Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Genomomfattande profilering av transkriptionsfaktor-DNA-bindande interaktioner i Candida albicans: En omfattande CUT & RUN-metod och dataanalysarbetsflöde

Published: April 1, 2022 doi: 10.3791/63655
Automatic Translation
*1,2, *1,2, *1,2, 1,2,4, 3, 1,4, 1,4
1Department of Molecular and Cell Biology, University of California, Merced, 2Quantitative and Systems Biology Graduate Program, University of California, Merced, 3Department of Applied Mathematics, University of California, Merced, 4Health Sciences Research Institute, University of California, Merced
* These authors contributed equally

Summary

Detta protokoll beskriver en experimentell metod och dataanalysarbetsflöde för klyvning under mål och frisättning med nukleas (CUT & RUN) i den humana svamppatogenen Candida albicans.

Abstract

Regulatoriska transkriptionsfaktorer styr många viktiga biologiska processer, inklusive cellulär differentiering, svar på miljöstörningar och påfrestningar och värdpatogeninteraktioner. Att bestämma den genomomfattande bindningen av regulatoriska transkriptionsfaktorer till DNA är avgörande för att förstå transkriptionsfaktorernas funktion i dessa ofta komplexa biologiska processer. Klyvning under mål och frisättning med nukleas (CUT &RUN) är en modern metod för genomomfattande kartläggning av in vivo protein-DNA-bindande interaktioner som är ett attraktivt alternativ till den traditionella och allmänt använda kromatinimmunutfällningen följt av sekvenseringsmetod (ChIP-seq). CUT&RUN är mottaglig för en experimentell installation med högre genomströmning och har ett betydligt högre dynamiskt omfång med lägre sekvenseringskostnader per prov än ChIP-seq. Här beskrivs ett omfattande CUT &RUN-protokoll och tillhörande arbetsflöde för dataanalys skräddarsydd för genomomfattande analys av transkriptionsfaktor-DNA-bindande interaktioner i den humana svamppatogenen Candida albicans . Detta detaljerade protokoll innehåller alla nödvändiga experimentella procedurer, från epitopmärkning av transkriptionsfaktorkodande gener till biblioteksberedning för sekvensering; Dessutom innehåller den ett anpassat beräkningsarbetsflöde för CUT &RUN-dataanalys.

Introduction

Candida albicans är en kliniskt relevant, polymorf mänsklig svamppatogen som finns i en mängd olika tillväxtsätt, såsom det planktoniska (fritt flytande) tillväxtsättet och som samhällen av tätt vidhäftade celler skyddade av en extracellulär matris, känd som biofilmslägetför tillväxt 1,2,3. I likhet med andra utvecklings- och cellulära processer är biofilmutveckling ett viktigt C. albicans virulensdrag som är känt för att styras på transkriptionsnivå av regulatoriska transkriptionsfaktorer (TF) som binder till DNA på ett sekvensspecifikt sätt4. Nyligen har kromatinregulatorer och histonmodifierare också dykt upp som viktiga regulatorer för C. albicans biofilmbildning5 och morfogenes6 genom att förmedla DNA-tillgänglighet. För att förstå den komplexa biologin hos denna viktiga svamppatogen är effektiva metoder för att bestämma genomomfattande lokalisering av specifika TF under distinkta utvecklings- och cellulära processer värdefulla.

Kromatinimmunutfällning följt av sekvensering (ChIP-seq) är en allmänt använd metod för att undersöka protein-DNA-interaktioner i C. albicans 5,6 och har till stor del ersatt den mer klassiska kromatinimmunutfällningen följt av microarray (ChIP-chip)9-metoden. Både ChIP-seq- och ChIP-chip-metoder kräver dock ett stort antal indataceller10, vilket kan vara en komplicerande faktor vid undersökning av TF i samband med specifika prover och tillväxtsätt, såsom biofilmer som samlats in från patienter eller djurmodeller av infektion. Dessutom ger kromatinimmunutfällningsanalysen (ChIP) ofta en betydande mängd bakgrundssignal i hela genomet, vilket kräver en hög anrikningsnivå för målet av intresse för att tillräckligt separera signal från brus. Medan ChIP-chipanalysen till stor del är föråldrad idag, gör sekvenseringsdjupen som är nödvändiga för ChIP-seq denna analys oöverkomligt dyr för många forskare, särskilt de som studerar flera TF och / eller kromatinassocierade proteiner.

Klyvning under mål och frisättning med nukleas (CUT &RUN) är ett attraktivt alternativ till ChIP-seq. Det utvecklades av Henikoff-laboratoriet 2017 för att kringgå begränsningarna av ChIP-seq och kromatin endogen klyvning följt av sekvensering chEC-seq11,12, en annan metod för att identifiera protein-DNA-interaktioner på en genomomfattande nivå, samtidigt som man tillhandahåller högupplöst, genomomfattande kartläggning av TF och kromatinassocierade proteiner13 . CUT &RUN förlitar sig på riktad matsmältning av kromatin i permeabiliserade kärnor med hjälp av bundna mikrokocknukleaser, följt av sekvensering av de smälta DNA-fragmenten 9,10. Eftersom DNA-fragment genereras specifikt vid de loci som är bundna av ett protein av intresse, snarare än att genereras i hela genomet via slumpmässig fragmentering som i ChIP-analyser, resulterar CUT &RUN-metoden i kraftigt reducerade bakgrundssignaler och kräver därför 1/10 av sekvenseringsdjupet jämfört med ChIP-seq11,13, 14. Dessa förbättringar leder i slutändan till betydande minskningar av sekvenseringskostnaderna och minskningar av det totala antalet indataceller som behövs som utgångsmaterial för varje prov.

Här beskrivs ett robust CUT&RUN-protokoll som har anpassats och optimerats för att bestämma genomomfattande lokalisering av TF i C. albicans-celler isolerade från biofilmer och planktoniska kulturer. En grundlig dataanalyspipeline presenteras också, vilket möjliggör bearbetning och analys av de resulterande sekvensdata och kräver att användarna har minimal expertis inom kodning eller bioinformatik. Kortfattat beskriver detta protokoll epitopmärkning av TF-kodande gener, skörd av biofilm och planktoniska celler, isolering av intakta permeabiliserade kärnor, inkubation med primära antikroppar mot det specifika proteinet eller epitopmärkta proteinet av intresse, tethering av det chimära A / G-mikrokocknukleaset (pAG-MNase) fusionsproteinerna till de primära antikropparna, genomisk DNA-återhämtning efter kromatinförtunning och beredning av genomiska DNA-bibliotek för sekvensering.

Det experimentella CUT & RUN-protokollet följs av en specialbyggd dataanalyspipeline, som tar rå DNA-sekvenseringsläsningar i FASTQ-format och implementerar alla nödvändiga bearbetningssteg för att ge en komplett lista över signifikant berikade loci bundna av TF av intresse (riktad mot den primära antikroppen). Observera att flera steg i det beskrivna biblioteksberedningsprotokollet har anpassats specifikt och optimerats för CUT &RUN-analys av TF (i motsats till nukleosomer). Medan de data som presenteras i detta manuskript genererades med hjälp av TF-specifika anpassningar av ett kommersiellt CUT & RUN-kit, har dessa protokoll också validerats med hjälp av individuellt framställda komponenter (dvs. pAG-MNas-enzym och magnetiska DNA-reningspärlor) och internt beredda buffertar, vilket avsevärt kan minska experimentella kostnader. De omfattande experiment- och dataanalysprotokollen beskrivs i detalj nedan i ett steg-för-steg-format. Alla reagenser och kritisk utrustning, liksom buffert- och medierecept, listas i materialförteckningen respektive tilläggsfil 1.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Epitopmärkning av C. albicans stammar

  1. Ladda upp genen av intresse, tillsammans med dess 1 kb uppströms och nedströms flankerande sekvenser, från Candida Genome Database till primerdesignverktyget (se materialförteckningen). Designa ett guide-RNA (gRNA) genom att markera 50 bp uppströms och nedströms från stoppkodonet och klicka på gRNA-urvalsverktyget till höger. Välj Designa och analysera guider. Använd genomet Ca22 (Candida albicans SC5314 Assembly 22 (diploid)) och ett NGG (SpCas9, 3' side) protospacer intilliggande motiv (PAM) för guideparametrarna och klicka på Finish. Figur 1 beskriver arbetsflödet för epitopmärkning av en C. albicans-gen av intresse med förbättrat grönt fluorescerande protein (eGFP).
    1. På efterföljande sida bekräftar du målregionen för gRNA-design och trycker på den gröna knappen. Sortera gRNA efter On-Target Score.
      OBS: Primerdesignverktyget beräknar poäng på och utanför målet för att kvantifiera specificiteten hos gRNA: erna. En idealisk guide har en målpoäng på >60, en poäng utanför målet på ~ 33 och överlappar stoppkodonet. Detta möjliggör hög gRNA-specificitet vid ablatering av gRNA-inriktning efter GFP-integration. Ett gRNA med en off-target-poäng på ~ 50 indikerar allelisk variation; således kommer endast en allel att erkännas av gRNA.
    2. Lägg till sekvenserna (5'-CGTAAACTATTTTTAATTTG-3') och (5'-GTTTTAGAGCTAGAAATAGC-3') till 5' respektive 3' ändarna av 20 bp gRNA-målsekvensen, vilket skapar en 60 bp primer/oligonukleotid. Alternativt kan du kopiera 20 bp-sekvensen till gRNA-kalkylatorn som tillhandahålls av Nguyen et al.15. Beställ 60 bp anpassad gRNA-oligonukleotid.
    3. Förstärk det "universella A-fragmentet" med 100 mM AHO1096 (5'-GACGGCACGGCCACGCGTTTAAACCGCC-3') och 100 mM AHO1098 (5'-CAAATTAAAAATAGTTTACGCAAG-3') och det "unika B-fragmentet" med den anpassade 60 bp gRNA-oligonukleotiden (100 mM) från steg 1.1.2. och 100 mM AHO1097 (5'-CCCGCCAGGCGCTGGGGTTTAAACACCG-3') med pADH110 (plasmidförvars-ID# 90982) respektive pADH139 (plasmidförvars-ID# 90987) som mall-DNA. Använd PCR-reaktionen och cykelförhållandena i tabell 1.
      OBS: pADH139 är specifik för stammar som bär den heterologa Candida maltosa LEU2-markören . Om du använder en stam med en enda kopia av genen C. albicans LEU2 , ersätt pADH119 (plasmidförvars-ID# 90985) i stället för pADH139.
    4. Bekräfta framgångsrik förstärkning genom att kontrollera 5 μL av PCR på en 1% agarosgel. Leta efter ~ 1 kb A- och B-fragmentambolier.
    5. Blanda 1 μL vardera av A- och B-fragment och sy ihop dem med hjälp av PCR-reaktions- och cykelförhållandena i tabell 2 för att skapa ett C-fragment i full längd.
    6. Tillsätt 0,5 μL 100 mM AHO1237 (5'-AGGTGATGCTGAAGTTGAAG-3') och 0,5 μL 100 mM AHO1453 (5'-ATTTTAGTAACAGCTTCGACAATCG-3') till varje PCR-reaktion, blanda väl genom pipettering och komplettera de cykelförhållanden som anges i tabell 3.
      OBS: Om du använder pADH119 i stället för pADH139, ersätt AHO1238 (5'-TGTATTTTGTTTTAAAATTTTAGTGTGTTTC-3') i stället för AHO1453.
    7. Bekräfta korrekt sömnad och förstärkning av C-fragmentet genom att kontrollera 5 μL av PCR på en 1% agarosgel. Leta efter en ~ 2 kb amplikon. Förvara C-fragmentet vid -20 °C tills det är klart att användas.
      OBS: Om sömnad och förstärkning resulterar i flera, ospecifika band eller utstrykning, utför en PCR-rengöring av A- och B-fragmenten och upprepa från steg 1.1.5.
  2. Lägg till hela CTG-optimerade monomera eGFP med länksekvens (RIPLING)16 (pCE1, plasmidförvars-ID# 174434) omedelbart uppströms stoppkodonet för genen av intresse med hjälp av primerdesignverktyget, vilket skapar en C-terminal translationell fusion. Använd denna konstruktion för att designa oligonukleotider för att förstärka donator-DNA (dDNA) från pCE1.
    1. Designa en framåtriktad oligonukleotid med 18-22 bp homologi till länksekvensen och >50 bp homologi till 3' änden av den öppna läsramen (ORF).
      OBS: Homologin på 18-22 bp skapar en glödgningstemperatur för amplifiering mellan 55 °C och 58 °C. Om oligonukleotiden i full längd bildar primerdimerer, justera homologin till länksekvensen/GFP eller genomet i enlighet därav.
    2. Skapa en omvänd oligonukleotid med 18-22 bp homologi till 3'-änden av GFP och >50 bp-homologi till den nedströms icke-kodande sekvensen för ORF som ska taggas.
    3. Beställ dessa oligonukleotider och förstärk dDNA med hjälp av de medföljande touchdown PCR-cykelförhållandena i tabell 4.
  3. Designa två uppsättningar koloni PCR (cPCR) oligonukleotider för att bekräfta integrationen av GFP genom att förstärka över de flankerande integrationsplatserna. Välj först den framåtriktade dDNA-oligonukleotiden med hjälp av primerdesignverktyget och klicka på Primer-knappen till höger.
    1. Klicka på Skapa primers | Guiden | Tm Param och bekräfta att algoritmen är inställd på SantaLucia 1998. Klicka på Använd markering för att mata in koordinaterna för den framåtriktade oligonukleotiden som utformats i 1.2.1 som målsekvens.
    2. Ställ in den optimala primertemperaturen på 55 °C och den maximala amplikonstorleken på 900 bp och klicka på knappen Generera primers längst upp till höger.
    3. Välj det oligonukleotidpar med lägst straffpoäng och bekräfta att primrar förstärks över 5'-integrationsstället. Se till att den framåtriktade cPCR-primern ligger uppströms om den främre dDNA-primersekvensen och den omvända cPCR-primern helt inom eGFP-taggen eller länkningssekvensen.
    4. Upprepa steg 1.3–1.3.3. med omvänd dDNA-oligonukleotid för att skapa den andra uppsättningen cPCR-oligonukleotider som förstärks över 3 'integrationsstället. Se till att den framåtriktade cPCR-primern ligger helt inom eGFP-taggen eller länkningssekvensen och den omvända cPCR-primern nedströms den omvända dDNA-primersekvensen.
    5. Beställ dessa oligonukleotider.
  4. Smält 2 500 ng pADH140, som innehåller Cas9 (plasmidförvars-ID # 90988), med restriktionsenzym för varje gen som ska GFP-märkas. Ställ in den totala volymen för varje matsmältning vid 15 μL; justera vattenvolymen i enlighet med detta baserat på plasmidkoncentrationen pADH140. Använd de rötningsförhållanden som anges i tabell 5. Förvara den smälta plasmiden vid -20 °C tills den är klar att användas.
    OBS: Om man omvandlar en stam med en enda kopia av C. albicans LEU2-genen , istället för den heterologa C. maltosa LEU2-markören , ersätt pADH137 (plasmidförvarS-ID # 90986) i stället för pADH140.
  5. Denaturera 12 μL av 10 mg / ml laxsperma-DNA för varje gen som kommer att GFP-märkas vid 99 ° C i 10 minuter och snabbt svalna till ≤4 ° C. Förvaras vid -20 °C tills det är klart att användas.
  6. Streak a C. albicans LEU2 hemizygot nourseothricin-känslig stam på jästpepton dextros (YPD) plattor och inkubera vid 30 ° C i två dagar.
  7. Välj en enda koloni och överför den till 4 ml flytande YPD. Inkubera i 12-16 h vid 30 °C med skakningar vid 250 rpm.
  8. Mät den optiska densiteten vid 600 nm (OD600) av kulturen över natten (12-16 timmar) i en spektrofotometer med hjälp av en engångskyvett (1 ml, 1 cm banlängd).
  9. Späd övernattningskulturen till en Erlenmeyerkolv till en OD600 på 0,1 i YPD. Stå för 5 ml per reaktion och inkludera ytterligare 5 ml för att kontrollera OD600 senare.
    OBS: Kulturens volym beror på antalet transformationsreaktioner.
  10. Inkubera den utspädda övernattningskulturen i en skakande inkubator vid 30 °C med skakningar vid 250 rpm tills den når en OD600 på 0,5-0,8.
  11. Centrifug vid 4 000 × g vid rumstemperatur i 5 min; ta bort och kassera supernatanten.
  12. Resuspend cellpelleten i 1 ml sterilt vatten via mild pipettblandning med filterspetsar och överför till ett sterilt 1,5 ml mikrofugerör.
  13. Pelletera cellerna genom centrifugering vid 4000 × g vid rumstemperatur i 1 min; ta bort och kassera supernatanten. Resuspend i 1 ml sterilt vatten och upprepa för totalt två tvättar.
  14. Återsuspendera pelletsen i 1/100 av den volymsom används i steg 1.10. Till exempel, om 15 ml användes, återsuspendera pelletsen i 150 μL sterilt vatten.
  15. Blanda i ett separat rör för varje transformationsreaktion 50 μL C-fragment, 50 μL dDNA, 2 500 ng restriktionsenzymsmält pADH140 och 10 μL denaturerat laxsperma-DNA.
  16. Tillsätt 50 μL av cellslamningen från steg 1.14 och blanda genom pipettering.
  17. Gör ett lager av plattblandningen (tilläggsfil 1) för n + 1 transformationer.
  18. Tillsätt 1 ml av plattblandningen till cellen / DNA-blandningen och blanda genom att invertera 5 gånger.
    OBS: Knacka på rörens botten medan du inverterar för att lossa eventuell kvarvarande vätska.
  19. Placera blandningen i en inkubator vid 30 °C över natten (12–16 timmar) utan att skaka.
  20. Värmechocka cellerna i 15 min vid 44 °C i ett vattenbad.
  21. Centrifugera 1,5 ml mikrofugerör vid 5 000 × g vid rumstemperatur i 2 min.
  22. Ta bort PLATE-blandningen genom vakuumaspiration med sterila pipettspetsar, var försiktig så att du inte stör cellpelleten.
  23. Resuspendera cellpelleten i 1 ml YPD, pellet genom centrifugering vid 4000 × g vid rumstemperatur i 1 min, och ta bort och kassera supernatanten. Upprepa för en andra tvätt, återsuspendera cellpelleten i 1 ml YPD och överför suspensionen till ett 10 ml rundbottnat engångsodlingsrör som innehåller ytterligare 1 ml YPD (2 ml slutlig volym). Återställ cellerna vid 30 ° C med skakning vid 250 rpm i 5 timmar.
  24. Centrifugera rören vid 4000 × g vid rumstemperatur i 5 min; ta bort och kassera supernatanten.
  25. Återutnytt cellpelleten i 100 μL sterilt vatten och platta på YPD kompletterat med 200 μg/ml nourseotricin (NAT200). Inkubera vid 30 °C i 2-3 dagar.
  26. Aliquot 100 μL av 20 mM NaOH i brunnarna på en 96-brunns PCR-platta, där varje brunn motsvarar en enskild koloni som växte på NAT200-plattorna. Använd en steril tandpetare eller pipettspets, välj enskilda transformerade kolonier, lappa dem på en ny NAT200-platta och virvla de återstående cellerna i en brunn med 20 mM NaOH. Upprepa för de återstående kolonierna för att skapa celllysatet som används som DNA-mall för cPCR-reaktionen.
  27. Försegla PCR-plattan och inkubera i 10 minuter vid 99 °C i en termocyklist med uppvärmt lock.
  28. Ställ in två cPCR-reaktioner med oligonukleotiderna utformade i steg 1.3-1.3.5. Skala upp antalet reaktioner efter behov. Utför PCR-reaktionen med celllysatet framställt i steg 1.26 efter cykelbetingelser och PCR-reaktionsblandningar från tabell 6. Kör 10-20 μL från varje brunn på en 1% agarosgel. Leta efter kolonier med förstärkning av de två cPCR-primeruppsättningarna som indikerar korrekt införlivat GFP dDNA.
  29. Restreak-kolonier som införlivade GFP på syntetiska kompletta (SC) medier som saknar leucin. Inkubera i en 30 ° C inkubator i 2-3 dagar. Välj enskilda kolonier och lappa på YPD och YPD kompletterat med 400 μg / ml nourseothricin (NAT400) plattor. Identifiera kolonier som inte växer på NAT400-plattor efter 24 timmar som de som framgångsrikt har förlorat CRISPR-komponenterna.
  30. Bekräfta att GFP-taggen behålls genom att upprepa steg 1.25–1.28 med hjälp av celler från YPD-patchplattan. Om rätt band är närvarande, inokulera till 4 ml YPD och växa över natten (12-16 timmar), enligt beskrivningen i steg 1.7.
  31. Blanda över natten av den nya GFP-märkta stammen med filtersteriliserad 50% glycerol i ett förhållande 1: 1 i en steril kryotube. Förvara vid -80 °C och sätt tillbaka på YPD-plattor efter behov.
    OBS: Det rekommenderas att validera de GFP-märkta stammarna genom att bekräfta kärnlokalisering av den märkta TF via fluorescerande mikroskopi och bekräfta en vildtypsfenotyp i en lämplig fenotypisk analys.

2. Provberedning av biofilmkulturer

  1. Streak C. albicans GFP-märkta stammar på YPD-agarplattor och inkubera vid 30 ° C i 2-3 dagar. Använd en enda isolerad koloni från agarplattan, inokulera i 4 ml YPD flytande medium. Inkubera vid 30 ° C med skakning över natten (12-16 timmar). Bestäm OD600 för övernattningskulturen(erna).
    OBS: Det rekommenderas att använda tre biologiska replikat per prov för CUT & RUN-experimenten.
  2. Inokulera en steril 12-brunns obehandlad cellodlingsplatta med övernattningskulturen till en slutlig OD600 på 0,5 (motsvarande 2 × 107 celler / ml) i Roswell Park Memorial Institute (RPMI) -1640 medium till en slutlig volym på 2 ml. Inkubera i 90 min vid 37 °C i en mikroplattinkubator med skakningar vid 250 rpm.
    OBS: Det rekommenderas att använda en 12-brunns cellodlingsplatta per stam med en brunn oinokulerad som en medium-ensam kontamineringskontroll. Detta protokoll har framgångsrikt tillämpats med så lite som 1/10 av en 12-brunns cellodlingsplatta väl (eller så få som 5 miljoner celler). Att använda ett högre antal celler ökar det totala DNA-utbytet, vilket vanligtvis resulterar i högkvalitativa sekvenseringsbibliotek.
  3. Ta bort ohäftande celler genom aspiration med sterila pipettspetsar fästa via flexibla plaströr till en vakuumfällapparat. Tvätta de vidhäftade cellerna en gång med 2 ml steril 1x fosfatbuffrad saltlösning (PBS). Tillsätt 2 ml färskt RPMI-1640-medium till brunnarna och inkubera i 24 timmar vid 37 °C med skakning vid 250 rpm.
    OBS: Byt pipettspetsar mellan brunnar med olika stammar och/eller förhållanden. Skrapa inte botten av brunnen med spetsen medan du aspirera.
  4. Vid slutet av 24 timmars inkubation, samla och slå samman vätske- och biofilmmaterialet från var och en av de 11 inokulerade brunnarna i ett enda, sterilt 50 ml koniskt rör. Upprepa vid behov med oberoende pooler om du bearbetar mer än en stam eller ett tillväxttillstånd samtidigt.
    OBS: Skrapa botten och kanterna på varje brunn med en pipettfilterspets för att lossna celler som förblir vidhäftade på ytan. Använd pipetten för att homogenisera biofilmerna.
  5. Pelletsprover genom centrifugering vid 4 000 × g vid rumstemperatur i 5 min. Dekantera så mycket av supernatanten som möjligt, var noga med att minimera störningar i pelletsen. Frys pelletsen i flytande kväve och förvara den vid -80 °C omedelbart efter uppsamlingen eller fortsätt direkt till steg 4 (isolering av kärnor).

3. Provberedning av planktoniska kulturer

  1. Streak C. albicans GFP-märkta stammar på YPD-agarplattor och inkubera vid 30 ° C i 2-3 dagar. Använd en enda isolerad koloni från agarplattan, inokulera i 4 ml YPD flytande medium. Inkubera vid 30 ° C med skakning över natten (12-16 timmar). Bestäm OD600 för övernattningskulturen(erna).
  2. Bakåtspädd över natten kulturer till OD600 av 0,1 i 50 ml RPMI-1640 flytande medium och inkubera vid 30 °C med skakning vid 225 rpm i 2-5 timmar tills OD600 är mellan 0,5 och 0,8.
    OBS: Celler bör gå igenom minst två fördubblingar innan de skördas. Villkor som används för planktoniska kulturer kan justeras efter behov.
  3. Pelletera proverna genom centrifugering vid 4 000 × g vid rumstemperatur i 5 min. Dekantera så mycket av supernatanten som möjligt, var noga med att minimera störningar i pelletsen. Frys pelletsen i flytande kväve och förvara den vid -80 °C omedelbart efter uppsamlingen eller fortsätt direkt till steg 4 (isolering av kärnor).

4. Isolering av kärnor

OBS: På experimentdagen, förbered färsk Ficoll Buffer, tillsätt 2-merkaptoetanol och proteashämmare till alikvot(er) i Resuspension Bufferten och tillsätt proteashämmare till alikvot(er) av SPC Buffer (se Kompletterande fil 1). För att återuppliva pelletsen, pipettera försiktigt med antingen 200 μL eller 1 ml pipettspetsar för att undvika att skada cellerna eller kärnorna. Innan du börjar kärnisoleringen, sätt på värmeblocket för att förvärma det till 30 ° C. Alla pipettspetsar och rör för resten av detta protokoll bör vara certifierade DNA / RNA och DNase / RNase-fria, och användning av filterspetsar rekommenderas för alla efterföljande pipetteringssteg.

  1. Resuspend pellet(er) i 1 ml rumstemperatur Resuspension Buffer och överför till ett sterilt 1,5 ml mikrofugerör. Pellets vid 2 000 × g vid rumstemperatur i 2 min i en bordscentrifug och ta bort supernatanten.
    OBS: Ta bort supernatanten med antingen 200 μL eller 1 ml pipettspets, var noga med att minimera störningar i pelletsna.
  2. Återsuspendera pelletsen/pelletsen i 200 μL resuspensionsbuffert vid rumstemperatur. Överför en 5 μL alikvot från den återsuspenderade pelleten till ett nytt PCR-rör och förvara den vid 4 °C för användning senare.
    OBS: Denna alikvot kommer att användas som en kontroll under ett efterföljande kvalitetskontrollsteg för att utvärdera kvaliteten på de isolerade kärnorna.
  3. Pellets vid 2000 × g i 2 minuter och ta bort och kassera supernatanten med en pipett. Upprepa tvättsteget två gånger med 200 μL Resuspension Buffer.
  4. Centrifug vid 2000 × g vid rumstemperatur i 2 min och ta bort supernatanten. Tillsätt 300 μL Resuspension Buffer och 10 μL lyticaselösning (50 mg/ml, se materialförteckningen). Inkubera i 30 min vid 30 °C i ett värmeblock.
    OBS: Alternativt kan ett vattenbad uppvärmt till 30 ° C också användas istället för ett värmeblock. De sfäroplasteringsförhållanden som används här har optimerats för att vara effektiva för både jäst- och hyphalceller av C. albicans. Det rekommenderas att optimera spheroplastingförhållandena vid tillämpning av detta protokoll på C. albicans-celler med mutationer som påverkar cellväggens integritet eller andra cellulära morfologier. Under detta 30 minuters inkubationssteg har användaren möjlighet att slutföra steg 5 (Concanavalin A Bead Activation) i förväg för att spara tid.
    1. KRITISKT STEG: Efter 30 minuters inkubationssteg, överför en 5 μL alikvot till ett nytt PCR-rör. Till 5 μL isolerade kärnor och 5 μL alikvot av intakta celler lagrade vid 4 °C från steg 4.2, tillsätt 1 μL kalkofluorvit (ett fluorescerande cellväggfärgämne) och 1 μL SYTO 13 (en nukleinsyrafläck). Inkubera vid 30 ° C i mörkret i 30 min.
    2. Visuellt inspektera integriteten och renheten hos de isolerade kärnorna med hjälp av ett fluorescensmikroskop. Leta efter isolerade kärnor som visar framträdande färgade intakta kärnor (med ett 488-509 nm excitationsfilter) och se till att det inte finns någon cellväggfärgning av kalkofluorns vita färgämne (med ett 390-420 nm excitationsfilter). I de intakta kontrollcellerna, leta efter framträdande cellväggfärgning av kalkofluorvitfärgämnet (med ett 390-420 nm excitationsfilter) och färgade intakta kärnor (med ett 488-509 nm excitationsfilter).
  5. Centrifug vid 2 000 × g vid 4 °C i 5 min och ta bort supernatanten. Resuspend pelletsen i 500 μL iskall Resuspension Buffer med 1 ml filterspetsar genom att pipettera försiktigt upp och ner 5 gånger. Centrifug vid 2 000 × g vid 4 °C i 5 min och avlägsna supernatanten med en 1 ml pipett. Resuspend pelletsen med 1 ml nygjord iskall Ficoll Buffer.
    OBS: Håll proverna och buffertarna på is från och med nu.
  6. Centrifugera proverna vid 5 000 × g vid 4 °C i 10 min och ta bort supernatanten. Resuspend pelletsen i 500 μL iskall SPC Buffer.
    OBS: Från och med nu, hantera kärnorna extremt försiktigt för att undvika att skada dem.
  7. Centrifugera proverna vid 5 000 × g vid 4 °C i 10 min och ta bort så mycket av supernatanten som möjligt utan att störa pelletsen. Placera rören som innehåller de pelleterade kärnorna på is och fortsätt till steg 5. Om steg 5 redan slutfördes i förväg i steg 4.4, fortsätt till steg 6 eller snäppfry pelletsen i flytande kväve och förvara dem vid -80 °C omedelbart efter uppsamlingen.

5. Concanavalin En pärlaktivering

OBS: Detta är ett kritiskt steg. Från och med nu har användarna möjlighet att fortsätta med protokollet med hjälp av ett kommersiellt tillgängligt CUT &RUN-kit eller källnyckelkomponenter individuellt och förbereda buffertar internt. Om du använder det kommersiella kitet ingår alla buffertar och reagenser som används nedan i satsen om inget annat anges. Individuella katalognummer för att köpa reagenser oberoende finns också i materialförteckningen. Kyl alla buffertar på is före användning. När steg 5 är klart rekommenderar vi att du fortsätter till steg 6 omedelbart. Undvik flera frys-upptining av isolerade kärnor eftersom det är känt för att öka DNA-skador och kan leda till resultat av dålig kvalitet.

  1. Resuspendera försiktigt concanavalin A (ConA) pärlorna med en pipett. Överför 22 μL ConA-pärlsuspension per prov som ska bearbetas i ett enda 1,5 ml mikrofugerör. Placera röret på ett magnetställ tills pärluppslamningen är klar; ta bort och kassera supernatanten med en pipett.
    OBS: När du utför CUT & RUN för totalt 10 prover, till exempel, överför 220 μL av ConA-pärlsuspensionen till ett 1,5 ml mikrofugerör.
  2. Ta bort röret som innehåller ConA-pärlorna från magnetstället och tillsätt omedelbart 200 μL iskall pärlaktiveringsbuffert och blanda försiktigt med en pipett. Placera röret på magnetstället tills pärluppslamningen är klar; ta bort och kassera supernatanten med en pipett. Upprepa detta steg för totalt två tvättar.
  3. Resuspend pärlorna i 22 μL iskall pärlaktiveringsbuffert per prov av kärnor som ska bearbetas. Håll pärlorna på is tills det behövs.
    OBS: Genomströmningen för de efterföljande stegen är beroende av antalet och kapaciteten hos tillgängliga magnetrörsställ. Bearbetning av 32 prover i två 16-brunns rörställ är ett hanterbart antal för de flesta användare av detta protokoll. Högre genomströmning är dock möjlig för mer erfarna användare, eller om robotiska vätskehanteringssystem finns tillgängliga.

6. Bindande kärnor till aktiverade pärlor

OBS: Kyl alla buffertar på is före användning. Alla buffertar kompletterade med proteashämmare bör beredas färskt på experimentdagen. Det rekommenderas att använda 0,2 ml remsrör i de efterföljande stegen.

  1. Återsuspendera de pelleterade kärnorna från steg 4 i 100 μL iskall SPC-buffert och överför till en ny 8-rörs 0,2 ml remsa. Tillsätt 20 μL av de aktiverade pärlorna till varje prov och pipett försiktigt för att blanda. Inkubera vid rumstemperatur i 10 min utan omrörning.
  2. Placera rören på magnetstället tills uppslamningen är klar; ta bort och kassera supernatanten med en pipett. Ta bort rören från magnetstället och tillsätt 200 μL iskall tvättbuffert till varje prov. Resuspend pärlorna genom att försiktigt pipettera upp och ner 5 gånger. Överför 100 μL alikvoter från varje prov till en ny 8-rörs 0,2 ml remsa.
    1. KRITISKT STEG: Dela upp varje CUT&RUN-prov i två separata alikvoter. Använd en av alikvoterna för den negativa kontrollantikroppen (t.ex. IgG-negativ kontrollantikropp) och den andra för målantikroppen mot proteinet av intresse (t.ex. anti-GFP-antikropp).
      OBS: Båda proverna krävs för att beräkningsrörledningen exakt ska kunna identifiera anrikningssignaler som är specifika för TF av intresse. En ytterligare kontroll med anti-GFP-antikroppar med en omärkt stam kan också utföras. Denna kontroll har visat resultat jämförbara med användningen av IgG-antikroppar i en GFP-märkt stam. För enkelhetens skull rekommenderas därför att använda standard IgG-kontrollen för alla experiment.

7. Primär antikroppsbindning

OBS: pAG-MNase fusionsprotein binder väl till kanin, get, åsna, marsvin och mus IgG-antikroppar17. I allmänhet är de flesta kommersiella ChIP-seq-certifierade kommersiella antikroppar kompatibla med CUT &RUN-förfaranden. Mängden primär antikropp som används beror på antikroppens effektivitet och titrering av antikroppen (t.ex. 1:50, 1:100, 1:200 och 1:400 slutlig utspädning) kan vara nödvändig om antikroppen av intresse inte tidigare har testats i ChIP- eller CUT&RUN-experiment. Kyl alla buffertar på is före användning. Alla buffertar som används för antikroppsbindningssteg bör beredas färskt på experimentdagen.

  1. Placera rören på ett magnetställ och vänta tills uppslamningen är helt klar; ta bort och kassera supernatanten med en pipett. Tillsätt 50 μL av antikroppsbufferten och blanda försiktigt genom pipettering.
  2. Tillsätt 3 μL av den polyklonala antikroppen mot GFP (eller 0,5 μg om du använder en otestad antikropp). Inkubera rören på en mutterblandare vid 4 °C i 2 timmar.
    OBS: Vissa CUT &RUN-protokoll rapporterar ökat utbyte genom att lägga till en sekundär antikropp före pAG-MNas-tillägg14; Emellertid observerades ingen signifikant förbättring med hjälp av detta tillagda steg, och därmed ingår det inte i detta protokoll.
  3. Centrifugera rören kort vid 100 × g vid rumstemperatur i 5 s, placera rören på ett magnetställ och när uppslamningen är klar, ta bort och kassera supernatanten med en pipett. Medan rören som innehåller pärlorna fortfarande finns på magnetstället, lägg till 200 μL iskall cellpermeabiliseringsbuffert direkt på pärlorna. Ta bort och kassera supernatanten med en pipett. Upprepa för totalt två tvättar med den iskalla Cell Permeabilization Buffer.
  4. Tillsätt 50 μL iskall cellpermeabiliseringsbuffert till varje rör och blanda försiktigt genom pipettering.
    OBS: Pärlor aggregeras ofta vid denna tidpunkt men kan lätt dispergeras genom att blanda försiktigt med en 200 μL pipett.

8. Bindning av pAG-MNas till antikropp

  1. Tillsätt 2,5 μL av pAG-Mnase (20x lager) till varje prov och blanda försiktigt genom pipettering. Placera proverna (något förhöjda i ~ 45 ° vinkel) på en mutterator vid 4 ° C. Slå på mutteratorn och inkubera proverna i 1 timme.
  2. Centrifugera remsrören kort vid 100 × g vid rumstemperatur i 5 s, placera rören på ett magnetställ och, när uppslamningen är klar, ta bort och kassera supernatanten med en pipett.
    OBS: Detta steg är kritiskt. Överföringsantikropp som finns kvar i locket eller sidorna av rören efter detta steg kommer att öka mängden bakgrundssignal avsevärt.
  3. Medan rören som innehåller pärlorna fortfarande finns på magnetstället, tillsätt 200 μL iskall cellpermeabiliseringsbuffert, låt uppslamningen rensa och ta bort och kassera supernatanten med en pipett. Upprepa detta steg för totalt två tvättar med Cell Permeabilization Buffer.
  4. Tillsätt 100 μL av den iskalla cellpermeabiliseringsbufferten till proverna och pipettera försiktigt upp och ner 5 gånger.

9. Riktad kromatinförtunning och frisättning

  1. Inkubera rören som innehåller provet /proverna i ett vått isbad i 5 minuter. Tillsätt 3 μL 100 mM CaCl2 i varje prov med hjälp av en flerkanalig pipett. Pipettera försiktigt upp och ner 5 gånger, sätt omedelbart tillbaka rören till det våta isbadet och inkubera i 30 minuter.
  2. Tillsätt 66 μL av stoppbufferten till varje prov och försiktigt virvel för att blanda. Inkubera prover i 10 minuter vid 37 °C i ett torrt bad.
    OBS: Det rekommenderas att lägga till 1,5 pg heterologt E. coli spike-in DNA per prov i stoppbufferten. Tillägget av 1,5 pg E. coli spike-in DNA resulterar i 1 000-10 000 kartlagda spikläsningar för 1-10 miljoner kartlagda experimentellaläsningar 14. Spik-in-DNA används för att kalibrera sekvenseringsdjupet och är särskilt viktigt för att jämföra prover i en serie. Tillsats av spike-in E. coli rekommenderas starkt men är inte nödvändigt. Det kommersiella CUT & RUN-kitet innehåller E. coli spike-in DNA, men det kan också köpas separat.
  3. Placera rören på magnetstället och överför 160 μL av supernatanten till ett 1,5 ml mikrofugerör. Överför 80 μL av provet till ett nytt 2 ml mikrofugerör och förvara vid -20 °C om ett reservprov behövs. Fortsätt till steg 10 med 80 μL-provet.

10. Sanering av insamlade DNA-prover

OBS: Inkubera DNA-renings pärlor vid rumstemperatur i 30 minuter före användning. Prechill 100% isopropanol på is. När du blandar proverna, pipettera upp och ner 10 gånger.

  1. Vortex DNA Rening Pärlor för att homogenisera pärlsuspensionen. Tillsätt 50 μL (~ 0,6x provvolym) av de resuspenderade pärlorna till varje prov. Pipett-blanda och inkubera proverna på en nutator i 5 min vid rumstemperatur.
    OBS: Förhållandet mellan DNA-renings pärlor och prov som används är kritiskt. Genom att använda 0,6x volymen DNA-reningspärlelösning i förhållande till provet kan de magnetiska pärlorna binda till stora DNA-fragment som frigörs från skadade kärnor. CUT&RUN-berikade DNA-fragment är mycket mindre än dessa stora DNA-fragment och behålls därför i supernatanten vid detta steg.
  2. Placera rören på ett magnetiskt rack och överför 130 μL av supernatanten som innehåller DNA till en 0,2 ml 8-rörsremsa. Tillsätt ytterligare 30 μL DNA-reningspärlor till provet /proverna (den totala volymen är 160 μL).
  3. Tillsätt 170 μL (~ 1x provvolym) iskall 100% isopropanol, blanda väl genom pipettering upp och ner 10 gånger och inkubera på is i 10 min.
    OBS: Det är viktigt att 100% iskall isopropanol används för detta steg för DNA-reningsplånlorna för att effektivt fånga de CUT & RUN-berikade små fragmenten.
  4. Placera rören på magnetstället, och när uppslamningen har rensats, ta försiktigt bort och kassera supernatanten med en pipett.
  5. Medan rören är på magnetstället, tillsätt 200 μL nyberedd rumstemperatur 80% etanol till rören och inkubera vid rumstemperatur i 30 s. Ta försiktigt bort och kassera supernatanten med en pipett. Upprepa detta steg för totalt två tvättar med 80% etanol.
  6. Snurra snabbt rören vid 100 × g, placera rören tillbaka på magnetstället och ta bort eventuell kvarvarande etanol med en pipett efter att uppslamningen har rensats. Lufttorka pärlorna i 5 min medan rören sitter kvar på magnetstället med locket öppet.
    OBS: Överskrid inte 5 minuters torktid eftersom detta kan minska det slutliga DNA-utbytet avsevärt.
  7. Ta bort rören från magnetstället och eluera DNA från pärlorna genom att tillsätta 17 μL 0,1x Tris-EDTA (TE) vid pH 8. Blanda väl och inkubera rören i 5 minuter vid rumstemperatur.
  8. Placera rören på magnetstället tills uppslamningen blir klar. När uppslamningen har rensats, överför försiktigt 15 μL av supernatanten till ett sterilt 0,2 ml PCR-rör.
  9. Mät koncentrationen av det insamlade DNA med hjälp av en fluorometer enligt tillverkarens protokoll.
    OBS: Typiskt är koncentrationen av det insamlade DNA ~ 1 ng / μL. Ibland är koncentrationen av det insamlade DNA: t för lågt för att kvantifiera med hjälp av en fluorometer. Detta är inte en indikator på ett misslyckat experiment. Fortsätt med biblioteksberedningen oavsett koncentrationen av det insamlade DNA: t.
  10. Fortsätt till steg 11 eller förvara proverna vid -20 °C tills de är klara.

11. Biblioteksberedning för sekvensering

OBS: Följande steg använder ett kommersiellt tillgängligt biblioteksförberedelsepaket. När du utför steg med Ligation Master Mix, minimera beröring av rören och håll dem alltid på is.

  1. Använd 0,1x TE vid pH 8, ta upp den totala volymen av CUT & RUN DNA till 50 μL. Gör en masterblandning av 3 μL End Prep Enzyme Mix och 7 μL End Prep Reaction Buffer per prov. Tillsätt 10 μL mastermix till CUT&RUN DNA och blanda noggrant genom pipettering upp och ner 5 gånger.
  2. Utför en snabb snurrning vid 100 × g för att samla all vätska från rörets sidor. Placera rören i en termocyklist med det uppvärmda locket inställt på ≥75 °C och kör cykelförhållandena i tabell 7.
    OBS: Beroende på de DNA-koncentrationer som samlats in från steg 10 följer du den önskade adapterutspädningen från tabell 8.
  3. Tillsätt 2,5 μL adapter per prov och blanda noggrant genom att pipettera upp och ner 10 gånger.
    OBS: Det är viktigt att adaptern läggs till provet och blandas noggrant innan ligeringsblandningen tillsätts.
  4. Gör en masterblandning av 30 μL Ligation Master Mix och 1 μL Ligation Enhancer. Tillsätt 31 μL av masterblandningen till provet/proverna. Blanda noggrant genom att pipettera upp och ner 10 gånger.
  5. Inkubera vid 20 °C i 15 min i en termocyklist med det uppvärmda locket av.
    OBS: Det är viktigt att prover hålls på is och överförs till termocyklisten först efter att termocyklisten har nått 20 ° C.
  6. Utför en snabb centrifugering vid 100 × g för att samla upp all vätska från rörets sidor, tillsätt 3 μL Uracil Excision Enzyme och inkubera rören i termocykeln vid 37 ° C i 15 min med det uppvärmda locket inställt på ≥47 ° C.
    OBS: Detta är en säker stopppunkt; förvara proverna vid -20 °C eller fortsätt direkt till steg 11.7. Om du fortsätter direkt till steg 11.7, inkubera DNA-renings pärlorna vid rumstemperatur i 30 minuter före användning.
  7. Tillsätt 154,4 μL (~ 1,6x provvolym) av DNA-reningspärlorna till adapterligeringsreaktionen från steg 11.6. Pipett-blanda och inkubera proverna i 5 min vid rumstemperatur.
  8. Placera rören på magnetstället och när uppslamningen har rensats, ta försiktigt bort och kassera supernatanten med en pipett.
  9. Tillsätt 200 μL nyberedd rumstemperatur 80% etanol till rören och inkubera vid rumstemperatur i 30 s. Ta försiktigt bort och kassera supernatanten med en pipett och upprepa detta steg för totalt två tvättar med 80% etanol.
  10. Snurra rören kort vid 100 × g. Placera rören tillbaka på magnetstället och ta bort eventuell kvarvarande etanol med en pipett. Lufttorka pärlorna i 5 min medan rören förblir på magnetstället med locket öppet.
    OBS: Överskrid inte 5 minuters torktid eftersom detta kan minska det slutliga DNA-utbytet avsevärt.
  11. Ta bort rören från magnetstället och eluera DNA från pärlorna genom att tillsätta 17 μL 0,1x TE vid pH 8. Blanda väl och inkubera i 5 min vid rumstemperatur.
  12. Placera rören på magnetstället tills uppslamningen blir klar. När uppslamningen har rensats, överför försiktigt 15 μL av supernatanten till ett sterilt 0,2 ml PCR-rör.
  13. Gör en masterblandning av 25 μL DNA Polymerase Master Mix och 5 μL Universal Forward Library Amplification Primer (10 μM) per prov.
    OBS: Förbered ett extra prov av mastermix för att ta hänsyn till pipetteringsförluster.
  14. Tillsätt 30 μL av masterblandningen till 15 μL adapter-ligterat DNA-prov. Tillsätt 5 μL Reverse Uniquely Indexed Library Amplification Primer (10 μM) till varje prov för att få den slutliga volymen till totalt 50 μL. Blanda noggrant genom att pipettera upp och ner 10 gånger. Utför PCR-cykelförhållandena i tabell 9.
    OBS: Inkubera DNA-renings pärlorna vid rumstemperatur i 30 minuter före användning.
  15. Vortex DNA-reningspärlorna för att återuppliva. Tillsätt 35 μL (~ 0,7x provvolym) av de resuspenderade pärlorna till de PCR-amplifierade DNA-proverna. Blanda och inkubera proverna på en nutator i 5 minuter vid rumstemperatur.
  16. Placera rören på magnetstället och när uppslamningen är klar, överför supernatanten som innehåller DNA till ett nytt 0,2 ml 8-brunns PCR-remsrör.
  17. Tillsätt 119 μL (~ 1,4x provvolym) pärlor till provet och blanda genom pipettering upp och ner 5 gånger. Inkubera proverna på en mutterator i 5 minuter vid rumstemperatur.
  18. Placera rören på magnetstället och när uppslamningen har rensats, ta försiktigt bort och kassera supernatanten med en pipett.
  19. Tillsätt 200 μL nyberedd rumstemperatur 80% etanol till rören och inkubera vid rumstemperatur i 30 s. Ta försiktigt bort och kassera supernatanten med en pipett; upprepa steget för totalt två tvättar med 80% etanol.
  20. Snurra rören kort vid 100 × g. Placera rören tillbaka på magnetstället och ta bort eventuell kvarvarande etanol med en pipett. Lufttorka pärlorna i 5 min medan rören sitter kvar på magnetstället med locket öppet.
    OBS: Överskrid inte 5 minuters torktid eftersom detta kan minska det slutliga DNA-utbytet avsevärt.
  21. Ta bort rören från magnetstället och eluera DNA från pärlorna genom att tillsätta 14 μL 0,1x TE vid pH 8. Blanda väl och inkubera i 5 min vid rumstemperatur.
  22. Placera rören på magnetstället tills uppslamningen blir klar. När uppslamningen har rensats, överför försiktigt 13 μL av supernatanten till ett sterilt 0,2 ml PCR-rör.
  23. Förbered färsk 1x Tris-borat-EDTA (TBE) och sätt in färdig, kommersiell 10% akrylamid TBE-gel i gelelektroforesapparaten fylld med 1x TBE.
  24. I den första brunnen lägger du till 2 μL DNA-stege med låg räckvidd. Blanda 3 μL 6x laddningsfärgämne med 13 μL av provet som tidigare samlats in från steg 11.22. Tillsätt försiktigt 15 μL i varje brunn av gelén. Kör gelén i 90 min vid 70 V.
    OBS: Det rekommenderas att lämna en brunn i gelén tom mellan varje prov, eftersom detta minskar sannolikheten för provkorskontaminering. Erfarna användare kan tycka att det är lämpligt att använda alla brunnar samtidigt som man noggrant undviker korskontaminering, särskilt vid bearbetning av ett stort antal prover.
  25. Ta bort gelgjutningen från gelboxen. Öppna gelgjutningen enligt tillverkarens instruktioner, ta försiktigt bort gelén från gelgjutningen och placera den i en gelhållarbricka som innehåller 100 ml 1x TBE.
    OBS: Se till att försiktigt ta bort gelén från gelen för att undvika att rippa gelén eftersom den är tunn och ömtålig. Det är viktigt att förvätning av handskar och gelén med 1x TBE när du hanterar gelén. Gelhållarbrickan ska vara något större än geléns storlek (ungefär 0,5 " på varje sida). Plastlocken som är försedda med 96-brunns PCR-rörförvaringslådor är praktiska hållbrickor för vanliga minigelstorlekar.
  26. Tillsätt 10 μL av nukleinsyragelfläcken i brickan och virvla försiktigt. Täck med folie för att skydda mot ljus och inkubera statiskt vid rumstemperatur i 10 min.
  27. Skölj gelén två gånger med 100 ml avjoniserat kranvatten. Föreställ dig gelén under blått ljusbelysning med ett gult filterlock (figur 2).
    OBS: Framgångsrika bibliotek visar ett smet mellan 100 och 500 bp. Det kommer också att finnas ett framträdande ~ 125 adapterdimerband. Närvaron av adapterdimerer är inte en indikator på dålig bibliotekskvalitet. Denna mängd adapterdimerer är oundviklig för CUT &RUN-experiment som utförs på TFs med låg överflöd och är en följd av den låga mängden indatamaterial som används för att förbereda dessa bibliotek. Använd inte ultraviolett ljus, vilket kan skada DNA.
  28. Som visas i figur 2, för varje bibliotek, skär gelén något ovanför ~ 125 bp framträdande adapterdimerband (se till att undvika att röra adapterdimerbandet) och under 400 bp-stegmärket.
    OBS: Det är viktigt att undvika adapterdimerbandet ~ 125. Även små mängder adapterdimerer kommer att minska bibliotekets kvalitet avsevärt.
  29. Punktera botten av ett 0,65 ml rör med en 22 G nål och placera det punkterade röret inuti ett sterilt 2 ml mikrofugerör. Överför gelskivan till det punkterade röret inuti 2 ml mikrofugeröret.
  30. Centrifugera 2 ml mikrofugeröret som innehåller 0,65 ml punkterat rör och prov vid 10 000 × g vid rumstemperatur i 2 minuter för att samla geluppslamningen inuti 2 ml mikrofugeröret.
    OBS: Det punkterade röret ska nu vara tomt och kan kasseras. Om det punkterade röret fortfarande har någon gel kvar inuti, placera det punkterade röret tillbaka inuti 2 ml mikrofugeröret och centrifug igen vid 10 000 × g vid rumstemperatur i ytterligare 2 minuter.
  31. Till geluppslamningen inuti 2 ml mikrofugeröret, tillsätt 300 μL iskall gelelueringsbuffert och blanda på en nutator vid rumstemperatur i minst 3 timmar eller över natten (12-16 timmar).
  32. Överför all vätske- och geluppslamning till en filterkolonn på 0,22 μm. Centrifug vid 10 000 × g vid rumstemperatur i 1 min; den uppsamlade volymen ska vara ~ 300 μL.
  33. Tillsätt 450 μL (~ 1,5x provvolym) DNA-reningspärlor, inkubera vid rumstemperatur i 5 minuter på en nutator och placera sedan provet på magnetstället tills uppslamningen är klar.
    OBS: Inkubera DNA-renings pärlorna vid rumstemperatur i 30 minuter före användning.
  34. Ta bort och kassera 500 μL av supernatanten, se till att inte störa pärlorna.
  35. Ta bort provet från magnetstället och blanda pärlorna genom att pipettera upp och ner 5 gånger. Överför 200 μL av provet till ett nytt PCR-remsrör.
  36. Placera remsröret på magnetstället, och när uppslamningen har rensats, ta försiktigt bort och kassera supernatanten med en pipett.
  37. Tillsätt 200 μL nyberedd rumstemperatur 80% etanol till rören och inkubera vid rumstemperatur i 30 s. Ta försiktigt bort och kassera supernatanten med en pipett; upprepa detta steg för totalt två tvättar med 80% etanol.
  38. Snurra rören kort vid 100 × g. Placera rören tillbaka på magnetstället och ta bort eventuell kvarvarande etanol med en pipett. Lufttorka pärlorna i upp till 5 min medan rören sitter kvar på magnetstället med locket öppet.
    OBS: Överskrid inte 5 minuters torktid eftersom detta kan minska det slutliga DNA-utbytet avsevärt.
  39. Ta bort rören från magnetstället och eluera DNA från pärlorna genom att tillsätta 17 μL 0,1x TE vid pH 8. Blanda väl och inkubera rören i 5 minuter vid rumstemperatur.
  40. Placera rören på magnetstället tills uppslamningen blir klar. När uppslamningen har rensats, överför försiktigt 15 μL av supernatanten till ett sterilt 0,2 ml PCR-rör.
  41. Mät den slutliga biblioteksmängden med fluorometern; använd det här slutliga biblioteket för sekvensering.
    OBS: Upp till 48 bibliotek kan samlas och sekvenseras tillsammans i en enda körfält med hjälp av en sekvenseringsplattform som ger minst 300 miljoner 40 bp eller längre parade ändläsningar.

12. CUT&RUN-sekvensanalys

OBS: I det här avsnittet presenteras beräkningsprotokollet som används för att analysera CUT&RUN-sekvensdata. Protokollet börjar med att konfigurera den virtuella beräkningsmiljön och vägleder användarna genom att köra kommandona på sin lokala dator. Det här protokollet fungerar på alla beräkningsresurser, till exempel lokala datorer, virtuella molnservrar och högpresterande datorkluster. Alla CUT&RUN-data som presenteras i detta dokument kan nås på NCBI GEO under anslutningsnummer GSE193803.

  1. Ladda ned källkoden för CUT&RUN-analysen från https://github.com/akshayparopkari/cut_run_analysis.
    Arbetsflödet fungerar bäst på ett MacOS- eller Linux OS-system. Windows-användare kan köra arbetsflödet med GitBash (se Materialtabellen).
    1. Ladda ned koden direkt från GitHub-sidan genom att klicka på den gröna kodknappen | Ladda ner ZIP-alternativet . Packa upp mappen till en relevant plats på den lokala datorn.
  2. Installera Conda-miljön (se Materialtabellen) och kör bara en gång.
    OBS: Detta arbetsflöde använder Conda-kommandoradsverktygsmiljön för att installera all nödvändig programvara och verktyg.
  3. När Conda har installerats (körs bara en gång) skapar du en virtuell miljö med tilläggsfilen 2 som medföljer följande kommando:
    conda create --name --file Supplementary_File_2.txt
  4. Aktivera den virtuella miljön varje gång det här arbetsflödet ska köras med:
    conda aktivera
  5. Organisera de inmatade råa FASTQ-filerna i en enda mapp, helst en mapp per CUT&RUN-experiment.

13. Generering av genomfilen för justering

  1. Generera genomfilen för justering (kör bara en gång för varje genomfil). Skapa en mapp för att spara alla C. albicans genomfiler, till exempel:
    mkdir ca_genome_files

14. Nedladdning av C. albicans genommontering 21

  1. Ladda ner C. albicans genommontering 21 från Candida Genome Database med hjälp av antingen wget- eller curlverktyg (se materialförteckningen)18.
    OBS: C. albicans montering 21 användes här för att jämföra CUT &RUN-resultat med tidigare publicerade ChIP-chipresultat, som anpassades till Assembly 21. Användare kan ladda ner andra sammansättningsversioner och köra liknande kommandon för att generera relevanta genomfiler för deras anpassningsbehov.

15. Generera en Bowtie 2-indexdatabas (databasnamn: ca21)

  1. Använd följande:
    bowtie2-build C_albicans_SC5314_A21_current_chromosomes.fasta.gz ca21
    fluga2-inspektera -s ca21

16. Kör CUT&RUN-analyspipelinen

  1. Läs hjälpavsnittet för att bekanta dig med parametrarna för rörledningen.
    bash cut_n_run_pipeline.sh -h

17. Kör filen cut_n_run_pipeline.sh med relevanta parametrar

  1. Kör skriptet:
    bash cut_n_run_pipeline.sh /path/to/input/folder 4 y y y y y > /path/to/output.log 2>&1
    OBS: De relevanta parametrarna med detaljerade beskrivningar på raderna 19-36 i koden beskrivs på GitHub-sidan https://github.com/akshayparopkari/cut_run_analysis/blob/main/cut_n_run_pipeline.sh.

18. Organisera utdatafiler

  1. Sammanfoga signifikanta toppar från alla repliker som anropas av MACS2 som finns i /path/to/input/folder/peakcalling/macs2 med hjälp av BedTools merge-funktionen19.
    cat /path/to/input/folder/peakcalling/macs2/all_replicate_files sortera -k1,1 -k2,2n | mergeBed -c 4,5,6,7,8,9 -o last,mean,first,mean,mean,mean,mean > /path/to/merged_output.bed
    OBS: För ytterligare information och bästa praxis för bedömning av överlappande toppar i replikatprover, se Landt et al.20 och Boyd et al.21.

19. Ta bort matchningar till blockerade genomiska regioner med hjälp av BedTools subtrahera funktionen

  1. Använd följande: subtrahera -a /path/to/merged_output.bed -b /path/to/Supplementary_File_3.bed -A > /path/to/merged_output_no_blocklist_hits.bed
    OBS: De blockerade regionerna i C. albicans-genomet tillhandahålls som en .bed-fil i tilläggsfil 3. Listan består främst av mycket repetitiva sekvenselement och regioner som telomeriska upprepningar och centromerer som vanligtvis ger falskt positiva resultat i C. albicans CUT &RUN, ChIP-seq och ChIP-chip dataset. Därför rekommenderas att du tar bort de blockerade regionerna. För vissa proteinmål kan det dock vara olämpligt eller oönskat att utesluta dessa loci. Användare kan hoppa över det här steget för att behålla signaler som finns i dessa blockerade regioner eller skapa egna blockerade regioner.

20. Slå samman BigWig-filer från repliker med UCSC bigWigMerge-funktionen22

  1. Använd följande: bigWigMerge /path/to/input/folder/bigwig/all_final_bw_files /path/to/input/folder/bigwig/ all_final_bdg_file
  2. Konvertera BedGraph-utdata från bigWigMerge till BigWig med hjälp av UCSC bedGraphToBigWig-funktionen.
    bedGraphToBigWig /path/to/input/folder/bigwig/ all_final_bdg_file /path/to/input/folder/bigwig/ all_final_bw_file

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Detta robusta CUT&RUN-protokoll anpassades och optimerades för att undersöka genomomfattande lokalisering av specifika TF i C. albicans biofilmer och planktoniska kulturer (se figur 2 för en översikt över den experimentella metoden). En grundlig dataanalyspipeline ingår också för att underlätta analysen av de resulterande CUT&RUN-sekvenseringsdata och kräver att användarna har minimal expertis inom kodning eller bioinformatik (se figur 3 för en översikt över analyspipelinen). I motsats till ChIP-chip- och ChIP-seq-metoderna utförs CUT &RUN med användning av intakta, permeabiliserade kärnor framställda från ett signifikant reducerat antal ingångsceller, utan formaldehydtvärbindning. Att isolera intakta kärnor från C. albicans spheroplaster är ett kritiskt steg i protokollet. Effektiv spheroplasting via matsmältningen av C. albicans cellvägg med lytikas kan vara utmanande eftersom de enzymatiska matsmältningsreaktionsförhållandena måste optimeras för varje celltyp. Således, för att säkerställa ett framgångsrikt CUT & RUN-experiment med högkvalitativa sekvenseringsresultat, ingår ett tidigt kvalitetskontrollsteg och närvaron av intakta kärnor verifieras med hjälp av ett standardfluorescensmikroskop.

Cellväggsförtunning och kärnintegritet utvärderas regelbundet genom att visualisera både kontroll intakta celler och isolerade kärnor färgade med fluorescerande cellvägg och nukleinsyrafläckar. Till skillnad från de isolerade intakta kärnorna, där cellväggsfärgning inte observeras, är både kärnor och cellväggar fluorescerande märkta i de intakta kontrollcellerna (figur 4A). Slutligen, före sekvensering, utvärderas fragmentstorleksfördelningen av CUT &RUN-bibliotek med hjälp av ett kapillärelektroforesinstrument. Detta kvalitetskontrollsteg är ett tillförlitligt mått vid bedömning av kvaliteten på CUT&RUN-biblioteken. Som framgår av elektroforesspåret på den övre panelen i figur 4B visar framgångsrika bibliotek som genereras för experiment som undersöker TF hög anrikning för fragment mindre än 280 bp. Elektroforesspåret i den nedre panelen i figur 4B representerar resultat från ett misslyckat CUT &RUN-experiment.

Här uppstod toppen vid ~ 2000 bp huvudsakligen från osmält DNA som släpptes från kärnor som skadades eller bröts i stor utsträckning under CUT & RUN-experimentet. Vi rekommenderar också att man bedömer fragmentstorleksfördelningen för de slutliga poolade biblioteken för att bekräfta fullständigt avlägsnande av förorenande adapterdimerer (figur 4C). Vanligtvis ger 5-10 miljoner parade ändläsningar (~ 40 basläsningslängd) per bibliotek tillräckligt sekvenseringsdjup för de flesta TF CUT & RUN-experiment i C. albicans. Alternativa läslängder för sekvensering, antingen parkopplade eller enkla ändar, kan användas för att sekvensera CUT&RUN-bibliotek. Till exempel bör parkopplade läslängder mellan 25 och 150 bp inte påverka kvaliteten på resultaten. Enkeländade läsningar som är större än eller lika med 150 bp bör också fungera för TF CUT & RUN-experiment. Den medföljande dataanalyspipelinen måste dock ändras för att rymma läsningar med en enda ände.

Detta CUT &RUN-protokoll och tillhörande dataanalyspipeline validerades genom att undersöka två TF, Ndt80 och Efg1, som styr C. albicans biofilmbildning. Som visas i figur 4D är Ndt80 bunden vid intergena regioner (markerade med de svarta staplarna som indikerar signifikant berikade Ndt80 ChIP-chip loci) uppströms EFG1 ORF. Denna intergena region uppströms EFG1 har tidigare visat sig vara mycket berikad för Ndt80-bindning under biofilmbildning av ChIP-chip4. CUT & RUN-experiment identifierade dock betydligt fler toppar inom denna region än ChIP-chipexperiment (10 toppar mot 4 toppar). Ndt80 DNA-bindningsmotiv berikas över alla Ndt80-bundna loci som identifieras av CUT & RUN (kompletterande figur 1), vilket indikerar att de ytterligare toppar som identifieras med denna metod sannolikt är bona fide Ndt80-bundna platser. En systematisk jämförande analys indikerade att detta presenterade CUT & RUN-protokoll framgångsrikt identifierade majoriteten av de tidigare kända bindningshändelserna för Ndt80 och Efg1 under biofilmbildning4 (figur 5).

Dessutom identifierades många nya TF-bindningshändelser som inte fångades i de tidigare publicerade ChIP-chipexperimenten med hjälp av CUT & RUN (figur 5). Sammantaget sammanfattas både Ndt80 och Efg1 som är bundna till loci som överlappar med tidigare publicerade ChIP-chipdata och till loci identifierade endast med CUT&RUN-metoden (överlappningar mellan dessa CUT&RUN-data och tidigare publicerade ChIP-chipdata för Ndt80 och Efg1 sammanfattas i Venn-diagrammen i figur 5). Dessutom var fraktionen av läsningar inom signifikant kallade toppar (FRiP-poäng) konsekvent högre i GFP-märkta prover än i deras kontroll-IgG-prover (se kompletterande figur 2). Sammanfattningsvis visar dessa resultat att CUT & RUN-protokollet som beskrivs här är en robust metod optimerad för att undersöka C. albicans TF-DNA-bindande interaktioner från prover med låg överflöd.

Figure 1
Figur 1: Epitopmärkning av C. albicans TF. (A) Identifiera en TF-gen av intresse (NDT80 i detta fall) och välj ett gRNA för att rikta skärningen av Cas9 (representerad av den orange formen) vid 3 '-änden av ORF. (B) Candida clade-optimerad eGFP med >50 bp homologi uppströms och nedströms från skärplatsen kommer att ge dDNA för att reparera DSB. (C) Använd koloni-PCR för att screena enskilda kolonier för att bekräfta den avsedda integrationen. Primers indikeras med röda pilar, och amplicons betecknas med streckade lådor. Denna siffra skapades med hjälp av BioRender.com. Förkortningar: TF = transkriptionsfaktor; gRNA = styr RNA; ORF = öppen läsram; eGFP = förbättrat grönt fluorescerande protein; DSB = dubbelsträngad paus; USA = uppströms; DS = nedströms. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 2
Figur 2: Schematisk översikt över det experimentella cut&run-protokollet. C. albicans celler som samlats in från biofilm eller planktoniska odlingsförhållanden permeabiliseras för att isolera intakta kärnor. ConA-pärlor aktiveras och de intakta kärnorna binds sedan till de aktiverade ConA-pärlorna. Antikroppen av intresse tillsätts till de pärlbundna kärnorna och inkuberas vid 4 °C. Därefter tillsätts pAG-MNase och får binda till målantikroppen. Efter tillsats av CaCl2 aktiveras pAG-MNas och riktad kromatinförtunning fortsätter tills tillsatsen av kelatreagenset för att inaktivera pAG-MNas. Det pAG-MNas-bundna antikroppskomplexet får diffundera ut ur de permeabiliserade kärnorna, och det resulterande DNA extraheras och rengörs. Sekvenseringsbibliotek förbereds från CUT & RUN-berikade DNA-fragment, och de resulterande biblioteken körs sedan på en 10% PAGE-gel för att separera och ta bort förorenande adapterdimerer före sekvensering. Denna siffra skapades med hjälp av BioRender.com. Förkortningar: CUT&RUN = klyvning under mål och frisättning med nukleas; ConA = concanavalin A; PAGE = polyakrylamidgelelektrofores. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 3
Bild 3: Schematisk översikt över CUT&RUN-dataanalyspipelinen. Arbetsflödet börjar med att utföra kvalitetskontroller på de råa FASTQ-filerna med FastQC, följt av trimning för att ta bort sekvenseringsadaptrar. De trimmade läsningarna justeras sedan till referensgenomet, och de justerade läsningarna filtreras baserat på deras storlek för att berika för bindningssignaler i TF-storlek (20 bp ≤ justerad läsning ≤ 120 bp). Storleksvalda avläsningar kalibreras sedan mot spik-in Escherichia coli-läsningar , och kalibrerade läsningar används för att ringa toppar med MACS2. Den <> symbolen är en visuell representation för att indikera att C. albicans läsantal kalibrerades med hjälp av E. coli läsantal för varje prov. Förkortningar: CUT&RUN = klyvning under mål och frisättning med nukleas; TF = transkriptionsfaktor. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 4
Figur 4: Kvalitetskontrollsteg som är kritiska för framgångsrika CUT & RUN-experiment. (A) Celler färgas med fluorescerande cellvägg (blå) och nukleinsyra (grön) fläckar före och efter kärnisolering och visualiseras med hjälp av ett fluorescensmikroskop. (B) CUT&RUN TF-bibliotek analyseras med hjälp av ett kapillärelektroforesinstrument. Framgångsrika CUT&RUN TF-bibliotek (som indikeras av den gröna bocken) berikas för korta fragment som är mindre än 200 bp. Suboptimala CUT&RUN TF-bibliotek (indikeras av det röda "X") visar anrikning för stora DNA-fragment. (C) 48 CUT&RUN-bibliotek samlas ihop och analyseras med hjälp av ett kapillärelektroforesinstrument. Högkvalitativa, poolade bibliotek (indikeras med den gröna bocken) är fria från adapterdimerer (körfält 1), medan poolbibliotek av låg kvalitet (indikeras med det röda "X") behåller små mängder adapterdimerer (körfält 2). (D) Representativa IGV-spår från CUT&RUN-dataset (inklusive Ndt80 IgG-kontrollen, bottenspåret) som visar betydande anrikning för Ndt80-bindning (toppspår) vid den intergena regionen uppströms EFG1 ORF (Orf19.610). De svarta staplarna representerar signifikant berikade Ndt80-bindningstoppar som identifierats av tidigare publicerade ChIP-chipexperiment4. De blå staplarna representerar signifikant berikade Ndt80-bindningstoppar som identifierats i CUT & RUN-experimenten som presenteras här. Skalstänger = 50 μm (A). Förkortningar: CUT&RUN = klyvning under mål och frisättning med nukleas; TF = transkriptionsfaktor; GFP = grönt fluorescerande protein; ORF = öppen läsram. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 5
Figur 5: Utvärdering av Ndt80- och Efg1-berikade toppar identifierade med hjälp av det presenterade CUT &RUN-protokollet och dataanalyspipelinen på Candida albicans biofilmer. Venndiagrammen i den övre raden illustrerar graden av överlappning mellan Ndt80- och Efg1-bindningsställen som identifierats via CUT&RUN med tidigare publicerade ChIP-chipdata4. CUT &RUN-signalerna för alla bindningshändelser för Ndt80 och Efg1 visas i den nedre raden som färgade värmekartor (röd = hög toppsignal; blå = låg / ingen toppsignal; färgad stapel indikerar IgG-signal subtraherad från GFP-signal); 1 000 bp-regioner uppströms (-1,0 kb) och nedströms (+1,0 kb) visas i värmekartorna. Signalintensiteten (dvs. anrikning) som profildiagram visas ovanför värmekartorna. Tre biologiska replikat för Ndt80 och Efg1 utvärderades för att visualisera CUT&RUN-anrikningen. Förkortningar: ChIP = kromatinimmunutfällning; CUT&RUN = klyvning under mål och frisättning med nukleas; GFP = grönt fluorescerande protein. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Tabell 1: PCR-reaktionsblandning och PCR-cykelförhållanden för att förstärka universella A- och unika B-fragment. Klicka här för att ladda ner denna tabell.

Tabell 2: PCR-reaktionsblandning och PCR-cykelförhållanden för att sy A- och B-fragment för att skapa C-fragmentet i full längd. Klicka här för att ladda ner denna tabell.

Tabell 3: PCR-cykelförhållanden till PCR förstärker C-fragmentet i full längd. Klicka här för att ladda ner denna tabell.

Tabell 4: PCR-reaktionsblandning och PCR-cykelförhållanden för att förstärka donatorns DNA GFP-tagg. Klicka här för att ladda ner denna tabell.

Tabell 5: Plasmid digestion reaction mix och reaktionsbetingelser för plasmid digestion reaktioner. Klicka här för att ladda ner denna tabell.

Tabell 6: PCR-reaktionsblandning och PCR-cykelförhållanden för koloni-PCR. Klicka här för att ladda ner denna tabell.

Tabell 7: PCR-cykelförhållanden för bibliotekets slutreparationssteg som förberedelse för sekvensering. Klicka här för att ladda ner denna tabell.

Tabell 8: Rekommendationer för adapterutspädning för indata-DNA för att förbereda sekvenseringsbibliotek. Klicka här för att ladda ner denna tabell.

Tabell 9: PCR-cykelförhållanden till PCR förstärker det adapterligade DNA: t. Klicka här för att ladda ner denna tabell.

Kompletterande figur 1: Ndt80 DNA-bindande sekvensmotiv anrikning. Kumulativa Ndt80-motivberikningspoäng för Ndt80-bundna loci identifierade i biofilm ChIP-chipdata (mörkblå prickad linje) eller CUT & RUN-data (ljusblå prickad linje) jämfört med slumpmässiga intergena loci (röd prickad linje). Den vänstra Y-axeln anger procentandelen av det totala antalet loci för varje datauppsättning som innehåller en motsvarande kumulativ motivpoäng på X-axeln. Streckade linjer anger betydelsen av motivpoängens anrikning (-log10 P-värde, höger Y-axel) vid varje punkt på X-axeln, i förhållande till de slumpmässiga intergena kontrollplatserna. Kumulativa motivpoäng och P-värden bestämdes med hjälp av MochiView23 (se Materialtabell). Alla Ndt80-bundna loci samplades som 500 bp-fönster centrerade under varje topp av Ndt80-bindningen inom ChIP-chip- och CUT & RUN-datauppsättningarna och jämfördes med slumpmässigt utvalda 500 bp intergena loci för att kontrollera för skillnader i längd. Förkortningar: ChIP = kromatinimmunutfällning; ChIP-chip = kromatinimmunutfällning följt av mikroarray; CUT&RUN = klyvning under mål och frisättning med nukleas. Klicka här för att ladda ner den här filen.

Kompletterande figur 2: Bråkdel av läsningar inom en topppoäng per prov. Stapeldiagram som visar FRiP-poängen för varje replik. FRiP-poäng beräknas som antalet mappade läsningar inom en topp dividerat med det totala antalet mappade läsningar i ett CUT&RUN-exempel. De olika stapelfärgerna representerar enskilda biologiska replikatprover, som anges längs X-axeln. Som förväntat är FRiP-poängen för positiva GFP-prover konsekvent högre än för negativa IgG-prover. Alla prover visar acceptabla FRiP-tröskelvärden (>1%), enligt rekommendationerna från Landt et al.20. Förkortningar: FRiP = bråkdel av läsningar inom en topp; CUT&RUN = klyvning under mål och frisättning med nukleas. Klicka här för att ladda ner den här filen.

Tilläggsfil 1: Recept för alla buffertar och lösningar som används. Klicka här för att ladda ner den här filen.

Kompletterande fil 2: Bioinformatiska verktyg som krävs för dataanalyspipelinen. Klicka här för att ladda ner den här filen.

Kompletterande fil 3: Rekommenderade blocklistade regioner i C. albicans genom. Denna lista över blocklistade loci innehåller främst mycket repetitiva sekvenselement och regioner som telomeriska upprepningar och centromerer som historiskt har gett falskt positiva resultat i tidigare genomomfattande bindningsexperiment. Klicka här för att ladda ner den här filen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Detta protokoll presenterar en omfattande experimentell och beräkningsmässig pipeline för genomomfattande lokalisering av regulatoriska TF i C. albicans. Den är utformad för att vara mycket tillgänglig för alla med standard mikrobiologi och molekylärbiologi utbildning. Genom att utnyttja det höga dynamiska omfånget och låga provinmatningskraven i CUT & RUN-analysen och inkludera optimeringar för lokalisering av TF-DNA-bindningsinteraktioner i C. albicans biofilm och planktoniska kulturer, presenterar detta protokoll ett kraftfullt och billigt alternativ till traditionella ChIP-seq-metoder. Jämfört med ChIP-seq ger CUT&RUN betydligt högre känslighet, med en högre andel sekvenseringsläsningar mappade till bundna toppar, är mer mottaglig för hög genomströmning, kräver väsentligt lägre indatacellnummer, kräver inte användning av giftiga tvärbindningsmedel och kräver tiofaldigt färre sekvenseringsläsningar per prov för att ge högkvalitativa resultat 13,14,17, 23,24. För att ytterligare minska kostnaden per prov för detta protokoll ingår buffert- och medierecept tillsammans med en detaljerad reagenslista för att underlätta intern beredning av alla nödvändiga buffertar och medier samt bulkanskaffning av väsentliga reagenser. Eftersom C. albicans biofilmbildning, fenotypisk växling och kommensalism alla regleras av komplexa sammanvävda transkriptionsnätverk26, ger detta robusta, enkla och kostnadseffektiva CUT & RUN-protokoll ett kraftfullt nytt verktyg för att förstå dessa och många andra cellulära processer i denna viktiga mänskliga svamppatogen.

TF är inte lika rikliga som histoner eller andra kromatinassocierade proteiner, vilket skapar en unik utmaning för att undersöka TF-DNA-bindningsinteraktioner via CUT & RUN. För att ta itu med denna utmaning gjordes kritiska justeringar och optimeringar av standard CUT &RUN experimentellt protokoll13. Eftersom de mest framgångsrika CUT &RUN-experimenten riktade mot TF ger en liten mängd DNA som är för utspädd för att kvantifiera och ofta berikas för fragment mindre än 150 bp13,23, optimerades också biblioteksberedningens reaktionsförhållanden för att gynna dessa mindre fragment27. Även med detta optimeringssteg innehåller de resulterande PCR-amplifierade biblioteken en betydande andel adapterdimerer, som inte helt avlägsnas med hjälp av magnetiska pärlbaserade DNA-storleksvalsmetoder. För att lösa problemet inkluderades ett page-gelstorleksvalssteg för att generera slutliga sekvenseringsklara bibliotek som i stort sett saknar adapterdimerer. Detta är ett kritiskt steg i protokollet, eftersom det är viktigt att ta bort adapterdimerer samtidigt som de mindre TF-härledda CUT &RUN-fragmenten behålls för att få högkvalitativa resultat.

Dessutom filtrerar den detaljerade beräkningspipelinen sekvenseringsdata för att fokusera på de mindre läsningarna som härrör från TF-DNA-bindningsinteraktioner i CUT & RUN-analysen. På grund av dessa TF-specifika justeringar rekommenderas inte detta protokoll för profilering av stora kromatinassocierade komplex såsom nukleosomer. Även om det är teoretiskt möjligt att anpassa protokollet för detta ändamål genom att följa standardprotokollet för biblioteksförberedelse som ingår i det kommersiellt tillgängliga biblioteksförberedelsepaketet, skulle användaren behöva justera valet av postsekvenseringsstorlek som ingår i beräkningspipelinen. Specifikt, i storleksfiltreringsavsnittet i kodfilen cut_n_run_pipeline.sh, skulle användarna behöva ersätta det aktuella värdet av "14400" (120 bp * 120 bp) med kvadraten av önskad fragmentlängd för att göra det möjligt för analysrörledningen att analysera sekvenseringsresultaten som genereras för andra typer av kromatin-DNA-bindningsinteraktioner.

Ett annat viktigt steg i ett framgångsrikt CUT &RUN-experiment inkluderar att välja optimala parametrar för dataanalys efter sekvensering. Medan det mesta av beräkningsrörledningen är utformad för att vara standardiserad och tillämplig på studien av alla regulatoriska TF av intresse för C. albicans, finns det två viktiga överväganden som användaren bör utvärdera när han kör rörledningen. Det första övervägandet är om du vill inkludera eller ta bort duplicerade läsningar från sekvenseringsdata innan bunden målwebbplats identifieras. Eftersom TF:er med låg förekomst vanligtvis ger sekvenseringsdata som innehåller en betydande andel läsningar som härleds från PCR-duplicering under biblioteksförstärkningssteget, kan borttagning av PCR-dubbletter ha en betydande negativ inverkan på resultaten. Men med mycket rikliga TF eller kromatinassocierade proteiner representerar PCR-dubbletter vanligtvis en mindre del av det totala antalet läsningar och tas ofta bort för att undertrycka bakgrundsbrus i data. I slutändan är detta beslut att behålla eller ta bort PCR-dubbletter beroende av TF av intresse och djupet av de erhållna sekvenseringsdata. Således genererar pipelinen automatiskt oberoende utdatafiler för data som härleds med eller utan PCR-dubblettläsningar, så att användaren kan bestämma vilka utdatafiler som ger de bästa resultaten för varje experiment.

Det andra övervägandet är om man ska identifiera och ta bort problematiska loci som ger betydande, men ändå mycket varierande, anrikning i både experimentella (antikroppar mot proteinet av intresse) och negativa kontrollprover (IgG). Toppanropsalgoritmen använder MACS2 för att identifiera signifikant berikade loci i både experiment- och kontrollproverna och utesluter de som visas i båda. Även om detta tillvägagångssätt vanligtvis eliminerar de mest problematiska loci, verkar vissa ibland som signifikanta toppar i vissa experiment, även om tidigare erfarenhet tyder på att de sannolikt inte är sanna positiva platser för TF-anrikning. Således tillhandahålls ett valfritt filtreringssteg för att ta bort dessa problematiska loci, kallade "blocklistade" loci. Listan över blocklistade loci innehåller främst mycket repetitiva sekvenselement och regioner som telomeriska upprepningar och centromerer som historiskt har gett falskt positiva resultat i tidigare genomomfattande bindningsanalyser. Detta är en mycket konservativ lista över loci som tilldelats som problematisk med högt förtroende. Varje användare bör dock utvärdera om det här filtret är lämpligt för deras experiment från fall till fall. Ett potentiellt alternativ till IgG-negativ kontroll skulle vara att utföra CUT&RUN mot ett kärnlokaliserat protein som inte binder DNA. Detta tillvägagångssätt har visat sig vara en idealisk kontroll för ChIP-experiment28, och ett liknande tillvägagångssätt är värt att överväga för CUT & RUN.

CUT&RUN har blivit ett populärt val för att undersöka protein-DNA-interaktioner i högre eukaryoter och modellen jäst Saccharomyces cerevisiae. Här har den framgångsrikt anpassats för att undersöka genomomfattande TF-DNA-bindningsinteraktioner i den kliniskt relevanta svamppatogenen C. albicans. Detta protokoll tillhandahåller detaljerade metoder för alla nödvändiga experimentella och beräkningsprocedurer, från konstruktion av stammar som uttrycker epitopmärkta TF: er, till beräkningsanalysen av de resulterande CUT & RUN-sekvenseringsdata. Sammantaget producerar detta protokoll och den medföljande dataanalysledningen robusta TF-DNA-bindningsprofiler, även vid användning av komplexa multimorfa populationer av celler isolerade från biofilmprover med låg överflöd och ger överlägsen datakvalitet till en lägre total kostnad än ChIP-seq-metoder.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Clarissa J. Nobile är en av grundarna av BioSynesis, Inc., ett företag som utvecklar diagnostik och terapi för biofilminfektioner.

Acknowledgments

Vi tackar alla tidigare och nuvarande medlemmar i Nobile och Hernday laboratorier för feedback på manuskriptet. Detta arbete stöddes av National Institutes of Health (NIH) National Institute of General Medical Sciences (NIGMS) tilldelningsnummer R35GM124594 och av Kamangar-familjen i form av en begåvad stol till C.J.N. Detta arbete stöddes också av NIH National Institute of Allergy and Infectious Diseases (NIAID) tilldelningsnummer R15AI137975 till A.D.H.C.L.E. stöddes av NIH National Institute of Dental and Craniofacial Research (NIDCR) stipendienummer F31DE028488. Innehållet är författarnas eget ansvar och representerar inte finansiärernas åsikter. Finansiärerna hade ingen roll i utformningen av studien; vid insamling, analys eller tolkning av data, i skrivandet av manuskriptet eller i beslutet att offentliggöra resultaten.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.22 μm filter Millipore Sigma SLGPM33RS
0.65 mL low-adhesion tubes VWR 490003-190
1 M CaCl2 Fisher Scientific 50-152-341
1 M PIPES Fisher Scientific AAJ61224AK
12-well untreated cell culture plates Corning 351143
2-mercaptoethanol Sigma-Aldrich 60-24-2
2% Digitonin Fisher Scientific CHR103MI
50 mL conical tubes VWR 89039-658
5x phusion HF buffer Fisher Scientific F530S Item part of the Phusion high fidelity DNA polymerase; referred to in text as "DNA polymerase buffer"
Agar Criterion C5001
Agencourt AMPure XP magnetic beads Beckman Coulter A63880
Agilent Bioanalyzer Agilent G2939BA Referred to in the text as "capillary electrophoresis instrument"; user-dependepent
Amplitube PCR reaction strips with attached caps, Simport Scientific VWR 89133-910
Bacto peptone BD Biosciences 211677
Benchling primer design tool Benchling https://www.benchling.com/molecular-biology/; Referred to in the text as "the primer design tool"
Betaine Fisher Scientific AAJ77507AB
Calcofluor white stain Sigma-Aldrich 18909-100ML-F
Candida Genome Database http://www.candidagenome.org/
Concanavalin A (ConA) conjugated paramagnetic beads Polysciences  86057-3
Conda software https://docs.conda.io/en/latest/miniconda.html
curl tool http://www.candidagenome.org/download/sequence/C_albicans_SC5314/Assembly21/current/C_albicans_SC5314_A21_current_
chromosomes.fasta.gz
CUTANA ChIC/CUT&RUN kit Epicypher 14-1048 Referred to in the text as "the CUT&RUN kit"
Deoxynucleotide (dNTP) solution mix (10 mM) New England Biolabs N0447S
Dextrose (D-glucose) Fisher Scientific D163
Difco D-mannitol  BD Biosciences 217020
Disposable cuvettes Fisher Scientific 14-955-127
Disposable transfer pipets Fisher Scientific 13-711-20
DNA Gel Loading Dye (6x) Fisher Scientific R0611
DreamTaq green DNA polymerase Fisher Scientific EP0713 Referred to in the text as "cPCR DNA polymerase"
DreamTaq green DNA polymerase buffer Fisher Scientific EP0713 Item part of the DreamTaq green DNA polymerase; referred to in the text as "cPCR DNA polymerase buffer"
E. coli spike-in DNA Epicypher 18-1401
ELMI Microplate incubator ELMI TRMS-04 Referred to in the text as "microplate incubator"
End Prep Enzyme Mix Item part of the NEBNext Ultra II DNA Library Prep kit
End Prep Reaction Buffer Item part of the NEBNext Ultra II DNA Library Prep kit
Ethanol 200 proof VWR 89125-170
FastDigest MssI Fisher Scientific FD1344 Referred to in the text as "restriction enzyme"
FastDigest MssI Buffer Fisher Scientific FD1344 Item part of the FastDigest MssI kit; referred to in the text as "restriction enzyme buffer"
Ficoll 400 Fisher BioReagents BP525-25
Fluorescence microscope User-dependent
Gel electrophoresis apparatus User-dependent
GeneRuler low range DNA ladder Fisher Scientific FERSM1192
GitBash workflow https://gitforwindows.org/
GitHub source code https://github.com/akshayparopkari/cut_run_analysis
HEPES-KOH pH 7.5 Boston BioProducts BBH-75-K
High-speed centrifuge User-dependent
Isopropanol Sigma-Aldrich PX1830-4
Lens paper VWR 52846-001
Ligation Enhancer Item part of the NEBNext Ultra II DNA Library Prep kit
Lithium acetate dihydrate MP Biomedicals 215525683
Living Colors Full-Length GFP polyclonal antibody Takara 632592 User-dependent
MACS2 https://pypi.org/project/MACS2/
Magnetic separation rack, 0.2 mL tubes Epicypher 10-0008
Magnetic separation rack, 1.5 mL tubes Fisher Scientific MR02
MgCl2 Sigma-Aldrich M8266
Microcentrifuge tubes 1.5 mL Fisher Scientific 05-408-129
Microplate and cuvette spectrophotometer BioTek EPOCH2TC Referred to in the text as "spectrophotometer"; user-dependent
MochiView http://www.johnsonlab.ucsf.edu/mochiview-downloads
MOPS Sigma-Aldrich M3183
NaCl VWR 470302-522
NaOH Fisher Scientific S318-500
NCBI GEO https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/
NEBNext Adaptor for Illumina Item part of the NEBNext Multiplex Oligos for Illumina (Index Primers Set 1); referred to in the text as "Adapter"
NEBNext Index X Primer for Illumina Item part of the NEBNext Multiplex Oligos for Illumina (Index Primers Set 1); referred to in the text as "Reverse Uniquely Indexed Library Amplification Primer"
NEBNext Multiplex Oligos for Illumina (Index Primers Set 1) New England Biolabs E7335S
NEBNext Ultra II DNA Library Prep kit New England Biolabs E7645S Referred to in the text as "library prep kit"
NEBNext Universal PCR Primer for Illumina Item part of the NEBNext Multiplex Oligos for Illumina (Index Primers Set 1); referred to in the text as "Universal Forward Library Amplification Primer"
Nourseothricin sulfate (NAT) Goldbio N-500-2
Novex TBE Gels, 10%, 15 well Fisher Scientific EC62755BOX
Nutating mixer VWR 82007-202
Nutrient broth Criterion C6471
pADH110 Addgene 90982 Referred to in the text as "plasmid repository ID# 90982"
pADH119 Addgene 90985 Referred to in the text as "plasmid repository ID# 90985"
pADH137 Addgene 90986 Referred to in the text as "plasmid repository ID# 90986"
pADH139 Addgene 90987 Referred to in the text as "plasmid repository ID# 90987"
pADH140 Addgene 90988 Referred to in the text as "plasmid repository ID# 90988"
pAG-MNase Epicypher 15-1016 or 15-1116 50 rxn or 250 rxn
pCE1 Addgene 174434 Referred to in the text as "plasmid repository ID# 174434"
Petri dishes with clear lid Fisher Scientific FB0875712
Phusion high fidelity DNA polymerase Fisher Scientific F530S Referred to in the text as "DNA polymerase"
Polyethylene glycol (PEG) 3350 VWR 10791-816
Potassium phosphate monobasic Fisher Scientific P285-500
Qubit 1x dsDNA HS assay kit Invitrogen Q33230
Qubit fluorometer Life Technologies Q33216 Referred to in the text as "fluorometer"; user-dependent
Rabbit IgG negative control antibody Epicypher 13-0042
RNase A Sigma-Aldrich 10109169001
Roche Complete protease inhibitor (EDTA-free) tablets Sigma-Aldrich 5056489001
RPMI-1640 Sigma-Aldrich R6504
Shaking incubator Eppendorf M12820004 User-dependent
Sorbitol Sigma-Aldrich S1876-500G
Spin-X centrifuge tube filters Fisher Scientific 07-200-385
Sterile inoculating loops VWR 30002-094
SYBR Gold nucleic acid gel stain Fisher Scientific S11494
SYTO 13 nucleic acid stain Fisher Scientific S7575 Referred to in the text as "nucleic acid gel stain"
Thermocycler User-dependent
ThermoMixer C Eppendorf 5382000023
Tris (hydroxymethyl) aminomethane Sigma-Aldrich 252859-100G
Ultra II Ligation Master Mix Item part of the NEBNext Ultra II DNA Library Prep kit; referred to in the text as "Ligation Master Mix"
Ultra II Q5 Master Mix Item part of the NEBNext Ultra II DNA Library Prep kit; referred to in the text as "High Fidelity DNA Polymerase Master Mix "
UltraPure salmon sperm DNA solution Invitrogen 15632011
USER Enzyme Item part of the NEBNext Ultra II DNA Library Prep kit; referred to in the text as "Uracil Excision Enzyme"
Vortex mixer VWR 10153-834
wget tool http://www.candidagenome.org/download/sequence/C_albicans_SC5314/Assembly21/current/C_albicans_SC5314_A21_current_
chromosomes.fasta.gz
Yeast extract Criterion C7341
Zymolyase 100T (lyticase, yeast lytic enzyme) Fisher Scientific NC0439194

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Gulati, M., Nobile, C. J. Candida albicans biofilms: development, regulation, and molecular mechanisms. Microbes and Infection. 18 (5), 310-321 (2016).
  2. Lohse, M. B., Gulati, M., Johnson, A. D., Nobile, C. J. Development and regulation of single-and multi-species Candida albicans biofilms. Nature Reviews Microbiology. 16 (1), 19-31 (2018).
  3. Nobile, C. J., Johnson, A. D. Candida albicans biofilms and human disease. Annual Review of Microbiology. 69 (1), 71-92 (2015).
  4. Nobile, C. J., et al. A recently evolved transcriptional network controls biofilm development in Candida albicans. Cell. 148 (1-2), 126-138 (2012).
  5. Iracane, E., Vega-Estévez, S., Buscaino, A. On and off: epigenetic regulation of C. albicans morphological switches. Pathogens. 10 (11), 1463 (2021).
  6. Qasim, M. N., Valle Arevalo, A., Nobile, C. J., Hernday, A. D. The roles of chromatin accessibility in regulating the Candida albicans white-opaque phenotypic switch. Journal of Fungi. 7 (1), 37 (2021).
  7. Mancera, E., et al. Evolution of the complex transcription network controlling biofilm formation in candida species. eLife. 10, 64682 (2021).
  8. Lohse, M. B., Johnson, A. D. Identification and characterization of Wor4, a new transcriptional regulator of white-opaque switching. G3: Genes, Genomes, Genetics. 6 (3), 721-729 (2016).
  9. Hernday, A. D., Noble, S. M., Mitrovich, Q. M., Johnson, A. D. Genetics and molecular biology in Candida albicans. Methods in Enzymology. 470, 737-758 (2010).
  10. Lee, T. I., Johnstone, S. E., Young, R. A. Chromatin immunoprecipitation and microarray-based analysis of protein location. Nature Protocols. 1 (2), 729-748 (2006).
  11. Zentner, G. E., Kasinathan, S., Xin, B., Rohs, R., Henikoff, S. ChEC-seq kinetics discriminates transcription factor binding sites by DNA sequence and shape in vivo. Nature Communications. 6, 8733 (2015).
  12. Schmid, M., Durussel, T., Laemmli, U. K. ChIC and ChEC: Genomic mapping of chromatin proteins. Molecular Cell. 16 (1), 147-157 (2004).
  13. Skene, P. J., Henikoff, S. An efficient targeted nuclease strategy for high-resolution mapping of DNA binding sites. eLife. 6, 21856 (2017).
  14. Skene, P. J., Henikoff, J. G., Henikoff, S. Targeted in situ genome-wide profiling with high efficiency for low cell numbers. Nature Protocols. 13 (5), 1006-1019 (2018).
  15. Nguyen, N., Quail, M. M. F., Hernday, A. D. An efficient, rapid, and recyclable system for CRISPR-mediated genome editing in Candida albicans. American Society For Microbiology. 2 (2), 00149 (2017).
  16. Ennis, C. L., Hernday, A. D., Nobile, C. J. A markerless CRISPR-mediated system for genome editing in Candida auris reveals a conserved role for Cas5 in the caspofungin response. Microbiology Spectrum. 9 (3), 0182021 (2021).
  17. Meers, M. P., Bryson, T. D., Henikoff, J. G., Henikoff, S. Improved CUT&RUN chromatin profiling tools. eLife. 8, 46314 (2019).
  18. Skrzypek, M. S., et al. The Candida Genome Database (CGD): Incorporation of Assembly 22, systematic identifiers and visualization of high throughput sequencing data. Nucleic Acids Research. 45, 592-596 (2017).
  19. Quinlan, A. R., Hall, I. M. BEDTools: a flexible suite of utilities for comparing genomic features. Bioinformatics. 26 (6), 841-842 (2010).
  20. Landt, S. G., et al. ChIP-seq guidelines and practices of the ENCODE and modENCODE consortia. Genome Research. 22 (9), 1813-1831 (2012).
  21. Boyd, J., Rodriguez, P., Schjerven, H., Frietze, S. ssvQC: an integrated CUT&RUN quality control workflow for histone modifications and transcription factors. BMC Research Notes. 14 (1), 366 (2021).
  22. Kent, W. J., Zweig, A. S., Barber, G., Hinrichs, A. S., Karolchik, D. BigWig and BigBed: enabling browsing of large distributed datasets. Bioinformatics. 26 (17), 2204-2207 (2010).
  23. Homann, O. R., Johnson, A. D. MochiView: Versatile software for genome browsing and DNA motif analysis. BMC Biology. 8, 49 (2010).
  24. Hainer, S. J., Fazzio, T. G. High-resolution chromatin profiling using CUT&RUN. Current Protocols in Molecular Biology. 126 (1), 85 (2019).
  25. Kaya-Okur, H. S., et al. CUT&Tag for efficient epigenomic profiling of small samples and single cells. Nature Communications. 10 (1), 1930 (2019).
  26. Rodriguez, D. L., Quail, M. M., Hernday, A. D., Nobile, C. J. Transcriptional circuits regulating developmental processes in Candida albicans. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 10, 605711 (2020).
  27. Zhu, Q., Liu, N., Orkin, S. H., Yuan, G. -C. CUT&RUNTools: a flexible pipeline for CUT&RUN processing and footprint analysis. Genome Biology. 20 (1), 192 (2019).
  28. Teytelman, L., Thurtle, D. M., Rine, J., Van Oudenaarden, A. Highly expressed loci are vulnerable to misleading ChIP localization of multiple unrelated proteins. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (46), 18602-18607 (2013).

Tags

Biologi utgåva 182 Candida albicans CUT & RUN transkriptionsfaktorer genomomfattande bindningsmetoder transkriptionsreglering
Genomomfattande profilering av transkriptionsfaktor-DNA-bindande interaktioner i <em>Candida albicans</em>: En omfattande CUT &amp; RUN-metod och dataanalysarbetsflöde
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Qasim, M. N., Valle Arevalo, A.,… More

Qasim, M. N., Valle Arevalo, A., Paropkari, A. D., Ennis, C. L., Sindi, S. S., Nobile, C. J., Hernday, A. D. Genome-wide Profiling of Transcription Factor-DNA Binding Interactions in Candida albicans: A Comprehensive CUT&RUN Method and Data Analysis Workflow. J. Vis. Exp. (182), e63655, doi:10.3791/63655 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter