Summary
Vi presenterer en protokoll for å utvikle epiteliale organoidkulturer som starter fra menneskelig tann. Organoidene er robust utvidbare og rekapitulerer tannens epiteliale stamceller, inkludert deres ameloblast differensieringskapasitet. Den unike organoidmodellen gir et lovende verktøy for å studere human tann (stamcelle) biologi med perspektiver for tannregenereringsmetoder.
Abstract
Tenner er av avgjørende betydning i livet, ikke bare for matmastikering og tale, men også for psykologisk velvære. Kunnskap om menneskelig tannutvikling og biologi er knapp. Spesielt er ikke mye kjent om tannens epitelceller og deres funksjon. Vi lyktes i å utvikle en ny organoid modell som starter fra menneskelig tannvev (dvs. tannsekken, isolert fra ekstraherte visdomstenner). Organoidene er robust og langsiktig utvidbare og rekapitulerer det foreslåtte humane tannepitelformede stamcellerommet når det gjelder markøruttrykk samt funksjonell aktivitet. Spesielt er organoidene i stand til å utfolde en ameloblast differensieringsprosess som forekommer in vivo under amelogenesis. Denne unike organoidmodellen vil gi et kraftig verktøy for å studere ikke bare menneskelig tannutvikling, men også tannpatologi, og kan bane vei mot tannregenereringsterapi. Å erstatte tapte tenner med en biologisk tann basert på denne nye organoidmodellen kan være et tiltalende alternativ til dagens standard implantasjon av syntetiske materialer.
Introduction
Tenner har viktige roller i matmastikering, tale og psykologisk velvære (selvbilde). Den menneskelige tannen består av svært mineraliserte vev av varierende tetthet og hardhet1. Dental emalje, hovedkomponenten i tannkronen, er det høyeste mineraliserte vevet i menneskekroppen. Under emaljedannelse (amelogenese), når tennene utvikler seg, skiller tannepitelceller (DESC) seg i emaljedannende celler (ameloblaster). Når den er dannet, blir emaljen sjelden reparert eller fornyet på grunn av apoptotisk tap av ameloblastene ved utbruddet av tannutbrudd1. Restaurering av skadet emaljevev, som forårsaket av traumer eller bakteriell sykdom, oppnås for tiden ved hjelp av syntetiske materialer; Disse er imidlertid plaget med viktige mangler som mikroleakage, dårligere osseointegrasjon og forankring, begrenset levetid og mangel på fullt funksjonell reparasjon2. Derfor vil en robust og pålitelig kultur av menneskelige DESC-er med kapasitet til å generere ameloblaster og potensialet for å produsere mineralisert vev være et stort skritt fremover i tannregenereringsfeltet.
Kunnskap om human DESC fenotype og biologisk funksjon er knappe 3,4,5. Interessant nok har DESCer av menneskelige tenner blitt foreslått å eksistere i Epithelial Cell Rests of Malassez (ERM), celleklynger tilstede i tannsekken (DF), som omgir uoppløste tenner, og forblir til stede i periodontal ligament rundt roten når tannen bryter ut1. ERM-celler som er kokulturert med tannmasse har vist seg å skille seg ut i ameloblastlignende celler og generere emaljelignende vev6. Imidlertid har dype studier av den spesifikke rollen til ERM-celler i emalje (re-) generasjon vært begrenset på grunn av mangel på pålitelige studiemodeller7. Nåværende ERM in vitro kultursystemer er hemmet av begrenset levetid og raskt tap av fenotype i 2D-forholdene standard brukt 8,9,10,11,12. Derfor er et gjennomførbart in vitro-system for trofast å utvide, studere og differensiere menneskelige DESC-er sterkt nødvendig.
I løpet av det siste tiåret har en kraftig teknikk for å vokse epitelceller in vitro blitt brukt på flere typer (menneskelig) epitelvev for å studere deres biologi samt sykdom 13,14,15,16. Denne teknologien gjør det mulig for vev epitelceller å selvutvikle seg til 3D-cellekonstruksjoner (dvs. organoider) når de frøes til en ekstracellulær matrise (ECM)-etterlignende stillas (vanligvis Matrigel) og dyrket i et definert medium som replikerer vevets stamcellenisjesignalering og / eller embryogenese. Typiske vekstfaktorer som trengs for organoid utvikling inkluderer epidermal vekstfaktor (EGF) og wingless-type MMTV integrasjonssted (WNT) aktivatorer 14,15,16. De resulterende organoidene er preget av varig troskap i å etterligne vevets opprinnelige epitelceller, samt høy utvidbarhet samtidig som de beholder sin fenotype og funksjonelle egenskaper, og overvinner dermed den ofte begrensede primære menneskelige vevstilgjengeligheten som er anskaffet fra klinikken. For å etablere organoider er det ikke nødvendig å isolere de epiteliale stamcellene fra det heterogene vevet (dvs. bestående av andre celletyper som mesenchymale celler) før culturing, da mesenchymale celler ikke festes til, eller trives i, ECM, noe som til slutt resulterer i rent epitelorganoider 13,16,17,18,19 . Denne lovende og allsidige teknologien har ført til utvikling av mangfoldige organoidmodeller fra ulike menneskelige epitelvev. Imidlertid ble menneskelige tannavledede organoider, verdifulle for dyp studie av tannutvikling, regenerering og sykdom, ikke etablert ennå20,21. Vi lyktes nylig i å utvikle en så ny organoid modell som starter fra DF vev fra tredje molarer (visdomstenner) ekstrahert fra ungdomspasienter19.
Her beskriver vi protokollen for å utvikle epitelorganoidkulturer fra den voksne menneskelige tannen (dvs. fra DF av tredje molarer) (figur 1A). De resulterende organoidene uttrykker ERM-assosierte stemnessmarkører samtidig som de er langsiktige utvidbare. Interessant, motsatt av de fleste andre organoidmodeller, er den typisk nødvendige EGF overflødig for robust organoid utvikling og vekst. Interessant nok viser stemness organoider ameloblast differensieringsegenskaper, og etterligner dermed ERM / DESC-funksjoner og prosesser som forekommer in vivo. Den nye og unike organoidmodellen som er beskrevet her, gjør det mulig å utforske DESC-biologi, plastisitet og differensieringskapasitet og åpner døren for å ta de første skrittene mot tannregenerering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle metoder beskrevet her er godkjent av Etikkkomiteens forskningskomité UZ/KU Leuven (13/0104U). Utvunnet tredje molarer (visdomstenner) ble innhentet etter pasientenes informerte samtykke.
1. Forberedelser
- Forvarsel en 48-brønns kulturplate i 15-20 timer i en 1,9% CO2 inkubator ved 37 °C.
- Liquefy en Matrigel aliquot (vekstfaktor-redusert; fenol rødfri; videre referert til som kjeller membran matrise; BMM) på is (4 °C) i minst 2 timer før trinn 2.1.
MERK: Unngå frysing/opptining av BMM-syklusene. Gjør BMM flytende i 15-20 timer på is og aliquot ved 1 ml i mikrosentrifugerør og oppbevar ved -20 °C. - Avkjøl sentrifugen til 4 °C.
- Klargjør medier og filtrer løsningen gjennom et 0,22 μm filter. Følgende volumer er basert på samlingen av DFer fra alle fire tredje molarene som vanligvis ekstraheres samtidig.
- Forbered 20 ml DF-oppsamlingsmedium (tabell 1): minimum essensiell medium ørn (αMEM) som inneholder 10% foster bovint serum (FBS), 0,5% amfotericin B og 1% penicillin-streptomycin. Overfør 4 ml DF-oppsamlingsmedium til et 15 ml rør og overfør rørene på is.
MERK: Ett 15 ml rør er tilstrekkelig per pasient til prøvetaking (dvs. for fire tredje molarer). - Lag 20 ml tannorganoid medium (videre referert til som TOM; Tabell 2) ved hjelp av serumfritt definert medium (SFDM; Tabell 3). Oppbevar TOM ved 4 °C i maksimalt 2 uker.
- Forbered 8 ml dissosiasjonsmedium (tabell 4), det vil si fosfatbufret saltvann (PBS) som inneholder kollagenase VI (3 mg/ml) og dispase II (4 mg/ml). Forvarm dissosiasjonsmediet i et 37 °C vannbad i minst 10 minutter før bruk og overfør det til to 15 ml rør (4 ml per rør) for å fjerne fire DF-vev.
- Forbered en vaskeplate (12-brønns) som inneholder: tre brønner med 70% EtOH, tre brønner med PBS og tre brønner med DF-oppsamlingsmedium.
- Lag 15 ml middels A per prøve (dvs. 5 ml per to DFer per pasient; Tabell 5).
MERK: Følgende trinn bør utføres under sterile forhold.
- Forbered 20 ml DF-oppsamlingsmedium (tabell 1): minimum essensiell medium ørn (αMEM) som inneholder 10% foster bovint serum (FBS), 0,5% amfotericin B og 1% penicillin-streptomycin. Overfør 4 ml DF-oppsamlingsmedium til et 15 ml rør og overfør rørene på is.
2. Dental follikkel dissosiasjon
- Når de tredje molarene med tilhørende DFer er samlet inn i samlingsmediet (på is), overfør innholdet i rørene til en Petri-tallerken.
- Hold tannen med en pinsett og isoler DF forsiktig ved hjelp av et kirurgisk blad.
MERK: Dette trinnet krever øvelse; vær forsiktig med bladet. - For å vaske det gjenværende blodet av DF-ene, plasser DF-vevet kort i den første brønnen på 70% EtOH (vaskeplate) i 20 s, og overfør deretter til neste EtOH-brønn i 20 s, og videre til den tredje EtOH-brønnen (maksimalt 1 min i 70% EtOH totalt; lengre inkubasjonstid vil resultere i redusert celle levedyktighet).
- Deretter fortsetter du skyllingen i de tre PBS-brønnene (maksimalt 2 min totalt).
- Skyll DF-ene i de tre gjenværende DF-oppsamlingsmediumsbrønnene (opptil maksimalt 20 min totalt).
- Overfør de skyllede DF-ene til en ny Petri-tallerken.
- Klipp et lite stykke av en av DFene (~5 mm2) for paraformaldehyd (PFA) fiksering (se avsnitt 7) og oppbevar den på is (i maksimalt 6 timer) i et mikrocentrifugerør som inneholder 500 μL DF-oppsamlingsmedium til PFA-fiksering.
- Hakk resten av DF-ene i små biter (~1 mm2).
MERK: Det anbefales å umiddelbart behandle det nyisolerte DF-vevet for optimal organoiddannelse og veksteffektivitet, i stedet for å starte fra kryopreservert vev, noe som resulterer i lavere effektivitet. Likevel er det mulig å kryopreservere primært DF-vev på dette trinnet (se kryopreserveringsmedium og protokoll i avsnitt 5). - Overfør de hakkede DF-ene til et 15 ml rør som inneholder 4 ml forvarselt dissosiasjonsmedium og inkuber i et 37 °C vannbad i 2 timer.
MERK: Tilsett to DFer per 4 ml forhåndsvarslet dissosiasjonsmedium (ett rør) for å sikre optimal dissosiasjon. - Hver 15 min, pipet DF-dissociation medium blande opp og ned ved hjelp av en glass Pasteur pipet for å øke hastigheten på vevet oppløsning. Når DF-brikker ikke lenger observeres (vanligvis etter 1 time), fortsett med DF-dissosiasjon ved hjelp av en innsnevret brannpolert Pasteur-pipet.
MERK: For optimal DF-dissosiasjon, bytt til en Pasteur-pipet innsnevret av brannpolering senest 1 t DF-isolasjon.- I mellomtiden, forberede 10 ml middels A som inneholder 50 μL DNase (0,2 mg / ml; Tabell 5).
- Tilsett 5 ml middels A (som inneholder DNase) i hvert rør med dissosiert DF, og inkuber i 1 min ved romtemperatur (RT).
- Filtrer celleopphenget (som inneholder enkeltceller og små celleklumper) gjennom en 40 μm cellesil for å fjerne de resterende store fragmentene og (det meste av) det fibrøse vevet.
- Kombiner flere rør med dissosiert DF fra en pasient på dette trinnet.
- Skyll filteret med 1 ml middels A. Sentrifuger den filtrerte cellefjæringen ved 200 x g i 10 min ved 4 °C.
- Fjern den supernatante, resuspend pellet i 1 ml SFDM (tabell 3), og overfør cellefjæringen til et 1,5 ml mikrosenterrør.
- Beregn cellekonsentrasjonen ved hjelp av en automatisert celleteller. Forsøm celleklumper som gjenstår.
- Sentrifuge ved 200 x g i 5 min ved 4 °C.
3. Etablering av tannorganoidkultur (figur 1A og figur 2A)
- Basert på det oppnådde cellenummeret, beregn antall brønner som kan frøes. En 20 μL dråpe skal inneholde 20.000 celler. Den endelige blandingen består av celleoppheng og BMM med et forhold på 30:70.
- Fjern riktig mengde supernatant og resuspend i iskald BMM for å oppnå et 70:30-forhold på BMM: cellefjæring for plating. For eksempel, når 200.000 celler er oppnådd, plate 10 dråper på 20 μL. Fjern dermed supernatanten til 60 μL av cellefjæringen er igjen, tilsett 140 μL iskald BMM og resuspend.
- Resuspend sakte for å unngå luftbobledannelse. Når du har resuspendert i BMM, hold mikrosentrifugerøret på is.
MERK: Å holde mikrosenterrøret på is er avgjørende for å unngå BMM-størkning.
- Resuspend sakte for å unngå luftbobledannelse. Når du har resuspendert i BMM, hold mikrosentrifugerøret på is.
- Rør de 20 μL BMM-dråpene i midten av brønnene på den forvarmede 48-brønns kulturplaten.
- Snu platen opp ned, legg den i en 1,9% CO2 inkubator (% CO2 i henhold til SFDM buffer), og la den størkne i minst 20 minutter ved 37 °C.
- Tilsett ROCK-hemmer (RI; 10 μM) og amfotericin B (0,1 %) til TOM og forvarm mediet i et vannbad på 37 °C.
MERK: Amfotericin B er lysfølsom. - Ta 48-brønnsplaten fra inkubatoren, plasser oppreist og tilsett 250 μL av det forberedte forhåndsvarsmede mediet til hver brønn med BMM-dråpe / celler og returner platen til 1,9% CO2 inkubator.
- For å oppdatere mediet (helst hver 2-3 dager), vipp 48-brønnsplaten i en 45° vinkel, fjern forsiktig det forrige mediet samtidig som du unngår å berøre BMM-dråpen, og tilsett 250 μL nytt forhåndsvarslet TOM-medium.
MERK: Det anbefales å oppdatere minst tre ganger i uken for å unngå uttømming av viktige næringsstoffer og vekstfaktorer. RI trenger bare å legges til TOM ved første såing og de første dagene av hver passaging (se avsnitt 4) for å forhindre celledød av anoikis og forbedre organoid utvekst. Amfotericin B tilsettes kun til mediet under passasje 0 (P0) for å blokkere mulig soppforurensning.
4. Forsterkning og passivisering av tannorganoidkultur (figur 1B og figur 2B)
- Passasje organoidene mellom 10 og 14 dager med kultur.
MERK: Unngå dyrking over lengre tid, da langvarig kultur kan begrense organoid gjenvekst og passasje. Bare ved første utvikling (P0) kan organoider dyrkes i opptil 20 dager, avhengig av vekstraten (til maksimalt ±200 μm i diameter nås). - Fjern mediet fra brønnene med organoider som må passeres. Innenfor én kulturtilstand samler du opptil fire sammenfallende brønner (se figur 2C).
- For å samle organoidene, tilsett 400 μL iskald SFDM per brønn direkte på BMM-dråpen og rør mediet gjentatte ganger opp og ned til hele BMM-dråpen løsnes.
- I tilfelle brønner samles, overfør 400 μL fra den første brønnen til den neste (og så videre) for å løsne de organoidholdige BMM-dråpene til alle brønner som må samles.
- Overfør den løsnede BMM-organoidenheten til et 1,5 ml mikrosenterrør og gjenta trinn 4.3 igjen til alle organoidstrukturene er samlet inn fra brønnene.
- Sentrifuge ved 200 x g i 5 min ved 4 °C.
- Prewarm en aliquot av TrypLE Express (supplert med RI ved 5 μM) i et 37 °C vannbad. Per mikrosentrifugerør av organoider er det nødvendig med et volum på 400 μL TrypLE Express.
- Etter sentrifugering, fjern supernatanten og resuspend pellet i 400 μL av TrypLE. Inkuber suspensjonen i et 37 °C vannbad i 12 minutter.
- Tilsett 400 μL iskald SFDM for å inaktivere enzymet og sentrifugen ved 200 x g i 5 min ved 4 °C. Fjern supernatanten.
- Pre-coat en spiss (for volum se nedenfor) med iskald SFDM og resuspend organoid pellet.
- For å unngå organoid tap, bruk den samme (forhåndsbelagte) spissen så mye som mulig uten å sette steriliteten i fare.
MERK: Volumet av SFDM som kreves for resuspending av pellets, avhenger av antall organoidstrukturer oppnådd og gjeldende passasjenummer. - Som en tommelfingerregel, for passasjer, bruker P0 til P2-3 (generelt fortsatt et lavt antall organoider) et volum på 200 μL SFDM. Fra passasjer bruker P3-4 eller høyere (vanligvis et større antall organoider) et volum på 700 μL SFDM.
MERK: Begge prosedyrene kalles henholdsvis "low passage" og "higher passage"-metoder (se trinn 4.10 og 4.11). Riktig bruk av de distinkte metodene er avgjørende for effektiv passaging av organoidene. Med den høyere passasjemetoden går organoider lettere tapt og bør ikke brukes på lavt antall organoider (dvs. ved P0 til P2-3). Den høyere passasjemetoden er imidlertid nødvendig for å effektivt dissosiere større mengder organoider.
- For å unngå organoid tap, bruk den samme (forhåndsbelagte) spissen så mye som mulig uten å sette steriliteten i fare.
- Lav passasje metode: Resuspend pellet i 200 μL av iskald SFDM. Skyv den helt tømte pipetspissen mot bunnen av mikrosenterrøret for å redusere diameteren. Kontroller om diameteren er liten nok (langsommere aspirasjon, flyten er skjev, men ikke blokkert). Pipet opp og ned i 5 min for å forstyrre organoidene mekanisk.
- Høyere passasjemetode: Resuspend pellet i 700 μL iskald SFDM med en P1000-spiss. Legg til en P200-spiss (ikke noe filter) på toppen av denne P1000-spissen og pre-coat med iskald SFDM. Forhindre luftbobledannelse ved å justere pipettens voluminnstilling for å aspirere minst 90% av medievolumet (med organoider). Pipet opp og ned i 5 min for å forstyrre organoidene mekanisk.
- Kontroller under lysmikroskopet (ved 4x forstørrelse) hvis hovedsakelig enkeltceller med (bare) noen få udisperserte strukturer oppnås.
- Tilsett 500 μL iskald SFDM i mikrosenterrøret og bland forsiktig den dissosierte celleblandingen med den friske SFDM ved pipettering.
- La store udispererte strukturer sedimentere i 10 min ved å plassere mikrocentrifugerøret vertikalt på is.
MERK: Det er nødvendig å fjerne de udispererte strukturene fordi de påvirker organoid passasjeevne negativt. For organoid initiering (P0) er dette sedimenteringstrinnet ikke nødvendig. - Samle supernatanten (~500-1000 μL avhengig av passiviseringsmetoden) som inneholder enkeltceller og små celleklynger; overføres til et nytt mikrosenterrør, og sentrifuge ved 190 x g i 10 minutter ved 4 °C.
- Beregn cellekonsentrasjonen ved hjelp av en automatisert celleteller. Forsøm celleklumper som gjenstår.
- Tell hvor mange brønner som kan sås og beregn riktig cellesuspensjon/BMM-forhold som beskrevet ovenfor (avsnitt 3).
- Tilsett 70% av BMM i cellepelleten og vedlikehold mikrocentrifugerøret på is.
MERK: Det er avgjørende å holde mikrosentrifugerøret på is for å unngå BMM-størkning. - Fortsett med trinn 3.3 til 3.7 og gå igjen mellom dag 10 og dag 14 av kulturen.
5. Kryopreservering av tannorganoider
- Samle og ta avstand fra organoidene som nevnt ovenfor for passivring (trinn 4). Sentrifuger cellesuspensjonen ved 200 x g i 5 min ved 4 °C.
- Kast den supernatante og resuspend pellet i 1 ml kryopreserveringsmedium som inneholder SFDM (70%), FBS (20%), og DMSO (10%).
- Overfør suspensjonen til en kryovial og legg den på is. Plasser kryovariene i en kryoboks og overfør til -80 °C (i minst 4 timer).
- Innen 1 måned overfører du de frosne prøvene til flytende nitrogen for langtidslagring (>12 måneder).
6. Tining av kryopreserverte tannorganoider
- Før du starter opptiningsprosedyren, plasser ett 15 ml rør per kryo toårig på is som inneholder 10 ml SFDM med 20% FBS.
- Fjern kryonalen fra det flytende nitrogenet og legg det på is.
MERK: Utfør følgende trinn så raskt som mulig og unngå for lang opptiningstid (>5 min) samt for lange intervaller mellom trinnene (>5 min), da slik forlengelse vil redusere celleoverlevelsen. - Plasser kryonalen i et varmt vannbad (37 °C) til det tines (~1-2 min).
- Overfør umiddelbart innholdet i kryonalen til det iskalde 15 ml-røret og sentrifugen ved 200 x g i 5 min ved 4 °C.
- Fjern 9 ml av supernatanten og sentrifuger de resterende 1 ml ved 200 x g i 5 minutter ved 4 °C. Fjern supernatanten og vask pelletsen med 1 ml iskald SFDM.
- Overfør celleoppheng til et 1,5 ml mikrosenterrør og tell cellene ved hjelp av en automatisert celleteller.
- Tell hvor mange brønner som kan sås og beregn riktig cellesuspensjon/BMM-forhold som beskrevet ovenfor (avsnitt 3).
- Sentrifuge ved 200 x g i 5 min ved 4 °C. Resuspend pellet i et 70:30 forhold mellom BMM:TOM og hold på is.
- Fortsett med trinn 3.3 til 3.7 og passasje mellom dag 10 og dag 14 av kulturen.
7. Fiksering og parafin-innebygging av tannorganoider
MERK: Denne prosedyren (inkludert avsnitt 8 og 9) kan også brukes på det primære DF-vevet.
- Fiksering av tannorganoider i PFA
- Fjern mediet fra hver brønn og i trinn 4.2.
- Samle organoidene ved å løsne BMM-dråpen (trinn 4.3). Overfør BMM-organoidblandingen til et 1,5 ml mikrosenterrør.
- Sentrifuge ved 200 x g i 5 min ved 4 °C.
- Fjern supernatanten og tilsett 500 μL 4% PFA og inkuber i minst 30 min (maksimalt 1 t) ved RT med skånsom blanding på en orbital shaker.
FORSIKTIG: Bruk den kjemiske hetten når du arbeider med PFA. - Sentrifuge ved 200 x g i 5 min ved 4 °C. Fjern supernatanten og skyll den organoide pelletsen med PBS i 10 min ved RT med forsiktig risting.
- Vask den organoide pelletsen (trinn 7.1.5) ytterligere to ganger. Snurr de faste organoidene ned ved 200 x g i 5 min ved 4 °C.
- Resuspend pellet i 500 μL av 70% EtOH (i deionisert vann). Oppbevar organoidene i opptil 1 måned i 70 % EtOH ved 4 °C.
- Agarose- og parafin-innebygging av tannorganoider
MERK: For å effektivt legge inn organoider i parafin, er det nødvendig med et ekstra trinn for innebygging i agarose.- Sentrifuger PFA-faste organoider i 70% EtOH ved 200 x g i 5 min ved 4 °C. Fjern supernatanten.
- Forbered en 2% agarose løsning i 30 ml PBS i en glassflaske. Varm opp agarose-PBS-blandingen i en mikrobølgeovn til en gellignende struktur er observert (ca. 2,5 min ved 600 W).
- Parallelt, tilsett 30 ml PBS til en annen glassflaske og varm opp i mikrobølgeovnen (ca. 2,5 min ved 600 W). La agaroseløsningen avkjøles i 1 min.
- Klipp enden av en P200-spiss for å tillate arbeid med agaroseoppløsningen nøyaktig og for å unngå luftbobler.
- Forvarm P200-spissen i den varme PBS ved å pipettere opp og ned et par ganger.
- Tilsett 150 μL for forhåndsvarslet agaroseoppløsning til den organoide pelletsen og rør forsiktig opp den organoid-agarose blandingen (med minimal resuspension) samtidig som du unngår luftbobler.
MERK: Den minimale resuspensionen vil tillate bedre lokalisering av organoidene i agarosegelen ved mikrotome-seksjonering siden organoidene da er nærmere hverandre. - Overfør umiddelbart den organoid-agarose blandingen til samme mikrocentrifuge rørhette, legg røret horisontalt og la agarose størkne (~ 20 min ved RT). I mellomtiden merker du kassettene.
- Når den er størknet, fjern agarosegelen fra mikrocentrifugehetten ved hjelp av en pinsett og overfør den til en merket kassett.
- Overfør den agaroseholdige kassetten til et beger som inneholder 50% EtOH i deionisert vann. Dekk begeret med parafilm for å unngå fordampning av EtOH.
MERK: Volumet på begeret avhenger av antall kassetter. - Behandle prøvene i en vevsprosessor over natten.
MERK: Ettersom parafin størkner ved RT, må følgende trinn utføres raskt. - Forvarm en varmeblokk i den innebygde arbeidsstasjonen i 15 minutter.
- Fjern den organoidholdige agarosegelen som er omsluttet av kassetten, og plasser den i den forhåndsvarmede varmeblokken. Fjern hetten fra kassetten og legg den til side for senere bruk.
- Fyll den gjenværende varmeblokken med paraffin.
MERK: Kontroller med en pinsett om den organoidholdige agarosegelen fortsatt er plassert på bunnen av varmeblokken. På grunn av sin lette, kan det begynne å flyte, noe som resulterer i prøvetap. - Plasser kassetthetten på toppen av varmeblokken. La det størkne i 30 min på en kald tallerken. Fjern varmeblokken og oppbevar parafinblokkene ved 4 °C.
8. Mikrotomseksjon og farging av tannorganoider (figur 2B og figur 3A-C)
- Mikrotome-seksjonering av organoidholdige parafinblokker
- Skjær 5 μm deler av tannorganoidene i parafinblokkene ved hjelp av en mikrotom.
- Plasser parafinskivene på toppen av en mikroskopglasssklie. Plasser mikroskopglasssklien på en varm plate ved 37 °C og dekk den med deionisert vann ved hjelp av en Pasteur-pipet.
- La mikroskopglasset gli tørt over natten.
- Farging av tannorganoide seksjoner
- Deparaffiner organoiddelene (på mikroskopglasssklie) i en ovn i 1 time ved 58 °C.
- Rehydrer organoiddelene (på mikroskopglasssklie) i å redusere EtOH-serien inne i den kjemiske hetten i følgende rekkefølge:
Xylen 2x i 3 min hver
100% EtOH 2x i 3 min hver
95% EtOH 2x i 3 min hver
90% EtOH 2x i 3 min hver
70% EtOH 3x i 3 min hver
FORSIKTIG: Bruk den kjemiske hetten når du arbeider med Xylen. - Skyll mikroskopglasset i vann fra springen i 5 minutter ved RT. Skyll den deretter i PBS i 5 minutter ved RT.
- Utfør antigenuthenting ved å plassere organoidseksjonene (på mikroskopglasssklie) i forvarselssitratbuffer (10 mM sitronsyre i deionisert vann med pH 6; i en plastbeholder; forvarsel i 10 min i et 95 °C vannbad) i 30 minutter i et 95 °C vannbad.
- La mikroskopglasset gli ned i 20 minutter ved RT. Skyll mikroskopglasset i PBS i 5 minutter ved RT, og deretter i PBS som inneholder 0,1 % Triton-X (PBT) i 5 minutter ved RT.
- Bruk en merkepenn til å opprette en hydrofob barriere ved kantene på hvert lysbilde.
- Blokker i minst 1 t ved RT i blokkeringsbuffer (inneholder 1,5 mg/ml glycin, 2 mg/ml albumin bovint serum (BSA) oppløst i PBT) pluss 10 % eselserum.
MERK: Vanligvis er det nødvendig med 300 μL blokkeringsbuffer pluss 10 % eselserum per mikroskopglasssklie. - Plasser mikroskopglasset i et fuktig kammer. Bruk en lufttett boks der alle lysbildene passer og fukter noen papirvev med vann som skal plasseres nederst i esken. Dette forhindrer at skliene tørker ut under de påfølgende fargingstrinnene.
- Fjern blokkeringsbufferen, tilsett det primære antistoffet (tabell 6) fremstilt i blokkeringsbuffer pluss 1% eselserum og inkuber lysbildet dekket med antistoffoppløsning over natten i det fuktige kammeret ved 4 °C. Gjør om nødvendig markeringsrammen for pennekanten.
- Vask mikroskopglasset tre ganger i PBT ved RT i 10 minutter med skånsom blanding på en orbital shaker (75-150 rpm).
- Tilsett det sekundære antistoffet (tabell 6), fremstilt i blokkeringsbuffer pluss 1% eselserum, og inkuber i 1 time i det fuktige kammeret ved RT.
- Fjern blokkeringsbufferen og vask mikroskopglasset tre ganger i PBT ved RT i 10 minutter med skånsom blanding på en orbital shaker.
- Tilsett antifade monteringsmedium med DAPI (1 til 3 dråper) på en glassdekslelip og monter dette på toppen av organoiddelene (på mikroskopglasssklie). Fortsett med avbildning; lagre lysbilder i maksimalt 1 uke ved 4 °C.
9. RNA-ekstraksjon og RT-qPCR av tannorganoider (figur 2B og figur 3D)
- RNA-ekstraksjon av tannorganoider
- Fjern mediet fra hver brønn (trinn 4.2).
- Samle organoidene ved å løsne BMM-dråpen (trinn 4.3), overfør BMM-organoidblandingen til et 1,5 ml mikrocentrifugerør og sentrifuger ved 200 x g i 5 minutter ved 4 °C.
- Fjern den supernatante, resuspend kraftig i 350 μL av 1% β-mercaptoetanol oppløst i lysisbuffer (Tabell over materialer), og legg på is.
FORSIKTIG: Utfør alle trinnene med β-mercaptoetanol i en kjemisk hette.
MERK: Prøver kan lagres på dette trinnet i opptil 1 måned ved -80 °C. Tine prøvene på is før du fortsetter med trinn 9.1.4. - Virvel prøvene til ingen organoidstrukturer blir observert lenger.
- Fortsett med RNA-ekstraksjon ved hjelp av RNA-ekstraksjonssettet (Materialliste) i henhold til produsentens instruksjoner.
- RT-qPCR av tannorganoider (tabell 7)
- Omvendt transkribering (RT) RNA19 ved hjelp av det omvendte transkripsjonssettet (Materialliste) i henhold til produsentens instruksjoner.
- Analyser de resulterende cDNA-prøvene med SYBR Green-basert kvantitativ PCR (qPCR)19 ved hjelp av et PCR-system i sanntid (Materialfortegnelse).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Tann organoid utvikling
Vi tilbyr en detaljert protokoll for å etablere organoidkulturer fra humant DF-vev ervervet etter visdomstannutvinning (figur 1A). Isolert DF er enzymatisk og mekanisk dissosiert. De oppnådde cellene dyrkes innenfor BMM i medier som ble empirisk definert for optimal organoid utvikling og vekst (tannorganoid medium; TOM)19.
Organoidene utvikler seg vanligvis innen 2 uker etter DF-cellesåing (P0; Figur 2A). Organoidene er langsiktige utvidbare (opptil 11 passasjer så langt) (figur 2B, vist ved P4). Såing rundt 20.000 celler per BMM-dråpe (ved både P0 og videre passasjer) gir en optimal tetthet av organoider (figur 2C), mens såing av høyere celletall fører til suboptimal organoid utvekst (dvs. mindre organoider med for høy tetthet) da det ikke er nok plass til å vokse (figur 2D). De til slutt optimaliserte kulturforholdene tillater utvikling av organoider fra DF-prøver ved 100% effektivitet19.
Tannorganoid karakterisering og validering
De utviklede organoidene viser et tett utseende og inneholder celler som viser et høyt nukleo-cytoplasmisk forhold, som tilsvarende observert i ERM-cellene7 (figur 3A). Videre, og i ytterligere analogi, uttrykker organoidene ERM-markøren cytokeratin 14 (CK14)22, og bekrefter dermed deres epitelial opprinnelse (figur 3B), samt andre foreslåtte ERM-markører (som P63, CD44 og ITGα6 12,22,23 (figur 3B). Videre uttrykker organoider SOX2, en kjent DESC-markør hos mus og også tilstede i epitelet for å utvikle menneskelige tenner (figur 3B)1. Interessant, amelogenin (AMELX), hovedkomponenten i emaljematrisen, også funnet uttrykt i organoidene, oppdages også i ERM24 (figur 3C). Uttrykk for fortsatt andre ERM/stemness markører er beskrevet i vår nylige studie19 og kan brukes til å ytterligere sertifisere de oppnådde organoider. Videre beholder organoidene sin ERM/stemness fenotype under passivring, blant annet vist ved stabilt uttrykk for ERM/stamcellemarkører (figur 3D). Til slutt viser de tannavledede organoidene differensieringskapasitet til ameloblastceller(-lignende), som også kan brukes til å validere de oppnådde organoidkulturene, som viser uttrykk for modne ameloblastmarkører som odontogene-ameloblast assosierte protein (ODAM) og amelotin (AMTN) etter overføring til differensieringsmedium (se19).
Figur 1: Skjematisk arbeidsflyt for tannorganoid utvikling, karakterisering og anvendelser. (A) Tannorganoid utvikling fra tannsekk (DF) vev isolert fra uutløste tredje molarer. (B) Forsterkning, karakterisering og anvendelsespotensial for tannorganoider. d, dag; P, passasje. Opprettet med BioRender.com. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Tannorganoid utvikling. (A) Organoid utvikling fra DF vev. Representative brightfield-bilder vist på forskjellige dager (d) etter sådd (P0; P, passasje; 2,5x). (B) Brightfield-bilder som viser robust passasje av en tannorganoid linje (2,5x). (C) Brightfield bilder som viser en tann organoid linje umiddelbart ved passaging (d0; venstre; 2.5x) frø på en tetthet på 20,000 celler per brønn, og den resulterende confluent organoid kultur klar til å bli passert (d14; høyre; 2,5x). (D) Brightfield-bilder som viser en tannorganoidlinje, som hadde blitt sådd med en tetthet på >20 000 celler, noe som førte til mindre organoider med for høy tetthet ved d14 (2,5x). Skalastenger: 200 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Tannorganoid karakterisering. (A) Brightfield-bilder av DF-avledede organoidkulturer ved forskjellige forstørrelser som viser tette strukturer utviklet på 14 dager i TOM (P4; 5-20x)). Hematoksylin og eosinfarging av en organoid (P1, dag 11). Boksen er forstørret. Piler indikerer celler med høyt nukleo-cytoplasmisk forhold. (B) Immunfluorescent farging for epitelial/ERM/stemness markører i TOM-dyrkede organoider (20x). (C) Immunfluorescent farging for amelogenin (AMELX) i TOM-dyrket organoid (20x). DAPI (blå) ble brukt til å merke kjerner. (D) Genuttrykksnivåer (i forhold til GAPDH) av ERM/stemness-markører i P1 og P5 TOM-dyrkede organoider på dag 14 av kulturen (gjennomsnittlig ± SEM; n = 3 biologiske repliker). Skalastenger: 50 μm, med mindre annet er angitt. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
| Dental follikkel (DF) samling medium | |
| Navn | Konsentrasjon |
| Minimum essensiell medium ørn (αMEM) | |
| Fetal bovin serum (FBS) | 10% |
| Amfotericin B | 0.5% |
| Penicillin-streptomycin (Penn/Strep) | 1% |
Tabell 1: Dental follikkel (DF) samlingsmedium. Tabellen viser bestanddelene i DF-samlingsmediet.
| Tannorganoid medium (TOM) | |
| Navn | Konsentrasjon |
| Serumfritt definert medium (SFDM) | Se tabell 3 for sammensetning |
| A83-01 | 0,5 μM |
| B27 (uten vitamin A) | 2% |
| Koleratoksin | 100 ng/ml |
| FGF2 (= grunnleggende FGF) | 20 ng/ml |
| FGF8 | 200 ng/ml |
| FGF10 | 100 ng/ml |
| L-Glutamin | 2 mM |
| IGF-1 | 100 ng/ml |
| N2 | 1% |
| N-acetyl L-cysteine | 1,25 mM |
| Nikotinamid | 10 mM |
| Noggin | 100 ng/ml |
| RSPO1 | 200 ng/ml |
| SB202190 (p38i) | 10 μM |
| Hysj | 100 ng/ml |
| WNT3a | 200 ng/ml |
Tabell 2: Tannorganoid medium (TOM). Tabellen viser bestanddelene og deres respektive konsentrasjoner som kreves for å forberede tannorganoidmediet.
| Serumfritt definert medium (SFDM) (pH 7.3) | |
| Navn | Konsentrasjon |
| Steril H2O | |
| DMEM 1:1 F12 uten Fe | 16,8 g/l |
| Transferrin | 5 mg/l |
| Insulin fra bovin bukspyttkjertelen | 5 mg/l |
| Penicillin G natriumsalt | 35 mg/l |
| Streptomycinsulfat salt | 50 mg/l |
| Etanol absolutt, ≥99,8% (EtOH) | 600 μL/l |
| Catalase fra bovin lever | 50 μL/l |
| Natrium hydrogen karbonat (NaHCO3) | 1 g/l |
| Albumin Bovine (cellekultur klasse) | 5 g/l |
Tabell 3: Serumfritt definert medium (SFDM) (pH 7.3). Tabellen viser sammensetningen av det serumfrie definerte mediet.
| Dissosiasjonsmedium | |
| Navn | Konsentrasjon |
| Fosfatbufret saltvann (PBS) | |
| Kollagené IV | 3 mg/ml |
| Dispase II | 4 mg/ml |
Tabell 4: Dissosiasjonsmedium. Liste over bestanddeler og deres nødvendige konsentrasjoner for å forberede dissosiasjonsmediet.
| Middels A (pH 7,3) | |
| Navn | Konsentrasjon |
| Steril H2O | |
| DMEM pulver høy glukose | 13,38 g/l |
| HEPES | 5,958 g/l |
| Natrium-pyruvat (C3H3NaO3) | 110 mg/l |
| Penicillin G natriumsalt | 35 mg/l |
| Streptomycinsulfat salt | 50 mg/l |
| Natriumklorid (NaCl) | 0,5 g/l |
| Natrium hydrogen karbonat (NaHCO3) | 1 g/l |
| Albumin Bovine (cellekultur klasse) | 3 g/l |
| Dnase* | 0,2 mg/ml |
| *legg til når det er nevnt |
Tabell 5: Middels A (pH 7,3). Tabellen viser konsentrasjonen av bestanddelene som brukes til å forberede middels A.
| Primære antistoffer | ||
| Navn | Vert | Konsentrasjon |
| AMELX | mus | 1:100 |
| CD44 | mus | 1:200 |
| CK14 | mus | 1:200 |
| ITGA6 | kanin | 1:200 |
| P63 | kanin | 1:1000 |
| SOX2 | kanin | 1:2000 |
| Sekrundære antistoffer | ||
| Navn | Vert | Konsentrasjon |
| mus IgG (Alexa 555) | esel | 1:1000 |
| kanin IgG (Alexa 488) | esel | 1:1000 |
Tabell 6: Liste over antistoffer og deres fortynning. Tabellen viser antistoffene og deres respektive fortynninger som brukes i denne studien.
| Primere | ||
| Gen | Fremoverprimer | Omvendt primer |
| GAPDH | GGTATCGTGGAAGGACTCATGAC | ATGCCAGTGAGCTTCCCGTTCAG |
| P63 | CAACGCAGTAGACACCATTTCC | CCCAAAACCTTCTCGCTTGTT |
| ITGA6 | GGCGGTGTTATGTCCTGAGTC | AATCGCCCATCAAAAGCTC |
| SOX2 | GCTGGGACATGTGAAGTCTG | CCCTGTGGTTACCTCTTCCT |
| PITX2 | CAGCGGACTCACTTTACCAG | ATTCTTGAACCAAACCCGGAC |
Tabell 7: Liste over primere. Tabellen viser primerne til GAPDH, P63, ITGA6, SOX2 og PITX2 som brukes i denne studien.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne protokollen beskriver den effektive og reproduserbare generasjonen organoider som starter fra den menneskelige tannen. Så vidt vi vet er dette den første metoden for å etablere nåværende konsept (epiteliale) organoider som starter fra humant tannvev. Organoidene er langsiktige utvidbare og viser en tannepitelemi fenotype, dupliserende DESC-er som tidligere er rapportert i ERM-rommet i DF7. Videre replikerer organoidene funksjonelle DESC / ERM-egenskaper, inkludert utfoldelse av en ameloblast differensieringsprosess 7,25,26. Funnene er robuste siden sammenlignbare resultater ble funnet med uavhengige pasientorganoidlinjer19.
Når du utfører denne tannorganoidprotokollen, må det tas hensyn til flere kritiske punkter. For det første er tilsetningen av Rho-assosiert kinase (ROCK) hemmer Y-27632 ved første sådd og umiddelbart etter hver passaging viktig for å forhindre at enkeltcellene gjennomgår anoikis27. I tillegg er amphotericin B nødvendig i alle medieforfriskninger under P0 for å unngå (oral) sopputvekst. For det andre anbefales det å umiddelbart behandle det nyisolerte DF-vevet for optimal organoiddannelse og veksteffektivitet, i stedet for å starte fra kryopreservert vev, noe som resulterer i lavere effektivitet. For det tredje, når du tiner en kryopreservert organoid linje for dyrking, utfør trinn så raskt som mulig og unngå for lang opptiningstid samt for lange intervaller mellom trinnene som tidsforlengelse reduserer celleoverlevelse. For det fjerde bør det bemerkes at antall organoider ved tidlig passasje (P0-P3) kan forbli begrenset, også fordi bare begrenset antall ERM (stamceller) kan være til stede i de spesifikke isolerte DF-vevsprøvene. Derfor bør organoidkulturene ved tidlig passasje håndteres med forsiktighet og omtanke. Derfor anbefales det å (i) unngå rask utvidelse av organoidkulturen (dvs. bare begynne å dele på 1:3 eller mer fra P3-4, og før kl. 1:0.5 eller 1:1); (ii) bruke riktig splittingsmetode (lav passasje - høyere passasje) som beskrevet. Innenfor denne sammenhengen anbefales det å samle uoppdagede visdomstenner til unge ungdomspasienter (15 til 19 år) siden ERM-cellene reduseres i antall med tannutvikling ogalder 28. For det femte fører gjenværende udisperserte harde vevsfragmenter fra DF-vevet i celleopphenget (selv etter filtrering) til at BMM-fallet blir mindre stabilt og mer sannsynlig å løsne under kulturen. En høyere prosentandel av BMM (for eksempel 80%) anbefales hvis flere udispersede harde vevsfragmenter observeres i den dissosierte DF-cellefjæringen. For det sjette anbefales det sterkt å passere organoidene mellom dag 10 og dag 14 av kulturen siden lengre kultur vil påvirke organoid utvidbarhet negativt på grunn av mindre optimal dissosiasjon. Hvis organoider av en eller annen grunn dyrkes lenger enn 14 dager, kan TryplE Express kvantitet og inkubasjonstid for organoid dissosiasjon utvides for effektiv dissosiasjon, selv om 15 min med enzymatisk eksponering ikke bør overgås. I samme sammenheng må kulturmediet oppdateres hver 2-3 dager for å forhindre nærings- og vekstfaktorutmattelse. I tilfelle organoider ikke ekspanderer riktig, uavhengig av de kritiske punktene nevnt ovenfor, bør man fokusere på å holde alle verktøy (BMM, iskald SFDM for pre-beleggspiss, mikrocentrifuge rør) som brukes under passaging på is. I tillegg er det avgjørende å bruke de distinkte passagingsmetodene riktig (lav passasje og høyere passasjemetode) for effektiv passaging av organoidene.
Tidligere har andre grupper rapportert in vitro-vekst av primært humant DESC/ERM-vev 8,9,10,11,12,21. Imidlertid var kulturer hovedsakelig 2D (monolayers) og ikke 3D, for eksempel denne organoidmodellen, og viste dessuten bare kortsiktig vekst og fenotype oppbevaring. Alternativt ble ofte (spontant) udødelige celler brukt, som imidlertid ikke er fysiologiske og viser bare begrenset likhet med vevet eller opprinnelsescellene. Videre ble disse cellelinjene avledet fra embryonalt vev og / eller fra dyr. Videre er ameloblast differensiering enten ikke beskrevet eller bare begrenset dokumentert. Dermed tilbyr den organoide modellen som presenteres her flere fordeler, å være (i) trofast recapitulation av vev / celler av opprinnelse, (ii) langsiktig utvidbar, (iii) dyrket i 3D nærmere representerer in vivo konfigurasjon, (iv) av menneskelig opprinnelse og postnatal alder, og (v) i stand til å differensiere til modne tannceller (ameloblast celletype) (se19).
Dermed genererte vi et verdifullt forskningsverktøy, ikke rapportert før, og holdt flere interessante applikasjoner (figur 1B). Organoidene kan brukes til å studere menneskelig DESC/ERM-stilhet og plastisitet. Det gir mulighet til å få ytterligere innsikt i biologien til den fortsatt gåtefulle ERM-cellepopulasjonen ved hjelp av immunfluoreserende, genuttrykk og (encellede) transkripsjonsanalyser. I tillegg er organoider spesielt egnet for modellering av menneskelig sykdom for å dechiffrere patogenetiske mekanismer, identifisere (nye) terapeutiske mål og generere verktøy for oppdagelse og screening av legemidler29. Mer spesifikt kan denne modellen brukes på odontogene cyster (som ingen pålitelig forskningsmodell er tilgjengelig for), som kan sammenlignes med sunne tannavledede organoider. I tillegg kan denne tannorganoide tilnærmingen utnyttes til å modellere og studere tannsykdommer som spenner fra påvirkning av bakterier til genetiske mutasjoner forbundet med tannavvik (som mutasjoner i P63, som kan innføres ved hjelp av banebrytende genredigeringsmetoder som CRISPR-Cas)30, som til slutt fører til potensiale, og nye, terapeutiske mål og behandlinger. Andre anvendelser av tannorganoidprotokollen kan omfatte biobanking (som for tiden allerede er tilgjengelig for tannmasse, for eksempel Future Health Biobank)31 for å samle organoidlinjer fra mangfoldige personer og sykdommer (f.eks. for grunnleggende og translasjonell forskning som narkotikascreening). Videre har flere rapporter om sammensatte organoidmodeller som ikke bare inneholder epitel, men også andre celletyper av opprinnelsesvevet nylig blitt publisert 32,33. Siden tannsammensetning er ganske kompleks, er det et tiltalende perspektiv å bruke denne epiteliale organoidmodellen i kombinasjon med disse celletypene for å representere deres in vivo-motstykke mer detaljert. Også dette systemet gjør det mulig å utforske amelogenesis i den menneskelige tannen, for tiden bare dårlig forstått, men absolutt stole på epitel-mesenchymale interaksjoner. Dechiffrering av ameloblastutvikling forventes å representere et viktig sprang fremover i tannvitenskapelig og klinisk verden siden produksjonen av emalje, den kvintessensielle komponenten av tennene våre, er et svært jaget mål i tannvevsreparasjon. Videre kan den organoide modelleringen som er beskrevet i denne studien, bety starten på dannelsen av mineralisert vev in vitro og bane vei mot å utvikle en bioengineered tann (eller i det minste deler) for erstatningsterapi.
En av begrensningene i organoidmodellen er at den utelukkende representerer den epiteliale komponenten av vev. Men som beskrevet i detalj ovenfor, kan denne mangelen løses ved tilsetning av andre celle / vevstyper, for eksempel tannmesenchyme19. Et annet aspekt som kan gjenkjennes som en begrensning er opprinnelsen til BMM som brukes her (Matrigel). Denne BMM er avledet fra en sarkom (Engelbrecht-Holm-Swarm) av en mus og må derfor byttes ut før du oversetter den organoide tilnærmingen til klinikken. Nylig er det gjort flere anstrengelser for å erstatte Matrigel med syntetiske hydrogeler34,35. Imidlertid er det nødvendig med mer forskning for å lykkes med å vokse organoider i slike ikke-naturlige geler. Selv om organoidteknologien gir en interessant tilnærming for fremtidig tannregenereringsterapi - for eksempel utviklingen av en bioengineered tann - bør det reises etiske spørsmål om personvernet til celledonorer samt kommersialisering av menneskelige organoider og vev avledet derav. Så langt er detikke kommet noen konklusjoner om organoid kommersialisering for regenerative formål. Dentalmasse biobanker har vært på vei opp31, samt organoid biobanker fra flere, hovedsakelig kreftvev, for narkotika screening formål. Gitt at organoider ikke kan kategoriseres som celler, gameter, vev eller organer (som alle er regulert av loven), er det et presserende behov for å skildre sin juridiske status for bruk i kliniske, vitenskapelige eller kommersielle omgivelser. Selv om organoidene har vist seg å deponere mineralisert vev når subkutant transplantert in vivo19, er det nødvendig med ytterligere studier for å analysere deres potensial til å deponere emalje som ligner på en naturlig menneskelig tann.
Til sammen presenterer den nye organoidmodellen et lovende, verdifullt verktøy for å studere human tann (stamcelle) biologi og amelogenesis, begge for tiden bare dårlig utforsket, med fremtidige perspektiver mot tannsykdomsmodellering og regenerative terapier.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Den tilsvarende forfatteren sørger for at alle forfattere har avslørt alle interessekonflikter.
Acknowledgments
Vi er takknemlige til alle ansatte ved Oral and Maxillofacial Surgery (MKA) i UZ Leuven, så vel som pasientene, for deres uvurderlige hjelp til å samle nyutpakkede tredje molarer. Vi vil også takke Dr. Reinhilde Jacobs og Dr. Elisabeth Tijskens for deres hjelp med prøvesamlingen. Dette arbeidet ble støttet av tilskudd fra KU Leuven (BOF) og FWO-Flandern (G061819N). L.H. er en FWO Ph.D. Fellow (1S84718N).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL Microcentrifuge tube | Eppendorf | 30120.086 | |
| 15 mL Centrifuge tube | Corning | 430052 | |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M-6250 | |
| 48-well flat bottom plates | Corning | 3548 | |
| 50 mL Centrifuge tube | Corning | 430290 | |
| A83-01 | Sigma-Aldrich | SML0788 | |
| Agarose | Lonza | 50004 | |
| Albumin Bovine (cell culture grade) | Serva | 47330.03 | |
| AMELX antibody | Santa Cruz | sc-365284 | |
| Amphotericin B | Gibco | 15200018 | |
| B27 (without vitamin A) | Gibco | 12587-010 | |
| Cassette | VWR | 7202191 | |
| Catalase from bovine liver | Sigma-Aldrich | C100 | |
| CD44 antibody | Abcam | ab34485 | |
| Cell strainer, 40 µm | Falcon | 352340 | |
| Cholera Toxin | Sigma-Aldrich | C8052 | |
| Citric acid | Sigma-Aldrich | C0759 | |
| CK14 antibody | Thermo Fisher Scientific | MA5-11599 | |
| Collagenase IV | Gibco | 17104-019 | |
| Cover glass | VWR | 6310146 | |
| Cryobox | Thermo Scientific | 5100-0001 | |
| Cryovial | Thermo Fisher Scientific | 375353 | |
| Dimethylsulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| Dispase II | Sigma-Aldrich | D4693 | |
| DMEM 1:1 F12 without Fe | Invitrogen | 074-90715A | |
| DMEM powder high glucose | Gibco | 52100039 | |
| Dnase | Sigma-Aldrich | D5025-15KU | |
| Donkey serum | Sigma-Aldrich | D9663 - 10ML | |
| Embedding workstation, 220 to 240 Vac | Thermo Fisher Scientific | 12587976 | |
| Ethanol absolute, ≥99.8% (EtOH) | Fisher Chemical | E/0650DF/15 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Sigma-Aldrich | F7524 | |
| FGF10 | Peprotech | 100-26 | |
| FGF2 (= basic FGF) | R&D Systems | 234-FSE-025 | |
| FGF8 | Peprotech | AF-100-25 | |
| GenElute Mammaliam Total RNA Miniprep Kit | Sigma-Aldrich | RTN350-1KT | Includes 1% β-mercaptoethanol dissolved in lysis buffer |
| Glass Pasteur pipette | Niko Mechanisms | 170-40050 | |
| Glycine | VWR | 101194M | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H4034 | |
| IGF-1 | PeproTech | 100-11 | |
| InSolution Y-27632 (ROCK inhibitor, RI) | Sigma-Aldrich | 688001 | |
| Insulin from bovine pancreas | Sigma-Aldrich | I6634 | |
| ITGA6 antibody | Sigma-Aldrich | HPA012696 | |
| L-Glutamine | Gibco | 25030024 | |
| Matrigel (growth factor-reduced; phenol red-free) | Corning | 15505739 | |
| Microscope slide | Thermo Fisher Scientific | J1800AMNZ | |
| Millex-GV Syringe Filter Unit, 0.22 μm | Millipore | SLGV033R | |
| Minimum essential medium eagle (αMEM) | Sigma-Aldrich | M4526 | |
| mouse IgG (Alexa 555) secondary antibody | Thermo Fisher Scientific | A-31570 | |
| N2 | Gibco | 17502-048 | |
| N-acetyl L-cysteine | Sigma-Aldrich | A7250 | |
| Nicotinamide | Sigma-Aldrich | N0636 | |
| Noggin | PeproTech | 120-10C | |
| P63 antibody | Abcam | ab124762 | |
| Pap Pen | Sigma-Aldrich | Z377821-1EA | Marking pen |
| Paraformaldehyde (PFA), 16% | Merck | 8.18715 | |
| Penicillin G sodium salt | Sigma-Aldrich | P3032 | |
| Penicillin-streptomycin (Pen/Strep) | Gibco | 15140-122 | |
| Petri dish | Corning | 353002 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Gibco | 10010-015 | |
| Pipette (P20, P200, P1000) | Eppendorf or others | 2231300006 | |
| Plastic transfer pipette (3.5 mL) | Sarstedt | 86.1171.001 | |
| Rabbit IgG (Alexa 488) secondary antibody | Thermo Fisher Scientific | A21206 | |
| RSPO1 | PeproTech | 120-38 | |
| SB202190 (p38i) | Biotechne (Tocris) | 1264 | |
| Scalpel (surgical blade) | Swann-Morton | 207 | |
| SHH | R&D Systems | 464-SH-200 | |
| Silicone molds (Heating block) | VWR | 720-1918 | |
| Sodium Chloride (NaCl) | BDH | 102415K | |
| Sodium Hydrogen Carbonate (NaHCO3) | Merck | 106329 | |
| Sodium-pyruvate (C3H3NaO3) | Sigma-Aldrich | P-5280 | |
| SOX2 antibody | Abcam | ab92494 | |
| StepOnePlus | Thermo Fisher Scientific | Real-Time PCR System | |
| Stericup-GP, 0.22 µm | Millipore | SCGPU02RE | |
| Steriflip-GP Sterile Centrifuge Tube Top Filter Unit, 0.22 μm | Millipore | SCGP00525 | |
| Sterile 1000 μL pipette tips with filter | Greiner | 740288 | |
| Sterile 20 μL pipette tips with filter | Greiner | 774288 | |
| Sterile 200 μL pipette tips with and without filter | Greiner | 739288 | |
| Sterile H2O | Fresenius | B230531 | |
| Streptomycin sulfate salt | Sigma-Aldrich | S6501 | |
| Superscript III first-strand synthesis supermix | Invitrogen | 11752-050 | Reverse transcription kit |
| Tissue processor | Thermo Scientific | 12505356 | |
| Transferrin | Serva | 36760.01 | |
| Triton X-100 | Sigma | T8787-50ML | |
| TrypLE express | Gibco | 12605-010 | |
| Vectashield mounting medium+DAPI | Labconsult NV | H-1200 | Antifade mounting medium with DAPI |
| WNT3a | Biotechne (Tocris) | 5036-WN-500 | |
| Xylenes, 99%, for biochemistry and histology | VWR | 2,89,75,325 |
References
- Yu, T., Klein, O. D. Molecular and cellular mechanisms of tooth development, homeostasis and repair. Development (Cambridge). 147 (2), (2020).
- Arrow, P. Dental enamel defects, caries experience and oral health-related quality of life: a cohort study. Australian Dental Journal. 62 (2), 165-172 (2017).
- Mitsiadis, T. A., Orsini, G., Jimenez-Rojo, L. Dental Stem Cells for Tooth Regeneration. Dental Stem Cells: Regenerative Potential. Stem Cell Biology and Regenerative Potential. Stem Cell Biology and Regenerative Medicine. Zavan, B., Bressan, E. , Humana Press. Cham. (2016).
- Mitsiadis, T. A., Orsini, G. Editorial: a new era in dentistry: stem cell-based approaches for tooth and periodontal tissue regeneration. Frontiers in Physiology. 7, 357 (2016).
- Miran, S., Mitsiadis, T. A., Pagella, P. Innovative dental stem cell-based research approaches: the future of dentistry. Stem Cells International. 2016, 7231038 (2016).
- Shinmura, Y., Tsuchiya, S., Hata, K. I., Honda, M. J. Quiescent epithelial cell rests of malassez can differentiate into ameloblast-like cells. Journal of Cellular Physiology. 217 (3), 728-738 (2008).
- Davis, E. M. A review of the epithelial cell rests of Malassez on the bicentennial of their description. Journal of Veterinary Dentistry. 35 (4), 290-298 (2018).
- Athanassiou-Papaefthymiou, M., Papagerakis, P., Papagerakis, S. Isolation and characterization of human adult epithelial stem cells from the periodontal ligament. Journal of Dental Research. 94 (11), 1591-1600 (2015).
- Kim, G. -H., et al. Differentiation and establishment of dental epithelial-like stem cells derived from human ESCs and iPSCs. International Journal of Molecular Sciences. 21 (12), 1-16 (2020).
- Nam, H., et al. Establishment of Hertwig's epithelial root sheath/ epithelial rests of malassez cell line from human periodontium. Molecules and Cells. 37 (7), 562-567 (2014).
- Nam, H., et al. Expression profile of the stem cell markers in human hertwig's epithelial root sheath/Epithelial rests of Malassez cells. Molecules and Cells. 31 (4), 355-360 (2011).
- Tsunematsu, T., et al. Human odontogenic epithelial cells derived from epithelial rests of Malassez possess stem cell properties. Laboratory Investigation; A Journal of Technical Methods and Pathology. 96 (10), 1063-1075 (2016).
- Artegiani, B., Clevers, H. Use and application of 3D-organoid technology. Human Molecular Genetics. 27 (2), 99-107 (2018).
- Boretto, M., et al. Patient-derived organoids from endometrial disease capture clinical heterogeneity and are amenable to drug screening. Nature Cell Biology. 21 (8), 1041-1051 (2019).
- Cox, B., et al. Organoids from pituitary as a novel research model toward pituitary stem cell exploration. Journal of Endocrinology. 240 (2), 287-308 (2019).
- Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
- Boretto, M., et al. Development of organoids from mouse and human endometrium showing endometrial epithelium physiology and long-term expandability. Development (Cambridge). 144 (10), 1775-1786 (2017).
- Schutgens, F., Clevers, H. Human organoids: tools for understanding biology and treating diseases). Annual Review of Pathology. 15, 211-234 (2020).
- Hemeryck, L., et al. Organoids from human tooth showing epithelial stemness phenotype and differentiation potential. Cellular and Molecular Life Sciences. 79 (3), 153 (2022).
- Gao, X., Wu, Y., Liao, L., Tian, W. Oral organoids: progress and challenges. Journal of Dental Research. 100 (5), 454-463 (2021).
- Binder, M., et al. Novel strategies for expansion of tooth epithelial stem cells and ameloblast generation. Scientific Reports. 10 (1), 4963 (2020).
- Xiong, J., Mrozik, K., Gronthos, S., Bartold, P. M. Epithelial cell rests of malassez contain unique stem cell populations capable of undergoing epithelial-mesenchymal transition. Stem Cells and Development. 21 (11), 2012-2025 (2012).
- Luan, X., Ito, Y., Diekwisch, T. G. H. Evolution and development of Hertwig's epithelial root sheath. Developmental Dynamics. 235 (5), 1167-1180 (2006).
- Fukumoto, S., et al. New insights into the functions of enamel matrices in calcified tissues. Japanese Dental Science Review. 50 (2), 47-54 (2014).
- Consolaro, A., Consolaro, M. F. M. O. ERM functions, EGF and orthodontic movement or Why doesn't orthodontic movement cause alveolodental ankylosis. Dental Press Journal of Orthodontics. 15 (2), 24-32 (2010).
- Guajardo, G., et al. Immunohistochemical localization of epidermal growth factor in cat paradental tissues during tooth movement. American Journal of Orthodontics and Dentofacial Orthopedics. 118 (2), 210-219 (2000).
- Watanabe, K., et al. A ROCK inhibitor permits survival of dissociated human embryonic stem cells. Nature Biotechnology. 25 (6), 681-686 (2007).
- Gonçalves, J., Sasso-Cerri, E., Cerri, P. Cell death and quantitative reduction of rests of Malassez according to age. Journal of Periodontal Research. 43 (4), 478-481 (2008).
- Kim, J., Koo, B. -K., Knoblich, J. A. Human organoids: Model systems for human biology and medicine. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 21 (10), 571-584 (2020).
- Razmi, M. T., Narang, T., Handa, S. ADULT (acro-dermato-ungual-lacrimal-tooth) syndrome: a case report from India. Indian Dermatology Online Journal. 9 (3), 194 (2018).
- Future Health Biobank. , Available from: https://futurehealthbiobank.com/ch-en/ (2022).
- Schreurs, R. R. C. E., Baumdick, M. E., Drewniak, A., Bunders, M. J. In vitro co-culture of human intestinal organoids and lamina propria-derived CD4+ T cells. STAR Protocols. 2 (2), 100519 (2021).
- Fiorini, E., Veghini, L., Corbo, V. Modeling cell communication in cancer with organoids: Making the complex simple. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 166 (2020).
- Gjorevski, N., et al. Designer matrices for intestinal stem cell and organoid culture. Nature. 539 (7630), 560-564 (2016).
- Zhang, Y., et al. Polyisocyanide hydrogels as a tunable platform for mammary gland organoid formation. Advanced Science. 7 (18), 2001797 (2020).
- Mollaki, V.
