (f.eks. for tidlig avslutning av ulike trinn). For disse problemene anbefales det at brukeren kontakter produsenten for ekstern støtte. Alternativt, hvis brukeren støter på iboende dataproblemer (f.eks. lavt antall kjerner totalt, lav variabilitet i uttrykk mellom avkastninger), kan de vurdere å gjenta tidligere trinn i prosedyren (f.eks. repooling av data fra den opprinnelige TMA, omdefinering av avkastning). Det er også viktig å vurdere variasjoner i vevstetthet som en potensiell sammenblanding av antigen produksjon og dermed antistoffuttrykk; Derfor bør vev av lignende tettheter sikte på å bli valgt for analyse.
Kontrolltiltak er innebygd i protokollen. Programmet gir både en intern positiv og negativ kontroll som står for variasjoner i hybridisering av PC-oligoene til de fluorescerende strekkodene. Housekeeping proteiner tilbyr en annen positiv kontroll som i tillegg kan tjene som en normaliseringsfaktor på grunnlag av cellularitet.
Evnen til å definere avkastninger der kvantifisering skjer, er grunnlaget for DSPs romlige profileringsevne. Denne tilpassbare avgrensningen av avkastningen markerer et kritisk og særegent trinn i protokollen. Muligheten til å skape en avkastning så liten som en enkelt celle gir mulighet for regional presisjon i protein- eller nukleinsyrekvantifisering, og evnen til å definere flere avkastninger og kvantifisere innholdet i tandem gjennom multipleksanalyse gir en høy gjennomstrømningstilnærming.
Når ROI er valgt for å representere patologisk distinkte regioner i en gliomprøve (f.eks. nekrotisk, perivaskulær), kan proteomisk profilering og regional sammenligning avsløre mekanismer for tumorutbredelse og progresjon. For eksempel har IHC blitt brukt til regionalt å kvantifisere hypoksiinduserbar faktor (HIF-1α) uttrykk i glioblastomprøver og har avslørt høyere uttrykk nær nekrotiske områder sammenlignet med perivaskulære soner29. Dette er i samsvar med flere studier som indikerer en rolle for hypoksi i tumorigenese av gliom.
Regional variasjon har også blitt mye studert blant immuncellekomponenter i tumormikromiljøet. Makrofager/mikroglia utgjør den dominerende immuncellepopulasjonen i gliomer og er grundig studert på regional basis. Subpopulasjoner av tumorassosierte makrofager (TAMs) har vist seg å spille forskjellige roller i tumorprogresjon avhengig av deres plassering i svulsten og mikromiljøet. De innenfor den tumorinvasive kanten bryter ned kjellermembranen, og fremmer spredning; de i hypoksiske områder utøver en angiogen effekt, noe som letter veksten; de i nærheten av tumorvaskulatur utskiller EGF og tilhørende faktorer for å lede stromale tumorceller mot blodkar, og driver metastase30. Disse kritiske, romlig avhengige egenskapene demonstrerer verdien av regionale proteomiske data i kreftbiologi og representerer en viktig tilleggsapplikasjon av DSP til karakterisering av immuncellepopulasjoner i en svulst og dens mikromiljø.
Teknikken har noen begrensninger, inkludert kostnader og det relativt lille antallet mål som er tilgjengelige i kjerneantistoffpanelene. I tillegg, selv om subcellulær oppløsning ikke er mulig med DSP, vil det være mulig med kommende nye teknologier31. Til tross for disse begrensningene er DSP en kraftig teknikk for visse typer målrettede, tidligere ubesvarte spørsmål i gliomcellebiologi. Denne innovative teknologien gir en eksepsjonell mulighet for å avdekke nye biologiske perspektiver gjennom presis vurdering av ulike proteinmål.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen interessekonflikter å opplyse om.
Acknowledgments
Forfatterne anerkjenner støtten fra Laboratoriet for klinisk genomikk og avansert teknologi ved Institutt for patologi og laboratoriemedisin i Dartmouth Hitchcock Health System. Forfatterne anerkjenner også Pathology Shared Resource ved Dartmouth Cancer Center med NCI Cancer Center Support Grant 5P30 CA023108-37.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BOND Research Detection System | Leica Biosystems, Wetzlar, Germany | DS9455 | Open detection system containing open containers in a reagent tray |
| BOND Wash | Leica Biosystems, Wetzlar, Germany | AR950 | 10X concentrated buffer solution for washing fixed tissue |
| Buffer W | NanoString, Seattle, WA | contact company | Blocking reagent |
| Cy3 conjugation kit | Abcam, Cambridge, UK | AB188287 | Cy3 fluorescent antibody conjugation kit |
| GeoMx Digital Spatial Profiler (DSP) | NanoString, Seattle, WA | contact company | System for imaging and characterizing protein and RNA targets |
| GeoMx DSP Instrument BufferKit | NanoString, Seattle, WA | 100471 | Buffer kit for GeoMX DSP (including buffers for sample processing and preparation) |
| GeoMx Hyb Code Pack_Protein | NanoString, Seattle, WA | 121300401 | Controls for running GeoMX DSP experiemtns |
| GeoMx Immune Cell Panel (Imm Cell Pro_Hs) | NanoString, Seattle, WA | 121300101 | Protein module with targets for human immune cells and immuno-oncologic targets |
| GeoMx Pan-Tumor Panel (Pan-Tumor_Hs) | NanoString, Seattle, WA | 121300105 | Protein module with targets for multiple human tumor types and for markers of epithelial-mesenchymal transition |
| GeoMx Protein Slide Prep FFPE | NanoString, Seattle, WA | 121300308 | Sample preparation reagents for GeoMX DSP protein analysis |
| LEICA Bond RX | Leica Biosystems, Wetzlar, Germany | contact company | Fully automated IHC stainer |
| Master Kit--12 reactions | NanoString, Seattle, WA | 100052 | Materials and reagents for use with the nCounter Analysis system |
| nCounter Analysis System | NanoString, Seattle, WA | contact company | Automated system for multiplex target expression quantification (to be used with GeoMx DSP) |
| TMA Master II | 3DHistech Ltd., Budapest, Hungary | To create the tissue microarray block |
References
- Pedersen, P. H., et al. Migratory patterns of lac-z transfected human glioma cells in the rat brain. International Journal of Cancer. 62 (6), 767-771 (1995).
- Wang, J., et al. Invasion of white matter tracts by glioma stem cells is regulated by a NOTCH1-SOX2 positive-feedback loop. Nature Neuroscience. 22 (1), 91-105 (2019).
- Iwadate, Y.
- Tao, C., et al. Genomics and prognosis analysis of epithelial-mesenchymal transition in glioma. Frontiers in Oncology. 10, 183 (2020).
- Cuddapah, V. A., Robel, S., Watkins, S., Sontheimer, H. A neurocentric perspective on glioma invasion. Nature Reviews Neuroscience. 15 (7), 455-465 (2014).
- Barthel, L., et al. Glioma: molecular signature and crossroads with tumor microenvironment. Cancer and Metastasis Reviews. 1 (1), 53-75 (2021).
- Ziegler, D. S., Kung, A. L., Kieran, M. W.
- Berghoff, A. S., et al. Programmed death ligand 1 expression and tumor-infiltrating lymphocytes in glioblastoma. Neuro-Oncology. 17 (8), 1064-1075 (2015).
- Merritt, C. R., et al. Multiplex digital spatial profiling of proteins and RNA in fixed tissue. Nature Biotechnology. 38 (5), 586-599 (2020).
- Van, T. M., Blank, C. U. A user's perspective on GeoMxTM digital spatial profiling. Immuno-Oncology Technology. 1, 11-18 (2019).
- Garcia-Pardo, M., Calles, A. ROS-1 NSCLC therapy resistance mechanism. Precision Cancer Medicine. , Online (2021).
- Ye, L., et al. Digital spatial profiling of individual glomeruli from patients with anti-neutrophil cytoplasmic autoantibody-associated glomerulonephritis. Frontiers in Immunology. 13, 831253 (2022).
- Bergholtz, H., et al. Best practices for spatial profiling for breast cancer research with the GeoMx digital spatial profiler. Cancers. 13 (17), 4456 (2021).
- Brady, L., et al. Inter- and intra-tumor heterogeneity of metastatic prostate cancer determined by digital spatial gene expression profiling. Nature Communications. 12 (1), 1426 (2021).
- Kulasinghe, A., et al. Highly multiplexed digital spatial profiling of the tumor microenvironment of head and neck squamous cell carcinoma patients. Frontiers in Oncology. 10, 607349 (2021).
- Wang, D. Y. -T., et al. Case study: Digital spatial profiling of metastatic clear cell carcinoma reveals intra-tumor heterogeneity in epithelial-mesenchymal gradient. bioRxiv. , (2021).
- GeoMx DSP. Automated slide preparation user manual. GeoMx DSP. , nanoString Technologies. Seattle, Washington. (2022).
- Allam, M., Cai, S., Coskun, A. F. Multiplex bioimaging of single-cell spatial profiles for precision cancer diagnostics and therapeutics. NPJ Precision Oncology. 4, 11 (2020).
- Wolchok, J. D., et al. Overall survival with combined nivolumab and ipilimumab in advanced melanoma. New England Journal of Medicine. 377 (14), 1345-1356 (2017).
- Blank, C. U., et al. Neoadjuvant versus adjuvant ipilimumab plus nivolumab in macroscopic stage III melanoma. Nature Medicine. 24 (11), 1655-1661 (2018).
- Matthews, R. T., et al. Brain-enriched hyaluronan binding (BEHAB)/brevican cleavage in a glioma cell line is mediated by a disintegrin and metalloproteinase with thrombospondin motifs (ADAMTS) family member. Journal of Biological Chemistry. 275 (30), 22695-22703 (2000).
- Paganetti, P. A., Caroni, P., Schwab, M. E. Glioblastoma infiltration into central nervous system tissue in vitro: involvement of a metalloprotease. Journal of Cell Biology. 107, 2281-2291 (1988).
- Beliën, A. T., Paganetti, P. A., Schwab, M. E. Membrane-type 1 matrix metalloprotease (MT1-MMP) enables invasive migration of glioma cells in central nervous system white matter. Journal of Cell Biology. 144 (2), 373-384 (1999).
- Coulie, P. G., Vanden Eynde, B. J., vander Bruggen, P., Boon, T. Tumour antigens recognized by T lymphocytes: At the core of cancer immunotherapy. Nature Reviews Cancer. 14 (2), 135-146 (2014).
- Finn, O. J. Vaccines for cancer prevention: a practical and feasible approach to the cancer epidemic. Cancer Immunology Research. 2 (8), 708-713 (2014).
- Sharma, P., Allison, J. P. The future of immune checkpoint therapy. Science. 348 (6230), 56-61 (2015).
- Chen, L., Han, X. Anti-PD-1/PD-L1 therapy of human cancer: past, present, and future. Journal of Clinical Investigation. 125 (9), 3384-3391 (2015).
- Cai, X., et al. Glioma-Associated stromal cells stimulate glioma malignancy by regulating the tumor immune microenvironment. Frontiers in Oncology. 11, 672928 (2021).
- Ishii,, et al. Histological characterization of the tumorigenic "peri-necrotic niche" harboring quiescent stem-like tumor cells in glioblastoma. PLoS One. 11 (1), 0147366 (2016).
- Lewis, C. E., Pollard, J. W. Distinct role of macrophages in different tumor microenvironments. Cancer Research. 66 (2), 605-612 (2006).
- NanoString. CosMx Spatial Molecular Imager: True Single-Cell In Situ Solution. NanoString. , (2022).
