Genomomfattande profilering av transkriptionsfaktor-DNA-bindande interaktioner i Candida albicans: En omfattande CUT & RUN-metod och dataanalysarbetsflöde

Detta protokoll beskriver alla experimentella procedurer, från epitopmärkning av transkriptionsfaktorkodande gener genom beräkningsdataanalys, för att utföra genomomfattande profilering av transkriptionsfaktor-DNA-bindande interaktioner i Candida albicans via CUT & RUN. Detta är en mer tillgänglig, snabbare, känsligare, billigare teknik och ger data av högre kvalitet än traditionella ChIP-chip- och ChIP-seq-metoder. Även om vårt protokoll är utvecklat för Candida albicans-celler isolerade från biofilmer eller planktoniska kulturer, bör det vara praktiskt att anpassa det till praktiskt taget alla goda former av Candida albicans-celler.

Efter inkubation av cellsuspensionen, överför en fem mikroliter alikvot till ett nytt PCR-rör. Till fem mikroliter isolerade kärnor och en fem mikroliter alikvot av intakta celler som tidigare lagrats vid fyra grader Celsius, tillsätt en mikroliter vardera av kalkofluorvit och SYTO 13. Inkubera vid 30 grader Celsius i mörkret i 30 minuter.

Visuellt inspektera integriteten och renheten hos de isolerade kärnorna med hjälp av ett fluorescensmikroskop. Leta efter isolerade kärnor som visar framträdande SYTO 13-färgning och se till att ingen cellväggsfärgning av det kalkofluorvita färgämnet. Upprepa inspektionen med intakta celler som en kontroll för cellväggfärgning med kalkofluorvitt färgämne.

Placera rören på ett magnetställ och vänta tills uppslamningen är helt klar. Kassera supernatanten med en pipett. Tillsätt 50 mikroliter av antikroppsbufferten och blanda försiktigt genom pipettering.

Tillsätt tre mikroliter av anti-GFP-polyklonal antikroppen till rören och inkubera rören på en mutterblandare vid 4 grader Celsius i två timmar. Centrifugera rören kort vid 100 gånger g vid rumstemperatur i fem sekunder och placera rören på ett magnetställ. När uppslamningen är klar, kassera supernatanten med en pipett.

Medan rören med pärlorna fortfarande finns på magnetstället, lägg till 200 mikroliter iskall cellpermeabiliseringsbuffert direkt på pärlorna. Kassera supernatanten med en pipett. Upprepa två tvättar med den iskalla cellpermeabiliseringsbufferten.

Tillsätt 50 mikroliter iskall cellpermeabiliseringsbuffert till varje rör och blanda försiktigt genom pipettering. Tillsätt 2,5 mikroliter av proteinet AG-MNas till varje prov och blanda genom pipettering. Placera proverna på en mutterblandare vid 4 grader Celsius och inkubera proverna i en timme.

Centrifugera remsrören kort vid 100 gånger g vid rumstemperatur i fem sekunder och placera sedan rören på ett magnetställ. När uppslamningen är klar, kassera supernatanten med en pipett. Medan rören med pärlorna fortfarande finns på magnetstället, lägg till 200 mikroliter iskall cellpermeabiliseringsbuffert direkt på pärlorna.

Kassera supernatanten med en pipett. Upprepa två tvättar med den iskalla cellpermeabiliseringsbufferten. Tillsätt 100 mikroliter av den iskalla cellpermeabiliseringsbufferten till proverna och pipettera försiktigt upp och ner fem gånger.

Ta bort gelgjutningen från gellådan och öppna gelgjutningen enligt tillverkarens instruktioner. Ta försiktigt bort gelén från gelgjutningen och placera den i en gelhållande bricka som innehåller 100 ml enkelstyrka TBE. Tillsätt 10 mikroliter av nukleinsyragelfläcken i brickan och virvla försiktigt.

Täck med folie för att skydda mot ljus och inkubera statiskt vid rumstemperatur i 10 minuter. Skölj sedan gelén två gånger med 100 ml avjoniserat kranvatten. Föreställ dig gelén under blått ljusbelysning med ett gult filterlock.

För varje bibliotek, skär gelén något ovanför det cirka 125 basparets framträdande adapterdimerband och under 400 basparstegemärket. Punktera botten av ett 0,65 ml rör med en 22-gauge nål och placera det punkterade röret inuti ett sterilt två milliliter mikrofugerör. Överför gelskivan till det punkterade röret inuti mikrofugeröret på två milliliter.

Centrifugera det två milliliter mikrofugeröret innehållande 0,65 ml punkterat rör och prov vid 10 000 gånger g vid rumstemperatur i två minuter för att samla geluppslamningen inuti två milliliter mikrofugeröret. Tillsätt 300 mikroliter iskall gelelueringsbuffert till geluppslamningen. Blanda på en mutterator vid rumstemperatur i minst tre timmar eller över natten.

Överför all vätska och geluppslamning till en 0,22 mikrometer filterkolonn och centrifug vid 10 000 gånger g vid rumstemperatur i en minut. Ladda ned källkoden för CUT&RUN-analysen från GitHub-sidan genom att klicka på den gröna kodknappen, följt av alternativet Ladda ned ZIP. Packa upp mappen till en relevant plats på den lokala datorn.

Installera Conda Environment och kör bara en gång. När Conda har installerats skapar du en virtuell miljö som medföljer relevant kommando. Aktivera den virtuella miljön varje gång det här arbetsflödet körs.

Cellväggsförtunning och kärnintegritet bedömdes genom att visualisera både kontroll intakta celler och isolerade kärnor färgade med fluorescerande cellvägg och nukleinsyrafläckar. I motsats till de isolerade intakta kärnorna där cellväggsfärgning inte observeras, är både kärnorna och cellväggarna fluorescerande märkta i de intakta kontrollcellerna. Figuren visar CUT & RUN TF-bibliotek analyserade med hjälp av ett kapillärelektroforesinstrument.

Framgångsrika CUT&RUN TF-bibliotek berikas för korta fragment mindre än 200 baspar. Suboptimala CUT&RUN TF-bibliotek visar anrikning för stora DNA-fragment. Figuren här visar att Ndt80 DNA-bindande motiv är berikade över alla Ndt80-bundna loci som identifierats av CUT & RUN, vilket indikerar att de ytterligare toppar som identifieras med denna metod sannolikt är bonafide Ndt80-bundna platser.

Jämförande analys indikerade att CUT &RUN-protokollet identifierade de flesta av de tidigare kända bindningshändelserna för Ndt80 och Efg1 under biofilmbildning. Sammantaget överlappar både Ndt80 och Efg1 loci med tidigare publicerade kromatinimmunutfällning ChIP-data och identifieras endast med hjälp av CUT & RUN. Det gör det möjligt för oss att avsevärt öka omfattningen och takten i vår forskning med fokus på transkriptionsregulatoriska nätverk och Candida albicans.