Summary
Ekstracellulær deplesjon av fluorescerende merket glukose korrelerer med glukoseopptak og kan brukes til høy gjennomstrømningsscreening av glukoseopptak i utskårne organer og cellekulturer.
Abstract
Den pågående verdensomspennende epidemien av diabetes øker etterspørselen etter identifisering av miljømessige, ernæringsmessige, endokrine, genetiske og epigenetiske faktorer som påvirker glukoseopptaket. Måling av intracellulær fluorescens er en mye brukt metode for å teste opptaket av fluorescerende merket glukose (FD-glukose) i celler in vitro, eller for avbildning av glukoseforbrukende vev in vivo. Denne analysen vurderer glukoseopptaket på et valgt tidspunkt. Den intracellulære analysen antar at metabolismen av FD-glukose er langsommere enn for endogen glukose, som deltar i katabolske og anabole reaksjoner og signalering. Dynamisk glukosemetabolisme endrer imidlertid også opptaksmekanismer, noe som vil kreve kinetiske målinger av glukoseopptak som respons på forskjellige faktorer. Denne artikkelen beskriver en metode for å måle ekstracellulær FD-glukosedeplesjon og validerer korrelasjonen med intracellulært FD-glukoseopptak i celler og vev ex vivo. Ekstracellulær glukosemangel kan potensielt være aktuelt for kinetiske og doseavhengige studier med høy gjennomstrømning, samt identifisering av forbindelser med glykemisk aktivitet og deres vevsspesifikke effekter.
Introduction
Etterspørselen etter måling av glukoseopptak stiger sammen med det kritiske behovet for å takle en epidemisk økning i en rekke sykdommer avhengig av glukosemetabolismen. Underliggende mekanismer for degenerative metabolske sykdommer, nevrologiske og kognitive forstyrrelser1,inflammatoriske 2 og smittsomme sykdommer3, kreft 4,5, samt aldring6, avhenger av glukosemetabolismen for energi og lagring, anabole prosesser, protein og genmodifisering, signalering, regulering av gener og nukleinsyresyntese og replikasjon 7,8,9 . Diabetes mellitus (DM) er direkte relatert til funksjonsfeil i glukoseopptaksreguleringen. DM er et spekter av kroniske sykdommer som type-1, -2 og -3 diabetes mellitus, svangerskapsdiabetes, modenhetsdempende diabetes hos de unge og andre typer av denne sykdommen indusert av miljømessige og / eller genetiske faktorer. I 2016 viste den første WHO Global-rapporten om diabetes at antall voksne som lever med den mest utbredte DM har nesten firedoblet seg siden 1980 til 422 millioner voksne10, og dette antallet DM-pasienter har økt eksponentielt de siste tiårene. Bare i 2019 var et estimat på 1,5 millioner dødsfall direkte forårsaket av DM10. Denne dramatiske økningen skyldes økningen i type 2 DM og forholdene som driver den, inkludert overvekt og fedme10. COVID-19-pandemien avslørte en to ganger økning i dødelighet hos pasienter med DM sammenlignet med befolkningen generelt, noe som tyder på den dype, men dårlig forståtte rollen som glukosemetabolismen i immunforsvaret3. Forebygging, tidlig diagnose og behandling av DM, fedme og andre sykdommer krever optimalisering av målinger av glukoseopptak av forskjellige vev, og identifisering av miljø11,ernæringsmessige 12, endokrine13,genetiske 14 og epigenetiske15 faktorer som påvirker glukoseopptaket.
I forskning måles intracellulært og/eller vevsopptak av glukose vanligvis med fluorescerende merket glukose (FD-glukose) in vitro 16,17,18 og in vivo19. FD-glukose ble en foretrukket metode sammenlignet med mer presise metoder ved bruk av radioaktivtmerket glukose 20, analytisk massespektroskopianalyse21, metabolomics22, kjernemagnetiske resonansmetoder23 og positronemisjonstomografi/computertomografi (PET/CT)5,24. I motsetning til FD-glukoseopptak, kan analysemetoder som krever mer biologisk materiale innebære en flertrinns prøvepreparering, dyre instrumenter og kompleks dataanalyse. Effektive og rimelige målinger av FD-glukoseopptak i cellekulturer har blitt brukt i proof-of-concept eksperimenter og kan kreve validering ved andre metoder.
Grunnlaget for FD-glukoseapplikasjon for glukoseopptaksstudier er redusert metabolisme av FD-glukose sammenlignet med endogen glukose25. Ikke desto mindre er både endogen glukose og FD-glukose dynamisk fordelt mellom alle cellulære rom for bruk i anabole, katabolske og signalprosesser. Compartmentalization og tidsavhengig behandling25 av FD-glukose forstyrrer fluorescensmålingene, og representerer de viktigste begrensende faktorene for bruk av denne analysen i høy gjennomstrømningsscreeningseksperimenter, kinetisk analyse, 3D-cellekultur, kokulturer og vevseksperimenter. Her gir vi data som viser en høy korrelasjon mellom den ekstracellulære uttømmingen av FD-glukose og dets intracellulære opptak, noe som tyder på den ekstracellulære uttømmingen av FD-glukose som en surrogatmåling for intracellulært glukoseopptak. Måling av ekstracellulær uttømming av glukose ble brukt for å validere vevsspesifikke forskjeller i glukoseopptak hos mus behandlet med insulin og et eksperimentelt legemiddel18 for å gi et prinsippbevis for denne metoden.
Den nåværende protokollen beskriver intracellulære og ekstracellulære (figur 1) målinger av FD-glukoseopptak i 3T3-L1-celler. Protokoll avsnitt 1-7 forklarer kulturen og veksten av celler i 48 timer; celle sult, stimulering og baseline ekstracellulære målinger; og poststimuleringsmålinger av ekstracellulær FD-glukose og intracellulære målinger av FD-glukose og protein. Protokollavsnitt 8 beskriver ex vivo-måling av ekstracellulært opptak av FD-glukose i vev dissekert fra ob/ob-mus i nærvær og fravær av insulin og aminosyreforbindelse 2 (AAC2) beskrevet andre steder18.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Dyrestudier ble godkjent av Institutional Animal Care and Use Committee ved Ohio State University (OSU, protokoll 2007A0262-R4).
MERK: Alle prosedyrer må gjøres i et klasse II biosikkerhetsskap med blåseren på og lysene av.
1. Forberedelse av materialer
MERK: Alle materialer er oppført i materialtabellen.
- Forbered Medium 1, sentrifugering Medium 2, og lagrings- og arbeidsløsninger av fluorescerende 2-deoksy-2-[(7-nitro-2,1,3-benzoxadiazol-4-yl) amino]-D-glukose (2-NBDG eller FD-glukose) i henhold til tabell 1 i et klasse II biosikkerhetsskap. Beskytt FD-glukose mot lys gjennom hele eksperimentet ved å slå av alle lysene under hetten.
- Bruk bruk bruksklare cellekulturreagenser: Trypsin-EDTA, fosfatbufret saltvann (PBS) og glukosefri og fenolrødfri Dulbeccos Modified Eagle Medium (heretter glukosefri DMEM).
- Bruk 20 ml radioimmunoprecipitation assay (RIPA) lysisbuffer.
MERK: I de følgende avsnittene sammenlignes ekstracellulær deplesjon og intracellulært opptak av forskjellige FD-glukosedoser i 3T3-L1 fibroblaster med og uten insulinstimulering (figur 2).
2. 3T3-L1 cellekultur og vedlikehold
- Kultur 3T3-L1 musfibroblaster ved plating 1 x 106 celler fortynnet i 20 ml Medium 1 i to 96-brønns plater. Plate 100 μL cellesuspensjon per brønn, og sikrer å opprettholde homogeniteten til denne suspensjonen ved blanding. Dyrk celler i 48 timer i en inkubator på 37 °C (5 % CO2 og 95 % fuktighet) uten å skifte medium før ca. 70 %-80 % vekselstrøm.
- Opprettholde celler sammenflytende og faste ved å dyrke dem i samme medium i 48 timer. Varier inkubasjonstiden fra 24-72 timer avhengig av ønsket fastende katabolsk tilstand.
3. Sult av 3T3-L1 celler
- Dekantere medier fra celler i 96-brønnsplatene. Absorber gjenværende væske ved hjelp av sterile papirhåndklær.
- Skyll 96-brønnplaten med 100 μL PBS per brønn og absorber gjenværende væske med sterile papirhåndklær.
- Tilsett 100 μL glukosefri DMEM per brønn og inkuber i 40 minutter. Juster inkubasjonstiden avhengig av celletype, stimuli og ønsket fastende nivå.
MERK: Inkubasjonstiden kan kreve optimalisering avhengig av sesong.
4. Fremstilling av FD-glukoseoppløsninger med forskjellige konsentrasjoner
MERK: Eksperimentet i figur 2 undersøker ekstracellulære og intercellulære medier med og uten stimulering med insulin.
- Bruk åtte replikasjoner (en rad i en plate med 96 brønner) for hver stimuleringstilstand. Forbered derfor 1 ml for hver stimuleringstilstand (spesifisert i tabell 2 og nedenfor).
- Bruk åtte stimuleringsbetingelser uten insulin: FD-glukose på 2,5 μg / ml, 1 μg / ml, 0,5 μg / ml, 0,2 μg / ml, 0,1 μg / ml, 0,05 μg / ml og 0 μg / ml (kontroll uten FD-glukose) i en 96-brønns plate.
- Bruk åtte stimuleringsbetingelser med insulin (10 μg / ml, endelig konsentrasjon): FD-glukose på 2,5 μg / ml, 1 μg / ml, 0,5 μg / ml, 0,2 μg / ml, 0,1 μg / ml, 0,05 μg / ml og 0 μg / ml (kontroll uten FD-glukose) i en annen 96-brønns plate.
- For å forberede stimuleringsforhold, fortynn 1 μL av 5 mg / ml FD-glukose arbeidsløsning (tabell 1) i 999 μL glukosefri DMEM for å oppnå 1 ml arbeidsmasseoppløsning (1: 1000 fortynning eller 5 μg / ml).
- Bruk denne arbeidsmasseløsningen til å klargjøre 1:2000, 1:5000, 1:10 000, 1:25 000, 1:50 000 og 1:100 000 fortynninger av FD-glukose for å oppnå 2,5 μg/ml, 1 μg/ml, 0,5 μg/ml, 0,2 μg/ml, 0,1 μg/ml og 0,05 μg/ml (tabell 2) i 2 ml rør umiddelbart før eksperimenter i et biosikkerhetsskap uten lys.
- Gjenta trinn 4.4 og tilsett 1 mikrolit insulin (10 mg/ml, endelig konsentrasjon) til hver av tilstandene spesifisert ovenfor.
MERK: Den endelige konsentrasjonen av insulin i disse prøvene er 10 mikrogram / ml = 1,7 nmol / ml. For å oppnå homogenisering, tilsett insulin til rørene før du legger til andre løsninger.
5. Behandling av sultne 3T3-L1-celler
- Etter 40 minutters inkubasjon dekanterer du glukosefri DMEM fra hver brønn i 96-brønnsplater og absorberer gjenværende væske med sterile papirhåndklær.
- Tilsett 100 μL (per brønn) hver fra de ulike behandlingsbetingelsene beskrevet ovenfor til brønner langs en kolonne, og 100 μL (per brønn) fra samme behandlingstilstand til brønnene langs raden (åtte replikasjoner) i begge 96-brønnsplatene. Merk platene som utnyttet forholdene med og uten insulin. Tilsett glukosefri DMEM alene i kontrollbrønnene (n = 8).
- Inkuber platen i 40 minutter i en cellekulturinkubator (37 °C, 5 % CO2 og 95 % fuktighet) i mørket.
6. Ekstracellulære og intercellulære målinger for stimulerte 3T3-L1-celler
- Etter at cellene har blitt stimulert i 40 minutter, overfører du stimuleringsmediet fra begge platene til nye 96-brønnsplater som opprettholder samme eksperimentelle layout.
- Dekanter eventuell gjenværende løsning fra de opprinnelige stimulerte 96-brønnsplatene med celler på sterile papirhåndklær.
- Eventuelt vaske celler med PBS. Fjern PBS og dekanter eventuell gjenværende oppløsning på sterile papirhåndklær.
- Tilsett 100 μL av RIPA-lysisbufferen til hver brønn. Eventuelt kan du legge proteasehemmer til RIPA-bufferen for å beskytte proteiner. Legg tallerkener med RIPA i en shaker i 30 minutter.
- Ved hjelp av en mikroplateleser (Materialtabell) måler du fluorescens ved eksitasjon (Ex) og emisjonsbølgelengder på henholdsvis 485 og 535 nm, først i mediet som inneholder ekstracellulær FD-glukose, og deretter platen med RIPA-lysede celler på slutten av 30 min inkubasjon (se trinn 6.4).
7. Proteinbasert normalisering av intracellulært glukoseopptak
MERK: Intracellulært FD-glukoseopptak avhenger av cellenummeret. Proteinnivåer i cellulære lysater er proporsjonale med celletallene som tillater normalisering av intracellulære FD-glukosenivåer til antall celler i hver brønn.
- Utfør BCA-proteinanalyse i henhold til produsentens instruksjoner (se materialtabell). Kvantifiser proteinkonsentrasjonene i hver brønn som inneholder RIPA-lysede celler.
- Bruk 10 μL av RIPA-homogenatet og mål proteinkonsentrasjoner i tre eksemplarer for å øke nøyaktigheten av målingene i 96-brønns plater.
- Kvantifiser protein basert på proteinstandarder (0, 10, 20, 30, 40, 50 og 60 μg / ml protein) analysert sammen med prøver på hver 96-brønns plate.
- Mål absorbansen ved 562 nm og kvantifiser proteinkonsentrasjoner i hver prøve basert på den lineære regresjonsformelen oppnådd for proteinstandarden.
- Normaliser nivåene av intracellulær FD-glukose ved å bruke fluorescerende verdi / proteinkonsentrasjon i hver brønn. Ekstracellulær FD-glukoseuttømming krever ikke normalisering.
- Du kan eventuelt bruke de gjennomsnittlige utgangsverdiene i kontrollutvalg for ytterligere normalisering (100 %).
8. Ex vivo måling av ekstracellulær FD glukosemangel i organer
- Forbehandle mus med forbindelser som stimulerer glukosemetabolismen før organdisseksjonen, som følger.
- Bruk ni uker gamle Lepob hannmus (n = 11). Fôr alle mus med en vanlig chow diett før forsøket.
- Tilordne mus tilfeldig i tre grupper for intraperitoneale (i.p.) injeksjoner.
- Injiser mus fra kontrollgruppen Lepob med 0,1 ml steril PBS (n = 4).
- Injiser mus fra insulin Lepob-gruppen med 0,1 ml steril PBS, som inneholder 12 IE humant insulin per gram kroppsvekt (n = 3).
- Injiser mus fra AAC2 Lepob-gruppen med 0,1 ml steril PBS, inneholdende 0,1 nmol AAC2 per gram kroppsvekt (BW) (n = 4).
- Etter 15 minutter, utsatt mus for innånding av 5% isofluran og exsanguinate blod ved hjertepunksjon fra de bedøvede dyrene26.
- Dissekere visceralt epidydimalt hvitt fettvev (200 mg), lever (200 mg) og helhjerne fra hvert dyr. Bruk en klasse II biosikkerhetshette for vevshåndtering.
- Forbered FD-glukose (0,29 mM) arbeidsløsning i glukosefri DMEM i et klasse II biosikkerhetsskap uten lys.
- Mål fluorescensen til FD-glukose arbeidsløsning (0,29 mM) ved eksitasjon og emisjonsbølgelengder på henholdsvis 485 og 535 nm ved hjelp av en mikroplateleser.
- Inkuber det høstede vevet/organene i en 6-brønns plate som inneholder PBS i 1 min. Håndter hvert vev eller organ i en egen brønn.
- Etter 1 min, legg hvert vev på et sterilt papirhåndkle for å absorbere PBS. Overfør vev/organer til en separat 6-brønns plate som inneholder 4000 μL glukosefri DMEM og inkuberes i 2 minutter.
- Etter 2 minutter, fjern og overfør vevet til brønner på en 6-brønns plate som inneholder 0,29 mM FD-glukose arbeidsløsning (1 ml / brønn). Inkuber 6-brønnsplatene som inneholder vev i FD-glukose arbeidsløsning ved 37 °C (5 % CO2 og 95 % fuktighet).
- Samle 100 μL FD-glukose arbeidsløsning fra hver brønn etter 0, 10, 20, 30, 40, 60, 90 og 120 min inkubasjon, for å analysere kinetikken til ekstracellulær FD glukoseuttømming. Rist før og etter innsamling.
- Overfør 100 μL FD-glukose arbeidsløsning til 96-brønns plater for å måle fluorescensen ved eksitasjon og utslippsbølgelengder på henholdsvis 485 og 535 nm ved hjelp av en mikroplateleser.
- Normaliser fluorescens til 0 min-verdien (100%) for hvert organ i hvert dyr (figur 3).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Intracellulært inntak og ekstracellulær glukosedeplesjon ble målt i 3T3-L1 preadipocytter, som respons på ulike konsentrasjoner av FD-glukose (figur 2) med og uten insulinstimulering. Figur 2A viser en doseavhengig økning i det intracellulære opptaket av FD-glukose, som var signifikant økt i nærvær av insulin. Den samtidige reduksjonen i ekstracellulær FD-glukose i de samme cellene er vist i figur 2B, hvor insulinstimulering førte til signifikant reduserte ekstracellulære FD-glukosenivåer sammenlignet med prøvene uten insulinstimulering. Det intracellulære inntaket av FD-glukose korrelerte med den ekstracellulære uttømmingen av FD-glukose på en doseavhengig måte i prøver med og uten insulin (figur 2C). Dermed kan ekstracellulær uttømming av FD-glukose måle en endring i glukoseopptak med sammenlignbar nøyaktighet (R2 = 0,99, P < 0,001) som intracellulært FD-glukoseopptak.
Deretter ble det utviklet en eksperimentell setting for å validere ekstracellulær FD-glukoseopptaksapplikasjon i kinetiske studier som undersøkte forskjellige vev ved stimulering med kanoniske og eksperimentelle induktorer av glukoseopptak (figur 3). Vi valgte Lepob-musemodellen for insulinresistens i perifert vev, inkludert visceralt hvitt fettvev27,28. De veletablerte responsene på insulin hos disse musene ble sammenlignet med effekter av ny forbindelse AAC2, som virker på både perifert og nervøst vev via leptinreseptor og glukosetransportør GLUT1-avhengige mekanismer18. Lepob mus ble i.p. injisert med insulin eller AAC2. Organene ble dissekert 15 minutter etter injeksjonen. Deretter ble kinetikken til ekstracellulær FD-glukoseuttømming studert i visceralt fett, lever og hjerne ex vivo (figur 3). I samsvar med rapportert insulinresistens i perifert vev ble ekstracellulær FD-glukose ikke utarmet i ikke-stimulert kontrollvisceralt fett under 120 minutters inkubasjon (figur 3A). I motsetning til dette førte forbehandling av mus med insulin eller AAC2 før disseksjonen til signifikant uttømming av ekstracellulær FD-glukose innen et tidsintervall på henholdsvis 30 minutter og 60 minutter.
Leveropptak av glukose benytter glukosetransportører, inkludert GLUT2, som er uavhengig av insulinstimulering29,30. Følgelig ble ekstracellulær FD-glukose initialt ikke utarmet i insulinstimulerte levereksplanter sammenlignet med ikke-stimulerte levereksplanter (figur 3B), selv om signifikant uttømming av FD-glukose ble observert etter 120 minutters inkubasjon i levereksplantasjon stimulert med insulin sammenlignet med initialnivåene (0 min). På den annen side ble ekstracellulær FD-glukose signifikant redusert på en tidsavhengig måte i levereksplanter forbehandlet med AAC2.
I hjernen er hovedtransportøren GLUT1 blant andre transportører31. FD-glukosedeplesjonskinetikken var påfallende forskjellig i hjernen sammenlignet med annet vev (figur 3C). Den signifikante uttømmingen av glukose ble observert i det ekstracellulære mediet som inneholdt den ikke-behandlede hjernen etter 60 minutters inkubasjon (fra 100 % ved 0 min til 78 %). Mediet inkubert med hjerner fra insulinbehandlede Lepob mus har vist moderat, men en signifikant lineær reduksjon i FD-glukose (fra 100% ved 0 min til 95%). AAC2-stimulerte hjerner fører til en dyp rask reduksjon av ekstracellulær FD-glukose i løpet av de første 20 minuttene (fra 100% ved 0 min til 67,4%). Sammen støtter målinger av ekstracellulær glukoseuttømming de tidligere rapporterte forskjellene i glukoseopptak i disse vevene in vivo32.
Figur 1: Prinsipp for den ekstracellulære FD-glukosedeplesjonsmetoden. Celler dyrket i 96-brønns format er egnet for denne analysen. For å overleve tar celler opp glukose, og denne tilstrømningen reduserer nivåene av ekstracellulær glukose. Erstatning av glukose med FD-glukose tillater overvåking av disse endringene. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Deplesjon av ekstracellulær FD-glukose korrelert med intracellulært opptak in vitro. 3T3-L1 preadipocytter ble inkubert i et glukosefritt medium i 40 minutter før inkubering med ulike konsentrasjoner av FD-glukose med og uten insulin (1,7 mM; 40 min inkubasjon). (A, B) Doseavhengig opptak av FD-glukose (A) og ekstracellulær FD-glukosedeplesjon (B) i kontroll (dvs. uten insulin) (klekkede stenger) og insulinstimulerte celler (svarte stolper). FD-glukoseopptaket ble normalisert ved proteinkonsentrasjoner. Data er vist som % av verdien målt i kontroll inkubert uten FD-glukose (gjennomsnittlig SD, n = 8 per tilstand). Signifikans ble undersøkt med uparret t-test. (C) Korrelasjon mellom intracellulær og ekstracellulær FD-glukose (%) mål med (kvadrater) eller uten (sirkler) insulin i eksperimenter beskrevet i (A) og (B). Pearson-korrelasjon, P < 0,001. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Kinetikk for ekstracellulær FD-glukosedeplesjon i ulike organer ex vivo. (A-C) Lepob mus ble injisert med vehikkel (PBS, n = 4), insulin (12 IE/kg kroppsvekt, n = 3) og AAC2 (1 nmol/g kroppsvekt, n = 3). Etter 15 minutter ble vev dissekert og isolert. Eksplanter av (A) visceralt fett, (B) lever og (C) hjerne ble inkubert i FD-glukose (0,29 mM). Kinetikken til ekstracellulær glukoseuttømming ble målt i aliquots av mediet ved forskjellige tidspunkter. Data (gjennomsnittlig SD) er vist som % fluorescens i hvert organ ved 0 minutters inkubasjon. Betydning P < 0,05, uparret t-test. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
| Løsning/Medium | Komponenter |
| Etanol: DMSO (01:01 /v / v) | Etanol (200 μL) og DMSO (200 μL) i 1-1,5 ml rør; bruke cellekultur klasse etanol og DMSO |
| Middels 1 | DMEM (89 ml), penicillin/streptomycin (1 %) (1 ml) og kalveserum (10 %) (10 ml) i sterile 50 ml slanger |
| Sentrifugering Medium 2 | DMEM (89 ml), penicillin/streptomycin (1 %) (1 ml) og bovint serum (10 %) (10 ml) i steril 50 ml slange |
| Lagring FD-glukoseoppløsning 5 mg / ml (14,5 mM) | FD glukose (1 mg) og etanol: DMSO (1: 1 / v / v) (200 μL) i 0,5 ml rør; oppbevares ved -80 °C, fortrinnsvis under argon- eller nitrogenatmosfære |
| Arbeidende FD-glukoseoppløsning 5 μg / ml (14,5 mM) | Lagring FD glukoseoppløsning 5 mg / ml (1 μL), glukosefri DMEM (999 μL); forberede umiddelbart før eksperimentet. |
Tabell 1: Tilberedning av dyrkningsmedier og FD-glukoseoppløsninger.
| Fortynning | Kontroll | 01:2x103 | 01:5x103 | 01:1x104 | 01:2,5 x 104 | 01:5x104 | 01:1x105 |
| Konsentrasjon (μg/ml) | 0 | 2.5 | 1 | 0.5 | 0.2 | 0.1 | 0.05 |
| Glukosefri DMEM (μL) | 1000 | 500 | 800 | 900 | 960 | 980 | 990 |
| FD Glukose 5 μg/ml (μL) | 0 | 500 | 200 | 100 | 40 | 20 | 10 |
Tabell 2: Fremstilling av FD-glukoseoppløsninger med ulike konsentrasjoner for forsøk vist i figur 2.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den direkte sammenligningen av ekstracellulær FD-glukosemangel med normalisert intracellulært glukoseopptak i cellekultur viste en høy korrelasjon, noe som tyder på at ekstracellulær glukosemangel kan være en surrogatmåling for glukoseopptaksvurdering. Måling av ekstracellulær FD-glukose kan bruke et bredt spekter av FD-glukosekonsentrasjoner, også 0,5-2,5 μg FD-glukose / ml ser ut til å gi det optimale området. Ekstracellulær FD-glukose krever ikke normalisering til cellenummer eller proteinkonsentrasjoner som er nødvendige for intracellulært FD-glukoseopptak. Den forventede begrensningen av ekstracellulære FD-glukosemålinger er undersøkelsen av reaktive oksygenartinduserende midler og spor av blod i eksplanter som kan slukke fluorescens. Andre miljøfaktorer som påvirker fluorescens, som lys, bør også vurderes. Forlenget behandlingstid som kreves ved bruk av flere vevsprøver, kan kompromittere vevets levedyktighet og glukosemetabolismen. Dette kan være en ekstra begrensning. De utskårne vevene må være i et lite størrelsesområde (50-300 mg) for å tillate permeabiliteten av glukose inne i vevet. Samtidig håndtering av vev av flere operatører kan redusere håndteringstiden. Selv om vi ikke målte glukoseopptaket i vevseksplantene, tyder de akkumulerte observasjonene i dyrkede vevseksplanter på at de overlever i det glukoseholdige mediet i opptil 17 dager med det progressive funksjonstapet33. I denne protokollen tillater den korte inkubasjonstiden for eksplanter overvåking av glukosemetabolismen i relativt funksjonelle vev. I vev med kompleks cellulær organisasjon, som hjernen, presenterer størrelsen en uløselig begrensning, fordi oppløsningen av komplekst vev og resulterende celledød påvirker glukoseopptaket. Imidlertid har inkubasjonen av hjernen i 24 timer tidligere blitt brukt til identifisering av endogen reguleringsmekanisme, som støtter relativ fysiologisk funksjonalitet av utskåret musehjerne i glukoseholdig medium34. Uansett kan den forenklede prosedyren og enkel tilgjengelighet av ekstracellulær FD-glukose tillate bruk av denne analysen i et høyt gjennomstrømningsformat. Sammenligningen av grunnleggende og insulinstimulert ekstracellulær FD-glukoseuttømming antyder at denne analysen kan brukes til å identifisere humorale, ernæringsmessige, patogene, miljøfaktorer eller farmasøytiske legemidler som regulerer glukoseopptak. Selv om denne analysen forenkler oppdagelsen, krevde funnene validering med kvantitativ radiomerking20 analytiske metoder 21,22,23 og / eller avbildningsmetoder 5,24 for streng mekanistisk belysning av banene.
De kritiske trinnene i denne protokollen inkluderer optimalisering av konfluens og fastetid som påvirker både basalt og stimulert FD-glukoseopptak. Disse parameterne kan også påvirkes av sesong basert på forfatternes observasjoner. Videre bruker forskjellige celletyper spesifikke mekanismer for glukoseopptak, inkludert forskjellige glukosetransportører og regulatoriske hormon / reseptorinteraksjoner 32,35,36. Andre kontroller enn insulin må derfor vurderes for cellekulturer som representerer annet vev enn muskel- eller fettvev regulert av insulin/GLUT4-akser. Feilsøkingen inkluderer også justering av cellekonfluens og optimalisering av tid for faste / refeeding med FD-glukose. I tillegg kan sensitiviteten til ekstracellulær glukosemåling forbedres ved å redusere nivåene av ekstracellulær FD-glukose, med tanke på grenseverdiene som kreves for glukoseopptak. Eksperimentet beskrevet i figur 2 kan hjelpe forskere til å tilpasse denne analysen for bruk med andre cellekulturer eller feilsøking.
Den iboende variabiliteten i glukosemetabolismen krevde også høyere utvalgsstørrelse (n = 5-8). Selv om ekstracellulære målinger av FD-glukosetap viste samme nøyaktighet som intracellulært opptak av FD-glukose normalisert av protein, kan normaliseringen redusere analysevariabiliteten. I tillegg til måling av proteinkonsentrasjoner, kan måling av DNA-innhold i cellen være en annen pålitelig surrogatvurdering av celle nummer37.
Ekstracellulær FD-glukose er tilgjengelig for kinetiske målinger. Her er det utviklet en enkel prosedyre for kinetiske målinger av ekstracellulær FD-glukose for å identifisere organspesifikke responser på mediatorer av glukoseopptak. Disse ex vitro-studiene kan direkte teste organrespons på ulike stimuli in vivo som kombineres med organers eksponering for FD-glukose og ex vivo kinetiske målinger, som vist i figur 3. Selv om ex vivo-studier ikke fullt ut ligner in vivo-forhold , har de flere fordeler. Organeksplanter opprettholder kompleks multicellulær primærcellestruktur, i motsetning til udødelige cellekulturer som utviser endret genuttrykk. Moderne legemiddelutvikling benytter modellorganismer, indirekte vurdering av glukoseopptak basert på transkriptom eller metabolom22, omfattende insulinklemmeteknikk38 eller kostbar avbildning32. Selv om måling av ekstracellulær FD-glukose i eksplanterte organer ikke vil erstatte disse teknologiene, vil det gi en rask vurdering av forbindelse, metabolitt og gener for å lette oppdagelsen av nye terapeutiske mål som regulerer glukoseopptak på en vevsspesifikk måte. Utviklingen av trygge terapier som adresserer glukosemetabolismen i bestemte vev, kan tilby en løsning for kreft, demens, aldring, diabetes, autoimmune sykdommer, fedme og andre relaterte applikasjoner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfattere har ingen problemer å avsløre og har ingen interessekonflikter.
Acknowledgments
Prosjektet ble støttet av Ralph og Marian Falk Medical Research Catalyst Award og Kathleen Kelly Award. Andre støtter inkluderte National Center for Research Resources UL1RR025755 og NCI P30CA16058 (OSUCCC), NIH Veikart for medisinsk forskning. Innholdet er utelukkende forfatternes ansvar og representerer ikke de offisielle synspunktene til Nasjonalt senter for forskningsressurser eller NIH.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3T3-L1 mouse fibroblasts | ATCC | CL-173 | Cell line |
| 96-well plates | Falcon | 353227 | Plastic ware |
| B6.V-Lepob/J male mice | Jackson Laboratory | stock number 000632 | Mice |
| BioTek Synergy H1 modular multimode microplate reader (Fisher Scientific, US) | Fisher Scientific, US | B-SHT | Device |
| Bovine serum | Gibco/ThermoFisher | 161790-060 | Cell culture |
| Calf serum | Gibco/ThermoFisher | 26010-066 | Cell culture |
| Cell incubator | Forma | Series II Water Jacket | Device |
| Diet (mouse/rat diet, irradiated) | Envigo | Teklad LM-485 | Diet |
| Dimethylsulfoxide (DMSO) | Sigma LifeScience | D2650-100mL | Reagent |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | Gibco/ThermoFisher | 11965-092 | Cell culture |
| Ethanol | Sigma Aldrich | E7023-500mL | Reagent |
| Fluorescent 2-deoxy-2-[(7-nitro-2,1,3-benzoxadiazol-4-yl) amino]-D-glucose) | Sigma | 72987-1MG | Assay |
| Glucose-free and phenol red-free DMEM | Gibco/ThermoFisher | A14430-01 | Cell culture |
| Human insulin 10 mg/mL | MilliporeSigma, Cat N 91077C | Cat N 91077C | Reagent |
| Isoflurane, 5% | Henry Schein | NDC 11695-6776-2 | Anestaetic |
| Penicillin/streptomycin (P/S) | Gibco/ThermoFisher | 15140-122 | Cell culture |
| Phosphate buffered solution | Sigma-Aldrich | DA537-500 mL | Cell culture |
| Pierce bicinchoninic acid (BCA) protein assay | ThermoFisher | Cat N23225 | Assay |
| Radioimmunoprecipitation assay lysis buffer | Santa Cruz Biotechnology | sc-24948 | Assay |
| Trypsin-EDTA (0.05%) | Gibco/ThermoFisher | 25300-054 | Cell culture |
References
- Kyrtata, N., Emsley, H. C. A., Sparasci, O., Parkes, L. M., Dickie, B. R. A systematic review of glucose transport alterations in Alzheimer's disease. Frontiers in Neuroscience. 15, 568 (2021).
- Garcia-Carbonell, R., et al. Critical role of glucose metabolism in rheumatoid arthritis fibroblast-like synoviocytes. Arthritis Rheumatology. 68 (7), 1614-1626 (2016).
- Kumar, A., et al. Is diabetes mellitus associated with mortality and severity of COVID-19? A meta-analysis. Diabetes & Metabolic Syndrome: Clinical Research & Review. 14 (4), 535-545 (2020).
- Lee, J. H., et al. Different prognostic impact of glucose uptake in visceral adipose tissue according to sex in patients with colorectal cancer. Scientific Reports. 11 (1), 21556 (2021).
- Miner, M. W. G., et al. Comparison of: (2S,4R)-4-[(18)F]Fluoroglutamine, [(11)C]Methionine, and 2-Deoxy-2-[(18)F]Fluoro-D-Glucose and two small-animal PET/CT systems imaging rat gliomas. Frontiers in Oncology. 11 (18), 730358 (2021).
- Gumbiner, B., Thorburn, A. W., Ditzler, T. M., Bulacan, F., Henry, R. R. Role of impaired intracellular glucose metabolism in the insulin resistance of aging. Metabolism. 41 (10), 1115-1121 (1992).
- Ebrahimi, A. G., et al. Beta cell identity changes with mild hyperglycemia: Implications for function, growth, and vulnerability. Molecular Metabolism. 35, 100959 (2020).
- Ruberto, A. A., et al. KLF10 integrates circadian timing and sugar signaling to coordinate hepatic metabolism. Elife. 10, 65574 (2021).
- Stocks, B., Zierath, J. R. Post-translational modifications: The signals at the intersection of exercise, glucose uptake, and insulin sensitivity. Endocrinology Reviews. , (2021).
- World Health Organization.
- Kolb, H., Martin, S. Environmental/lifestyle factors in the pathogenesis and prevention of type 2 diabetes. BMC Medicine. 15 (1), 131 (2017).
- Galicia-Garcia, U., et al. Pathophysiology of type 2 diabetes mellitus. International Journal of Molecular Science. 21 (17), 6275 (2020).
- Petrov, M. S., Basina, M. DIAGNOSIS OF ENDOCRINE DISEASE: Diagnosing and classifying diabetes in diseases of the exocrine pancreas. European Journal of Endocrinology. 184 (4), 151-163 (2021).
- Sirdah, M. M., Reading, N. S. Genetic predisposition in type 2 diabetes: A promising approach toward a personalized management of diabetes. Clinical Genetics. 98 (6), 525-547 (2020).
- Ramos-Lopez, O., Milagro, F. I., Riezu-Boj, J. I., Martinez, J. A. Epigenetic signatures underlying inflammation: an interplay of nutrition, physical activity, metabolic diseases, and environmental factors for personalized nutrition. Inflammation Research. 70 (1), 29-49 (2021).
- Yamamoto, N., et al. Measurement of glucose uptake in cultured cells. Current Protocols in Pharmacology. 71 (1), 12-14 (2015).
- Yang, L., et al. A sensitive and simple HPLC-FLD-based method for the measurement of intracellular glucose uptake. Food Chemistry. 372, 131218 (2021).
- Lee, A., et al. Amino acid-based compound activates atypical PKC and leptin receptor pathways to improve glycemia and anxiety like behavior in diabetic mice. Biomaterials. 239, 119839 (2020).
- Shukla, S. K., Mulder, S. E., Singh, P. K. Hypoxia-mediated in vivo tumor glucose uptake measurement and analysis. Methods in Molecular Biology. 1742, 107-113 (2018).
- Jakson, I., Ujvari, D., Brusell Gidlof, S., Linden Hirschberg, A. Insulin regulation of solute carrier family 2 member 1 (glucose transporter 1) expression and glucose uptake in decidualizing human endometrial stromal cells: an in vitro study. Reproductive Biology and Endocrinology. 18 (1), 117 (2020).
- Saparbaev, E., et al. Identification and quantification of any isoforms of carbohydrates by 2D UV-MS fingerprinting of cold ions. Analytical Chemistry. 92 (21), 14624-14632 (2020).
- Schulz, A., et al. Targeted metabolomics of pellicle and saliva in children with different caries activity. Scientific Reports. 10 (1), 697 (2020).
- Shulman, R. G. Nuclear magnetic resonance studies of glucose metabolism in non-insulin-dependent diabetes mellitus subjects. Molecular Medicine. 2 (5), 533-540 (1996).
- Cochran, B. J., et al. In vivo PET imaging with [(18)F]FDG to explain improved glucose uptake in an apolipoprotein A-I treated mouse model of diabetes. Diabetologia. 59 (18), 1977-1984 (2016).
- Lloyd, P. G., Hardin, C. D., Sturek, M. Examining glucose transport in single vascular smooth muscle cells with a fluorescent glucose analog. Physiological Research. 48 (6), 401-410 (1999).
- Beeton, C., Garcia, A., Chandy, K. G. Drawing blood from rats through the saphenous vein and by cardiac puncture. Journal of Visualized Experiments. (7), e266 (2007).
- DiSilvestro, D. J., et al. Leptin production by encapsulated adipocytes increases brown fat, decreases resistin, and improves glucose intolerance in obese mice. PLoS One. 11 (4), 0153198 (2016).
- Friedman, J. M. Leptin and the endocrine control of energy balance. Nature Metabolism. 1 (8), 754-764 (2019).
- Guillam, M. T., Burcelin, R., Thorens, B. Normal hepatic glucose production in the absence of GLUT2 reveals an alternative pathway for glucose release from hepatocytes. Proceedings of the National Academy of Sciences. 95 (21), USA. 12317-12321 (1998).
- Guillam, M. T., et al. Early diabetes and abnormal postnatal pancreatic islet development in mice lacking Glut-2. Nature Genetics. 17 (3), 327-330 (1997).
- Barros, L. F., et al. Kinetic validation of 6-NBDG as a probe for the glucose transporter GLUT1 in astrocytes. Journal of Neurochemistry. 109, 94-100 (2009).
- Sprinz, C., et al. Effects of blood glucose level on 18F-FDG uptake for PET/CT in normal organs: A systematic review. PLoS One. 13 (2), 0193140 (2018).
- Johnson, T. V., Martin, K. R. Development and characterization of an adult retinal explant organotypic tissue culture system as an in vitro intraocular stem cell transplantation model. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 49 (8), 3503-3512 (2008).
- de Urquiza, A. M., et al. Docosahexaenoic acid, a ligand for the retinoid X receptor in mouse brain. Science. 290 (5499), 2140-2144 (2000).
- Olson, A. L., Pessin, J. E. Structure, function, and regulation of the mammalian facilitative glucose transporter gene family. Annual Review of Nutrition. 16 (1), 235-256 (1996).
- Muhanna, D., Arnipalli, S. R., Kumar, S. B., Ziouzenkova, O. Osmotic adaptation by Na(+)-dependent transporters and ACE2: correlation with hemostatic crisis in COVID-19. Biomedicines. 8 (11), 460 (2020).
- Ligasova, A., Koberna, K. DNA dyes-highly sensitive reporters of cell quantification: comparison with other cell quantification methods. Molecules. 26 (18), 5515 (2021).
- DeFronzo, R. A., Tobin, J. D., Andres, R. Glucose clamp technique: a method for quantifying insulin secretion and resistance. American Journal of Physiology. 237 (3), 214-223 (1979).
