Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Chemistry
Click here for the English version

Chemistry

השוואה ישירה של פיזור ראמן מגורה היפרספקטרלי ומיקרוסקופיית פיזור ראמן אנטי-סטוקס קוהרנטית להדמיה כימית

Published: April 28, 2022 doi: 10.3791/63677
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1
1Department of Chemistry, Purdue University

Summary

מאמר זה משווה באופן ישיר את ניגודי הרזולוציה, הרגישות וההדמיה של פיזור ראמאן מגורה (SRS) ופיזור ראמן קוהרנטי נגד סטוקס (CARS) המשולבים באותה פלטפורמת מיקרוסקופ. התוצאות מראות של-CARS יש רזולוציה מרחבית טובה יותר, SRS נותן ניגודים טובים יותר ורזולוציה ספקטרלית טובה יותר, ולשתי השיטות יש רגישות דומה.

Abstract

פיזור ראמאן מגורה (SRS) ומיקרוסקופיה קוהרנטית נגד סטוקס ראמאן (CARS) הן טכנולוגיות ההדמיה הקוהרנטיות הנפוצות ביותר של פיזור ראמאן. הדמיית SRS ו-CARS היפרספקטרלית מציעות מידע ספקטרלי של ראמאן בכל פיקסל, מה שמאפשר הפרדה טובה יותר בין הרכבים כימיים שונים. למרות ששתי הטכניקות דורשות שני לייזרי עירור, תוכניות זיהוי האותות והתכונות הספקטרליות שלהן שונות למדי. מטרת פרוטוקול זה היא לבצע הן הדמיית SRS היפרספקטרלית והן הדמיית CARS על פלטפורמה אחת ולהשוות בין שתי טכניקות המיקרוסקופיה להדמיית דגימות ביולוגיות שונות. שיטת המיקוד הספקטרלי משמשת לרכישת מידע ספקטרלי באמצעות לייזרים פמטו-שניים. על ידי שימוש בדגימות כימיות סטנדרטיות, משווים את הרגישות, הרזולוציה המרחבית והרזולוציה הספקטרלית של SRS ו-CARS באותם תנאי עירור (כלומר, כוח בדגימה, זמן השהייה של הפיקסלים, העדשה האובייקטיבית, אנרגיית הדופק). ניגודי ההדמיה של CARS ו-SRS עבור דגימות ביולוגיות משתווים ומושווים. ההשוואה הישירה של ביצועי CARS ו-SRS תאפשר בחירה אופטימלית של המודל להדמיה כימית.

Introduction

תופעת פיזור הרמאן נצפתה לראשונה בשנת 1928 על ידי C. V. Raman1. כאשר פוטון אירוע מקיים אינטראקציה עם דגימה, אירוע פיזור לא אלסטי יכול להתרחש באופן ספונטני, שבו שינוי האנרגיה של הפוטון תואם מעבר רטטי של המין הכימי שנותח. תהליך זה אינו דורש שימוש בתג כימי, מה שהופך אותו לכלי רב-תכליתי ונטול תוויות לניתוח כימי תוך מזעור ההפרעה לדגימות. למרות יתרונותיו, פיזור ראמן ספונטני סובל מחתך פיזור נמוך (בדרך כלל 1011 נמוך יותר מחתך הקליטה האינפרא אדום [IR]), המחייב זמני רכישה ארוכים לניתוח2. לפיכך, השאיפה להגברת הרגישות של תהליך פיזור הראמן חיונית לדחיפת טכנולוגיות ראמאן להדמיה בזמן אמת.

אחת הדרכים היעילות להגביר במידה ניכרת את הרגישות של פיזור ראמאן היא באמצעות תהליכי פיזור ראמאן (CRS) קוהרנטיים, שעבורם שני פעימות לייזר משמשות בדרך כלל להנעת מעברי רטט מולקולריים 3,4. כאשר הפרש אנרגיית הפוטונים בין שני הלייזרים מתאים למצבי הרטט של מולקולות הדגימה, ייווצרו אותות ראמאן חזקים. שני תהליכי ה-CRS הנפוצים ביותר להדמיה הם פיזור ראמן קוהרנטי נגד סטוקס (CARS) ופיזור ראמאן מגורה (SRS)5. במהלך שני העשורים האחרונים, פיתוחים טכנולוגיים קידמו את טכניקות המיקרוסקופיה של CARS ו-SRS כדי להפוך לכלים רבי עוצמה לכימות ללא תוויות ולהבהרת שינויים כימיים בדגימות ביולוגיות.

הדמיה כימית על ידי מיקרוסקופיה של CARS יכולה להיות מתוארכת לשנת 1982 כאשר סריקת לייזר יושמה לראשונה כדי לרכוש תמונות CARS, שהודגמו על ידי Duncan et al6. המודרניזציה של מיקרוסקופיית CARS הואצה מאוד לאחר היישומים הרחבים של סריקת לייזר של מיקרוסקופיה פלואורסצנטית מולטי-פוטון7. עבודה מוקדמת של קבוצת Xie באמצעות לייזרים בקצב חזרות גבוה הפכה את CARS לפלטפורמת הדמיה כימית מהירה, נטולת תוויות, לאפיון מולקולות בדגימות ביולוגיות 8,9,10. אחת הבעיות המרכזיות בהדמיית CARS היא נוכחותו של רקע לא-רזוננטי, מה שמפחית את ניגודיות התמונה ומעוות את ספקטרום הראמן. נעשו מאמצים רבים להפחית את הרקע הלא-רנסנטי 11,12,13,14,15 או לחלץ אותות ראמאן מהדהדים מהספקטרה 16,17 של CARS. התקדמות נוספת שהקדמה מאוד את התחום היא הדמיית CARS היפרספקטרלית, המאפשרת מיפוי ספקטרלי בכל פיקסל תמונה עם סלקטיביות כימית משופרת 18,19,20,21.

פיזור ראמאן מגורה (SRS) היא טכנולוגיית הדמיה צעירה יותר מ-CARS, אם כי היא התגלתה מוקדם יותרבשנת 22. בשנת 2007 דווח על מיקרוסקופיית SRS באמצעות מקור לייזר בעל קצב חזרות נמוך23. עד מהרה, מספר קבוצות הדגימו הדמיית SRS במהירות גבוהה באמצעות לייזרים בקצב חזרת גבוה 24,25,26. אחד היתרונות העיקריים של מיקרוסקופיית SRS על פני CARS הוא היעדר הרקע הלא-רציוננטי27, אם כי רקעים אחרים כגון אפנון חוצה פאזות (XPM), קליטה חולפת (TA), בליעת שני פוטונים (TPA) ואפקט פוטוסתרמי (PT), עשויים להתרחש עם SRS28. בנוסף, לאות SRS ולריכוז הדגימה יש קשרים ליניאריים, בניגוד ל-CARS, שיש לה תלות ריבועית בריכוז האות29. זה מפשט את הכימות הכימי ואת אי-המיזוג הספקטרלי. SRS צבעוני והיפרספקטרלי התפתח בצורות שונות 30,31,32,33,34,35,36, כאשר מיקוד ספקטרלי הוא אחת הגישות הפופולריות ביותר להדמיה כימית 37,38.

גם CARS וגם SRS דורשים את המיקוד של המשאבה ואת קרני הלייזר של סטוקס על הדגימה כדי להתאים למעבר הרטט של המולקולות לעירור אותות. מכוניות ומיקרוסקופים SRS גם חולקים הרבה במשותף. עם זאת, בפיזיקה העומדת בבסיס שני התהליכים הללו, ובזיהוי האותות המעורבים בטכנולוגיות מיקרוסקופיה אלה, יש פעריםשל 3,39. CARS הוא תהליך פרמטרי שאין לו צימוד אנרגיה נטו של פוטון-מולקולה3. SRS, לעומת זאת, הוא תהליך לא-פאראמטרי, ותורם להעברת אנרגיה בין פוטונים למערכות מולקולריות27. ב-CARS נוצר אות חדש בתדר אנטי-סטוקס, בעוד ש-SRS מתבטא בהעברת האנרגיה בין המשאבה לקרני הלייזר של סטוקס.

אות CARS עונה על Eq (1)28.

Equation 1 (1)

בינתיים, ניתן לכתוב אות SRS כ- Eq (2)28.

Equation 1(2)

כאן, Ip, Is, ICARS ו - ΔISRS הם העוצמות של אלומת המשאבה, קרן סטוקס, אות CARS ואותות SRS, בהתאמה. χ(3) הוא הרגישות האופטית הלא-ליניארית מסדר שלישי של המדגם, והוא ערך מורכב המורכב מחלקים ממשיים ודמיוניים.

משוואות אלה מבטאות את הפרופילים הספקטרליים ואת התלות בריכוז האותות של CARS ו-SRS. הבדלים בפיזיקה גורמים לתוכניות זיהוי שונות עבור שתי טכנולוגיות מיקרוסקופיה אלה. זיהוי אותות ב-CARS כולל בדרך כלל הפרדה ספקטרלית של פוטונים חדשים שנוצרו וזיהוי באמצעות שפופרת פוטומולטיפלייר (PMT) או התקן מצומד מטען (CCD); עבור SRS, חילופי האנרגיה בין המשאבה לבין אלומות סטוקס נמדדים בדרך כלל על ידי אפנון בעוצמה גבוהה באמצעות אפנן אופטי ודמודולציה באמצעות פוטודיודה (PD) בשילוב עם מגבר נעילה.

למרות שהתפתחויות ויישומים טכנולוגיים רבים פורסמו בשנים האחרונות הן בתחום CARS והן בתחום ה- SRS, לא בוצעו השוואות שיטתיות של שתי טכניקות ה- CRS באותה פלטפורמה, במיוחד עבור מכוניות היפרספקטרליות ומיקרוסקופיה SRS. השוואות ישירות ברגישות, ברזולוציה מרחבית, ברזולוציה ספקטרלית וביכולות הפרדה כימית יאפשרו לביולוגים לבחור את המודל הטוב ביותר לכימות כימי. בפרוטוקול זה, מסופקים שלבים מפורטים לבניית פלטפורמת הדמיה רב-מודאלית עם הן מכוניות היפרספקטרליות והן אופני SRS המבוססים על מערכת לייזר femtosecond ומיקוד ספקטרלי. שתי הטכניקות הושוו בכיוון קדימה לרזולוציה ספקטרלית, רגישות לזיהוי, רזולוציה מרחבית וניגודים הדמיה של תאים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. הגדרה אינסטרומנטלית להדמיית CRS היפרספקטרלית

הערה: יצירת אות CRS דורשת שימוש בלייזרים בהספק גבוה (כלומר, מחלקה 3B או מחלקה 4). יש לטפל בפרוטוקולי הבטיחות וללבוש ציוד מגן אישי מתאים (PPE) בכל עת בעת עבודה בהספקי שיא כה גבוהים. התייעץ עם תיעוד מתאים לפני הניסוי. פרוטוקול זה מתמקד בתכנון נתיב הקרן, ציוץ פולסים של femtosecond ואופטימיזציה של תנאי ההדמיה. פריסה אופטית כללית של מיקרוסקופ CRS היפרספקטרלי זה מוצגת באיור 1. התצורה המוצגת כאן היא אחת מתצורות קיימות רבות עבור מיקרוסקופית CRS. מערכת המיקרוסקופיה CRS המשמשת בפרוטוקול זה בנויה על מקור לייזר פמטו-שניות בעל תפוקה כפולה ומיקרוסקופ סריקת לייזר.

  1. ודא שמקור הלייזר מספק שתי רכבות פולסים של femtosecond (רוחב 120 fs) עם קצב חזרה של 80 MHz, כולל אורך גל קבוע ב-1,045 ננומטר המשמש כקרן סטוקס, ואורך גל מתכוונן מ-680 עד 1,300 ננומטר המשמש כקרן המשאבה. סנכרן את פולסים של הפלט עם הפרש השהיה אופטי. השתמש במסגרת מיקרוסקופ כדי לבנות את פלטפורמת ההדמיה.
  2. תכנון נתיב הקורה
    1. כדי לשלוט בכוח הלייזר בדגימה, השתמש בשילוב של לוחית חצי גל ומפצל קרן קיטוב (PBS) עבור כל קרן לייזר.
    2. התקן אפנן אקוסטו-אופטי (AOM) בנתיב קרן הלייזר של סטוקס. מקד את הקרן עם עדשה באורך מוקד של 150 מ"מ לתוך ה- AOM ושחזר אתהפלט מסדר 0 עם עדשה באורך מוקד של 400 מ"מ.
    3. השתמש באותו זוג עדשות (אורכי מוקד של 150 מ"מ ו-400 מ"מ) כדי להרחיב את קרן המשאבה כך שתתאים לגודל קרן הלייזר עם הסטוקס.
    4. מקם את עדשות אורך המוקד בקוטר 400 מ"מ הן במשאבה והן בנתיבי הקרן של סטוקס בשלבי תרגום חד-ממדיים נפרדים כדי לכוונן את סטיית הקרן ולייעל את גודל הקרן לפני הכניסה למיקרוסקופ.
    5. כוון את אלומת המשאבה עם מראה מחזירה בזווית ישרה המותקנת על שלב תרגום ממונע לכוונון השהיה אופטי. אם קרן סטוקס זקוקה לעיכוב אופטי, מקם רכיבים אלה במקום זאת בנתיב הקרן שלה.
    6. אפשרו לשלב את שתי האלומות במראה דיכרואית עם אורך גל חתך של כ-1,000 ננומטר (בין המשאבה לאורכי הגל של סטוקס), כך שקרן סטוקס תועבר דרך המראה הדיכרואית בעוד קרן המשאבה משתקפת על ידי המראה הדיכרואית. שלח את קרני הלייזר המשולבות בקולינאריות למיקרוסקופ.
    7. כדי לצייץ את המשאבה ואת קורות סטוקס, הניחו מוטות זכוכית בנתיבי הקורה שלהם. ראה שלב 1.5 לקבלת פרטים.
    8. כדי לאשר יישור תקין וגודל קרן, השתמשו בסרעפת קשתית לאחר המראה הדיכרואית ולפני המיקרוסקופ. באופן ספציפי, התקן אחד במיקום קרוב והשני במרחק מהמראה הדיכרואית כדי לאשר יישור טוב וחפיפת קרן. השתמש בכרטיס צפייה ב- IR או במציג IR כדי להמחיש את הקרן במהלך היישור.
    9. השתמש ב- PD מהיר ובאוסצילוסקופ כדי למדוד בקירוב את ההשהיה האופטית בין המשאבה לפולסים של סטוקס. הפעל את האוסצילוסקופ על ידי דגימת רכבת פולס הלייזר.
    10. חסום את קרן המשאבה ודגום את קרן סטוקס. הגדל את אחד הפולסים והנח עליו סמן אנכי כדי לסמן את מיקומו הזמני על האוסצילוסקופ.
    11. שחררו את קרן המשאבה וחסמו את קרן סטוקס. תרגם את שלב ההשהיה עד שפולסים של משאבת הדגימה יתיישרו באופן זמני עם המיקום המסומן.
  3. מיקרוסקופ סריקת הלייזר
    1. לתצורת מיקרוסקופ זקוף, שלחו את קרני הלייזר המשולבות דרך פריסקופ כדי לטפס לרמה מתאימה לפני שתגיעו למראות הסריקה הדו-ממדיות של הגלבו.
    2. מדוד את גודל קרן הלייזר לפני המיקרוסקופ, והגדר את זוג העדשות המתאים לאחר מראות הגלבו כדי להרחיב את קרן הלייזר כך שתתאים בצורה הטובה ביותר לגודל אישון הכניסה של העדשה האובייקטיבית.
    3. בנו מערכת 4-f באמצעות שתי העדשות, כאשר הצמצם האחורי של העדשה האובייקטיבית והמרכז של שתי מראות הגלבו הם מישורים מצומדים. לחלופין, השתמש בשתי מראות galvo 1D נפרדות עם שתי מערכות עדשות 4-f לסריקת לייזר.
    4. לאחר המעבה, תכנן מראה הפוכה 2 כדי לשקף את קרני הלייזר לאיסוף אותות. מקם עדשה בקוטר 2 אינץ ' בנתיב הקרן המועברת כדי לאסוף ולמקד באופן מלא את אותות השידור לגלאים.
    5. כוון את אותות ה- CARS ל- PMT עם מראה דיכרואית בעלת ניתוק ב- 776 ננומטר, ואפשר לזהות את אותות ה- SRS המועברים על ידי ה- PD. השתמש במסנן bandpass (655/30 ננומטר) לפני ה- PMT כדי לדחות פולסים של לייזר עירור שיורי. השתמש במסנן מעבר קצר (מעבר קצר של 980 ננומטר) לפני ה- PD כדי לחסום את כניסת קרן סטוקס לגלאי.
    6. עבור זיהוי אותות CARS, חברו קדם-מהאמפיר וממיר מתח זרם לאחר ה-PMT ולפני שליחת האות למערכת רכישת הנתונים. התאם את מתח ה- PMT כדי למטב את ניגודיות האות והתמונה.
    7. השתמש במחולל פונקציות כדי לווסת את ה- AOM ב- 1-10 MHz, והשתמש באותו תדר כמו ההפניה להדגמת הנעילה. השתמש במגבר נעילה כדי לחלץ אותות SRS לפני רכישת נתונים.
  4. איסוף והצגה של נתונים
    1. בצע רכישת נתונים באמצעות כרטיס רכישת נתונים דיגיטליים (DAQ) בשילוב עם בלוק מסוף.
    2. השתמש ביציאות האנלוגיות מה- DAQ כדי לשלוט במראות ה- galvo ובכניסות האנלוגיות לרכישת אותות.
    3. השתמש בתוכנה הכתובה במעבדה המבוססת על כך של-LabVIEW יש תצוגה רב-ערוצית בו-זמנית לצפייה ושמירה בזמן אמת של תמונות (ראה קובץ משלים).
  5. ציוץ מקור הפמטו-שניות ומדידת הרזולוציה הספקטרלית
    הערה: כדי להשיג רזולוציה ספקטרלית טובה באמצעות מיקוד ספקטרלי, מוטות זכוכית משמשים כדי להציג פיזורים ולצייץ פולסי לייזר מ femtosecond כדי picosecond. כדי להשיג את הרזולוציה הספקטרלית הטובה ביותר, קצב הציוץ של קרן המשאבה צריך להיות שווה לזה של קרן סטוקס. עבור מערכת לייזר זו, ניתן להשיג את הרזולוציה הספקטרלית הטובה ביותר על ידי ציוץ פולסי הלייזר של כ-120 fs ל-3.4 ps עבור המשאבה ו-1.8 ps עבור הסטוקס. ציוץ זה מושג על ידי שימוש בשילוב 4+1 (ארבעה בקרן המשולבת, אחד רק בקורת סטוקס) של שילוב מוט זכוכית 150 מ"מ (SF-57), כמתואר להלן, ואמור להשיג רזולוציה ספקטרלית של 15 ס"מ-1 . ניתן למדוד את משך הדופק באמצעות מתאם אוטומטי.
    1. הכנס מוט זכוכית אחד בקוטר 150 מ"מ רק לנתיב הקורה של סטוקס.
    2. הכנס שני מוטות זכוכית בקוטר 150 מ"מ לנתיב הקרן המשולב של המשאבה/סטוקס לאחר מפצל הקורה הדיכרואי. כדי להגביר את הציוץ, תנו לקרני הלייזר המשולבות לעבור פעמיים את שני מוטות הזכוכית על ידי הצבת מראה דיאלקטרית בקצה אחד של המוטות.
    3. כדי למדוד את הרזולוציה הספקטרלית, הכינו דגימה כימית סטנדרטית (למשל, דימתיל סולפוקסיד [DMSO]) שנלחצה בין שני כיסויי זכוכית, וסרוק את שלב ההשהיה עד להשגת האות המרבי.
    4. הזז את ההשהיה האופטית 1,000 מיקרומטר בכיוון ההסטה האדומה. לאחר מכן, הפעל 200 פריימים ב- 10 מיקרומטר/צעד לכיוון ההסחה הכחולה כדי לאסוף את ערימת התמונות ההיפר-ספקטרלית.
    5. כדי להמיר את מספרי המסגרות למספרי גלים, בצע רגרסיה ליניארית באמצעות המספרים הסימטריים (2,913 ס"מ-1) והאסימטריים (2,994 ס"מ-1) C-H הנמתחים מ-DMSO ומספרי המסגרות המתאימים להם40.
    6. השתמש באות XPM למדידת פרופיל עוצמת המיקוד הספקטרלי. סגרו למחצה את הסרעפת על המעבה והזיזו את הפוקוס לכיסוי ריק. אסוף את אותו מספר צעדים כמו עבור SRS היפרספקטרלי. כדי למדוד את הרקע הלא-רציוננטי של CARS, התמקדו בכיסוי הזכוכית ואספו את אותו מספר צעדים עבור מדידות ה-CARS ההיפר-ספקטרליות.
  6. מיטוב יחס האות לרעש (SNR) של תמונות
    1. הכן דגימה כימית ליישור המערכת. בצע את ההליך המתואר בשלב 3.1 להכנת דגימה.
      הערה: DMSO הוא בחירה טובה מכיוון שהוא כימיקל מעבדה נפוץ עם אותות ראמאן חזקים ופסגות סימטריות ואסימטריות C-H מופרדות היטב.
    2. מניחים את הדגימה על שלב המיקרוסקופ, ומוסיפים מים או שמן טבילה במידת הצורך לעדשה האובייקטיבית או למעבה. הזז כראוי את קצה טיפת ה- DMSO בשדה הראייה והתאם את העדשה האובייקטיבית למיקוד הטוב ביותר. מרכזים את המעבה בשיטת התאורה של קוהלר41. לפתוח באופן מלא את הסרעפת על המעבה.
    3. כוונו את אורך הגל של קרן המשאבה ל-800 ננומטר (1,045 ננומטר סטוקס) כדי לכוון לשיא של 2,913 ס"מ-1 CH3 . הגדר את ההספק של המשאבה ושל קרן סטוקס לכ-30 mW לפני המיקרוסקופ על ידי התאמת לוחית חצי הגל (~ 10 mW כוח במישור הדגימה).
    4. עבור SRS, הגדר את רווח מגבר הנעילה ל- ~10 עם קבוע זמן של 7 μs (בעת שימוש בזמן השהייה של 10 μs pixel). ודא שקבוע הזמן קטן מזמן השהייה של הפיקסל. השתמש ב- Demod R עבור פלט AUX עבור אותות SRS.
    5. עבור CARS, שלח את יציאת ה- PMT לממיר הקדם-מהאמפליפייר ומתח הזרם. השתמש ב- DAQ כדי להשיג את הפלט מהממיר.
    6. הגדר את הפרמטרים של רכישת התמונה בתוכנת הרכישה. השתמש במספר פיקסלים של 200 x 200 עם גודל סריקה של ~ 100 x 100 מיקרומטר2. ודא שהתמונה מכילה גם את טיפת ה-DMSO וגם אזור ריק.
    7. סרוק את הדגימה ובדוק את התמונה על מסך המחשב. סרוק את שלב ההשהיה הממונע בקרן Stokes/pump תוך ניטור התמונות בזמן אמת. סרוק את ההשהיה עד למקסימום האות.
    8. הזז את טיפת ה- DMSO כדי לכסות את כל שדה הראייה ובדוק אם אות DC המרבי ממורכז בתמונה (האות תלוי בקרן משאבה). התאם את מיקום אלומת המשאבה באמצעות מראה או את היסט המתח בתוכנת ההדמיה.
    9. לאחר אופטימיזציה של DC, התאם את מראות הקרן של סטוקס עד למקסימום אות AC על ידי התאמת ערך הסף כך שיציג רוויה של כ-50%. בדוק אם הרוויה ממורכזת בתמונה. אם לא, כוונו את המראות רק בקרן של סטוקס. עקוב אחר האות במהלך היישור כמשוב בזמן אמת על איכות היישור.
    10. כדי לקבוע את ה- SNR, בחר אזור קטן בתמונת ה- DMSO ומדוד את הערך הממוצע. עבור הרעש, בחר אזור קטן באזור הריק של התמונה וקבע הן את הערך הממוצע הממוצע והן את סטיית התקן. הפחת את הערך הממוצע לרעש מהערך הממוצע של האות וחלק את התוצאות בסטיית התקן של האזור הריק.
    11. אם ה-SNR המחושב אינו גבוה מספיק (בדרך כלל 800-1,000 עבור SRS ו->10,000 עבור CARS במתח PMT של 0.4 V עם שילוב הספק זה), בדוק והתקן מחדש את חפיפת הקרן, גדלי הקרן ומיקום שלב ההשהיה, כוונן את ה-AOM ושינה את תדר המודולציה של מחולל הפונקציות עד לקבלת ה-SNR הצפוי.

2. ניתוח תמונות ועיבוד נתונים

  1. ניתוח SNR
    1. פתחו את תוכנת ImageJ. כדי לייבא את קובץ .txt לדוגמת DMSO שנשמר, לחץ על קובץ | ייבוא | | תמונת טקסט פתוח.
    2. לאחר ייבוא התמונה, הקש CTRL+shift+C כדי להעלות את פונקציית הבהירות והניגודיות (B&C). כדי למצוא את אות הדגימה המרבי, לחץ על הלחצן האוטומטי ב - B&C עד שאזור בדגימת DMSO יופיע רווי.
    3. לחץ על כלי הבחירה הסגלגלה בממשק ImageJ והדגש אזור קטן באזור DMSO הרווי. לאחר הסימון, הקש M כדי למדוד את הממוצע וסטיית התקן של האזור שנבחר.
    4. למדידת הרקע, התאם את הסרגלים בפונקציה B&C עד שניתן יהיה להבחין באות של האזור הריק. לחץ על הבחירה הסגלגלה והסמן אזור ברקע באותו גודל כמו עבור שלב 2.1.3. ודא שהאזור שנבחר אינו מכיל DMSO. לחץ על M כדי למדוד את הנתונים הסטטיסטיים של האזור שנבחר.
    5. חשב את ה- SNR לפי שלב 1.6.10.
  2. עיבוד תמונות CRS היפרספקטרליות
    1. ייבא את קובץ .txt בהתאם לשלב 2.1.1. לאחר הייבוא, לחץ על תמונה | ערימות | כלים | מונטאז' לערימה... כדי להמיר את הקובץ לערימת תמונות.
    2. גלול דרך המונטאז' עד שפסגת ה-DMSO הראשונה תהיה גלויה לעין. בחר אזור ב- DMSO ולחץ על תמונה | | מחסנית פרופיל ציר Z של תרשים כדי להתוות את העוצמה לעומת ספקטרום מספרי המסגרות. כדי לחלץ את הנתונים הספקטרליים הגולמיים, לחץ על רשימה והעתק את נתוני הפרופיל.
    3. כדי להמיר את הספקטרום המשוחזר ליחידות מספר גל, בצע רגרסיה ליניארית כמתואר בשלב 1.5.5.
  3. מתאים למדידת רזולוציה ספקטרלית
    הערה: פונקציות לורנציאניות משמשות להתאמה ל- SRS ול- CARS spectra28.
    1. פתח את התוכנה המתאימה, ולאחר מכן העתק והדבק את נתוני הרגרסיה הליניארית לתוך התוכנית. להתאמת נתוני ה- SRS, סמן את הנתונים ולאחר מכן התווה את הנתונים כעלילת פיזור.
    2. משוך את חלקת הפיזור. לחץ על ניתוח | פסגות וקו בסיס | מספר | כושר שיא פתח את דיאלוג כדי להעלות את מנתח השיא. כאשר מושכים למעלה, בדקו שהקלט הוא העלילה הנוכחית ושנו את פונקציית השיא ללורנציאן (לורנץ).
    3. לחץ פעמיים על כל אחת משתי פסגות ה- DMSO בגרף כדי להדגיש את האזורים שיש להתקין. לאחר מכן, לחץ על פתח NLfit כדי להעלות את חלון ההתאמה . לחץ על כפתור ההתאמה עד להתכנסות , ולאחר מכן אישור, כדי לראות סיכום טבלאי של מקדמי ההתאמה (ראה Eq (3)).
      הערה: המשוואה שלהלן מציגה את תבנית הפונקציה הלורנציאנית בתוכנה. 1/2 הם המשרעת של הפסגות המתאימות, w1/2 הם רוחב הפסגות המותאמות, וערכי x01/02 הם המרכזים של הפסגות המותאמות. המשתנה הבלתי תלוי הוא x והמשתנה התלוי הוא y.
      Equation 1 (3)
    4. להתאמה ספקטרלית של CARS, לחצו על ניתוח | התאמת | התאמה של עקומה לא ליניארית | פתח את תיבת הדו-שיח. בחר קטגוריה: חדש כדי להגדיר פונקציה חדשה עבור CARS. השתמש בפונקציית התאמת CARS בעלת שני שיאים המוגדרת להלן (ראה Eq (4)) עבור התאמה ספקטרלית של CARS.
      Equation 1 (4)
  4. קביעת הרזולוציה המרחבית
    הערה: לפני שלב זה, חשוב לדעת את ההמרה בין גודל הפיקסל בהגדלה מסוימת, מספר פיקסלים וגודל הצעד ב- μm. ניתן לבצע זאת על ידי שימוש בדגימה בקוטר ידוע הגדול מרזולוציית ההדמיה הצפויה, מדידת פרופיל הקו שלה והתאמת פונקציית גאוס כדי לקבוע את הרוחב המלא בחצי ערך מקסימלי (FWHM). ניתן להשתמש ביעדי רזולוציה או בדגימות אחידות כגון חרוזים פולימריים.
    1. רכשו תמונה של תאים או חלקיקים פולימריים בקוטר של פחות מ-200 ננומטר.
    2. השתמש ב-ImageJ כדי לצייר קו על פני החלקיק הקטן ביותר בתמונה.
    3. לחץ על K כדי להתוות את פרופיל העוצמה.
    4. לחץ על רשימה מהחלון המוקפץ והעתק את המידע לתוכנה המתאימה.
    5. התווה את הפרופיל בתוכנת ההתאמה והשתמש בהתאמה של גאוס (לחץ על ניתוח | התאמת | התאמה של עקומה לא ליניארית | פתיחת | דו-שיח קטגוריה: פונקציות בסיסיות; פונקציה: גאוס).
    6. קרא את רוחב השיא לאחר ההתקנה. השתמש בהמרת הגודל של הפיקסל כדי לקבל את הרזולוציה בפועל של המיקרוסקופ.

3. הכנת דגימות להדמיית CRS היפרספקטרלית

  1. הכנת שקופיות הדמיה ודגימות כימיות
    1. מניחים חתיכת סרט דו-צדדי על רצועת כיסוי, וחותכים צורה מלבנית קטנה של הקלטת מאמצע הקלטת המונחת כדי ליצור שטח פתוח להנחת הדגימה.
    2. פיפטה 1-2 μL של DMSO טהור ולחלק את הטיפה במרכז הפנוי.
    3. הניחו בזהירות את הכיסוי העליון ולחצו בעדינות על קצות הכיסויים כדי לאטום את התא תוך הקפדה על דגימת ה-DMSO שאינה יוצרת קשר עם קצות הקלטת.
    4. לניסויים ברגישות, הכינו דילולים סדרתיים של DMSO בתחמוצת דאוטריום (D2O) כדי לתת טווח ריכוז של 50%-0%. קח 1-2 μL של כל פתרון והכן דוגמאות דחוסות כמתואר לעיל.
  2. הכנת תאים
    1. זרעו את התאים בצלחת תחתית זכוכית של 35 מ"מ (או גדולה יותר) ב-Modified Eagle Medium (DMEM) של Dulbecco עם 10% סרום בקר עוברי (FBS) ו-1% פניצילין/סטרפטומיצין.
    2. דגירה של התאים בתא דגירה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם אטמוספירה של 5% CO2 למשך הלילה או יותר עד להשגת מפגש של כ-50%-80%.
    3. צלמו את התאים החיים ישירות או תקנו את התאים בעזרת תמיסת פורמלין של 10% להדמיה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

השוואות של הרזולוציה הספקטרלית
איור 2 משווה את הרזולוציה הספקטרלית של מיקרוסקופיית SRS היפרספקטרלית (איור 2A) ו-CARS (איור 2B) באמצעות דגימת DMSO. עבור ספקטרום ה-SRS, שתי פונקציות לורנציאניות (ראו פרוטוקול שלב 2.3) יושמו כך שיתאימו לספקטרום, ורזולוציה של 14.6 ס"מ-1 הושגה באמצעות השיא של 2,913 ס"מ-1 . עבור CARS, נעשה שימוש בפונקציית התאמה של שני שיאים עם רקע גאוסיאני (ראה פרוטוקול שלב 2.3) להתאמה, מה שנתן את הרזולוציה הספקטרלית של 17.1 ס"מ-1. תוצאות אלה מראות כי באותו מצב מדידה, ל-SRS יש רזולוציה ספקטרלית טובה יותר מאשר ל-CARS. הרזולוציה הספקטרלית המופחתת ב-CARS תורמת בעיקר על ידי מעורבות הרקע הלא-רציוננטי. בנוסף, נמצא כי יחסי השיא הסימטריים (2,913 ס"מ-1) והאסימטריים (2,995 ס"מ-1) היו שונים מאוד עבור SRS ו-CARS. הסיבה לכך היא מתאמי האותות השונים עם הרגישות האופטית הלא-ליניארית מסדר שלישי, כמתואר במשוואות (1) ו-(2). עם התלות הריבועית של CARS, הפרש העוצמה בין שתי הפסגות מוגבר. ניתן לראות בספקטרום את צורות הקווים הסימטריים של פסגות ה-SRS ואת צורות הקווים האסימטריות של פסגות ה-CARS. האסימטריה באות CARS נובעת בעיקר מנוכחותה של הפרעת הרקע הלא-רציונלית. הפסגות הספקטרליות של CARS נראות מעט עם תזוזה אדומה (1-2 ס"מ-1) לפסגות ה-SRS. זה נובע גם מהפרעת הרקע הלא-רסוננטית עם פסגות תהודה.

השוואות של רגישות הזיהוי
איור 3 משווה את רגישות הגילוי של SRS היפרספקטרלי ומיקרוסקופיה של CARS. ה-SNR של אותות ה-DMSO SRS (2,913 ס"מ-1) כפונקציה של ריכוז ה-DMSO ב-D 2O בריכוזים גבוהים מתוארים ראשונים (1%-50%, איור 3A). התוצאות מראות קשר ליניארי, משוואה מספקת (2). איור 3B משרטט את ספקטרום ה-DMSO בריכוזים של 0.1% ו-0.01%, שבהם ניתן לפתור את השיא של 2,913 ס"מ-1 בראשון אך לא באחרון, מה שמצביע על כך שמגבלת הגילוי היא בין 0.1% ל-0.01% DMSO. באמצעות המגבלה של קריטריונים ריקים, הערכנו שמגבלת זיהוי ה-SRS היא 0.021% DMSO. איור 3C משרטט את ה-CARS SNR כפונקציה של ריכוז DMSO (1%-50%), ומראה תלות ריבועית בהסכמה עם משוואה (1). ספקטרום ה-CARS שאוחזר בפאזה מוצג באיור 3D עבור 0.1% ו-0.01% DMSO. כדי להשיג ספקטרום זה, נעשה שימוש בשיטת אחזור פאזה ספקטרלית המבוססת על יחסי קרמרס-קרוניג ובוצעה הסרת רקע נוספת16. בדומה לספקטרום SRS, ניתן לפתור בבירור את שיא DMSO 2,913 ס"מ-1 עבור ה-DMSO של 0.1% אך לא עבור ה-0.01%, מה שמצביע על מגבלת זיהוי בין שני הריכוזים הללו. באמצעות המגבלה של קריטריונים ריקים, הערכנו שמגבלת זיהוי ה-SRS היא 0.015% DMSO. DMSO של 0.02% מתאים ל-2.8 מיליון דולר. לכן, מגבלת הגילוי של מיקרוסקופ CRS היפרספקטרלי המשמש כאן היא ~ 2.1-2.8 mM DMSO.

השוואות של הרזולוציה המרחבית
איור 4 משווה את הרזולוציה של תכונה סלולרית קטנה שזוהתה בתמונות SRS (איור 4A) ו-CARS (איור 4B). פרופילי העוצמה מאותו קו מוצגים ומתאימים באמצעות פונקציית גאוס כדי לקבוע ערכי FWHM להשוואת רזולוציה. אות ה-SRS נתן רזולוציה של 398.6 ננומטר (איור 4C), בעוד שאות ה-CARS נתן רזולוציה של 330.3 ננומטר (איור 4D). הרזולוציה של CARS הייתה טובה פי 1.2 מפי 1.2 מזו של ה-SRS. הסיבה להפרש הרזולוציה טמונה גם במשוואות (1) ו-(2). גם לקורות המשאבה וגם לקורות סטוקס יש פונקציית התפשטות נקודתית של גאוס במוקד. האות של CARS הוא אז פרופורציונלי לכפל של שלוש פונקציות גאוסיות, מה שמקטין בערך את הרוחב בפקטור של √3. באופן דומה, עבור SRS, הרוחב מצטמצם בפקטור של √2. לכן, הרזולוציה של CARS הייתה √3/√2 = פי 1.2 יותר טובה מזו של ה- SRS.

השוואות של תמונות התאים
איור 5 משווה תמונות SRS ו-CARS מתאי MIA PaCa-2 במיקומי השהיה אופטיים שונים. איור 5A מראה את תמונות ה-SRS בהשהיה האופטית שנתנה את האות החזק ביותר. בתמונה זו ניתן לזהות טיפות ליפידים (LDs), רשתית אנדופלסמית (ER) וגרעין (NU), כאשר LDs הם בעלי האותות החזקים ביותר המוצגים כנקודות בהירות. איור 5B מציג את תמונת ערוץ CARS באותה השהיה אופטית, עם ניגודים מופחתים בהרבה עבור LDs. הסיבות העיקריות להבדל הניגודיות הזה הן נוכחותו של הרקע הלא-רנסנטי וההסטה האדומה של אותו שיא ראמאן בספקטרום CARS. בהשהיה אופטית זו, לאות שנוצר יש תרומה גדולה מהרקע הלא-רציוננטי של המים. כדי לשפר את ניגודיות השומנים ב-CARS, ההשהיה האופטית כווננה לערך עם תזוזה אדומה. ההסטה האדומה שיפרה את ניגודיות השומנים על-ידי ריכוז אנרגיה רבה יותר ל-2,850 ס"מ-1 הן עבור SRS (איור 5C) והן עבור CARS (איור 5D), אם כי רמת האות הכוללת הופחתה. עבור CARS, ניגודיות דומה של LDs כמו SRS הושגה על ידי תזוזה אדומה של כ-98 ס"מ-1 במיקוד הספקטרלי (איור 5D), אם כי עדיין נצפה רקע גבוה מזה בתמונת ה-SRS. בהשהיה האופטית הזו, תמונת ה-SRS מראה הרבה פחות תכולת חלבונים וחומצות גרעין, אך תכולת שומנים חזקה ב-LDs, ב-ER ובקרומי התאים (איור 5C).

CARS הוא תהליך פרמטרי ואילו SRS הוא לא-פאראמטרי. הבדל כזה תורם גם להבדלי הניגוד בין שתי האופנים. אותות ה-CARS הפרמטריים נקבעים על-ידי ההפרעה של אותות CARS משכבות שונות הקרובות למוקד הלייזר, מה שעשוי להראות ניגודים שליליים כפי שמציינים החצים באיור 5B ובאיור 5D (גם באיור 4B). ניגודים שליליים כאלה המושרים על ידי הפרעת אותות נעדרים בתמונות SRS. הניגוד השלילי ב-CARS עשוי לספק מידע על המיקום הצירי של יעד העניין.

לאותות ה-SRS יש קשר ליניארי עם הריכוז המולקולרי, בעוד שאותות ה-CARS מספקים תלות בריכוז כמעט ריבועי. לכן, ה-LDs העשירים ב-CH2 מראים אות חזק בהרבה מ-ER וממברנות התאים בתמונת CARS מאשר בתמונת ה-SRS (איור 5E,F). ניתן לחלץ את ספקטרום ה-SRS מתמונות היפרספקטרליות. איור 5G מראה את ספקטרום ה-SRS הטיפוסי מ-LDs, ER, ציטוזול (CY) ו-NU. הן העוצמה והן הצורה הספקטרלית שונות עבור תאים תאיים שונים. LD מראה אות הרבה יותר חזק ב-2,850 ס"מ-1 מאשר אברונים אחרים. באשר ל- CARS, ספקטרום דומה, אם כי שונה בצורות, ניתן להשיג. ספקטרום ה-CARS הגולמי מציג תזוזה אדומה קטנה בהשוואה לספקטרום ה-SRS המתאים. ניתן להשתמש בשליפת פאזה ספקטרלית עוד יותר כדי לחלץ את תגובות הראמן באמצעות ספקטרום CARS.

Figure 1
איור 1: סכמטי של המיקרוסקופ ההיפרספקטרלי CARS/SRS. קיצורים: CARS = פיזור קוהרנטי נגד סטוקס ראמאן; SRS = פיזור ראמאן מגורה; PBS = מפצל קרן קיטוב; PD = פוטודיודה; PMT = שפופרת פוטומולטיפלייר; AOM = אפנן אקוסטו-אופטי. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 2
איור 2: ספקטרום DMSO. (A) SRS ו-(B) ספקטרום מכוניות של DMSO. נקודות הן נתונים ניסיוניים; עקומות הן תוצאות התאמה ספקטרליות. קיצורים: CARS = פיזור קוהרנטי נגד סטוקס ראמאן; SRS = פיזור ראמאן מגורה; DMSO = דימתיל סולפוקסיד; w = רזולוציה ספקטרלית. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 3
איור 3: יחסי אות לרעש וספקטרום של DMSO. (A) יחס אות לרעש של השיא הסימטרי DMSO ב-2,913 ס"מ-1 כפונקציה של ריכוז ב-D2O הנמדדת על-ידי SRS. הנקודות הן נתונים ניסיוניים; הקו הוא תוצאת ההתאמה הליניארית. (B) ספקטרום ה-SRS של 0.1% ו-0.01% DMSO ב-D2O. (C) יחס אות לרעש של השיא הסימטרי DMSO ב-2,913 ס"מ-1 כפונקציה של ריכוז ב-D2O שנמדד על ידי CARS. הנקודות הן נתונים ניסיוניים; העקומה היא התוצאה המתאימה לפולינום מדרגה שנייה. (D) ספקטרום ה-CARS של 0.1% ו-0.01% DMSO ב-D2O. קיצורים: CARS = פיזור קוהרנטי נגד סטוקס ראמאן; SRS = פיזור ראמאן מגורה; DMSO = דימתיל סולפוקסיד; SNR = יחס אות לרעש; D2O = תחמוצת דאוטריום. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 4
איור 4: תמונות SRS ו-CARS ופרופילי עוצמה של תא MIA PaCa-2. (A) תמונת SRS של תא MIA PaCa-2. (B) תמונת CARS של תא MIA PaCa-2 באותו שדה ראייה כמו לוח A. (C) פרופיל עוצמה של SRS לאורך הקו הצהוב בלוח A. (D) פרופיל העוצמה של CARS לאורך הקו הצהוב בלוח B. נקודות הן נתונים ניסיוניים; עקומות הן תוצאות התאמת פונקציה של גאוס. סרגלי קנה מידה = 5 מיקרומטר. קיצורים: CARS = פיזור קוהרנטי נגד סטוקס ראמאן; SRS = פיזור ראמאן מגורה; w = רזולוציה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 5
איור 5: תמונות ופרופיל עוצמה של תאי MIA PaCa-2. (A) תמונת SRS של תאי MIA PaCa-2 בהשהיית הזמן הממוטבת לעוצמת SRS. (B) תמונת CARS באותה השהיה כמו בלוח A. (C) תמונת SRS בעיכובים של 98 ס"מ-1 עם תזוזה אדומה כמו בלוח A. (D) תמונת CARS באותה השהיה אופטית כמו בלוח C. (ה,ו) פרופילי העוצמה של SRS ו-CARS שורטטו לאורך הקווים המנוקדים בפאנלים A ו-D. (G) ספקטרום SRS טיפוסי מטיפות השומנים, הרשתית האנדופלסמית, הציטוזול והגרעין. (H) ספקטרום CARS טיפוסי של ארבעת הרכבי התאים. הקווים המנוקדים בירוק ובאדום הם מיקומי השהיה עבור לוחות A/B ו-C/D, בהתאמה. סרגלי קנה מידה = 10 מיקרומטר. קיצורים: CARS = פיזור קוהרנטי נגד סטוקס ראמאן; SRS = פיזור ראמאן מגורה; LD = טיפות שומנים; ER = רשתית אנדופלסמית; CY = ציטוזול; NU = גרעין. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

קובץ משלים: תוכנה שנכתבה במעבדה מבוססת על כך של-LabVIEW יש תצוגה רב-ערוצית בו-זמנית לצפייה ושמירה בזמן אמת של תמונות. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

הפרוטוקול המוצג כאן מתאר את בנייתו של מיקרוסקופ CRS רב-מודלי ואת ההשוואה הישירה בין CARS להדמיית SRS. עבור בניית המיקרוסקופ, השלבים הקריטיים הם חפיפת קרן מרחבית וטמפורלית ואופטימיזציה של גודל הקרן. מומלץ להשתמש בדגימה סטנדרטית כגון DMSO לפני ההדמיה הביולוגית לאופטימיזציה של SNR וכיול משמרות ראמאן. השוואה ישירה בין תמונות CARS ו-SRS מגלה של-CARS יש רזולוציה מרחבית טובה יותר, בעוד ש-SRS מספק רזולוציה ספקטרלית טובה יותר וניגודים כימיים מפותלים פחות. גם ל-CARS וגם ל-SRS יש מגבלות זיהוי דומות.

CARS והדמיית SRS משתמשות בלייזרים עם דופק באנרגיה גבוהה לעירור. זה מאפשר לפלטפורמה לשלב שיטות הדמיה אופטיות לא ליניאריות אחרות כגון פלואורסצנציה של עירור מרובה פוטונים, ייצור הרמוני וספיגה חולפת עבור ניגודים כימיים נוספים28,39.

CARS ו-SRS שימשו באופן נרחב לחקר הרכב השומנים עם סלקטיביות כימית גבוהה. עם זאת, הטכנולוגיות אינן מוגבלות לכימות שומנים. SRS הוחל על מיפוי התפלגות תרופות42, סינתזת חלבונים43 ודנ"א44. CARS ו- SRS יושמו גם על רכיבי תרופות תמונה וחומרים אקסיפיינטים בטבליות 45,46,47,48. מכוניות היפרספקטרליות ו- SRS מצאו יישומים באבחון סרטן49, הערכת מחלות לב וכלי דם50, והדמיה עצבית51. ניתן גם ליישם אותם במחקרי COVID-1952. CARS בפס רחב, שיכול לכסות חלונות ספקטרליים ברוחב של עד 3,000 ס"מ-1, יכול להבהיר מבנים כימיים עשירים בדגימות ביולוגיות53. עם זאת, בשל קצב הקריאה האיטי של ה-CCD, זמן השהייה של הפיקסלים הוא ברמה של אלפיות השנייה, הרבה יותר איטי מזמן השהייה של הפיקסלים במיקרו-שניות של מיקרו-שניה עבור מיקרוסקופיית SRS34. למיקרוסקופיית SRS היפרספקטרלית יש כיום רוחב פס טיפוסי של 200-300 ס"מ-1, המוגבל על ידי רוחב הפס של הלייזר והיעדר גלאי מערך משולביםנעולים 34. מיקרוסקופיית SRS של התמרת פורייה היא דרך חלופית להרחיב את הכיסוי הספקטרלי של SRS35.

למרות ש-CARS ו-SRS מספקים מידע כימי עשיר ללא צורך בסימון, הסלקטיביות הכימית טמונה בקשרים כימיים, מה שמקשה על הבחנה בין חלבונים ספציפיים. תגי Raman הראו את הפוטנציאל לשפר את הסלקטיביות הכימית של CARS ו- SRS54,55. עם זאת, להדמיית ראמאן קוהרנטית עדיין יש רגישות נמוכה בהרבה בהשוואה לזיהוי פלואורסצנטי. שיפור פני השטח שימש לספקטרוסקופיית פיזור ראמן ספונטנית כדי לשפר את רמות האות56. הוא הוחל גם על CARS ו- SRS להגברת אותות 57,58,59. למרות שמקדם השיפור אינו גבוה כמו פיזור ראמאן ספונטני, מכוניות משופרות פני השטח ומיקרוסקופיית SRS עדיין מראות את הפוטנציאל לזהות מולקולות בודדות59,60. עם זאת, השימוש בחלקיקי מתכת או משטחים שולל את היתרון של הגישה נטולת התוויות. שיפור הרגישות של מיקרוסקופיית ראמאן קוהרנטית ללא שימוש במשטחי מתכת ירחיב מאוד את היישום של הטכנולוגיה במדע הביולוגי.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

המחברים מצהירים על היעדר ניגודי עניינים.

Acknowledgments

מחקר זה נתמך על ידי קרן הסטארט-אפים של המחלקה לכימיה באוניברסיטת פרדו.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2D galvo scanner set Thorlabs GVS002
Acousto-optic modulator Isomet M1205-P80L-0.5
AOM driver Isomet 532B-2
Data acquisition card National Instruments PCle 6363 Custom ordered filter (980 sp)
Delay stage Zaber X-LSM050A
Deuterium oxide Millipore Sigma 151882-100G
Dichroic mirror for beam combination Thorlabs DMLP1000
Dichroic mirror for signal separation Semrock FF776-Di01-25x36
DMSO MiliporeSigma 200-664-3
MIA PaCa 2 Cells ATCC CRL-1420
Femtosecond laser system Spectral Physics InSightX3+
Filter for CARS Chroma AT655/30m
Filter for SRS Chroma ET980sp
Function generator Rigol DG1022Z
Glass rods Lattice Electro Optics SF-57
Half-wave plate Newport 10RP02-51; 10RP02-46
LabVIEW 2020 National Instruments This is the image acquisition software
Lock-in amplifier Zurich Instrument HF2LI
Microscope housing Olympus BX51W1
Objective lens Olympus UPLSAPO60XW
Origin Pro 2019b OriginLab Corporation This is the spectral fitting software
Oscilloscope Tektronix TBS2204B
Photodiode Hamamatsu S3994-01
PMT detector Hamamatsu H7422P-40
PMT voltage amplifier Advanced Research Instrument Corp. PMT4V3
Polarizing beamsplitter cube Thorlabs PBS255
Terminal block National Instruments BNC-2110

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Raman, C. V. A change of wave-length in light scattering. Nature. 121 (3051), 619 (1928).
  2. Li, S., Li, Y., Yi, R., Liu, L., Qu, J. Coherent anti-Stokes Raman scattering microscopy and its applications. Frontiers in Physics. 8, 515 (2020).
  3. Evans, C. L., Xie, X. S. Coherent anti-Stokes Raman scattering microscopy: chemical imaging for biology and medicine. Annual Review of Analytical Chemistry. 1 (1), 883-909 (2008).
  4. Min, W., Freudiger, C. W., Lu, S., Xie, X. S. Coherent nonlinear optical imaging: beyond fluorescence microscopy. Annual Review of Physical Chemistry. 62, 507-530 (2011).
  5. Suhalim, J. L., Boik, J. C., Tromberg, B. J., Potma, E. O. The need for speed. Journal of Biophotonics. 5 (5-6), 387-395 (2012).
  6. Duncan, M. D., Reintjes, J., Manuccia, T. J. Scanning coherent anti-Stokes Raman microscope. Optics Letters. 7 (8), 350-352 (1982).
  7. Denk, W., Strickler, J. H., Webb, W. W. Two-photon laser scanning fluorescence microscopy. Science. 248 (4951), 73-76 (1990).
  8. Zumbusch, A., Holtom, G. R., Xie, X. S. Three-dimensional vibrational imaging by coherent anti-Stokes Raman scattering. Physical Review Letters. 82 (20), 4142-4145 (1999).
  9. Cheng, J. -X., Xie, X. S. Coherent anti-Stokes Raman scattering microscopy: instrumentation, theory, and applications. The Journal of Physical Chemistry B. 108 (3), 827-840 (2004).
  10. Evans, C. L., et al. Chemical imaging of tissue in vivo with video-rate coherent anti-Stokes Raman scattering microscopy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (46), 16807 (2005).
  11. Cheng, J. -X., Volkmer, A., Book, L. D., Xie, X. S. An epi-detected coherent anti-Stokes Raman scattering (E-CARS) microscope with high spectral resolution and high sensitivity. The Journal of Physical Chemistry B. 105 (7), 1277-1280 (2001).
  12. Volkmer, A., Book, L. D., Xie, X. S. Time-resolved coherent anti-Stokes Raman scattering microscopy: Imaging based on Raman free induction decay. Applied Physics Letters. 80 (9), 1505-1507 (2002).
  13. Marks, D. L., Boppart, S. A. Nonlinear interferometric vibrational imaging. Physical Review Letters. 92 (12), 123905 (2004).
  14. Ganikhanov, F., Evans, C. L., Saar, B. G., Xie, X. S. High-sensitivity vibrational imaging with frequency modulation coherent anti-Stokes Raman scattering (FM CARS) microscopy. Optics Letters. 31 (12), 1872-1874 (2006).
  15. Potma, E. O., Evans, C. L., Xie, X. S. Heterodyne coherent anti-Stokes Raman scattering (CARS) imaging. Optics Letters. 31 (2), 241-243 (2006).
  16. Liu, Y., Lee, Y. J., Cicerone, M. T. Broadband CARS spectral phase retrieval using a time-domain Kramers-Kronig transform. Optics Letters. 34 (9), 1363-1365 (2009).
  17. Masia, F., Karuna, A., Borri, P., Langbein, W. Hyperspectral image analysis for CARS, SRS, and Raman data. Journal of Raman Spectroscopy. 46 (8), 727-734 (2015).
  18. Knutsen, K. P., Johnson, J. C., Miller, A. E., Petersen, P. B., Saykally, R. J. High spectral resolution multiplex CARS spectroscopy using chirped pulses. Chemical Physics Letters. 387 (4-6), 436-441 (2004).
  19. Okuno, M., Kano, H., Leproux, P., Couderc, V., Hamaguchi, H. -o Ultrabroadband multiplex CARS microspectroscopy and imaging using a subnanosecond supercontinuum light source in the deep near infrared. Optics Letters. 33 (9), 923-925 (2008).
  20. Masia, F., Glen, A., Stephens, P., Borri, P., Langbein, W. Quantitative chemical imaging and unsupervised analysis using hyperspectral coherent anti-Stokes Raman scattering microscopy. Analytical Chemistry. 85 (22), 10820-10828 (2013).
  21. Pegoraro, A. F., Slepkov, A. D., Ridsdale, A., Moffatt, D. J., Stolow, A. Hyperspectral multimodal CARS microscopy in the fingerprint region. Journal of Biophotonics. 7 (1-2), 49-58 (2014).
  22. Eckhardt, G., et al. Stimulated Raman scattering from organic liquids. Physical Review Letters. 9 (11), 455-457 (1962).
  23. Ploetz, E., Laimgruber, S., Berner, S., Zinth, W., Gilch, P. Femtosecond stimulated Raman microscopy. Applied Physics B. 87 (3), 389-393 (2007).
  24. Freudiger, C. W., et al. Label-free biomedical imaging with high sensitivity by stimulated Raman scattering microscopy. Science. 322 (5909), 1857-1861 (2008).
  25. Nandakumar, P., Kovalev, A., Volkmer, A. Vibrational imaging based on stimulated Raman scattering microscopy. New Journal of Physics. 11 (3), 033026 (2009).
  26. Slipchenko, M. N., Le, T. T., Chen, H., Cheng, J. -X. High-speed vibrational imaging and spectral analysis of lipid bodies by compound Raman microscopy. The Journal of Physical Chemistry B. 113 (21), 7681-7686 (2009).
  27. Min, W., Freudiger, C. W., Lu, S., Xie, X. S. Coherent nonlinear optical imaging: beyond fluorescence microscopy. Annual Review of Physical Chemistry. 62 (1), 507-530 (2011).
  28. Zhang, C., Zhang, D., Cheng, J. -X. Coherent Raman scattering microscopy in biology and medicine. Annual Review of Biomedical Engineering. 17 (1), 415-445 (2015).
  29. Prince, R. C., Frontiera, R. R., Potma, E. O. Stimulated Raman scattering: from bulk to nano. Chemical Reviews. 117 (7), 5070-5094 (2017).
  30. Lu, F. -K., et al. Multicolor stimulated Raman scattering microscopy. Molecular Physics. 110 (15-16), 1927-1932 (2012).
  31. Ozeki, Y., et al. High-speed molecular spectral imaging of tissue with stimulated Raman scattering. Nature Photonics. 6 (12), 845-851 (2012).
  32. Wang, P., et al. Label-free quantitative imaging of cholesterol in intact tissues by hyperspectral stimulated raman scattering microscopy. Angewandte Chemie International Edition. 125 (49), 13280-13284 (2013).
  33. Freudiger, C. W., et al. Stimulated Raman scattering microscopy with a robust fibre laser source. Nature Photonics. 8 (2), 153-159 (2014).
  34. Liao, C. -S., et al. Microsecond scale vibrational spectroscopic imaging by multiplex stimulated Raman scattering microscopy. Light: Science & Applications. 4 (3), 265 (2015).
  35. Liao, C. -S., et al. Spectrometer-free vibrational imaging by retrieving stimulated Raman signal from highly scattered photons. Science Advances. 1 (9), 1500738 (2015).
  36. He, R., et al. Dual-phase stimulated Raman scattering microscopy for real-time two-color imaging. Optica. 4 (1), 44-47 (2017).
  37. Andresen, E. R., Berto, P., Rigneault, H. Stimulated Raman scattering microscopy by spectral focusing and fiber-generated soliton as Stokes pulse. Optics Letters. 36 (13), 2387-2389 (2011).
  38. Fu, D., Holtom, G., Freudiger, C., Zhang, X., Xie, X. S. Hyperspectral imaging with stimulated Raman scattering by chirped femtosecond lasers. The Journal of Physical Chemistry B. 117 (16), 4634-4640 (2013).
  39. Zhang, C., Aldana-Mendoza, J. A. Coherent Raman scattering microscopy for chemical imaging of biological systems. Journal of Physics: Photonics. , (2021).
  40. Martens, W. N., Frost, R. L., Kristof, J., Theo Kloprogge, J. Raman spectroscopy of dimethyl sulphoxide and deuterated dimethyl sulphoxide at 298 and 77 k. Journal of Raman Spectroscopy. 33 (2), 84-91 (2002).
  41. Gill, G. W. Cytopreparation: Principles & Practice. Gill, G. W. , Springer. New York. 309-323 (2013).
  42. Fu, D., et al. Imaging the intracellular distribution of tyrosine kinase inhibitors in living cells with quantitative hyperspectral stimulated Raman scattering. Nature Chemistry. 6 (7), 614-622 (2014).
  43. Wei, L., Yu, Y., Shen, Y., Wang, M. C., Min, W. Vibrational imaging of newly synthesized proteins in live cells by stimulated Raman scattering microscopy. Proceedings of the National Academy of Sciences. 110 (28), 11226-11231 (2013).
  44. Lu, F. -K., et al. Label-free DNA imaging in vivo with stimulated Raman scattering microscopy. Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (37), 11624-11629 (2015).
  45. Slipchenko, M. N., et al. Vibrational imaging of tablets by epi-detected stimulated Raman scattering microscopy. Analyst. 135 (10), 2613-2619 (2010).
  46. Slipchenko, M. N., Zhou, B., Pinal, R., Teresa Carvajal, M., Cheng, J. -X. RAMAN-chemical imaging of solid dosage forms based on stimulated Raman scattering. American Pharmaceutical Review. 15 (3), 66 (2012).
  47. Sarri, B., et al. Discriminating polymorph distributions in pharmaceutical tablets using stimulated Raman scattering microscopy. Journal of Raman Spectroscopy. 50 (12), 1896-1904 (2019).
  48. Fussell, A. L., Kleinebudde, P., Herek, J., Strachan, C. J., Offerhaus, H. L. Coherent anti-Stokes Raman scattering (CARS) microscopy visualizes pharmaceutical tablets during dissolution. JoVE (Journal of Visualized Experiments). (89), e51847 (2014).
  49. Freudiger, C. W., et al. Multicolored stain-free histopathology with coherent Raman imaging). Laboratory Investigation. 92 (10), 1492-1502 (2012).
  50. Lim, R. S., et al. Multimodal CARS microscopy determination of the impact of diet on macrophage infiltration and lipid accumulation on plaque formation in ApoE-deficient mice [S]. Journal of Lipid Research. 51 (7), 1729-1737 (2010).
  51. Ji, M., et al. label-free detection of brain tumors with stimulated Raman scattering microscopy. Science Translational Medicine. 5 (201), (2013).
  52. Tabish, T. A., Narayan, R. J., Edirisinghe, M. Rapid and label-free detection of COVID-19 using coherent anti-Stokes Raman scattering microscopy. Mrs Communications. 10 (4), 566-572 (2020).
  53. Camp, C. H., et al. High-speed coherent Raman fingerprint imaging of biological tissues. Nature Photonics. 8 (8), 627-634 (2014).
  54. Wei, L., et al. Live-cell bioorthogonal chemical imaging: stimulated Raman scattering microscopy of vibrational probes. Accounts of Chemical Research. 49 (8), 1494-1502 (2016).
  55. Hu, F., Shi, L., Min, W. Biological imaging of chemical bonds by stimulated Raman scattering microscopy. Nature Methods. 16 (9), 830-842 (2019).
  56. Nie, S., Emory, S. R. Probing single molecules and single nanoparticles by surface-enhanced Raman scattering. Science. 275 (5303), 1102-1106 (1997).
  57. Steuwe, C., Kaminski, C. F., Baumberg, J. J., Mahajan, S. Surface enhanced coherent anti-Stokes Raman scattering on nanostructured gold surfaces. Nano Letters. 11 (12), 5339-5343 (2011).
  58. Fast, A., Kenison, J. P., Syme, C. D., Potma, E. O. Surface-enhanced coherent anti-Stokes Raman imaging of lipids. Applied Optics. 55 (22), 5994-6000 (2016).
  59. Zong, C., et al. Plasmon-enhanced stimulated Raman scattering microscopy with single-molecule detection sensitivity. Nature Communications. 10 (1), 1-11 (2019).
  60. Yampolsky, S., et al. Seeing a single molecule vibrate through time-resolved coherent anti-Stokes Raman scattering. Nature Photonics. 8 (8), 650-656 (2014).

Tags

כימיה גיליון 182
השוואה ישירה של פיזור ראמן מגורה היפרספקטרלי ומיקרוסקופיית פיזור ראמן אנטי-סטוקס קוהרנטית להדמיה כימית
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Clark, M. G., Brasseale III, K. A.,… More

Clark, M. G., Brasseale III, K. A., Gonzalez, G. A., Eakins, G., Zhang, C. Direct Comparison of Hyperspectral Stimulated Raman Scattering and Coherent Anti-Stokes Raman Scattering Microscopy for Chemical Imaging. J. Vis. Exp. (182), e63677, doi:10.3791/63677 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter