Comparaison directe de la diffusion Raman stimulée hyperspectrale et de la microscopie à diffusion Raman anti-Stokes cohérente pour l’imagerie chimique

Summary

Cet article compare directement la résolution, la sensibilité et les contrastes d’imagerie de la diffusion Raman stimulée (SRS) et de la diffusion Raman anti-Stokes cohérente (CARS) intégrées dans la même plate-forme de microscope. Les résultats montrent que CARS a une meilleure résolution spatiale, SRS donne de meilleurs contrastes et une meilleure résolution spectrale, et les deux méthodes ont une sensibilité similaire.

Abstract

La diffusion Raman stimulée (SRS) et la microscopie cohérente anti-diffusion Raman (CARS) sont les technologies d’imagerie par diffusion Raman cohérente les plus largement utilisées. L’imagerie hyperspectrale SRS et CARS offre des informations spectrales Raman à chaque pixel, ce qui permet une meilleure séparation des différentes compositions chimiques. Bien que les deux techniques nécessitent deux lasers d’excitation, leurs schémas de détection de signal et leurs propriétés spectrales sont très différents. L’objectif de ce protocole est d’effectuer à la fois l’imagerie hyperspectrale SRS et CARS sur une seule plate-forme et de comparer les deux techniques de microscopie pour l’imagerie de différents échantillons biologiques. La méthode de focalisation spectrale est utilisée pour acquérir des informations spectrales à l’aide de lasers femtosecondes. En utilisant des échantillons chimiques standard, la sensibilité, la résolution spatiale et la résolution spectrale de SRS et CARS dans les mêmes conditions d’excitation (c.-à-d. puissance à l’échantillon, temps de séjour en pixels, lentille d’objectif, énergie d’impulsion) sont comparées. Les contrastes d’imagerie de CARS et SRS pour les échantillons biologiques sont juxtaposés et comparés. La comparaison directe des performances CARS et SRS permettrait une sélection optimale de la modalité d’imagerie chimique.

Introduction

Le phénomène de diffusion Raman a été observé pour la première fois en 1928 par C. V. Raman¹. Lorsqu’un photon incident interagit avec un échantillon, un événement de diffusion inélastique peut se produire spontanément, dans lequel le changement d’énergie du photon correspond à une transition vibratoire des espèces chimiques analysées. Ce processus ne nécessite pas l’utilisation d’une étiquette chimique, ce qui en fait un outil polyvalent et sans étiquette pour l’analyse chimique tout en minimisant la perturbation des échantillons. Malgré ses avantages, la diffusion Raman spontanée souffre d’une faible section de diffusion (généralement 10^{à 11} inférieure à la section transversale d’absorption infrarouge [IR]), ce qui nécessite de longs temps d’acquisition pour l’analyse². Ainsi, la recherche d’une augmentation de la sensibilité du processus de diffusion Raman est essentielle pour pousser les technologies Raman à l’imagerie en temps réel.

Un moyen efficace d’améliorer considérablement la sensibilité de la diffusion Raman consiste à utiliser des processus de diffusion Raman cohérents (CRS), pour lesquels deux impulsions laser sont généralement utilisées pour exciter les transitions vibratoires moléculaires ^3,4. Lorsque la différence d’énergie des photons entre les deux lasers correspond aux modes vibratoires des molécules de l’échantillon, de forts signaux Raman seront générés. Les deux procédés CRS les plus couramment utilisés pour l’imagerie sont la diffusion Raman anti-Stokes cohérente (CARS) et la diffusion Raman stimulée (SRS)⁵. Au cours des deux dernières décennies, les développements technologiques ont fait progresser les techniques de microscopie CARS et SRS pour devenir des outils puissants pour la quantification sans étiquette et l’élucidation des changements chimiques dans les échantillons biologiques.

L’imagerie chimique par microscopie CARS peut être datée de 1982, lorsque le balayage laser a été appliqué pour la première fois pour acquérir des images CARS, démontré par Duncan et al⁶. La modernisation de la microscopie CARS a été considérablement accélérée après les vastes applications de la microscopie à fluorescence multiphotonique à balayage laser⁷. Les premiers travaux du groupe Xie utilisant des lasers à haut taux de répétition ont permis à CARS de devenir une plate-forme d’imagerie chimique à grande vitesse, sans étiquette, pour la caractérisation de molécules dans des échantillons biologiques ^8,9,10. L’un des principaux problèmes de l’imagerie CARS est la présence d’un arrière-plan non résonant, ce qui réduit le contraste de l’image et déforme le spectre Raman. De nombreux efforts ont été faits pour réduire le fond non résonant 11,12,13,14,15 ou pour extraire les signaux Raman résonnants des spectres CARS ^16,17. Une autre avancée qui a considérablement fait progresser le domaine est l’imagerie hyperspectrale CARS, qui permet une cartographie spectrale à chaque pixel d’image avec une sélectivité chimique améliorée ^18,19,20,21.

La diffusion Raman stimulée (SRS) est une technologie d’imagerie plus jeune que CARS, bien qu’elle ait été découverte plus tôt²². En 2007, la microscopie SRS a été rapportée en utilisant une source laser à faible taux de répétition²³. Bientôt, plusieurs groupes ont démontré l’imagerie SRS à grande vitesse en utilisant des lasers à haut taux de répétition 24,25,26. L’un des principaux avantages de la microscopie SRS par rapport à CARS est l’absence du fond non résonant²⁷, bien que d’autres arrière-plans tels que la modulation de phase croisée (XPM), l’absorption transitoire (TA), l’absorption à deux photons (TPA) et l’effet photothermique (PT) puissent se produire avec SRS²⁸. De plus, le signal SRS et la concentration de l’échantillon ont des relations linéaires, contrairement à CARS, qui a une dépendance quadratique signal-concentration²⁹. Cela simplifie la quantification chimique et le démélange spectral. Le SRS multicolore et hyperspectral a évolué sous différentes formes 30,31,32,33,34,35,36, la focalisation spectrale étant l’une des approches les plus populaires pour l’imagerie chimique ^37,38.

Cars et SRS nécessitent la focalisation de la pompe et des faisceaux laser Stokes sur l’échantillon pour correspondre à la transition vibratoire des molécules pour l’excitation du signal. Les microscopes CARS et SRS ont également beaucoup en commun. Cependant, la physique sous-jacente à ces deux processus et les détections de signaux impliquées dans ces technologies de microscopie présentent des disparités ^3,39. CARS est un processus paramétrique qui n’a pas de couplage d’énergie photon-molécule net³. Le SRS, cependant, est un processus non paramétrique et contribue au transfert d’énergie entre les photons et les systèmes moléculaires²⁷. Dans CARS, un nouveau signal à la fréquence anti-Stokes est généré, tandis que SRS se manifeste par le transfert d’énergie entre la pompe et les faisceaux laser Stokes.

Le signal CARS satisfait Eq (1)²⁸.

(1)

Pendant ce temps, le signal SRS peut être écrit comme Eq (2) ²⁸.

(2)

Ici, I_p, I_s, I_CARS et ΔI_SRS sont les intensités du faisceau de pompe, du faisceau de Stokes, du signal CARS et des signaux SRS, respectivement. χ⁽³⁾ est la susceptibilité optique non linéaire de troisième ordre de l’échantillon et est une valeur complexe composée de parties réelles et imaginaires.

Ces équations expriment les profils spectraux et la dépendance signal-concentration de CARS et SRS. Les différences physiques se traduisent par des schémas de détection disparates pour ces deux technologies de microscopie. La détection du signal dans CARS implique généralement la séparation spectrale des photons nouvellement générés et la détection à l’aide d’un tube photomultiplicateur (PMT) ou d’un dispositif à couplage de charge (CCD); pour srS, l’échange d’énergie entre la pompe et les faisceaux de Stokes est généralement mesuré par modulation d’intensité à grande vitesse à l’aide d’un modulateur optique et démodulation à l’aide d’une photodiode () associée à un amplificateur de verrouillage.

Bien que de nombreux développements et applications technologiques aient été publiés ces dernières années dans les domaines CARS et SRS, aucune comparaison systématique des deux techniques CRS n’a été effectuée sur la même plate-forme, en particulier pour la microscopie hyperspectrale CARS et SRS. Des comparaisons directes de la sensibilité, de la résolution spatiale, de la résolution spectrale et des capacités de séparation chimique permettraient aux biologistes de choisir la meilleure modalité pour la quantification chimique. Dans ce protocole, des étapes détaillées pour construire une plate-forme d’imagerie multimodale avec des modalités hyperspectrales CARS et SRS basées sur un système laser femtoseconde et une focalisation spectrale sont fournies. Les deux techniques ont été comparées dans le sens avant pour la résolution spectrale, la sensibilité de détection, la résolution spatiale et les contrastes d’imagerie des cellules.

Protocol

1. Configuration instrumentale pour l’imagerie CRS hyperspectrale REMARQUE: La génération de signal CRS nécessite l’utilisation de lasers de haute puissance (c.-à-d. classe 3B ou classe 4). Les protocoles de sécurité doivent être respectés et l’équipement de protection individuelle (EPI) approprié doit être porté en tout temps lorsque vous travaillez à des puissances de pointe aussi élevées. Consultez la documentation appropriée avant l’expérimentation. …

Representative Results

Comparaisons de la résolution spectraleLa figure 2 compare la résolution spectrale de la microscopie hyperspectrale SRS (Figure 2A) et CARS (Figure 2B) à l’aide d’un échantillon de DMSO. Pour le spectre SRS, deux fonctions lorentziennes (voir l’étape 2.3 du protocole) ont été appliquées pour s’adapter au spectre, et une résolution de 14,6 cm-1 a été obtenue en utilisant le pic de 2 …

Discussion

Le protocole présenté ici décrit la construction d’un microscope CRS multimodal et la comparaison directe entre CARS et l’imagerie SRS. Pour la construction du microscope, les étapes critiques sont le chevauchement spatial et temporel des faisceaux et l’optimisation de la taille des faisceaux. Il est recommandé d’utiliser un échantillon standard tel que le DMSO avant l’imagerie biologique pour optimiser le SNR et calibrer les décalages Raman. La comparaison directe entre les images CARS et SRS révèle q…

Materials

2D galvo scanner set	Thorlabs	GVS002
Acousto-optic modulator	Isomet	M1205-P80L-0.5
AOM driver	Isomet	532B-2
Data acquisition card	National Instruments	PCle 6363	Custom ordered filter (980 sp)
Delay stage	Zaber	X-LSM050A
Deuterium oxide	Millipore Sigma	151882-100G
Dichroic mirror for beam combination	Thorlabs	DMLP1000
Dichroic mirror for signal separation	Semrock	FF776-Di01-25×36
DMSO	MiliporeSigma	200-664-3
MIA PaCa 2 Cells	ATCC	CRL-1420
Femtosecond laser system	Spectral Physics	InSightX3+
Filter for CARS	Chroma	AT655/30m
Filter for SRS	Chroma	ET980sp
Function generator	Rigol	DG1022Z
Glass rods	Lattice Electro Optics	SF-57
Half-wave plate	Newport	10RP02-51; 10RP02-46
LabVIEW 2020	National Instruments		This is the image acquisition software
Lock-in amplifier	Zurich Instrument	HF2LI
Microscope housing	Olympus	BX51W1
Objective lens	Olympus	UPLSAPO60XW
Origin Pro 2019b	OriginLab Corporation		This is the spectral fitting software
Oscilloscope	Tektronix	TBS2204B
Photodiode	Hamamatsu	S3994-01
PMT detector	Hamamatsu	H7422P-40
PMT voltage amplifier	Advanced Research Instrument Corp.	PMT4V3
Polarizing beamsplitter cube	Thorlabs	PBS255
Terminal block	National Instruments	BNC-2110