מאמר זה משווה באופן ישיר את ניגודי הרזולוציה, הרגישות וההדמיה של פיזור ראמאן מגורה (SRS) ופיזור ראמן קוהרנטי נגד סטוקס (CARS) המשולבים באותה פלטפורמת מיקרוסקופ. התוצאות מראות של-CARS יש רזולוציה מרחבית טובה יותר, SRS נותן ניגודים טובים יותר ורזולוציה ספקטרלית טובה יותר, ולשתי השיטות יש רגישות דומה.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
השוואה ישירה של פיזור ראמן מגורה היפרספקטרלי ומיקרוסקופיית פיזור ראמן אנטי-סטוקס קוהרנטית להדמיה כימית
במאמר זה
סיכום
תקציר
פיזור ראמאן מגורה (SRS) ומיקרוסקופיה קוהרנטית נגד סטוקס ראמאן (CARS) הן טכנולוגיות ההדמיה הקוהרנטיות הנפוצות ביותר של פיזור ראמאן. הדמיית SRS ו-CARS היפרספקטרלית מציעות מידע ספקטרלי של ראמאן בכל פיקסל, מה שמאפשר הפרדה טובה יותר בין הרכבים כימיים שונים. למרות ששתי הטכניקות דורשות שני לייזרי עירור, תוכניות זיהוי האותות והתכונות הספקטרליות שלהן שונות למדי. מטרת פרוטוקול זה היא לבצע הן הדמיית SRS היפרספקטרלית והן הדמיית CARS על פלטפורמה אחת ולהשוות בין שתי טכניקות המיקרוסקופיה להדמיית דגימות ביולוגיות שונות. שיטת המיקוד הספקטרלי משמשת לרכישת מידע ספקטרלי באמצעות לייזרים פמטו-שניים. על ידי שימוש בדגימות כימיות סטנדרטיות, משווים את הרגישות, הרזולוציה המרחבית והרזולוציה הספקטרלית של SRS ו-CARS באותם תנאי עירור (כלומר, כוח בדגימה, זמן השהייה של הפיקסלים, העדשה האובייקטיבית, אנרגיית הדופק). ניגודי ההדמיה של CARS ו-SRS עבור דגימות ביולוגיות משתווים ומושווים. ההשוואה הישירה של ביצועי CARS ו-SRS תאפשר בחירה אופטימלית של המודל להדמיה כימית.
מבוא
תופעת פיזור הרמאן נצפתה לראשונה בשנת 1928 על ידי C. V. Raman1. כאשר פוטון אירוע מקיים אינטראקציה עם דגימה, אירוע פיזור לא אלסטי יכול להתרחש באופן ספונטני, שבו שינוי האנרגיה של הפוטון תואם מעבר רטטי של המין הכימי שנותח. תהליך זה אינו דורש שימוש בתג כימי, מה שהופך אותו לכלי רב-תכליתי ונטול תוויות לניתוח כימי תוך מזעור ההפרעה לדגימות. למרות יתרונותיו, פיזור ראמן ספונטני סובל מחתך פיזור נמוך (בדרך כלל 1011 נמוך יותר מחתך הקליטה האינפרא אדום [IR]), המחייב זמני רכישה ארוכים לניתוח2. לפיכך, השאיפה להגברת הרגישות של תהליך פיזור הראמן חיונית לדחיפת טכנולוגיות ראמאן להדמיה בזמן אמת.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
1. הגדרה אינסטרומנטלית להדמיית CRS היפרספקטרלית
הערה: יצירת אות CRS דורשת שימוש בלייזרים בהספק גבוה (כלומר, מחלקה 3B או מחלקה 4). יש לטפל בפרוטוקולי הבטיחות וללבוש ציוד מגן אישי מתאים (PPE) בכל עת בעת עבודה בהספקי שיא כה גבוהים. התייעץ עם תיעוד מתאים לפני הניסוי. פרוטוקול זה מתמקד בתכנון נתיב הקרן, ציוץ פולסים של femtosecond ואופטימיזציה של תנאי ההדמיה. פריסה אופטית כללית של מיקרוסקופ CRS היפרספקטרלי זה מוצגת באיור 1. התצורה המוצגת כאן היא אחת מתצורות קיימות רבות עבור מיקרוסקופית CRS. מערכת המיקרוסקופיה CRS המשמשת בפרוטוקול זה בנויה על מקור לייזר פמטו-שניות בעל תפוקה כפולה ומיקרוסקופ סריקת לייזר.....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
השוואות של הרזולוציה הספקטרלית
איור 2 משווה את הרזולוציה הספקטרלית של מיקרוסקופיית SRS היפרספקטרלית (איור 2A) ו-CARS (איור 2B) באמצעות דגימת DMSO. עבור ספקטרום ה-SRS, שתי פונקציות לורנציאניות (ראו פרוטוקול שלב 2.3) יושמו כך שיתאימו לספקטרום, ורזולוציה של 14.6 ס"מ-1 הושגה באמצעות השיא של 2,913 ס"מ-1 . עבור CARS, נעשה שימוש בפונקציית התאמה של שני שיאים עם רקע גאוסיאני (ראה פרוטוקול שלב 2.3) לה.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
הפרוטוקול המוצג כאן מתאר את בנייתו של מיקרוסקופ CRS רב-מודלי ואת ההשוואה הישירה בין CARS להדמיית SRS. עבור בניית המיקרוסקופ, השלבים הקריטיים הם חפיפת קרן מרחבית וטמפורלית ואופטימיזציה של גודל הקרן. מומלץ להשתמש בדגימה סטנדרטית כגון DMSO לפני ההדמיה הביולוגית לאופטימיזציה של SNR וכיול משמרות ראמאן. השוואה ישירה בין תמונות CARS ו-SRS מגלה של-CARS יש רזולוציה מרחבית טובה יותר, בעוד ש-SRS מספק רזולוציה ספקטרלית טובה יותר וניגודים כימיים מפותלים פחות. גם ל-CARS וגם ל-SRS יש מגבלות זיהוי דומות.
CARS.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
המחברים מצהירים על היעדר ניגודי עניינים.
תודות
מחקר זה נתמך על ידי קרן הסטארט-אפים של המחלקה לכימיה באוניברסיטת פרדו.
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| סט סורק galvo דו-ממדי | Thorlabs | GVS002 | |
| מודולטור אקוסטו-אופטי | Isomet | M1205-P80L-0.5 | |
| דרייבר AOM | Isomet | 532B-2 | |
| כרטיס רכישת נתונים | National Instruments | PCle 6363 | מסנן בהזמנה אישית (980 sp) |
| שלב עיכוב | Zaber | X-LSM050A | |
| Deuterium תחמוצת | Millipore Sigma | 151882-100G | |
| מראה דיכרואית לשילוב קרן | Thorlabs | DMLP1000 | |
| מראה דיכרואית להפרדת אותות | Semrock | FF776-Di01-25x36 | |
| DMSO | MiliporeSigma | 200-664-3 | |
| MIA PaCa 2 תאים | ATCC | CRL-1420 | |
| מערכת לייזר פמטו-שנייה | ספקטרלי פיזיקה | InSightX3 + | |
| פילטר למכוניות | Chroma | AT655 / 30m | |
| מסנן עבור SRS | Chroma | ET980sp | |
| מוטות זכוכית | סריג אלקטרואופטיקה | SF-57 | |
| צלחת חצי גל | ניופורט | 10RP02-51; 10RP02-46 | |
| LabVIEW 2020 | מכשירים לאומיים | זוהי תוכנת רכישת התמונה | |
| מגבר נעילה | מכשיר ציריך | HF2LI | |
| מיקרוסקופ המאכלס | אולימפוס | ||
| Origin Pro 2019b | OriginLab Corporation | זוהי תוכנת ההתאמה הספקטרלית | |
| אוסצילוסקופ | Tektronix | TBS2204B | |
| Photodiode | Hamamatsu | S3994-01 | |
| גלאי PMT | מגבר מתח Hamamatsu | H7422P-40 | |
| PMT | Advanced Research Instrument Corp. | PMT4V3 | |
| קוביית מפצל קרן מקטב | Thorlabs | PBS255 | |
| בלוק מסוף | National Instruments | BNC-2110 |
מקורות
- Raman, C. V. A change of wave-length in light scattering. Nature. 121 (3051), 619(1928).
- Li, S., Li, Y., Yi, R., Liu, L., Qu, J. Coherent anti-Stokes Raman scattering microscopy and its applications. Frontiers in Physics. 8, 515(2020).
- Evans, C. L., Xie, X. S.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
