Summary
La disregolazione proteomica svolge un ruolo importante nella diffusione dei gliomi diffusamente infiltranti, ma diverse proteine rilevanti rimangono non identificate. L'elaborazione spaziale digitale (DSP) offre un approccio efficiente e ad alto rendimento per caratterizzare l'espressione differenziale di proteine candidate che possono contribuire all'invasione e alla migrazione dei gliomi infiltrativi.
Abstract
I gliomi diffusamente infiltranti sono associati ad elevata morbilità e mortalità a causa della natura infiltrativa della diffusione del tumore. Sono tumori morfologicamente complessi, con un alto grado di variabilità proteomica sia nel tumore stesso che nel suo microambiente eterogeneo. Il potenziale maligno di questi tumori è potenziato dalla disregolazione delle proteine coinvolte in diversi percorsi chiave, compresi i processi che mantengono la stabilità cellulare e preservano l'integrità strutturale del microambiente. Sebbene ci siano state numerose analisi di glioma bulk e monocellulari, c'è una relativa scarsità di stratificazione spaziale di questi dati proteomici. La comprensione delle differenze nella distribuzione spaziale dei fattori tumorigenici e delle popolazioni di cellule immunitarie tra il tumore intrinseco, il bordo invasivo e il microambiente offre preziose informazioni sui meccanismi alla base della proliferazione e della propagazione del tumore. La profilazione spaziale digitale (DSP) rappresenta una potente tecnologia che può costituire la base per queste importanti analisi multistrato.
DSP è un metodo che quantifica in modo efficiente l'espressione proteica all'interno di regioni spaziali specificate dall'utente in un campione di tessuto. La DSP è ideale per studiare l'espressione differenziale di più proteine all'interno e tra le regioni di distinzione, consentendo più livelli di analisi quantitativa e qualitativa. Il protocollo DSP è sistematico e facile da usare, consentendo un'analisi spaziale personalizzata dei dati proteomici. In questo esperimento, i microarray tissutali sono costruiti da biopsie del nucleo di glioblastoma archiviate. Successivamente, viene selezionato un pannello di anticorpi, mirando alle proteine di interesse all'interno del campione. Gli anticorpi, che sono preconiugati a oligonucleotidi del DNA fotoscisvivi UV, vengono quindi incubati con il campione di tessuto durante la notte. Sotto la visualizzazione al microscopio a fluorescenza degli anticorpi, le regioni di interesse (ROI) all'interno delle quali quantificare l'espressione proteica sono definite con i campioni. La luce UV viene quindi diretta ad ogni ROI, fendendo gli oligonucleotidi del DNA. Gli oligonucleotidi sono microaspirati e contati all'interno di ciascun ROI, quantificando la proteina corrispondente su base spaziale.
Introduction
I gliomi diffusamente infiltranti sono il tipo più comune di tumore cerebrale maligno negli adulti e sono invariabilmente letali. La propensione delle cellule di glioma a migrare ampiamente nel cervello è una grande sfida terapeutica. Il meccanismo con cui si diffondono comporta la migrazione diretta e l'invasione incontrollata. Le cellule di glioma invasive hanno dimostrato di esibire tropismo e migrazione lungo i tratti di sostanza bianca1, con recenti ricerche che implicano la demielinizzazione di questi tratti come una caratteristica protumorigenica attiva2. L'invasione è mediata da una transizione epiteliale-mesenchimale, in cui le cellule di glioma acquisiscono proprietà mesenchimali riducendo l'espressione di geni codificanti proteine della matrice extracellulare e molecole di adesione cellulare, amplificando la migrazione e facilitando la propagazione attraverso il microambiente tumorale 3,4,5.
A livello molecolare, è stata dimostrata la rottura di diverse proteine che conferiscono stabilità cellulare e interfaccia con componenti immunogenici6. È noto che i gliomi infiltrativi subiscono la soppressione di proteine con proprietà anti-apoptotiche (ad esempio, PTEN)7. Inoltre sovraesprimono proteine che promuovono l'evasione della risposta immunitaria dell'ospite (ad esempio, PD1 / PDL1)8. La disregolazione di queste vie complesse aumenta la tumorigenicità e aumenta il potenziale maligno.
All'interno di campioni di glioma invasivo, l'obiettivo era quello di valutare l'espressione differenziale di proteine chiave per la crescita, la sopravvivenza e la proliferazione cellulare e per l'integrità strutturale del microambiente tra componenti invasive e non invasive. Inoltre, abbiamo cercato di studiare la regolazione differenziale delle proteine con un ruolo immunogenico attivo, offrendo informazioni sul meccanismo attraverso il quale le difese immunitarie dell'ospite compromesso possono aumentare il potenziale proliferativo e invasivo dei gliomi. Ciò è particolarmente rilevante data la recente ampiezza della ricerca che dimostra come i marcatori immunitari e i driver della disregolazione nella malignità possano servire come bersagli dell'immunoterapia. L'identificazione di bersagli terapeutici praticabili tra le molte proteine coinvolte nell'immunosorveglianza e nella reattività richiede un approccio altamente sensibile e completo.
Data l'ampia gamma di proteine candidate che possono essere studiate, abbiamo cercato un metodo simile all'immunoistochimica ma con una maggiore efficienza di elaborazione dei dati. Nel campo della biologia del cancro, DSP è emersa come una potente tecnologia con importanti vantaggi rispetto agli strumenti alternativi per l'analisi proteomica e la quantificazione. Il segno distintivo del DSP è la sua capacità di multiplexing ad alto rendimento, che consente lo studio simultaneo di diverse proteine all'interno di un campione, segnando un'importante distinzione dalle tecnologie standard ma a basso plex come l'immunoistochimica (IHC)9,10. La caratteristica multiplex del DSP non ne compromette la fedeltà come strumento quantitativo e analitico, come dimostrato da studi che confrontano DSP e IHC. Quando viene utilizzato per la quantificazione proteomica di campioni di carcinoma polmonare non a piccole cellule, ad esempio, DSP ha dimostrato di avere risultati simili a IHC11. Inoltre, DSP offre specifiche regionali personalizzabili, in cui gli utenti possono definire manualmente le regioni all'interno delle quali eseguire l'analisi proteomica. Ciò presenta un vantaggio rispetto ai metodi multiplex a sezione intera10,12. In un unico ciclo di elaborazione, DSP offre quindi più livelli di analisi esaminando diversi bersagli proteici in più regioni di interesse.
DSP ha applicazioni in diversi contesti patologici. La DSP è particolarmente vantaggiosa nell'analisi oncologica, poiché la variazione spaziale può essere correlata alla trasformazione cellulare e all'espressione differenziale delle proteine. Ad esempio, DSP è stato utilizzato per confrontare il profilo proteomico del cancro al seno con il microambiente tumorale adiacente. Ciò comporta importanti implicazioni per la comprensione della storia naturale di questo tumore e della sua progressione, nonché della potenziale risposta al trattamento13. Ulteriori contesti che illustrano la versatilità della DSP includono la quantificazione spaziale della diversità proteica nel carcinoma prostatico14, l'associazione dell'espressione dei marcatori delle cellule immunitarie con la progressione della malattia nel carcinoma a cellule squamose della testa e del collo 15 e la dimostrazione di un gradiente epiteliale-mesenchimale dell'espressione proteica che distingue il carcinoma ovarico metastatico da quello primario a cellule chiare16 . Implementando la DSP, caratterizziamo la topografia spaziale delle proteine che potrebbero influenzare la tumorigenesi e l'invasione dei gliomi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Il protocollo descritto di seguito segue le linee guida del Dartmouth-Hitchcock Human Research Ethics Committee. Il consenso informato è stato ottenuto dai pazienti i cui campioni di tessuto sono stati inclusi in questo studio. Vedere la sezione Tabella dei materiali per i dettagli relativi a tutti i materiali, i reagenti, le apparecchiature e il software utilizzati in questo protocollo.
1. Preparazione della diapositiva17
- Recuperare o preparare tessuto fissato in formalina, incorporato in paraffina da gliomi infiltranti diffusamente di tipo adulto umano.
NOTA: In questo esperimento, sono stati utilizzati blocchi di biopsie incorporati in paraffina di tre pazienti con glioblastoma. - Creare un blocco di microarray tissutale (TMA). Prendi diversi nuclei di 2 mm da ogni biopsia e mettili in un singolo blocco TMA (Figura 1, in alto). Tagliare le sezioni dal blocco TMA a 4 μm e montarle su vetrini. Posizionare ogni diapositiva all'interno della guarnizione del portaslitte. Incubare il vetrino a 60 °C per 30 min.
2. Preparazione semi-automatica del sistema IHC e configurazione del software (per il caricamento e l'esecuzione delle diapositive)17
- Impostare i reagenti. Fare clic sul pulsante Reagent Setup (Configurazione reagente ). Fare clic su Aggiungi nella scheda Configurazione .
- Registrare un wash buffer digitando un nome nel campo Nome . Selezionare Ancillary nel campo Tipo . Clicca su Salva.
- Registrare una soluzione di blocco ripetendo gli stessi passaggi di cui sopra (modificati se applicabile, ad esempio, nel campo Nome ), ma selezionando Anticorpo primario nel campo Tipo . Selezionare i protocolli desiderati nelle caselle a discesa per Default Staining Protocol e Default HIER Protocol. Selezionare un'opzione Protocollo enzimatico predefinito , se lo si desidera (questa casella è stata lasciata vuota nel protocollo corrente). Clicca su Salva.
- Registrare il sistema di rilevamento, costituito da un vassoio contenitore di reagenti con codice a barre. Scansiona il codice a barre.
- Iniziare a immettere i dettagli del sistema di reagenti nella finestra Aggiungi sistema di reagenti di ricerca . Digitare un Nome per il sistema di rilevamento.
- Digitare una data di scadenza. Evidenziare la prima riga del grafico dei reagenti e scansionare il codice a barre di un nuovo contenitore di reagenti da 30 ml, momento in cui il codice a barre popolerà la riga 1.
- Posizionare il contenitore nella posizione 1 del sistema di rilevamento. Selezionare il nome del wash buffer nella casella a discesa della colonna Reagente e fare clic su Aggiungi. Ripetere questi passaggi per aggiungere eventuali reagenti aggiuntivi nelle righe successive, inclusa la soluzione di blocco.
- Impostare il protocollo proteico per IHC. Fare clic su Impostazione protocollo. Evidenziare la riga corrispondente al protocollo desiderato e fare clic su Copia. Immettere il Nome e compilare tutti gli altri campi pertinenti nella finestra Modifica proprietà protocollo .
- Selezionare la casella Mostra passaggi di lavaggio. Verificare che i campi Inc (min) e DispenseType siano corretti per ciascun reagente (10 min per la soluzione bloccante, 0 min per il tampone di lavaggio e 150 μL per ogni DispenseType). Clicca su Salva.
- Prepara lo studio. Riempire il contenitore in posizione 1 con un tampone di lavaggio. Riempire 150 μL per vetrino e 5 ml di volume morto; Lasciare il coperchio aperto. Ripetere questi passaggi per il contenitore nella posizione 2, che deve essere riempito con una soluzione di blocco. Questo contenitore dovrebbe avere 150 μL per vetrino e 350 μL di volume morto.
- Caricare il vassoio del contenitore dei reagenti sulla macchina. Consentire al sistema di eseguire misure di riconoscimento del contenitore e conferma del volume. Fare clic su Slide Setup | Aggiungi studio. Inserire l'ID dello studio e il nome dello studio e selezionare 150 μL in Volume di erogazione | il protocollo desiderato nel menu a discesa Protocollo di preparazione (si consiglia Bake and Dewax ). Evidenzia lo studio e fai clic su Aggiungi diapositiva.
- Selezionare il tessuto in esame sotto Tipo di tessuto | 150 μL in Volume di erogazione | Singolo e Routine dalle caselle a discesa Modalità colorazione . Selezionare un processo (IHC per lo studio corrente) | il nome della soluzione di blocco nella casella a discesa del campo Marcatore | Protocollo DSP IHC nel campo Colorazione della scheda Protocolli | * Cuocere e decerare per la preparazione | *HIER 20 minuti con ER1 per HIER. Lasciare vuoto il campo Enzima .
- Ripetere questa procedura per ogni diapositiva. Fare clic su Chiudi una volta terminato, quindi fare clic su Stampa etichette. Controllare tutte le etichette diapositiva non ancora stampate per lo studio corrente e fare clic su Stampa. Applicare etichette sulla parte superiore delle diapositive.
- Caricare ed eseguire diapositive. Caricare le diapositive sul vassoio di scorrimento, assicurandosi che il campione e l'etichetta siano rivolti verso l'alto. Posiziona i riquadri di copertura sopra le diapositive, assicurandoti che le diapositive siano orientate con le schede nella parte inferiore. Caricare i vassoi di scorrimento sullo strumento.
- Premere il pulsante LED per abbassare il vassoio e consentire allo strumento di iniziare la scansione e il riconoscimento delle diapositive. Fare clic sul pulsante Start per iniziare l'esperimento.
- Completa l'esperimento. Premere il pulsante LED quando lampeggia in verde, indicando il completamento dell'esecuzione. Rimuovere il vassoio dallo strumento e sollevare con attenzione le piastrelle di copertura da ogni vetrino. Posizionare i vetrini in 1x soluzione salina tamponata con fosfato (PBS), rimuovere il tampone in eccesso e delineare ogni sezione di tessuto con una penna idrofobica per creare una barriera idrofobica.
3. Incubazione di anticorpi e colorazione dei nuclei17
- Selezionare un pannello di anticorpi per localizzare gli antigeni di interesse (vedere Tabella 1 per gli anticorpi utilizzati in questo esperimento).
NOTA: Ogni anticorpo è già stato coniugato ad un oligonucleotide del DNA con un segmento UV-fotosciavabile (PC-oligo) che lo identifica in modo univoco (oligo indicizzatori, Figura 2). - Realizzare una soluzione anticorpo-PC-oligo funzionante aggiungendo, per ogni vetrino, 8 μL di ciascun anticorpo (diluito 1:40) nel pannello. Utilizzare il reagente bloccante come diluente per raggiungere il volume finale di 200 μL per ogni vetrino. Incubare per una notte a 4 °C (Figura 3, Fase 1).
NOTA: marcatori morfologici, coloranti biologici o anticorpi marcati con fluorescenza possono anche essere aggiunti alla soluzione in questa fase. - Il giorno successivo, posizionare il vetrino in un barattolo Coplin e lavare 3 x 10 minuti in 1x TBS-T. Postfisso in paraformaldeide al 4% per 30 minuti a temperatura ambiente, seguito da 2 x 5 minuti in 1x TBS-T.
- Aggiungere la macchia nucleare SYTO13 (diluita 1:10 in 1x TBS) per 15 minuti a temperatura ambiente. Lavare 2x con 1x TBS-T, quindi conservare il vetrino in 1x TBS-T.
4. Visualizzazione della fluorescenza, identificazione del ROI e fotoscissione UV sullo strumento DSP17
- Dopo aver passato il mouse sopra Raccolta dati nel Centro di controllo, selezionare Nuovo/Continua esecuzione.
- Posizionare la diapositiva nel portavetrina, con l'etichetta rivolta verso l'utente. Abbassare il morsetto del vassoio di scorrimento, assicurandosi che il tessuto sia visibile nella finestra allungata. Aggiungere 6 mL di Buffer S.
- Seguire le istruzioni nel Centro di controllo. Ingrandisci tra diversi assi con i cursori X e Y per delineare una regione per la scansione. Seleziona Scansione. Consentire la scansione fino a quando non è stata ripresa l'intera area di destinazione definita.
- Genera un'immagine 20x. Definire il ROI automaticamente o manualmente (Figura 3, Passaggio 2). Per seguire questo protocollo, selezionare tre ROI circolari di dimensioni uguali (diametro di 250 μm) per ciascun nucleo di tessuto (Figura 4, in basso).
NOTA: i ROI sono personalizzabili in termini di dimensioni e forma. È possibile selezionare diversi ROI all'interno di ogni sezione. In questo esperimento, i ROI circolari vengono definiti manualmente. - Approvare i ROI facendo clic sul pulsante Esci dall'area di lavoro di scansione . Attendere che la luce UV scissa gli oligo dagli anticorpi.
- Quando il processo di pulizia dello strumento è stato completato, selezionare Nuova raccolta dati per continuare con le diapositive o la piastra corrente. In caso contrario, selezionare Rimuovi diapositive e micropiastra.
- Aprire la finestra Finalizza piastra facendo doppio clic sull'area dell'icona della piastra in basso a destra del Centro di controllo. Se il numero di lotto del Code Pack di ibridazione (Hyb ) (#) è noto, immettere il numero e fare clic su Aggiorna (facoltativo durante questo passaggio). Fare clic su Finalizza.
- Staccare il portavetrini e la piastra di raccolta seguendo le istruzioni. Conservare le diapositive in TBS-T. Se i vetrini non verranno utilizzati per un lungo periodo, coprirli con un mezzo acquoso e un coprifoglio.
5. Lettura delle proteine17
- Utilizzare una guarnizione permeabile e asciugare gli aspirati a 65 °C in un termociclatore con la parte superiore aperta. Aggiungere 7 μL di acqua trattata con dietil pirocarbonato e mescolare. Incubare a RT per 10 minuti, quindi girare rapidamente.
- Scegliere le equazioni R e U della sonda appropriate dalla Tabella 2 per guidare la creazione della miscela sonda/tampone. Sulla base del numero di codici Hyb necessari per l'ibridazione nel presente esperimento, applicare l'equazione (1) come di seguito. Mescolare e centrifugare rapidamente.
# Hyb Codes Probe R Working Pool Probe U Working Pool Hybridization Buffer n = _______ (n × 8 μL) = _____ μL + (n × 8 μL) = ______ μL + (n × 80 μL) = _____ μL (1) - Aggiungere 84 μL di Probe/Buffer Mix a ciascun Hyb Code Pack da utilizzare. Scorri per mescolare e girare. In una nuova piastra di ibridazione a 96 pozzetti, aggiungere 8 μL di ciascuna miscela Master di Hyb Code in tutti i 12 pozzetti della fila indicata.
- Trasferire 7 μL dalla piastra di raccolta DSP al pozzetto corrispondente nella piastra di ibridazione. Mescolare delicatamente. Sigillare a caldo ed eseguire una rapida centrifuga. Quindi, incubare per una notte a 67 ° C. Raffreddare il piatto sul ghiaccio ed eseguire un giro veloce.
- Raggruppare i prodotti hyb da ciascun pozzetto in un tubo a striscia, convogliando delicatamente ogni pozzetto 5 volte per mescolare. Tappare il tubo della striscia e girare verso il basso. Congelare eventuali prodotti hyb rimanenti non raggruppati a -80 °C. Caricare i tubi a nastro nel sistema di analisi.
- Salvare il file CDF su un'unità USB, quindi trasferire i dati dallo strumento DSP all'analizzatore digitale. Completare la configurazione eseguendo i passaggi seguenti.
- Caricare materiali di consumo e campioni raggruppati sulla stazione di preparazione. Sullo schermo, premere Avvia elaborazione. Selezionare Alta sensibilità, quindi Avanti. Premere Seleziona tutto per il numero di pozzi con campioni | Finisci | Avanti sulla notifica e-mail | Inizio.
- Una volta terminata la stazione di preparazione, sigillare la cartuccia e trasferirla all'analizzatore digitale. Premere Start Counting, selezionare Stage Position, premere Load Existing CDF file e selezionare il file precedentemente caricato. Premete Fine, selezionate nuovamente la posizione dello stage, premete Fine | Avviare l'esecuzione del programma.
- Salvare il file compresso dei file di conversione del conteggio reporter dal sistema di analisi a un'unità USB, quindi inserire l'unità nella macchina DSP. Nel Centro di controllo DSP, passare il puntatore del mouse su Raccolta dati, quindi fare clic su Conteggi caricamento. Selezionare il file compresso pertinente.
6. Analisi dei dati17
- Fare clic su Record nel Centro di controllo DSP. Per visualizzare le scansioni nella coda, selezionare Aggiungi scansioni selezionate alla coda | La mia coda di analisi. Selezionare Nuovo studio dalla coda dopo aver passato il puntatore del mouse sull'opzione Analisi dati nel Centro di controllo.
- Scegliere Controllo qualità da Opzioni barra delle applicazioni. Continuare con i valori predefiniti o modificarli se lo si desidera. Selezionare Esegui controllo qualità ed esaminare la griglia dei risultati. Fare clic su Esegui QC per procedere e creare un nuovo set di dati, normalizzando i valori ai controlli di ibridazione positiva.
- Importare i nuovi tag in un file XLSX. Selezionare Gestisci annotazioni nel riquadro Scansioni , quindi scaricare un modello, inserire i tag e importare il file.
- FACOLTATIVO: dopo aver eseguito QC, regolare ulteriormente i dati utilizzando altre opzioni della barra degli strumenti. Utilizzare gli strumenti nel riquadro Visualizzazioni per tracciare i dati trasformati.
- Spostarsi nella casella grigia a discesa dei parametri per comporre ogni grafico nel riquadro Visualizzazioni . Selezionare una particolare regione all'interno di un grafico per visualizzare i segmenti evidenziati corrispondenti nel riquadro Scansioni e fare clic con il pulsante destro del mouse per generare tag o gruppi. All'interno di Riepilogo set di dati, rivedere i grafici da Normalizzazione, Ridimensionamento e altre opzioni per l'analisi e la visualizzazione.
- Salvare una visualizzazione selezionando l'icona da salvare; rivedere le visualizzazioni già salvate in Riepilogo. Selezionare il pulsante Esporta (.svg) per esportare una visualizzazione in formato .svg. Esportare i dati su cui si basa una visualizzazione facendo clic sul pulsante Esporta (.xlsx). Esportare tutti i dati contenuti all'interno di un set di dati specifico posizionando il cursore sul nome del set di dati nel secondo riquadro e facendo clic sull'icona di esportazione .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
La Figura 4 mostra i risultati rappresentativi di un esperimento DSP eseguito su campioni di glioblastoma. Viene presentata una mappa di calore, che illustra uno dei metodi con cui acquisire visivamente i dati utilizzando il software DSP. Le righe rappresentano i bersagli proteici e ogni colonna corrisponde a una regione di interesse. Una gamma di colori dal blu al rosso denota rispettivamente un'espressione da bassa ad alta. La variabilità del colore all'interno di una riga riflette l'eterogeneità proteica regionale e suggerisce una possibile associazione spaziale con l'espressione proteica differenziale. Ad esempio, nel presente esperimento, S100 e CD56 sono universalmente alti perché sono marcatori neurali.
I marcatori con la maggiore variabilità includevano B7-H3, Ki-67, CD44 e fibronectina. Questi marcatori hanno importanti associazioni con la proliferazione tumorale, la migrazione e le metastasi, rispettivamente. È quindi ragionevole che mostrino variabilità regionale tra campioni di nucleo maligno, invasione maligna e tessuto non maligno. È anche possibile la rappresentazione numerica dei dati; un file contenente il valore di espressione di ciascun marcatore proteico all'interno di un ROI in forma di tabella può essere esportato per analisi matematiche e statistiche. Questo valore di espressione è prodotto dalla funzione di conteggio digitale disponibile tramite DSP, che quantifica gli oligo PC microaspirati all'interno di ciascun ROI (Figura 1 e Figura 2).
Figura 1: Definizione delle regioni di interesse nel microarray tissutale da biopsie di glioblastoma. Sezione superiore, colorata con ematossilina ed eosina di microarray tissutale contenente diverse biopsie core di 2 mm di diametro da un totale di tre pazienti con glioblastoma. In basso, regioni di interesse definite sull'immagine a fluorescenza. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 2: Oligonucleotidi fotoscivoli. Le sonde anticorpali o antisenso oligonucleotidiche per bersagli proteici o RNA, rispettivamente, sono legate covalentemente agli oligonucleotidi con linker fotoscissabili. Le sezioni di tessuto sono macchiate con le sonde. La luce UV viene quindi diretta ai ROI per rilasciare gli oligo PC, che vengono conteggiati digitalmente. Questa cifra è stata modificata da9, con il permesso di Springer Nature (copyright 2020). Abbreviazioni: PC-oligos = oligonucleotidi fotoscisviabili; ROI = regioni di interesse. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 3: Procedura DSP. 1) Lavorazione dei tessuti: un vetrino tissutale viene colorato con anticorpi oligo-coniugati o sonde di RNA. 2) Selezione del ROI: viene visualizzata la visualizzazione del vetrino del tessuto e i ROI vengono delineati, manualmente o automaticamente, in base a determinati modelli di fluorescenza. 3) Scissione degli oligonucleotidi coniugati: la luce UV è diretta verso i ROI, con conseguente scissione degli oligonucleotidi fotoscisabili. 4) Raccolta PC-oligo: I PC-oligos vengono aspirati in un tubo microcapillare. 5) Placcatura: Gli oligo PC aspirati vengono depositati in una piastra di microtitolazione. 6) Ripetere: i passaggi 3-5 vengono ripetuti per ogni ROI; Tra ogni ciclo viene eseguito un lavaggio meticoloso. 7) Quantificazione: pool di PC-oligo risolti spazialmente possono essere ibridati in codici a barre fluorescenti; ciò consente il conteggio digitale fino a circa 1 milione di eventi vincolanti per ROI. In alternativa, gli oligo PC possono essere quantificati tramite NGS, in cui l'intera piastra del microtitolo viene raggruppata in un singolo tubo e sequenziata. Le letture vengono quindi tradotte in conteggi digitali e mappate al loro ROI originale, creando una mappa visiva dell'espressione di proteine o RNA all'interno di ciascuna sezione tissutale. Questa cifra è stata modificata da9, con il permesso di Springer Nature (copyright 2020). Abbreviazioni: DSP = elaborazione spaziale digitale; PC-oligos = oligonucleotidi fotoscisabili; ROI = regioni di interesse; NGS = sequenziamento di nuova generazione. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 4: Mappa di calore rappresentativa di un esperimento DSP. Le colonne rappresentano le singole aree di interesse. Le righe rappresentano un bersaglio proteico. L'espressione bassa è mostrata in blu e l'espressione alta è mostrata in rosso. Abbreviazione: DSP = elaborazione spaziale digitale. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
| GeoMx ImmunoCell Profiling - umano | Modulo Pan-Tumor |
| PD-1 · | MART1 |
| CD68 | NY-ESO-1 |
| HLA-DR | S100B |
| Ki-67 · | Bcl-2 |
| Beta-2 Microglobulina | EpCAM |
| CD11c | Her2 |
| CD20 | PTEN |
| CD3 | ER-alfa |
| CD4 | PR |
| CD45 | |
| CD56 | |
| CD8 | |
| CTLA4 | |
| GZMB | |
| PD-L1 | |
| PanCk | |
| SMA | |
| Fibronectina | |
| Rb IgG | |
| Sig.ra IgG1 | |
| Sig.ra IgG2a | |
| Istone H3 | |
| S6 | |
| GAPDH |
Tabella 1: Un campione rappresentativo di proteine che può essere valutato utilizzando pannelli anticorpali predefiniti.
| Sonda U Working Pool | ||||||
| Modulo 2 Sonda R | Altri moduli | Acqua trattata con DEPC (microlitri) | Volume totale (microlitri) | Sonda U Master Stock (microlitro) | Acqua trattata con DEPC (microlitro) | volume totale |
| 2 | ... | 16.5 | 2 | 14.5 | 16.5 | |
| 4 | ... | 33 | 4 | 29 | 33 | |
| 6 | ... | 49.5 | 6 | 43.5 | 49.5 | |
| 8 | ... | 66 | 8 | 58 | 66 |
Tabella 2: Codici di ibridazione e pool di lavoro Probe R e Probe U. Abbreviazione: hyb = ibridazione; DEPC = dietil pirocarbonato.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Data la diversità delle proteine che potrebbero potenzialmente influenzare l'aggressività dei gliomi e l'idea che molte di queste proteine rimangono sconosciute, un metodo di quantificazione delle proteine ad alto rendimento è un approccio tecnologico ideale. Inoltre, dato che i dati spaziali nei campioni oncologici sono spesso correlati con l'espressione differenziale18, incorporare la profilazione spaziale nell'approccio di quantificazione delle proteine consente un'analisi più efficace.
L'approccio ad alto rendimento del DSP consente inoltre di utilizzarlo in un approccio simile a un fucile, ideale per scoprire potenziali nuovi biomarcatori di malattia e risposta alla terapia. In due studi sul melanoma, la DSP è stata utilizzata per valutare le risposte alla terapia di associazione con ipilimumab e nivolumab rispetto a nivolumab in monoterapia19 e alla terapia di associazione neoadiuvante con ipilimumab e nivolumab rispetto al trattamento adiuvante standard20. In entrambi gli studi, il profilo DSP di una varietà di bersagli proteici dopo il trattamento ha dimostrato un'espressione relativa differenziale di marcatori immunologici chiave, suggerendo un ruolo per potenziali biomarcatori di risposta terapeutica.
La DSP facilita anche la determinazione del significato patologico ultimo di processi complessi a livello molecolare. Ad esempio, una caratteristica distintiva dei gliomi invasivi è la loro propensione a migrare direttamente attraverso la matrice extracellulare (ECM), e il loro percorso migratorio è spesso guidato da tratti vascolari e di sostanza bianca 1,2. La variabilità nell'espressione proteica del microambiente tissutale è un segno distintivo della transizione epiteliale-mesenchimale che guida l'invasione. Diversi studi hanno esaminato come i gliomi possono sovraregolare le metalloproteinasi della matrice (MMP), con conseguente rottura della ECM circostante e aumento dell'invasività21,22,23. Visualizzando e quantificando l'effetto cumulativo a valle di questa regolazione differenziale, DSP fornisce un'analisi olistica su larga scala.
Un fattore determinante del potenziale maligno dei gliomi è la loro capacità di interagire e manipolare le difese immunitarie dell'ospite. Analogamente ad altri tumori solidi, i gliomi impiegano una varietà di meccanismi per eludere l'immunosorveglianza dell'ospite e interrompere l'attivazione di proteine critiche per montare una risposta immunitaria. I recenti progressi nell'immuno-oncologia si sono concentrati sull'identificazione delle proteine immunogeniche che sono espresse o sfruttate dai tumori. In prima linea in questi sviluppi ci sono l'uso di cellule T per rilevare antigeni tumorali immunologicamente attivi contro i quali i virus oncolitici possono essere diretti 24,25 e lo sviluppo di inibitori del checkpoint contro le proteine inibitorie delle cellule T (ad esempio, PD1 / PDL1 e CTLA4) per potenziare l'immunità dell'ospite contro i tumori 26,27 . Altre popolazioni stromali che figurano in modo prominente nel microambiente del glioma includono macrofagi, cellule endoteliali microvascolari, cellule immunitarie e una sottopopolazione recentemente identificata denominata "cellule stromali associate al glioma" (GASC)28. Le interazioni di queste cellule con chemochine, citochine e componenti della ECM hanno importanti implicazioni per la proliferazione del tumore, l'invasione e la risposta al trattamento, e quindi servono come obiettivi importanti per la quantificazione regionale e il confronto attraverso tecnologie come DSP.
Il protocollo DSP è facile da usare e consente più livelli di personalizzazione. Poiché gran parte del processo di quantificazione è automatizzato, i principali passaggi dipendenti dall'utente sono orientati al raggiungimento della massima sensibilità e specificità possibile del rilevamento del target. I passaggi chiave all'interno del protocollo includono quindi la determinazione di una colorazione per la visualizzazione fluorescente iniziale del campione, la delineazione dei ROI e la selezione dei pannelli anticorpali.
Quando si progetta un protocollo di colorazione, è importante identificare prima un bersaglio che possa dimostrare differenze quantificabili tra le varie regioni del campione, corrispondenti a una caratteristica critica o a un comportamento del tessuto di origine. Successivamente, è necessario selezionare un agente che aggiunga efficacemente la destinazione. Ad esempio, se si spera di visualizzare regioni di iperplasia o atipia nucleare, può essere scelto H & E o una colorazione nucleare; In alternativa, se si mira a visualizzare i cambiamenti nell'espressione di un gene noto per essere associato a tessuti maligni o premaligni, può essere scelto un anticorpo coniugato con fluorofori. Le cellule tumorali stesse possono essere specificamente etichettate nel caso di tumori mutanti IDH1-R132H. Il presente protocollo potrebbe essere modificato con l'aggiunta di IDH1-R132H marcato fluorescentmente come marcatore morfologico (fase 3.2 del protocollo). Possono essere utilizzate fino a quattro macchie per campione. Una volta che si è verificata la visualizzazione del tessuto colorato, vengono designati i ROI. La selezione dei ROI dovrebbe riflettere dove si prevedono differenze significative nell'espressione del bersaglio proteico. Le considerazioni chiave nella selezione del ROI includono dimensioni (diametro 10-600 μm), forma (cerchio, rettangolo o disegnato dall'utente) e segmentazione (demarcazione ulteriore delle sottoregioni all'interno di un singolo ROI, offrendo un ulteriore potenziale livello di analisi). Queste variabili devono essere ottimizzate per catturare nel modo più efficace la variazione spaziale nell'espressione bersaglio che viene anticipata in base al pannello anticorpale selezionato.
La selezione del pannello anticorpale è di fondamentale importanza, poiché l'espressione differenziale degli anticorpi serve in ultima analisi come punto finale dello studio. Quando si esegue questo passaggio, è importante considerare quali marcatori possono mostrare un'espressione correlata positivamente o negativamente con le fasi lungo lo spettro dello sviluppo del tumore, da benigno, a preinvasivo, a invasivo o maligno. È anche importante considerare attentamente le proprietà sia del tessuto di origine che del tipo di tumore, poiché entrambe queste caratteristiche possono influenzare l'espressione di alcuni marcatori.
Poiché gran parte del processo è automatizzato, eventuali difetti nella procedura sono generalmente dovuti a malfunzionamenti hardware o software, offrendo capacità di risoluzione dei problemi dell'utente limitate. I problemi che possono sorgere includono l'interruzione della misura di controllo qualità (QC) integrata (progettata per contrassegnare e potenzialmente omettere dati indicativi di basso rapporto segnale-rumore, conteggi bassi e rilevamento del target inadeguato), aggiornamenti software aberranti e problemi procedurali (ad esempio, interruzione anticipata di vari passaggi). Per questi problemi, si consiglia all'utente di contattare il produttore per il supporto remoto. In alternativa, se l'utente riscontra problemi intrinseci di dati (ad esempio, basso numero di nuclei complessivi, bassa variabilità nell'espressione tra i ROI), può prendere in considerazione la possibilità di ripetere i passaggi precedenti della procedura (ad esempio, riraggruppare i dati dalla TMA originale, ridefinire i ROI). È anche importante considerare le variazioni nella densità tissutale come un potenziale confondente della produzione antigenica e quindi dell'espressione anticorpale; Pertanto, i tessuti di densità simili dovrebbero mirare ad essere selezionati per l'analisi.
Le misure di controllo sono integrate nel protocollo. Il programma fornisce sia un controllo interno positivo che negativo che tiene conto delle variazioni nell'ibridazione degli oligo PC ai codici a barre fluorescenti. Le proteine domestiche offrono un altro controllo positivo che può inoltre servire come fattore di normalizzazione sulla base della cellularità.
La capacità di definire i ROI all'interno dei quali avviene la quantificazione è alla base della capacità di profilazione spaziale del DSP. Questa demarcazione personalizzabile dei ROI segna un passaggio critico e distintivo all'interno del protocollo. L'opzione di creare un ROI piccolo come una singola cella consente una precisione regionale nella quantificazione di proteine o acidi nucleici e la capacità di definire più ROI e quantificare il loro contenuto in tandem attraverso l'analisi multiplex produce un approccio ad alto rendimento.
Quando i ROI sono selezionati per rappresentare regioni patologicamente distinte all'interno di un campione di glioma (ad esempio, necrotico, perivascolare), il profilo proteomico e il confronto regionale possono rivelare meccanismi di propagazione e progressione del tumore. Ad esempio, IHC è stato utilizzato per quantificare a livello regionale l'espressione del fattore inducibile dall'ipossia (HIF-1α) nei campioni di glioblastoma e ha rivelato una maggiore espressione vicino alle aree necrotiche rispetto alle zone perivascolari29. Ciò è coerente con diversi studi che indicano un ruolo per l'ipossia nella tumorigenesi del glioma.
La variazione regionale è stata anche ampiamente studiata tra i componenti delle cellule immunitarie del microambiente tumorale. I macrofagi/microglia costituiscono la popolazione di cellule immunitarie predominanti nei gliomi e sono stati studiati in modo completo su base regionale. È stato dimostrato che le sottopopolazioni di macrofagi associati al tumore (TAM) svolgono ruoli diversi nella progressione tumorale a seconda della loro posizione all'interno del tumore e del microambiente. Quelli all'interno del bordo invasivo del tumore abbattono la membrana basale, promuovendo la diffusione; quelli in aree ipossiche esercitano un effetto angiogenico, facilitando la crescita; quelli in prossimità della vascolarizzazione tumorale secernono EGF e fattori associati per dirigere le cellule tumorali stromali verso i vasi sanguigni, guidando le metastasi30. Queste proprietà critiche e spazialmente dipendenti dimostrano il valore dei dati proteomici regionali nella biologia del cancro e rappresentano un'importante applicazione aggiuntiva della DSP alla caratterizzazione delle popolazioni di cellule immunitarie all'interno di un tumore e del suo microambiente.
La tecnica ha alcune limitazioni, tra cui il costo e il numero relativamente piccolo di bersagli disponibili nei pannelli anticorpali principali. Inoltre, sebbene la risoluzione subcellulare non sia possibile con DSP, sarà possibile con le prossime nuove tecnologie31. Nonostante queste limitazioni, la DSP è una tecnica potente per alcuni tipi di domande mirate e precedentemente senza risposta nella biologia cellulare del glioma. Questa tecnologia innovativa rappresenta un'eccezionale opportunità per scoprire nuove prospettive biologiche attraverso una valutazione precisa di vari bersagli proteici.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Gli autori non hanno conflitti di interesse da rivelare.
Acknowledgments
Gli autori riconoscono il supporto del Laboratorio di genomica clinica e tecnologia avanzata nel Dipartimento di Patologia e Medicina di Laboratorio del Dartmouth Hitchcock Health System. Gli autori riconoscono anche la risorsa condivisa di patologia presso il Dartmouth Cancer Center con NCI Cancer Center Support Grant 5P30 CA023108-37.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BOND Research Detection System | Leica Biosystems, Wetzlar, Germany | DS9455 | Open detection system containing open containers in a reagent tray |
| BOND Wash | Leica Biosystems, Wetzlar, Germany | AR950 | 10X concentrated buffer solution for washing fixed tissue |
| Buffer W | NanoString, Seattle, WA | contact company | Blocking reagent |
| Cy3 conjugation kit | Abcam, Cambridge, UK | AB188287 | Cy3 fluorescent antibody conjugation kit |
| GeoMx Digital Spatial Profiler (DSP) | NanoString, Seattle, WA | contact company | System for imaging and characterizing protein and RNA targets |
| GeoMx DSP Instrument BufferKit | NanoString, Seattle, WA | 100471 | Buffer kit for GeoMX DSP (including buffers for sample processing and preparation) |
| GeoMx Hyb Code Pack_Protein | NanoString, Seattle, WA | 121300401 | Controls for running GeoMX DSP experiemtns |
| GeoMx Immune Cell Panel (Imm Cell Pro_Hs) | NanoString, Seattle, WA | 121300101 | Protein module with targets for human immune cells and immuno-oncologic targets |
| GeoMx Pan-Tumor Panel (Pan-Tumor_Hs) | NanoString, Seattle, WA | 121300105 | Protein module with targets for multiple human tumor types and for markers of epithelial-mesenchymal transition |
| GeoMx Protein Slide Prep FFPE | NanoString, Seattle, WA | 121300308 | Sample preparation reagents for GeoMX DSP protein analysis |
| LEICA Bond RX | Leica Biosystems, Wetzlar, Germany | contact company | Fully automated IHC stainer |
| Master Kit--12 reactions | NanoString, Seattle, WA | 100052 | Materials and reagents for use with the nCounter Analysis system |
| nCounter Analysis System | NanoString, Seattle, WA | contact company | Automated system for multiplex target expression quantification (to be used with GeoMx DSP) |
| TMA Master II | 3DHistech Ltd., Budapest, Hungary | To create the tissue microarray block |
References
- Pedersen, P. H., et al. Migratory patterns of lac-z transfected human glioma cells in the rat brain. International Journal of Cancer. 62 (6), 767-771 (1995).
- Wang, J., et al. Invasion of white matter tracts by glioma stem cells is regulated by a NOTCH1-SOX2 positive-feedback loop. Nature Neuroscience. 22 (1), 91-105 (2019).
- Iwadate, Y.
- Tao, C., et al. Genomics and prognosis analysis of epithelial-mesenchymal transition in glioma. Frontiers in Oncology. 10, 183 (2020).
- Cuddapah, V. A., Robel, S., Watkins, S., Sontheimer, H. A neurocentric perspective on glioma invasion. Nature Reviews Neuroscience. 15 (7), 455-465 (2014).
- Barthel, L., et al. Glioma: molecular signature and crossroads with tumor microenvironment. Cancer and Metastasis Reviews. 1 (1), 53-75 (2021).
- Ziegler, D. S., Kung, A. L., Kieran, M. W.
- Berghoff, A. S., et al. Programmed death ligand 1 expression and tumor-infiltrating lymphocytes in glioblastoma. Neuro-Oncology. 17 (8), 1064-1075 (2015).
- Merritt, C. R., et al. Multiplex digital spatial profiling of proteins and RNA in fixed tissue. Nature Biotechnology. 38 (5), 586-599 (2020).
- Van, T. M., Blank, C. U. A user's perspective on GeoMxTM digital spatial profiling. Immuno-Oncology Technology. 1, 11-18 (2019).
- Garcia-Pardo, M., Calles, A. ROS-1 NSCLC therapy resistance mechanism. Precision Cancer Medicine. , Online (2021).
- Ye, L., et al. Digital spatial profiling of individual glomeruli from patients with anti-neutrophil cytoplasmic autoantibody-associated glomerulonephritis. Frontiers in Immunology. 13, 831253 (2022).
- Bergholtz, H., et al. Best practices for spatial profiling for breast cancer research with the GeoMx digital spatial profiler. Cancers. 13 (17), 4456 (2021).
- Brady, L., et al. Inter- and intra-tumor heterogeneity of metastatic prostate cancer determined by digital spatial gene expression profiling. Nature Communications. 12 (1), 1426 (2021).
- Kulasinghe, A., et al. Highly multiplexed digital spatial profiling of the tumor microenvironment of head and neck squamous cell carcinoma patients. Frontiers in Oncology. 10, 607349 (2021).
- Wang, D. Y. -T., et al. Case study: Digital spatial profiling of metastatic clear cell carcinoma reveals intra-tumor heterogeneity in epithelial-mesenchymal gradient. bioRxiv. , (2021).
- GeoMx DSP. Automated slide preparation user manual. GeoMx DSP. , nanoString Technologies. Seattle, Washington. (2022).
- Allam, M., Cai, S., Coskun, A. F. Multiplex bioimaging of single-cell spatial profiles for precision cancer diagnostics and therapeutics. NPJ Precision Oncology. 4, 11 (2020).
- Wolchok, J. D., et al. Overall survival with combined nivolumab and ipilimumab in advanced melanoma. New England Journal of Medicine. 377 (14), 1345-1356 (2017).
- Blank, C. U., et al. Neoadjuvant versus adjuvant ipilimumab plus nivolumab in macroscopic stage III melanoma. Nature Medicine. 24 (11), 1655-1661 (2018).
- Matthews, R. T., et al. Brain-enriched hyaluronan binding (BEHAB)/brevican cleavage in a glioma cell line is mediated by a disintegrin and metalloproteinase with thrombospondin motifs (ADAMTS) family member. Journal of Biological Chemistry. 275 (30), 22695-22703 (2000).
- Paganetti, P. A., Caroni, P., Schwab, M. E. Glioblastoma infiltration into central nervous system tissue in vitro: involvement of a metalloprotease. Journal of Cell Biology. 107, 2281-2291 (1988).
- Beliën, A. T., Paganetti, P. A., Schwab, M. E. Membrane-type 1 matrix metalloprotease (MT1-MMP) enables invasive migration of glioma cells in central nervous system white matter. Journal of Cell Biology. 144 (2), 373-384 (1999).
- Coulie, P. G., Vanden Eynde, B. J., vander Bruggen, P., Boon, T. Tumour antigens recognized by T lymphocytes: At the core of cancer immunotherapy. Nature Reviews Cancer. 14 (2), 135-146 (2014).
- Finn, O. J. Vaccines for cancer prevention: a practical and feasible approach to the cancer epidemic. Cancer Immunology Research. 2 (8), 708-713 (2014).
- Sharma, P., Allison, J. P. The future of immune checkpoint therapy. Science. 348 (6230), 56-61 (2015).
- Chen, L., Han, X. Anti-PD-1/PD-L1 therapy of human cancer: past, present, and future. Journal of Clinical Investigation. 125 (9), 3384-3391 (2015).
- Cai, X., et al. Glioma-Associated stromal cells stimulate glioma malignancy by regulating the tumor immune microenvironment. Frontiers in Oncology. 11, 672928 (2021).
- Ishii,, et al. Histological characterization of the tumorigenic "peri-necrotic niche" harboring quiescent stem-like tumor cells in glioblastoma. PLoS One. 11 (1), 0147366 (2016).
- Lewis, C. E., Pollard, J. W. Distinct role of macrophages in different tumor microenvironments. Cancer Research. 66 (2), 605-612 (2006).
- NanoString. CosMx Spatial Molecular Imager: True Single-Cell In Situ Solution. NanoString. , (2022).
