Summary
La desregulación proteómica juega un papel importante en la propagación de gliomas infiltrantes difusos, pero varias proteínas relevantes permanecen sin identificar. El procesamiento espacial digital (DSP) ofrece un enfoque eficiente y de alto rendimiento para caracterizar la expresión diferencial de proteínas candidatas que pueden contribuir a la invasión y migración de gliomas infiltrativos.
Abstract
Los gliomas infiltrantes difusos se asocian con una alta morbilidad y mortalidad debido a la naturaleza infiltrativa de la diseminación tumoral. Son tumores morfológicamente complejos, con un alto grado de variabilidad proteómica tanto en el propio tumor como en su microambiente heterogéneo. El potencial maligno de estos tumores se ve reforzado por la desregulación de las proteínas involucradas en varias vías clave, incluidos los procesos que mantienen la estabilidad celular y preservan la integridad estructural del microambiente. Aunque se han realizado numerosos análisis masivos y de glioma unicelular, existe una relativa escasez de estratificación espacial de estos datos proteómicos. Comprender las diferencias en la distribución espacial de los factores tumorígenos y las poblaciones de células inmunitarias entre el tumor intrínseco, el borde invasivo y el microambiente ofrece información valiosa sobre los mecanismos subyacentes a la proliferación y propagación del tumor. El perfil espacial digital (DSP) representa una tecnología poderosa que puede formar la base para estos importantes análisis multicapa.
DSP es un método que cuantifica eficientemente la expresión de proteínas dentro de las regiones espaciales especificadas por el usuario en una muestra de tejido. DSP es ideal para estudiar la expresión diferencial de múltiples proteínas dentro y entre regiones de distinción, lo que permite múltiples niveles de análisis cuantitativo y cualitativo. El protocolo DSP es sistemático y fácil de usar, lo que permite un análisis espacial personalizado de los datos proteómicos. En este experimento, los microarrays de tejido se construyen a partir de biopsias archivadas del núcleo del glioblastoma. A continuación, se selecciona un panel de anticuerpos, dirigidos a proteínas de interés dentro de la muestra. Los anticuerpos, que se conjugan previamente a oligonucleótidos de ADN fotocleavable UV, se incuban con la muestra de tejido durante la noche. Bajo microscopía de fluorescencia visualización de los anticuerpos, las regiones de interés (ROIs) dentro de las cuales cuantificar la expresión de proteínas se definen con las muestras. La luz UV se dirige a cada ROI, dividiendo los oligonucleótidos de ADN. Los oligonucleótidos son microaspirados y contados dentro de cada ROI, cuantificando la proteína correspondiente sobre una base espacial.
Introduction
Los gliomas infiltrantes difusamente son el tipo más común de tumor cerebral maligno en adultos y son invariablemente letales. La propensión de las células de glioma a migrar extensamente en el cerebro es un desafío terapéutico importante. El mecanismo por el cual se propagan implica la migración dirigida y la invasión sin control. Se ha demostrado que las células de glioma invasivo exhiben tropismo y migración a lo largo de los tractos de sustancia blanca1, con investigaciones recientes que implican la desmielinización de estos tractos como una característica activa y protumorigénica2. La invasión está mediada por una transición epitelial-mesenquimal, en la que las células gliomas adquieren propiedades mesenquimales al reducir la expresión de genes que codifican proteínas de la matriz extracelular y moléculas de adhesión celular, amplificando la migración y facilitando la propagación a través del microambiente tumoral 3,4,5.
A nivel molecular, se ha demostrado la disrupción de varias proteínas que confieren estabilidad celular e interactúan con componentes inmunogénicos6. Se sabe que los gliomas infiltrativos sufren supresión de proteínas con propiedades antiapoptóticas (por ejemplo, PTEN)7. También sobreexpresan proteínas que promueven la evasión de la respuesta inmune del huésped (por ejemplo, PD1/PDL1)8. La desregulación de estas vías complejas aumenta la tumorigenicidad y aumenta el potencial maligno.
Dentro de muestras de glioma invasivo, el objetivo fue evaluar la expresión diferencial de proteínas clave para el crecimiento, la supervivencia y la proliferación celular, y para la integridad estructural del microambiente entre componentes invasivos y no invasivos. Además, buscamos estudiar la regulación diferencial de proteínas con un papel inmunogénico activo, ofreciendo información sobre el mecanismo por el cual las defensas inmunes comprometidas del huésped pueden mejorar el potencial proliferativo e invasivo de los gliomas. Esto es especialmente relevante dada la reciente amplitud de la investigación que demuestra cómo los marcadores inmunes y los impulsores de la desregulación en la malignidad pueden servir como objetivos de la inmunoterapia. La identificación de dianas terapéuticas viables entre las muchas proteínas implicadas en la inmunovigilancia y la reactividad requiere un enfoque altamente sensible y completo.
Dada la amplia gama de proteínas candidatas que se pueden estudiar, buscamos un método similar a la inmunohistoquímica pero con una mayor eficiencia en el procesamiento de datos. Dentro del campo de la biología del cáncer, DSP se ha convertido en una tecnología poderosa con importantes ventajas sobre herramientas alternativas para el análisis proteómico y la cuantificación. El sello distintivo de DSP es su capacidad de multiplexación de alto rendimiento, que permite el estudio simultáneo de varias proteínas diferentes dentro de una muestra, marcando una distinción importante de las tecnologías estándar pero de plexación inferior como la inmunohistoquímica (IHC)9,10. La característica múltiplex de DSP no compromete su fidelidad como herramienta cuantitativa y analítica, como lo demuestran los estudios que comparan DSP con IHC. Cuando se utiliza para la cuantificación proteómica de muestras de cáncer de pulmón de células no pequeñas, por ejemplo, se ha demostrado que el DSP tiene resultados similares a IHC11. Además, DSP ofrece una especificación regional personalizable, en la que los usuarios pueden definir manualmente las regiones dentro de las cuales realizar el análisis proteómico. Esto presenta una ventaja sobre los métodos multiplexores de sección completa10,12. En una sola ronda de procesamiento, DSP ofrece múltiples capas de análisis mediante el estudio de varios objetivos de proteínas en múltiples regiones de interés.
DSP tiene aplicaciones en varios entornos patológicos diferentes. DSP es especialmente ventajoso en el análisis oncológico, ya que la variación espacial puede correlacionarse con la transformación celular y la expresión diferencial de proteínas. Por ejemplo, DSP se ha utilizado para comparar el perfil proteómico del cáncer de mama con el microambiente tumoral adyacente. Esto conlleva implicaciones importantes para la comprensión de la historia natural de este tumor y su progresión, así como la posible respuesta al tratamiento13. Otros contextos que ilustran la versatilidad del DSP incluyen la cuantificación espacial de la diversidad de proteínas en el cáncer de próstata14, la asociación de la expresión del marcador de células inmunitarias con la progresión de la enfermedad en el carcinoma de células escamosas de cabeza y cuello 15 y la demostración de un gradiente epitelial-mesenquimal de la expresión de proteínas que distingue el cáncer de ovario metastásico del primario de células claras16 . Mediante la implementación de DSP, caracterizamos la topografía espacial de las proteínas que podrían afectar la tumorigénesis y la invasión de gliomas.
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Protocol
El protocolo descrito a continuación sigue las pautas del Comité de Ética de Investigación Humana de Dartmouth-Hitchcock. Se obtuvo el consentimiento informado de los pacientes cuyas muestras de tejido fueron incluidas en este estudio. Consulte la sección Tabla de materiales para obtener detalles relacionados con todos los materiales, reactivos, equipos y software utilizados en este protocolo.
1. Preparación de la diapositiva17
- Recuperar o preparar tejido fijado en formalina e incrustado en parafina a partir de gliomas infiltrantes difusos de tipo adulto humano.
NOTA: En este experimento, se utilizaron bloques de biopsias con parafina de tres pacientes con glioblastoma. - Cree un bloque de micromatriz de tejido (TMA). Tome varios núcleos de 2 mm de cada biopsia y colóquelos en un solo bloque TMA (Figura 1, arriba). Corte secciones del bloque TMA a 4 μm y móntelas en portaobjetos de vidrio. Coloque cada portaobjetos dentro de la junta del portacorrederas. Incubar el tobogán a 60 °C durante 30 min.
2. Preparación del sistema IHC semiautomatizado y configuración del software (para la carga y ejecución de diapositivas)17
- Configure los reactivos. Haga clic en el botón Configuración del reactivo . Haga clic en Agregar en la pestaña Configuración .
- Registre un búfer de lavado escribiendo un nombre para él en el campo Nombre . Seleccione Auxiliar en el campo Tipo . Haga clic en Guardar.
- Registre una solución de bloqueo repitiendo los mismos pasos anteriores (modificados según corresponda, por ejemplo, en el campo Nombre ), pero seleccionando Anticuerpo primario en el campo Tipo . Seleccione los protocolos deseados en los cuadros desplegables para Protocolo de tinción predeterminado y Protocolo HIER predeterminado. Seleccione una opción Protocolo de enzimas predeterminado si lo desea (este cuadro se dejó en blanco en el protocolo actual). Haga clic en Guardar.
- Registre el sistema de detección, que consiste en una bandeja de contenedor de reactivos con código de barras. Escanee el código de barras.
- Comience a introducir los detalles del sistema de reactivos en la ventana Agregar sistema de reactivos de investigación . Escriba un Nombre para el sistema de detección.
- Escriba una fecha de caducidad. Resalte la primera fila del gráfico Reactivos y Escanee el código de barras de un nuevo contenedor de reactivos de 30 ml, momento en el que el código de barras rellenará la fila 1.
- Coloque el contenedor en la posición 1 del sistema de detección. Seleccione el nombre del tampón de lavado en el cuadro desplegable de la columna Reactivo y haga clic en Agregar. Repita estos pasos para agregar cualquier reactivo adicional en las filas siguientes, incluida la solución de bloqueo.
- Configure el Protocolo de proteínas para IHC. Haga clic en Configuración de protocolo. Resalte la fila correspondiente al protocolo deseado y haga clic en Copiar. Introduzca el Nombre y rellene cualquier otro campo relevante en la ventana Editar propiedades del protocolo.
- Seleccione la casilla Mostrar pasos de lavado. Confirme que los campos Inc (min) y DispenseType son correctos para cada reactivo (10 min para la solución de bloqueo, 0 min para el tampón de lavado y 150 μL para cada DispenseType). Haga clic en Guardar.
- Prepare el estudio. Llene el recipiente en la posición 1 con un tampón de lavado. Llene 150 μL por portaobjetos y 5 ml de volumen muerto; Deje la tapa abierta. Repita estos pasos para el contenedor en la posición 2, que debe llenarse con una solución de bloqueo. Este recipiente debe tener 150 μL por portaobjetos y 350 μL de volumen muerto.
- Cargue la bandeja del contenedor de reactivos en la máquina. Permitir que el sistema realice medidas de reconocimiento de contenedores y confirmación de volumen. Haga clic en Slide Setup | Añadir estudio. Introduzca el ID del estudio y el nombre del estudio y seleccione 150 μL en Volumen de dispensación | el protocolo deseado en el menú desplegable Protocolo de preparación (se sugiere Hornear y desparacar). Resalte el estudio y haga clic en Agregar diapositiva.
- Seleccione Tejido de prueba bajo Tipo de tejido | 150 μL en Volumen de dispensación | Individual y Rutina en los cuadros desplegables Modo de tinción . Seleccione un proceso (IHC para el estudio actual) | el Nombre de la solución de bloqueo en el cuadro desplegable del campo Marcador | Protocolo DSP IHC en el campo Tinción de la pestaña Protocolos | * Hornear y desparafinar para la preparación | *HIER 20 min con ER1 para HIER. Deje el campo Enzima en blanco.
- Repita este proceso para cada diapositiva. Haga clic en Cerrar una vez finalizado y, a continuación, haga clic en Imprimir etiquetas. Marque todas las etiquetas de diapositivas aún no impresas para el estudio actual y haga clic en Imprimir. Coloque etiquetas en la parte superior de las diapositivas.
- Cargar y ejecutar diapositivas. Cargue las diapositivas en la bandeja portaobjetos, asegurándose de que la muestra y la etiqueta estén orientadas hacia arriba. Coloque los azulejos de la cubierta sobre las diapositivas, asegurándose de que las diapositivas estén orientadas con pestañas en la parte inferior. Cargue las bandejas deslizantes en el instrumento.
- Presione el botón LED para bajar la bandeja y permitir que el instrumento comience el escaneo y reconocimiento de diapositivas. Haga clic en el botón Inicio para comenzar el experimento.
- Termina el experimento. Presione el botón LED cuando parpadee en verde, lo que indica que se ha completado la ejecución. Retire la bandeja del instrumento y levante con cuidado las baldosas de la cubierta de cada portaobjetos. Coloque los portaobjetos en 1x solución salina tamponada con fosfato (PBS), elimine el exceso de tampón y delinee cada sección de tejido con una pluma hidrófoba para crear una barrera hidrófoba.
3. Incubación de anticuerpos y tinción de núcleos17
- Seleccione un panel de anticuerpos para localizar los antígenos de interés (consulte la Tabla 1 para los anticuerpos utilizados en este experimento).
NOTA: Cada anticuerpo ya ha sido conjugado a un oligonucleótido de ADN con un segmento fotodivisible UV (PC-oligo) que lo identifica de forma única (oligos de indexación, Figura 2). - Haga una solución funcional de anticuerpo-PC-oligo añadiendo, para cada portaobjetos, 8 μL de cada anticuerpo (diluido 1:40) en el panel. Utilice el reactivo de bloqueo como diluyente para alcanzar el volumen final de 200 μL para cada portaobjetos. Incubar durante la noche a 4 °C (Figura 3, Paso 1).
NOTA: También se pueden agregar marcadores morfológicos, colorantes biológicos o anticuerpos marcados con fluorescencia a la solución en este paso. - Al día siguiente, coloque el portaobjetos en un frasco de Coplin y lave 3 x 10 min en 1x TBS-T. Postfijo en paraformaldehído al 4% durante 30 min a temperatura ambiente, seguido de 2 x 5 min en 1x TBS-T.
- Añadir la tinción nuclear SYTO13 (diluida 1:10 en 1x TBS) durante 15 min a temperatura ambiente. Lave 2x con 1x TBS-T y, a continuación, guarde la diapositiva en 1x TBS-T.
4. Visualización de fluorescencia, identificación de ROI y fotoescisión UV en el instrumento DSP17
- Después de pasar el mouse sobre la recopilación de datos en el Centro de control, seleccione Nuevo/Continuar ejecución.
- Coloque la diapositiva en el portadiapositivas, con la etiqueta hacia el usuario. Baje la abrazadera de la bandeja deslizante, asegurándose de que el tejido sea visible en la ventana alargada. Añadir 6 ml de tampón S.
- Siga las indicaciones en el Centro de control. Haga zoom entre diferentes ejes con los controles deslizantes X e Y para delinear una región para escanear. Seleccione Escanear. Permita que el escaneo continúe hasta que se haya creado una imagen de toda el área de destino definida.
- Genera una imagen de 20x. Defina los ROI de forma automática o manual (Figura 3, Paso 2). Para seguir este protocolo, seleccione tres ROI circulares de igual tamaño (diámetro de 250 μm) para cada núcleo de tejido (Figura 4, abajo).
NOTA: Los ROI son personalizables en tamaño y forma. Se pueden seleccionar varios ROI dentro de cada sección. En este experimento, los ROI circulares se definen manualmente. - Apruebe los ROI haciendo clic en el botón Salir del espacio de trabajo de escaneo . Espere a que la luz UV separe los oligos de los anticuerpos.
- Cuando se haya completado el proceso del instrumento de limpieza , seleccione Nueva recopilación de datos para continuar con las diapositivas o placas actuales. De lo contrario, seleccione Quitar portaobjetos y microplacas.
- Abra la ventana Finalizar placa haciendo doble clic en el área del icono de la placa en la parte inferior derecha del Centro de control. Si se conoce el número de lote (#) del paquete de código de hibridación (Hyb), ingrese el número y haga clic en Actualizar (opcional durante este paso). Haga clic en Finalizar.
- Separe el portaportaobjetos y la placa de recolección siguiendo las indicaciones. Almacene las diapositivas en TBS-T. Si los portaobjetos no se van a utilizar durante mucho tiempo, cúbralos con un medio acuoso y un cubreobjetos.
5. Lectura de proteínas17
- Utilizar un precinto permeable y secar los aspirados a 65 °C en un termociclador con la parte superior abierta. Añadir 7 μL de agua tratada con pirocarbonato de dietilo y mezclar. Incubar en RT durante 10 minutos, y luego girar hacia abajo rápidamente.
- Elija las ecuaciones de la sonda R y la sonda U adecuadas de la Tabla 2 para guiar la creación de la combinación de sonda/tampón. Basado en el número de códigos Hyb necesarios para la hibridación en el presente experimento, aplique la ecuación (1) como se muestra a continuación. Mezclar y girar hacia abajo rápidamente.
# Sonda de códigos Hyb R Sonda de piscina de trabajo U Tampón de hibridación de piscina de trabajo n = _______ (n × 8 μL) = _____ μL + (n × 8 μL) = ______ μL + (n × 80 μL) = _____ μL (1) - Agregue 84 μL de mezcla de sonda/tampón a cada paquete de códigos Hyb que se utilizará. Desplázate para mezclar y girar. En una placa de hibridación fresca de 96 pocillos, agregue 8 μL de cada mezcla maestra de código Hyb en los 12 pocillos de la fila indicada.
- Transfiera 7 μL de la placa de recolección DSP al pocillo correspondiente en la placa de hibridación. Mezclar suavemente. Selle térmicamente y realice un giro rápido. A continuación, incubar durante la noche a 67 °C. Enfríe el plato en hielo y realice un giro rápido.
- Agrupe los productos hyb de cada pozo en un tubo de tira, canalizando suavemente cada pocillo 5 veces para mezclar. Tapa el tubo de la tira y gira hacia abajo. Congele cualquier producto hyb no agrupado restante a -80 °C. Cargue los tubos de la tira en el sistema de análisis.
- Guarde el archivo CDF en una unidad USB y, a continuación, transfiera los datos del instrumento DSP al analizador digital. Complete la configuración realizando los siguientes pasos.
- Cargue consumibles y muestras agrupadas en la estación de preparación. En la pantalla, presione Iniciar procesamiento. Seleccione Alta sensibilidad, seguido de Siguiente. Presione Seleccionar todo para ver el número de pozos con muestras | Terminar | Siguiente en la notificación por correo electrónico | Inicio.
- Una vez que la estación de preparación haya terminado, selle el cartucho y transfiéralo al analizador digital. Presione Iniciar conteo, seleccione Posición de etapa, presione Cargar archivo CDF existente y seleccione el archivo cargado anteriormente. Pulse Listo, seleccione de nuevo la posición del escenario, pulse Listo | Comience a ejecutar el programa.
- Guarde el archivo comprimido de los archivos de conversión de recuento de reporteros del sistema de análisis en una unidad USB y, a continuación, inserte la unidad en la máquina DSP. En el Centro de control de DSP, coloque el cursor sobre Recopilación de datos y, a continuación, haga clic en Recuentos de carga. Seleccione el archivo comprimido correspondiente.
6. Análisis de datos17
- Haga clic en Registros en el Centro de control de DSP. Para ver los análisis de la cola, seleccione Agregar análisis seleccionados a la cola | Mi cola de análisis. Seleccione Nuevo estudio en Cola después de pasar el cursor sobre la opción Análisis de datos en el Centro de control.
- Seleccione Control de calidad en Opciones de la barra de tareas. Continúe con los valores predeterminados o ajuste si lo desea. Seleccione Ejecutar control de calidad y revise la cuadrícula de resultados. Haga clic en Ejecutar control de calidad para continuar y crear un nuevo conjunto de datos, normalizando los valores a los controles de hibridación positiva.
- Importe las nuevas etiquetas en un archivo XLSX. Seleccione Administrar anotaciones en el panel Análisis y, a continuación, descargue una plantilla, inserte las etiquetas e importe el archivo.
- OPCIONAL: Después de ejecutar QC, ajuste los datos aún más utilizando otras opciones de la barra de herramientas. Utilice las herramientas del panel Visualizaciones para trazar los datos transformados.
- Navegue por el cuadro desplegable gris de parámetros para componer cada gráfico en el panel Visualizaciones . Seleccione una región concreta dentro de un gráfico para visualizar los segmentos resaltados correspondientes en el panel Análisis y haga clic con el botón derecho para generar etiquetas o grupos. En Resumen del conjunto de datos, revise los gráficos de Normalización, Escalado y otras opciones para su análisis y visualización.
- Guarde una visualización seleccionando el icono para Guardar; revise las visualizaciones ya guardadas en Resumen. Seleccione el botón Exportar (.svg) para exportar una visualización en formato .svg. Exporte los datos en los que se basa una visualización haciendo clic en el botón Exportar (.xlsx). Exporte todos los datos contenidos en un conjunto de datos específico colocando el cursor sobre el nombre del conjunto de datos en el segundo panel y haciendo clic en el icono de exportación.
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Representative Results
La Figura 4 muestra los resultados representativos de un experimento DSP realizado en muestras de glioblastoma. Se presenta un mapa de calor, que ilustra uno de los métodos para capturar datos visualmente utilizando el software DSP. Las filas representan objetivos de proteínas, y cada columna corresponde a una región de interés. Una gama de colores de azul a rojo denota una expresión baja a alta, respectivamente. La variabilidad del color dentro de una fila refleja la heterogeneidad regional de proteínas y sugiere una posible asociación espacial con la expresión diferencial de proteínas. Por ejemplo, en el presente experimento, S100 y CD56 son universalmente altos porque son marcadores neuronales.
Los marcadores con mayor variabilidad incluyeron B7-H3, Ki-67, CD44 y fibronectina. Estos marcadores tienen asociaciones importantes con la proliferación tumoral, la migración y la metástasis, respectivamente. Por lo tanto, es razonable que exhiban variabilidad regional entre muestras de núcleo maligno, invasión maligna y tejido no maligno. También es posible la representación numérica de datos; un archivo que contiene el valor de expresión de cada marcador de proteína dentro de un ROI en forma de tabla se puede exportar para el análisis matemático y estadístico. Este valor de expresión es producido por la función de conteo digital disponible a través de DSP, que cuantifica los oligos PC microaspirados dentro de cada ROI (Figura 1 y Figura 2).
Figura 1: Definición de regiones de interés en microarrays tisulares a partir de biopsias de glioblastoma. Arriba, sección teñida con hematoxilina y eosina del microarray tisular que contiene varias biopsias centrales de 2 mm de diámetro de un total de tres pacientes con glioblastoma. Abajo, regiones de interés definidas en la imagen de fluorescencia. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Oligonucleótidos fotodivisibles. Las sondas de oligonucleótidos anticuerpo o antisentido para objetivos de proteínas o ARN, respectivamente, están unidas covalentemente a oligonucleótidos con enlaces fotodivisibles. Las secciones de tejido se tiñen con las sondas. La luz UV se dirige a los ROI para liberar los oligos PC, que se cuentan digitalmente. Esta cifra fue modificada de9, con permiso de Springer Nature (copyright 2020). Abreviaturas: PC-oligos = oligonucleótidos fotodivisibles; ROIs = regiones de interés. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Procedimiento DSP. 1) Procesamiento tisular: Un portaobjetos de tejido se tiñe con anticuerpos oligoconjugados o sondas de ARN. 2) Selección de ROI: se visualiza el portaobjetos de tejido y se delinean los ROI, ya sea manual o automáticamente en función de ciertos patrones de fluorescencia. 3) Escisión de oligonucleótidos conjugados: la luz UV se dirige a los ROIs, lo que resulta en la escisión de los oligonucleótidos fotodivisibles. 4) Colección PC-oligo: Los PC-oligos se aspiran en un tubo microcapilar. 5) Placa: Los PC-oligos aspirados se depositan en una placa de microtitulación. 6) Repetir: Los pasos 3-5 se repiten para cada ROI; Entre cada ciclo, se realiza un lavado meticuloso. 7) Cuantificación: Los grupos de PC-oligos resueltos espacialmente se pueden hibridar a códigos de barras fluorescentes; esto permite el conteo digital de hasta aproximadamente 1 millón de eventos vinculantes por ROI. Alternativamente, los oligos PC se pueden cuantificar a través de NGS, en el que toda la placa de microtitulación se agrupa en un solo tubo y se secuencia. Las lecturas se traducen en recuentos digitales y se mapean de nuevo a su ROI original, creando un mapa visual de la expresión de proteínas o ARN dentro de cada sección de tejido. Esta cifra fue modificada de9, con permiso de Springer Nature (copyright 2020). Abreviaturas: DSP = procesamiento espacial digital; PC-oligos = oligonucleótidos fotodivisibles; ROIs = regiones de interés; NGS = secuenciación de próxima generación. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Mapa de calor representativo de un experimento DSP. Las columnas representan regiones individuales de interés. Las filas representan un objetivo proteico. La expresión baja se muestra en azul y la expresión alta se muestra en rojo. Abreviatura: DSP = procesamiento espacial digital. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| Perfil de células inmunes GeoMx - humano | Módulo pantumoral |
| PD-1 | MART1 |
| CD68 | NY-ESO-1 |
| HLA-DR | S100B |
| Ki-67 | Bcl-2 |
| Beta-2 Microglobulina | EpCAM |
| CD11c | Ella2 |
| CD20 | PTEN |
| CD3 | ER-alfa |
| CD4 | PR |
| CD45 | |
| CD56 | |
| CD8 | |
| CTLA4 | |
| GZMB | |
| PD-L1 | |
| PanCk | |
| SMA | |
| Fibronectina | |
| Rb IgG | |
| Sra. IgG1 | |
| Sra. IgG2a | |
| Histona H3 | |
| S6 | |
| GAPDH |
Tabla 1: Una muestra representativa de proteínas que se puede evaluar utilizando paneles de anticuerpos prediseñados.
| Piscina de trabajo de la sonda U | ||||||
| Módulo 2 Sonda R | Otros módulos | Agua tratada con DEPC (microlitros) | Volumen total (microlitros) | Sonda U Master Stock (microlitro) | Agua tratada con DEPC (microlitro) | Volumen total |
| 2 | ... | 16.5 | 2 | 14.5 | 16.5 | |
| 4 | ... | 33 | 4 | 29 | 33 | |
| 6 | ... | 49.5 | 6 | 43.5 | 49.5 | |
| 8 | ... | 66 | 8 | 58 | 66 |
Tabla 2: Códigos de hibridación y grupos de trabajo Probe R y Probe U. Abreviatura: hyb = hibridación; DEPC = pirocarbonato de dietilo.
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Discussion
Dada la diversidad de proteínas que podrían influir potencialmente en la agresividad de los gliomas y la noción de que varias de estas proteínas permanecen sin descubrir, un método de cuantificación de proteínas de alto rendimiento es un enfoque tecnológico ideal. Además, dado que los datos espaciales en muestras oncológicas a menudo se correlacionan con la expresión diferencial18, la incorporación del perfil espacial en el enfoque de cuantificación de proteínas permite un análisis más efectivo.
El enfoque de alto rendimiento de DSP también permite que se utilice en un enfoque similar a una escopeta, que es ideal para descubrir nuevos biomarcadores potenciales de enfermedad y respuesta a la terapia. En dos estudios de melanoma, se utilizó DSP para evaluar las respuestas al tratamiento combinado con ipilimumab y nivolumab versus nivolumab en monoterapia19 y al tratamiento combinado neoadyuvante con ipilimumab y nivolumab versus tratamiento adyuvante estándar20. En ambos estudios, el perfil DSP de una variedad de dianas proteicas después del tratamiento demostró una expresión relativa diferencial de marcadores inmunológicos clave, lo que sugiere un papel para los posibles biomarcadores de respuesta terapéutica.
DSP también facilita la determinación de la importancia patológica final de los procesos complejos a nivel molecular. Por ejemplo, una característica distintiva de los gliomas invasivos es su propensión a migrar directamente a través de la matriz extracelular (MEC), y su ruta migratoria a menudo está guiada por tractos vasculares y de sustancia blanca 1,2. La variabilidad en la expresión de proteínas del microambiente tisular es un sello distintivo de la transición epitelial-mesenquimal que impulsa la invasión. Varios estudios han examinado cómo los gliomas pueden regular al alza las metaloproteinasas de matriz (MMP), lo que resulta en la descomposición de la ECM circundante y el aumento de la invasividad21,22,23. Al visualizar y cuantificar el efecto acumulativo aguas abajo de esta regulación diferencial, DSP proporciona un análisis holístico a gran escala.
Un determinante clave del potencial maligno de los gliomas es su capacidad para interactuar y manipular las defensas inmunes del huésped. Al igual que otros tumores sólidos, los gliomas emplean una variedad de mecanismos para evadir la inmunovigilancia del huésped e interrumpir la activación de proteínas críticas para montar una respuesta inmune. Los avances recientes en inmunooncología se han centrado en la identificación de proteínas inmunogénicas que son expresadas o explotadas por tumores. A la vanguardia de estos desarrollos están el uso de células T para detectar antígenos tumorales inmunológicamente activos contra los cuales los virus oncolíticos pueden ser dirigidos 24,25, y el desarrollo de inhibidores de puntos de control contra proteínas inhibidoras de células T (por ejemplo, PD1 / PDL1 y CTLA4) para potenciar la inmunidad del huésped contra tumores 26,27 . Otras poblaciones estromales que ocupan un lugar destacado en el microambiente del glioma incluyen macrófagos, células endoteliales microvasculares, células inmunes y una subpoblación recientemente identificada denominada "células estromales asociadas a gliomas" (GASCs)28. Las interacciones de estas células con quimiocinas, citoquinas y componentes de la ECM tienen implicaciones importantes para la proliferación tumoral, la invasión y la respuesta al tratamiento y, por lo tanto, sirven como objetivos importantes para la cuantificación y comparación regional a través de tecnologías como DSP.
El protocolo DSP es fácil de usar y permite múltiples capas de personalización. Como gran parte del proceso de cuantificación está automatizado, los principales pasos dependientes del usuario están orientados a lograr la mayor sensibilidad y especificidad posibles de detección de objetivos. Por lo tanto, los pasos clave dentro del protocolo incluyen la determinación de una tinción para la visualización fluorescente inicial de la muestra, la delineación de ROI y la selección de los paneles de anticuerpos.
Al diseñar un protocolo de tinción, es importante identificar primero un objetivo que probablemente demuestre diferencias cuantificables entre varias regiones de la muestra, correspondientes a una característica crítica o comportamiento del tejido de origen. A continuación, se debe seleccionar un agente que enlazará efectivamente el destino. Por ejemplo, si uno espera visualizar regiones de hiperplasia o atipia nuclear, se puede elegir H&E o una tinción nuclear; Alternativamente, si se pretende visualizar cambios en la expresión de un gen que se sabe que está asociado con tejidos malignos o premalignos, se puede elegir un anticuerpo conjugado con fluoróforos. Las propias células tumorales pueden marcarse específicamente en el caso de tumores mutantes IDH1-R132H. El protocolo actual podría modificarse mediante la adición de IDH1-R132H marcado con fluorescencia como marcador morfológico (paso de protocolo 3.2). Se pueden utilizar hasta cuatro tinciones por muestra. Una vez que se ha producido la visualización del tejido teñido, se designan los ROI. La selección de ROI debe reflejar dónde se espera que ocurran diferencias significativas en la expresión de proteínas diana. Las consideraciones clave al seleccionar ROI incluyen el tamaño (10-600 μm de diámetro), la forma (círculo, rectángulo o dibujado por el usuario) y la segmentación (demarcando aún más las subregiones dentro de un solo ROI, ofreciendo una capa potencial adicional de análisis). Estas variables deben optimizarse para capturar de manera más efectiva la variación espacial en la expresión del objetivo que se anticipa en función del panel de anticuerpos seleccionado.
La selección del panel de anticuerpos es de importancia crítica, ya que la expresión diferencial de anticuerpos sirve en última instancia como punto final del estudio. Al realizar este paso, es importante considerar qué marcadores pueden exhibir una expresión que se correlacione positiva o negativamente con las etapas a lo largo del espectro del desarrollo del tumor, desde benignas hasta preinvasivas, invasivas o malignas. También es importante considerar cuidadosamente las propiedades tanto del tejido de origen como del tipo de tumor, ya que ambas características pueden influir en la expresión de ciertos marcadores.
Debido a que gran parte del proceso está automatizado, cualquier falla en el procedimiento generalmente se debe a un mal funcionamiento del hardware o software, lo que ofrece una capacidad limitada de solución de problemas para el usuario. Los problemas que pueden surgir incluyen la interrupción de la medida de control de calidad (QC) incorporada (diseñada para marcar y potencialmente omitir datos que sugieren una baja relación señal-ruido, recuentos bajos y detección inadecuada del objetivo), actualizaciones de software aberrantes y problemas de procedimiento (por ejemplo, terminación prematura de varios pasos). Para estos problemas, se recomienda que el usuario se ponga en contacto con el fabricante para obtener soporte remoto. Alternativamente, si el usuario encuentra problemas de datos intrínsecos (por ejemplo, bajo recuento de núcleos en general, baja variabilidad en la expresión entre ROI), puede considerar repetir pasos anteriores en el procedimiento (por ejemplo, volver a agrupar datos del TMA original, redefinir los ROI). También es importante considerar las variaciones en la densidad tisular como un posible factor de confusión de la producción antigénica y, por lo tanto, de la expresión de anticuerpos; Por lo tanto, los tejidos de densidades similares deben tratar de ser seleccionados para el análisis.
Las medidas de control están integradas en el protocolo. El programa proporciona un control interno positivo y negativo que tiene en cuenta las variaciones en la hibridación de los oligos PC a los códigos de barras fluorescentes. Las proteínas de limpieza ofrecen otro control positivo que además puede servir como un factor de normalización sobre la base de la celularidad.
La capacidad de definir el ROI dentro del cual se produce la cuantificación es la base de la capacidad de creación de perfiles espaciales de DSP. Esta demarcación personalizable de ROI marca un paso crítico y distintivo dentro del protocolo. La opción de crear un ROI tan pequeño como una sola célula permite la precisión regional en la cuantificación de proteínas o ácidos nucleicos, y la capacidad de definir múltiples ROI y cuantificar su contenido en tándem a través del análisis multiplex produce un enfoque de alto rendimiento.
Cuando los ROI se seleccionan para representar regiones patológicamente distintas dentro de una muestra de glioma (p. ej., necrótico, perivascular), el perfil proteómico y la comparación regional pueden revelar mecanismos de propagación y progresión tumoral. Por ejemplo, la IHQ se ha utilizado para cuantificar regionalmente la expresión del factor inducible por hipoxia (HIF-1α) en muestras de glioblastoma y ha revelado una mayor expresión cerca de áreas necróticas en comparación con las zonasperivasculares 29. Esto es consistente con varios estudios que indican un papel para la hipoxia en la tumorigénesis del glioma.
La variación regional también se ha estudiado ampliamente entre los componentes de las células inmunes del microambiente tumoral. Los macrófagos/microglía constituyen la población de células inmunes predominante en los gliomas y se han estudiado exhaustivamente a nivel regional. Se ha demostrado que las subpoblaciones de macrófagos asociados a tumores (TAM) desempeñan diferentes funciones en la progresión del tumor dependiendo de su ubicación dentro del tumor y el microambiente. Aquellos dentro del borde invasivo del tumor rompen la membrana basal, promoviendo la diseminación; aquellos en áreas hipóxicas ejercen un efecto angiogénico, facilitando el crecimiento; aquellos en proximidad a la vasculatura tumoral secretan EGF y factores asociados para dirigir las células tumorales del estroma hacia los vasos sanguíneos, lo que lleva a la metástasis30. Estas propiedades críticas y espacialmente dependientes demuestran el valor de los datos proteómicos regionales en la biología del cáncer y representan una importante aplicación adicional de DSP a la caracterización de poblaciones de células inmunes dentro de un tumor y su microambiente.
La técnica tiene algunas limitaciones, incluido el costo y el número relativamente pequeño de objetivos que están disponibles en los paneles de anticuerpos centrales. Además, aunque la resolución subcelular no es posible con DSP, sí lo será con las próximas nuevas tecnologías31. A pesar de estas limitaciones, DSP es una técnica poderosa para ciertos tipos de preguntas dirigidas y previamente sin respuesta en la biología celular del glioma. Esta tecnología innovadora presenta una oportunidad excepcional para descubrir nuevas perspectivas biológicas a través de la evaluación precisa de varios objetivos proteicos.
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Disclosures
Los autores no tienen conflictos de intereses que revelar.
Acknowledgments
Los autores reconocen el apoyo del Laboratorio de Genómica Clínica y Tecnología Avanzada del Departamento de Patología y Medicina de Laboratorio del Sistema de Salud Dartmouth Hitchcock. Los autores también reconocen el Recurso Compartido de Patología en el Centro Oncológico de Dartmouth con la Subvención de Apoyo al Centro Oncológico del NCI 5P30 CA023108-37.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BOND Research Detection System | Leica Biosystems, Wetzlar, Germany | DS9455 | Open detection system containing open containers in a reagent tray |
| BOND Wash | Leica Biosystems, Wetzlar, Germany | AR950 | 10X concentrated buffer solution for washing fixed tissue |
| Buffer W | NanoString, Seattle, WA | contact company | Blocking reagent |
| Cy3 conjugation kit | Abcam, Cambridge, UK | AB188287 | Cy3 fluorescent antibody conjugation kit |
| GeoMx Digital Spatial Profiler (DSP) | NanoString, Seattle, WA | contact company | System for imaging and characterizing protein and RNA targets |
| GeoMx DSP Instrument BufferKit | NanoString, Seattle, WA | 100471 | Buffer kit for GeoMX DSP (including buffers for sample processing and preparation) |
| GeoMx Hyb Code Pack_Protein | NanoString, Seattle, WA | 121300401 | Controls for running GeoMX DSP experiemtns |
| GeoMx Immune Cell Panel (Imm Cell Pro_Hs) | NanoString, Seattle, WA | 121300101 | Protein module with targets for human immune cells and immuno-oncologic targets |
| GeoMx Pan-Tumor Panel (Pan-Tumor_Hs) | NanoString, Seattle, WA | 121300105 | Protein module with targets for multiple human tumor types and for markers of epithelial-mesenchymal transition |
| GeoMx Protein Slide Prep FFPE | NanoString, Seattle, WA | 121300308 | Sample preparation reagents for GeoMX DSP protein analysis |
| LEICA Bond RX | Leica Biosystems, Wetzlar, Germany | contact company | Fully automated IHC stainer |
| Master Kit--12 reactions | NanoString, Seattle, WA | 100052 | Materials and reagents for use with the nCounter Analysis system |
| nCounter Analysis System | NanoString, Seattle, WA | contact company | Automated system for multiplex target expression quantification (to be used with GeoMx DSP) |
| TMA Master II | 3DHistech Ltd., Budapest, Hungary | To create the tissue microarray block |
References
- Pedersen, P. H., et al. Migratory patterns of lac-z transfected human glioma cells in the rat brain. International Journal of Cancer. 62 (6), 767-771 (1995).
- Wang, J., et al. Invasion of white matter tracts by glioma stem cells is regulated by a NOTCH1-SOX2 positive-feedback loop. Nature Neuroscience. 22 (1), 91-105 (2019).
- Iwadate, Y.
- Tao, C., et al. Genomics and prognosis analysis of epithelial-mesenchymal transition in glioma. Frontiers in Oncology. 10, 183 (2020).
- Cuddapah, V. A., Robel, S., Watkins, S., Sontheimer, H. A neurocentric perspective on glioma invasion. Nature Reviews Neuroscience. 15 (7), 455-465 (2014).
- Barthel, L., et al. Glioma: molecular signature and crossroads with tumor microenvironment. Cancer and Metastasis Reviews. 1 (1), 53-75 (2021).
- Ziegler, D. S., Kung, A. L., Kieran, M. W.
- Berghoff, A. S., et al. Programmed death ligand 1 expression and tumor-infiltrating lymphocytes in glioblastoma. Neuro-Oncology. 17 (8), 1064-1075 (2015).
- Merritt, C. R., et al. Multiplex digital spatial profiling of proteins and RNA in fixed tissue. Nature Biotechnology. 38 (5), 586-599 (2020).
- Van, T. M., Blank, C. U. A user's perspective on GeoMxTM digital spatial profiling. Immuno-Oncology Technology. 1, 11-18 (2019).
- Garcia-Pardo, M., Calles, A. ROS-1 NSCLC therapy resistance mechanism. Precision Cancer Medicine. , Online (2021).
- Ye, L., et al. Digital spatial profiling of individual glomeruli from patients with anti-neutrophil cytoplasmic autoantibody-associated glomerulonephritis. Frontiers in Immunology. 13, 831253 (2022).
- Bergholtz, H., et al. Best practices for spatial profiling for breast cancer research with the GeoMx digital spatial profiler. Cancers. 13 (17), 4456 (2021).
- Brady, L., et al. Inter- and intra-tumor heterogeneity of metastatic prostate cancer determined by digital spatial gene expression profiling. Nature Communications. 12 (1), 1426 (2021).
- Kulasinghe, A., et al. Highly multiplexed digital spatial profiling of the tumor microenvironment of head and neck squamous cell carcinoma patients. Frontiers in Oncology. 10, 607349 (2021).
- Wang, D. Y. -T., et al. Case study: Digital spatial profiling of metastatic clear cell carcinoma reveals intra-tumor heterogeneity in epithelial-mesenchymal gradient. bioRxiv. , (2021).
- GeoMx DSP. Automated slide preparation user manual. GeoMx DSP. , nanoString Technologies. Seattle, Washington. (2022).
- Allam, M., Cai, S., Coskun, A. F. Multiplex bioimaging of single-cell spatial profiles for precision cancer diagnostics and therapeutics. NPJ Precision Oncology. 4, 11 (2020).
- Wolchok, J. D., et al. Overall survival with combined nivolumab and ipilimumab in advanced melanoma. New England Journal of Medicine. 377 (14), 1345-1356 (2017).
- Blank, C. U., et al. Neoadjuvant versus adjuvant ipilimumab plus nivolumab in macroscopic stage III melanoma. Nature Medicine. 24 (11), 1655-1661 (2018).
- Matthews, R. T., et al. Brain-enriched hyaluronan binding (BEHAB)/brevican cleavage in a glioma cell line is mediated by a disintegrin and metalloproteinase with thrombospondin motifs (ADAMTS) family member. Journal of Biological Chemistry. 275 (30), 22695-22703 (2000).
- Paganetti, P. A., Caroni, P., Schwab, M. E. Glioblastoma infiltration into central nervous system tissue in vitro: involvement of a metalloprotease. Journal of Cell Biology. 107, 2281-2291 (1988).
- Beliën, A. T., Paganetti, P. A., Schwab, M. E. Membrane-type 1 matrix metalloprotease (MT1-MMP) enables invasive migration of glioma cells in central nervous system white matter. Journal of Cell Biology. 144 (2), 373-384 (1999).
- Coulie, P. G., Vanden Eynde, B. J., vander Bruggen, P., Boon, T. Tumour antigens recognized by T lymphocytes: At the core of cancer immunotherapy. Nature Reviews Cancer. 14 (2), 135-146 (2014).
- Finn, O. J. Vaccines for cancer prevention: a practical and feasible approach to the cancer epidemic. Cancer Immunology Research. 2 (8), 708-713 (2014).
- Sharma, P., Allison, J. P. The future of immune checkpoint therapy. Science. 348 (6230), 56-61 (2015).
- Chen, L., Han, X. Anti-PD-1/PD-L1 therapy of human cancer: past, present, and future. Journal of Clinical Investigation. 125 (9), 3384-3391 (2015).
- Cai, X., et al. Glioma-Associated stromal cells stimulate glioma malignancy by regulating the tumor immune microenvironment. Frontiers in Oncology. 11, 672928 (2021).
- Ishii,, et al. Histological characterization of the tumorigenic "peri-necrotic niche" harboring quiescent stem-like tumor cells in glioblastoma. PLoS One. 11 (1), 0147366 (2016).
- Lewis, C. E., Pollard, J. W. Distinct role of macrophages in different tumor microenvironments. Cancer Research. 66 (2), 605-612 (2006).
- NanoString. CosMx Spatial Molecular Imager: True Single-Cell In Situ Solution. NanoString. , (2022).
