В этой статье непосредственно сравниваются разрешение, чувствительность и контрасты визуализации стимулированного комбинационного рассеяния (SRS) и когерентного анти-Стоксовского рамановского рассеяния (CARS), интегрированные в одну и ту же платформу микроскопа. Результаты показывают, что CARS имеет лучшее пространственное разрешение, SRS дает лучшие контрасты и спектральное разрешение, и оба метода имеют одинаковую чувствительность.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Прямое сравнение гиперспектрального стимулированного рамановского рассеяния и когерентной рамановской микроскопии против Стокса для химической визуализации
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Стимулированное рамановское рассеяние (SRS) и когерентная микроскопия против стоксовского рамановского рассеяния (CARS) являются наиболее широко используемыми технологиями когерентного рамановского рассеяния. Гиперспектральная визуализация SRS и CARS предлагает рамановскую спектральную информацию на каждом пикселе, что позволяет лучше разделять различные химические составы. Хотя оба метода требуют двух лазеров возбуждения, их схемы обнаружения сигналов и спектральные свойства совершенно различны. Целью этого протокола является выполнение гиперспектральной визуализации SRS и CARS на одной платформе и сравнение двух методов микроскопии для визуализации различных биологических образцов. Метод спектральной фокусировки используется для получения спектральной информации с помощью фемтосекундных лазеров. При использовании стандартных химических образцов сравниваются чувствительность, пространственное разрешение и спектральное разрешение SRS и CARS в одинаковых условиях возбуждения (т.е. мощность на образце, время выдержки пикселя, объективная линза, энергия импульса). Контрасты изображений CARS и SRS для биологических образцов сопоставляются и сравниваются. Прямое сравнение характеристик CARS и SRS позволит оптимально выбрать модальность для химической визуализации.
Введение
Явление комбинационного рассеяния впервые наблюдалось в 1928 году К. В.Раманом 1. Когда падающий фотон взаимодействует с образцом, может спонтанно произойти событие неупругого рассеяния, при котором изменение энергии фотона соответствует вибрационному переходу анализируемых химических веществ. Этот процесс не требует использования химической метки, что делает его универсальным инструментом для химического анализа без этикеток, сводя к минимуму возмущение образца. Несмотря на свои преимущества, спонтанное комбинационное рассеяние страдает от низкого поперечного сечения рассеяния (обычно 1011 ниже, чем инфракрасно....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
1. Инструментальная настройка для гиперспектральной визуализации CRS
ПРИМЕЧАНИЕ: Генерация сигнала CRS требует использования мощных (т.е. класса 3B или класса 4) лазеров. Протоколы безопасности должны быть соблюдены, и надлежащие средства индивидуальной защиты (СИЗ) должны носиться в любое время при работе на таких высоких пиковых мощностях. Перед экспериментированием ознакомьтесь с надлежащей документацией. Этот протокол фокусируется на проектировании траектории луча, щебетании фемтосекундных импульсов и оптимизации условий визуализации. Общая оптическая компоновка этого гиперспектрального микроскопа CRS показана
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Сравнение спектрального разрешения
На рисунке 2 сравнивается спектральное разрешение гиперспектральной микроскопии SRS (рисунок 2A) и CARS (рисунок 2B) с использованием образца DMSO. Для спектра SRS были применены две функции Лоренца (см. этап протокола 2.3), чтобы соответствовать спектру, и разрешение 14,6 см-1 было получено с использованием пика 2,913 см-1 . Для CARS для подгонки использов.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Протокол, представленный здесь, описывает конструкцию мультимодального микроскопа CRS и прямое сравнение между визуализацией CARS и SRS. Для конструкции микроскопа критическими шагами являются пространственное и временное перекрытие пучка и оптимизация размера пучка. Рекомендуется использовать стандартный образец, такой как DMSO, перед биологической визуализацией для оптимизации SNR и калибровки рамановских сдвигов. Прямое сравнение между изображениями CARS и SRS показывает, что CARS имеет лучшее пространственное разреше.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
Благодарности
Это исследование было поддержано стартап-фондом факультета химии Университета Пердью.
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Комплект 2D гальванических | сканеров Thorlabs | GVS002 | |
| Акустооптический модулятор | Isomet | M1205-P80L-0.5 | |
| Драйвер AOM | Isomet | 532B-2 | |
| Плата сбора данных | National Instruments | PCle 6363 | Фильтр по заказу (980 sp) |
| Ступень задержки | Zaber | X-LSM050A | |
| Deuterium оксид | Millipore Sigma | 151882-100G | |
| Дихроичное зеркало для комбинации пучков | Thorlabs | DMLP1000 | |
| Дихроичное зеркало для разделения сигналов | Semrock | FF776-Di01-25x36 | |
| DMSO | MiliporeSigma | 200-664-3 | |
| MIA PaCa 2 Cells | ATCC | CRL-1420 | |
| Фемтосекундная лазерная система | Spectral Физика | InSightX3+ | |
| Фильтр для CARS | Chroma | AT655/30m | |
| Фильтр для SRS | Chroma | ET980sp | |
| Генератор функций | Rigol | DG1022Z | |
| Стеклянные стержни | Решетка Электрооптика | SF-57 | |
| Полуволновая пластина | Newport | 10RP02-51; 10RP02-46 | |
| LabVIEW 2020 | National Instruments | Это программное обеспечение для получения изображений | |
| Lock-in усилитель | Zurich Instrument | HF2LI | |
| Корпус микроскопа | Olympus | BX51W1 | |
| Объектив | Olympus | UPLSAPO60XW | |
| Origin Pro 2019b | OriginLab Corporation | Это программное обеспечение для подгонки спектра | |
| Осциллограф | Фотодиод Tektronix | TBS2204B | |
| Hamamatsu | S3994-01 | ||
| ФЭУ Хамамацу | H7422P-40 | ||
| ФЭУ | Advanced Research Instrument Corp. | PMT4V3 | |
| Поляризационный куб светоделителя | Thorlabs | PBS255 | |
| Клеммная колодка | National Instruments | BNC-2110 |
Ссылки
- Raman, C. V. A change of wave-length in light scattering. Nature. 121 (3051), 619(1928).
- Li, S., Li, Y., Yi, R., Liu, L., Qu, J. Coherent anti-Stokes Raman scattering microscopy and its applications. Frontiers in Physics. 8, 515(2020).
- Evans, C. L., Xie, X. S.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
