Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

דלדול גלוקוז חוץ-תאי כמדד עקיף לספיגת גלוקוז בתאים וברקמות Ex Vivo

Published: April 6, 2022 doi: 10.3791/63681
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1
1Department of Human Sciences, The Ohio State University

Summary

דלדול חוץ-תאי של גלוקוז המסומן באופן פלואורסצנטי מתואם עם ספיגת גלוקוז, וניתן להשתמש בו לבדיקת תפוקה גבוהה של ספיגת גלוקוז באיברים שנכרתו ובתרביות תאים.

Abstract

המגיפה העולמית המתמשכת של סוכרת מגבירה את הביקוש לזיהוי גורמים סביבתיים, תזונתיים, אנדוקריניים, גנטיים ואפיגנטיים המשפיעים על ספיגת גלוקוז. מדידת פלואורסצנציה תוך-תאית היא שיטה נפוצה לבדיקת ספיגת גלוקוז המסומן בפלואורסצנטיות (FD-glucose) בתאים במבחנה, או להדמיית רקמות הצורכות גלוקוז in vivo. מחקר זה מעריך את ספיגת הגלוקוז בנקודת זמן נבחרת. הניתוח התוך-תאי מניח כי חילוף החומרים של FD-גלוקוז איטי יותר מזה של גלוקוז אנדוגני, המשתתף בתגובות ואיתות קטבוליים ואנבוליים. עם זאת, חילוף החומרים הדינמי של הגלוקוז משנה גם את מנגנוני הספיגה, מה שידרוש מדידות קינטיות של ספיגת גלוקוז בתגובה לגורמים שונים. מאמר זה מתאר שיטה למדידת דלדול FD-גלוקוז חוץ-תאי ומאמת את המתאם שלה עם ספיגת FD-גלוקוז תוך-תאית בתאים וברקמות ex vivo. דלדול גלוקוז חוץ-תאי עשוי להיות ישים פוטנציאלית למחקרים קינטיים ותלויי מינון בתפוקה גבוהה, כמו גם לזיהוי תרכובות עם פעילות גליקמית והשפעותיהן הספציפיות לרקמות.

Introduction

הביקוש למדידת ספיגת גלוקוז עולה יחד עם הצורך הקריטי לטפל בעלייה במגפה במספר רב של מחלות התלויות בחילוף החומרים של הגלוקוז. המנגנונים הבסיסיים של מחלות מטבוליות ניווניות, הפרעות נוירולוגיות וקוגניטיביות1, דלקת2 ומחלות זיהומיות3, סרטן 4,5, כמו גם הזדקנות6, תלויים בחילוף החומרים של גלוקוז לאנרגיה ולאגירתה, תהליכים אנבוליים, חלבון ושינוי גנים, איתות, ויסות גנים וסינתזה ושכפול של חומצות גרעין 7,8,9 . סוכרת (DM) קשורה ישירות לתקלה בוויסות ספיגת הגלוקוז. DM הוא ספקטרום של מחלות כרוניות כגון סוכרת מסוג 1, -2 ו -3, סוכרת הריונית, סוכרת הריון, סוכרת בשלות של צעירים, וסוגים אחרים של מחלה זו הנגרמת על ידי גורמים סביבתיים ו / או גנטיים. בשנת 2016, הדו"ח הגלובלי הראשון של ארגון הבריאות העולמי על סוכרת הראה כי מספר המבוגרים החיים עם ה- DM הנפוץ ביותר כמעט הוכפל פי ארבעה מאז 1980 ל -422 מיליון מבוגרים10, ומספר זה של חולי DM עלה באופן אקספוננציאלי בעשורים האחרונים. בשנת 2019 לבדה, הערכה של 1.5 מיליון מקרי מוות נגרמה ישירות על ידי DM10. עלייה דרמטית זו נובעת מהעלייה ב-DM מסוג 2 ומהתנאים המניעים אותו, כולל עודף משקל והשמנת יתר10. מגפת COVID-19 חשפה עלייה של פי שניים בתמותה בקרב חולי דושן בהשוואה לאוכלוסייה הכללית, מה שמרמז על התפקיד העמוק אך הלא מובן של חילוף החומרים של גלוקוז בהגנה החיסונית3. מניעה, אבחון מוקדם וטיפול ב-DM, השמנת יתר ומחלות אחרות דורשים אופטימיזציה של מדידות של ספיגת גלוקוז על ידי רקמות שונות, וזיהוי של גורמים סביבתיים11, תזונתיים12, אנדוקריניים13,גנטיים 14, ו-15 אפיגנטיים המשפיעים על ספיגת גלוקוז.

במחקר, ספיגה תוך-תאית ו/או רקמות של גלוקוז נמדדת בדרך כלל על-ידי גלוקוז המסומן בפלואורסצנט (FD-גלוקוז) במבחנה 16,17,18 ו-in vivo19. FD-גלוקוז הפך לשיטה מועדפת בהשוואה לשיטות מדויקות יותר באמצעות גלוקוז מסומןרדיואקטיבית 20, ניתוח ספקטרוסקופיית מסה אנליטית21, מטבוליקה22, שיטות תהודה מגנטית גרעינית23, וטומוגרפיה של פליטת פוזיטרונים/טומוגרפיה ממוחשבת (PET/CT)5,24. שלא כמו ספיגת גלוקוז FD, שיטות אנליטיות הדורשות יותר חומר ביולוגי עשויות לכלול הכנת דגימה רב-שלבית, מכשירים יקרים וניתוח נתונים מורכב. מדידות יעילות וזולות של ספיגת FD-גלוקוז בתרביות תאים שימשו בניסויי הוכחת היתכנות ועשויות לדרוש אימות בשיטות אחרות.

הבסיס ליישום FD-גלוקוז למחקרי ספיגת גלוקוז הוא חילוף החומרים המופחת של FD-גלוקוז בהשוואה לגלוקוז אנדוגני25. עם זאת, הן גלוקוז אנדוגני והן FD-גלוקוז מופצים באופן דינמי בין כל התאים התאיים לשימוש בתהליכים אנאבוליים, קטבוליים ואיתות. המידור והעיבוד תלוי הזמן25 של FD-גלוקוז מפריעים למדידות הפלואורסצנטיות, ומייצגים את הגורמים המגבילים העיקריים לשימוש בבדיקה זו בניסויי סינון בתפוקה גבוהה, ניתוח קינטי, תרבית תאים תלת-ממדית, תרביות משותפות וניסויי הסבר רקמות. כאן אנו מספקים נתונים המדגימים מתאם גבוה בין הידלדלות החוץ-תאית של גלוקוז FD לבין ספיגתו התוך-תאית, מה שמצביע על הידלדלות חוץ-תאית של FD-גלוקוז כמדידה פונדקאית לספיגת גלוקוז תוך-תאי. המדידה של דלדול חוץ-תאי של גלוקוז יושמה כדי לאמת הבדלים ספציפיים לרקמות בספיגת הגלוקוז בעכברים שטופלו באינסולין ובתרופה ניסיונית18 כדי לספק הוכחה עקרונית לשיטה זו.

הפרוטוקול הנוכחי מתאר מדידות תוך-תאיות וחוץ-תאיות (איור 1) של ספיגת FD-גלוקוז בתאי 3T3-L1. סעיפי פרוטוקול 1-7 מסבירים את התרבית והצמיחה של תאים במשך 48 שעות; הרעבת תאים, גירוי ומדידות חוץ-תאיות בסיסיות; ומדידות לאחר גירוי של FD-גלוקוז חוץ-תאי ומדידות תוך-תאיות של FD-גלוקוז וחלבון. פרוטוקול סעיף 8 מתאר את מדידת ה-ex vivo של ספיגה חוץ-תאית של FD-גלוקוז ברקמות שנותחו מעכברי ob/ob בנוכחות והיעדר תרכובת אינסולין וחומצות אמינו 2 (AAC2) שתוארה במקום אחר18.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

מחקרים בבעלי חיים אושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים של אוניברסיטת אוהיו (OSU, פרוטוקול 2007A0262-R4).

הערה: כל ההליכים חייבים להיעשות בארון בטיחות ביולוגית מדרגה II עם המפוח דולק והאורות כבויים.

1. הכנת חומרים

הערה: כל החומרים רשומים בטבלת החומרים.

  1. הכן בינוני 1, צנטריפוגה בינונית 2, ופתרונות אחסון ועבודה של פלואורסצנטי 2-דאוקסי-2-[(7-nitro-2,1,3-benzoxadiazol-4-yl) אמינו]-D-גלוקוז (2-NBDG או FD-גלוקוז) על פי טבלה 1 בארון בטיחות ביולוגית Class II. הגן על FD-גלוקוז מפני אור לאורך כל הניסוי על ידי כיבוי כל האורות מתחת למכסה המנוע.
  2. השתמשו בריאגנטים מוכנים לשימוש מתרביות תאים: טריפסין-EDTA, מי מלח עם מאגר פוספט (PBS), ומדיום הנשר המהונדס של דולבקו ללא גלוקוז ופנול ללא אדום (להלן, DMEM נטול גלוקוז).
  3. השתמש ב-20 מ"ל של מאגר תזה של בדיקת רדיו-אימונופרציפציה (RIPA).
    הערה: בסעיפים הבאים, דלדול חוץ-תאי וספיגה תוך-תאית של מינוני FD-גלוקוז שונים מושווים בפיברובלסטים 3T3-L1 עם ובלי גירוי אינסולין (איור 2).

2. תרבית תאים 3T3-L1 ותחזוקה

  1. פיברובלסטים של עכבר 3T3-L1 בתרבית 3T3-L1 על ידי ציפוי 1 x 106 תאים מדוללים ב-20 מ"ל של מדיום 1 בשתי צלחות של 96 בארות. צלחת 100 μL של תרחיף התא לכל באר, מה שמבטיח לשמור על הומוגניות של תרחיף זה על ידי ערבוב. לגדל תאים במשך 48 שעות באינקובטור של 37 מעלות צלזיוס (5% CO2 ו-95% לחות) מבלי לשנות את המדיה עד למפגש של כ-70%-80%.
  2. לשמור על תאים נפגשים וצומים על ידי התרבות שלהם באותו מדיום במשך 48 שעות. שנה את זמן הדגירה בין 24-72 שעות בהתאם למצב הקטבולי הרצוי של צום.

3. הרעבה של תאי 3T3-L1

  1. דקאנט מדיה מתאים בלוחות 96 הבאר. סופגים את הנוזל הנותר באמצעות מגבות נייר סטריליות.
  2. יש לשטוף את צלחת ה-96 באר עם 100 μL של PBS לבאר ולספוג את הנוזל הנותר במגבות נייר סטריליות.
  3. הוסיפו 100 μL של DMEM ללא גלוקוז לבאר ודגרו למשך 40 דקות. התאם את זמן הדגירה בהתאם לסוג התא, לגירויים ולרמת הצום הרצויה.
    הערה: זמן הדגירה עשוי לדרוש אופטימיזציה בהתאם לעונה.

4. הכנת תמיסות FD-גלוקוז עם ריכוזים שונים

הערה: הניסוי באיור 2 בוחן מדיה חוץ-תאית ובין-תאית עם ובלי גירוי באמצעות אינסולין.

  1. השתמש בשמונה שכפולים (שורה אחת בלוחית של 96 בארות) עבור כל מצב גירוי. לכן, הכן 1 מ"ל עבור כל תנאי גירוי (המפורטים בטבלה 2 ומטה).
  2. השתמש בשמונה תנאי גירוי ללא אינסולין: FD-גלוקוז של 2.5 מיקרוגרם/מ"ל, 1 מיקרוגרם/מ"ל, 0.5 מיקרוגרם/מ"ל, 0.2 מיקרוגרם/מ"ל, 0.1 מיקרוגרם/מ"ל, 0.05 מיקרוגרם/מ"ל ו-0 מיקרוגרם/מ"ל (שליטה ללא FD-גלוקוז) בצלחת אחת של 96 בארות.
  3. השתמש בשמונה תנאי גירוי עם אינסולין (10 מיקרוגרם/מ"ל, ריכוז סופי): FD-גלוקוז של 2.5 מיקרוגרם/מ"ל, 1 מיקרוגרם/מ"ל, 0.5 מיקרוגרם/מ"ל, 0.2 מיקרוגרם/מ"ל, 0.1 מיקרוגרם/מ"ל, 0.05 מיקרוגרם/מ"ל ו-0 מיקרוגרם/מ"ל (שליטה ללא FD-גלוקוז) בצלחת אחרת של 96 בארות.
  4. כדי להכין תנאי גירוי, דיללו 1 μL של תמיסת עבודה של 5 מ"ג/מ"ל FD-גלוקוז (טבלה 1) ב-999 μL של DMEM ללא גלוקוז כדי לקבל 1 מ"ל של תמיסת מלאי עובד (1:1000 דילול או 5 מיקרוגרם/מ"ל).
    1. באמצעות תמיסת מלאי עבודה זו, הכינו 1:2000, 1:5000, 1:10,000, 1:25,000, 1:50,000 ו-1:100,000 דילולים של גלוקוז FD כדי להשיג 2.5 מיקרוגרם/מ"ל, 1 מיקרוגרם/מ"ל, 0.5 מיקרוגרם/מ"ל, 0.2 מיקרוגרם/מ"ל, 0.1 מיקרוגרם/מ"ל ו-0.05 מיקרוגרם/מ"ל (טבלה 2) בצינורות של 2 מ"ל מיד לפני הניסויים בארון בטיחות ביולוגית ללא אורות.
  5. חזור על שלב 4.4 והוסף 1 μL של אינסולין (10 מ"ג/מ"ל, ריכוז סופי) לכל אחד מהמצבים שצוינו לעיל.
    הערה: הריכוז הסופי של אינסולין בדגימות אלה הוא 10 מיקרוגרם/מ"ל = 1.7 ננומול/מ"ל. כדי להשיג הומוגניזציה, יש להוסיף אינסולין לצינורות לפני הוספת פתרונות אחרים.

5. טיפול בתאי 3T3-L1 מורעבים

  1. לאחר 40 דקות של דגירה, הוציאו את ה-DMEM נטול הגלוקוז מכל באר בצלחות של 96 באר וספגו את הנוזלים הנותרים במגבות נייר סטריליות.
  2. הוסף 100 μL (לכל באר) כל אחד ממצבי הטיפול השונים שתוארו לעיל לבארות לאורך עמודה אחת, ו-100 μL (לכל באר) מאותו מצב טיפול לבארות לאורך השורה (שמונה שכפולים) בשתי צלחות 96 הבאר. סמן את הצלחות שניצלו את התנאים עם ובלי אינסולין. הוסיפו DMEM ללא גלוקוז בלבד לבארות הבקרה (n = 8).
  3. דגירו את הצלחת למשך 40 דקות בחממת תרביות תאים (37 מעלות צלזיוס, 5% CO2 ו-95% לחות) בחושך.

6. מדידות חוץ-תאיות ובין-תאיות לתאי 3T3-L1 מגורה

  1. לאחר שהתאים מגורה במשך 40 דקות, העבירו את מדיית הגירוי משתי הצלחות ללוחות חדשים בני 96 בארות, תוך שמירה על אותה פריסה ניסיונית.
  2. נקו כל תמיסה שנותרה מהצלחות המקוריות של 96 בארות עם תאים על מגבות נייר סטריליות.
  3. לחלופין, לשטוף תאים עם PBS. יש להסיר PBS ולפרק כל תמיסה שנותרה על מגבות נייר סטריליות.
  4. הוסף 100 μL של מאגר ה-RIPA lysis לכל באר. לחלופין, הוסיפו מעכב פרוטאזות למאגר RIPA כדי להגן על חלבונים. מניחים צלחות המכילות RIPA בשייקר למשך 30 דקות.
  5. באמצעות קורא מיקרו-פלטות (טבלת חומרים), מודדים פלואורסצנציה באורכי גל של עירור (Ex) ופליטה (Em) של 485 ו-535 ננומטר, בהתאמה, תחילה במדיום המכיל FD-גלוקוז חוץ-תאי, ולאחר מכן, את הצלחת עם תאים עם RIPA-lysed בסוף 30 דקות דגירה (ראו שלב 6.4).

7. נורמליזציה מבוססת חלבון של ספיגת גלוקוז תוך-תאית

הערה: ספיגת FD-גלוקוז תוך-תאית תלויה במספר התא. רמות החלבון בליזאטים תאיים פרופורציונליות למספרי התאים המאפשרים לנרמל את רמות ה-FD-גלוקוז התוך-תאיות למספר התאים בכל באר.

  1. בצע בדיקת חלבון BCA בהתאם להוראות היצרן (ראה טבלת חומרים). לכמת את ריכוזי החלבון בכל באר המכילה תאים עם RIPA.
  2. השתמשו ב-10 μL של ההומוגנט RIPA ומדדו ריכוזי חלבונים במשולש כדי להגביר את דיוק המדידות בלוחות של 96 בארות.
  3. כימות חלבון על סמך תקני חלבון (0, 10, 20, 30, 40, 50 ו-60 מיקרוגרם/מ"ל) שנותחו יחד עם דגימות על כל צלחת של 96 בארות.
  4. מדוד את הספיגה ב- 562 ננומטר וכימת את ריכוזי החלבון בכל דגימה בהתבסס על נוסחת הרגרסיה הליניארית שהתקבלה עבור תקן החלבון.
  5. נרמלו את רמות ה-FD-גלוקוז התוך-תאי על-ידי שימוש בערך פלואורסצנטי/ריכוז חלבון בכל באר. דלדול גלוקוז FD חוץ-תאי אינו דורש נורמליזציה.
  6. לחלופין, השתמש בערכי הבסיס הממוצעים בדגימות בקרה לצורך נורמליזציה נוספת (100%).

8. מדידת Ex vivo של דלדול גלוקוז FD חוץ-תאי באיברים

  1. Pretreat עכברים עם תרכובות המעוררות את חילוף החומרים של גלוקוז לפני כריתת האיברים, כדלקמן.
  2. השתמש בעכברים זכרים בני תשעה שבועות של Lepob (n = 11). האכילו את כל העכברים בדיאטת צ'או רגילה לפני הניסוי.
  3. הקצה עכברים באופן אקראי לשלוש קבוצות עבור זריקות תוך-צפקיות (כלומר).
    1. הזריקו לעכברים מקבוצת הביקורת Lepob עם 0.1 מ"ל של PBS סטרילי (n = 4).
    2. הזריקו לעכברים מקבוצת האינסולין Lepob 0.1 מ"ל של PBS סטרילי, המכיל 12 אינסולין אנושי יבעירוני לגרם של משקל גוף (BW) (n= 3).
    3. הזריקו לעכברים מקבוצת AAC2 Lepob עם 0.1 מ"ל של PBS סטרילי, המכיל 0.1 ננומול AAC2 לגרם של משקל גוף (BW) (n = 4).
  4. לאחר 15 דקות, העמידו את העכברים בשאיפה של 5% איזופלורן והקזת דם על ידי ניקור לב מבעלי החיים המורדמים26.
  5. לנתח רקמת שומן לבן אפידידימלית קרבית (200 מ"ג), כבד (200 מ"ג) ומוח שלם מכל חיה. השתמש במכסה מנוע בטיחות ביולוגית Class II לטיפול ברקמות.
  6. הכן FD-גלוקוז (0.29 mM) פתרון עבודה ב- DMEM ללא גלוקוז בארון בטיחות ביולוגית Class II ללא אור.
  7. מדוד את הפלואורסצנציה של תמיסת עבודה FD-גלוקוז (0.29 mM) באורכי גל של עירור ופליטה של 485 ו-535 ננומטר, בהתאמה, באמצעות קורא מיקרו-פלטות.
  8. דגירה של הרקמות/איברים שנקטפו בצלחת בעלת 6 בארות המכילה PBS למשך דקה אחת. טפלו בכל רקמה או איבר בבאר נפרדת.
  9. לאחר דקה אחת, מניחים כל רקמה על מגבת נייר סטרילית כדי לספוג PBS. מעבירים רקמות/איברים לצלחת נפרדת של 6 בארות המכילה 4,000 μL של DMEM ללא גלוקוז ודגירה למשך 2 דקות.
  10. לאחר 2 דקות, הסר והעביר את הרקמות לבארות של צלחת 6 בארות המכילה תמיסת עבודה של 0.29 mM FD-גלוקוז (1 מ"ל / באר). דגירה של 6 צלחות באר המכילות רקמות בתמיסת FD-גלוקוז בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס (5% CO2 ו-95% לחות).
  11. אסוף 100 μL של תמיסת FD-גלוקוז עובד מכל באר לאחר 0, 10, 20, 30, 40, 60, 90, ו 120 דקות של דגירה, כדי לנתח את הקינטיקה של דלדול גלוקוז FD חוץ-תאי. יש לנער לפני ואחרי האיסוף.
  12. העברת 100 μL של תמיסת עבודה FD-גלוקוז לתוך לוחות 96 באר כדי למדוד את הפלואורסצנציה באורכי גל של עירור ופליטה של 485 ו-535 ננומטר, בהתאמה, באמצעות קורא מיקרו-לוחיות.
  13. נרמלו את הפלואורסצנציה לערך של 0 דקות (100%) עבור כל איבר בכל חיה (איור 3).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

הצריכה התוך-תאית ודלדול הגלוקוז החוץ-תאי נמדדו בפראדיפוציטים של 3T3-L1, בתגובה לריכוזים שונים של FD-גלוקוז (איור 2) עם ובלי גירוי אינסולין. איור 2A מדגים עלייה תלוית מינון בספיגה התוך-תאית של FD-גלוקוז, שהייתה מוגברת באופן משמעותי בנוכחות אינסולין. הירידה המקבילה ברמת ה-FD-גלוקוז החוץ-תאית באותם תאים מוצגת באיור 2B, שם גירוי אינסולין הוביל לירידה משמעותית ברמות ה-FD-גלוקוז החוץ-תאיות בהשוואה לדגימות ללא גירוי אינסולין. הצריכה התוך-תאית של FD-גלוקוז מתואמת עם הידלדלות חוץ-תאית של FD-גלוקוז באופן התלוי במינון בדגימות עם ובלי אינסולין (איור 2C). לפיכך, דלדול חוץ-תאי של FD-גלוקוז יכול למדוד שינוי בספיגת הגלוקוז בדיוק דומה (R2 = 0.99, P < 0.001) כספיגת FD-גלוקוז תוך-תאית.

לאחר מכן, פותחה סביבה ניסיונית כדי לאמת את היישום החוץ-תאי של ספיגת גלוקוז ב-FD במחקרים קינטיים שבחנו רקמות שונות עם גירויים קנוניים וניסיוניים של ספיגת גלוקוז (איור 3). בחרנו במודל עכברי Lepob של תנגודת לאינסולין ברקמות היקפיות, כולל רקמת שומן לבנה קרבית27,28. התגובות המבוססות היטב לאינסולין בעכברים אלה הושוו להשפעות של תרכובת חדשה AAC2, הפועלת הן על רקמות היקפיות והן על רקמות עצבים באמצעות קולטן לפטין ומנגנוני העברת גלוקוז GLUT1 התלוייםב- 18. עכברי Lepob הוזרקו ל-i.p. אינסולין או AAC2. איברים נותחו 15 דקות לאחר ההזרקה. לאחר מכן, הקינטיקה של דלדול FD-גלוקוז חוץ-תאי נחקרה בשומן הקרביים, בכבד ובמוח ex vivo (איור 3). בהסכמה עם התנגודת המדווחת לאינסולין ברקמות היקפיות, FD-גלוקוז חוץ-תאי לא התרוקן בשומן קרבי בקרה שאינו מגורה במהלך 120 דקות של דגירה (איור 3A). לעומת זאת, טיפול מקדים בעכברים עם אינסולין או AAC2 לפני הניתוח הוביל לדלדול משמעותי של גלוקוז FD חוץ-תאי תוך מרווח זמן של 30 דקות ו-60 דקות, בהתאמה.

ספיגת גלוקוז בכבד משתמשת בהובלות גלוקוז, כולל GLUT2, שאינן תלויות בגירוי אינסולין29,30. בהתאם לכך, בתחילה לא התרוקן ה-FD-גלוקוז החוץ-תאי בצמחי כבד מגורה באינסולין בהשוואה לגולשי כבד שאינם מגורה (איור 3B), אם כי הידלדלות משמעותית של FD-גלוקוז נצפתה לאחר 120 דקות של דגירה באקספלנט של הכבד המעורר באינסולין בהשוואה לרמות הראשוניות (0 דקות). מצד שני, גלוקוז מחוץ לתאים מסוג FD ירד באופן משמעותי באופן תלוי-זמן במוציאים מהכבד שטופלו מראש ב-AAC2.

במוח, הטרנספורטר הראשי הוא GLUT1 בקרב מובילים אחרים31. הקינטיקה של דלדול FD-גלוקוז הייתה שונה באופן בולט במוח בהשוואה לרקמות אחרות (איור 3C). הידלדלות משמעותית של הגלוקוז נצפתה במדיום החוץ-תאי המכיל את המוח הלא מטופל לאחר 60 דקות של דגירה (מ-100% ב-0 דקות ל-78%). המדיום המודגר במוחות של עכברי Lepob שטופלו באינסולין הראה ירידה ליניארית מתונה אך משמעותית ב-FD-גלוקוז (מ-100% ב-0 דקות ל-95%). מוחות מגורה AAC2 מובילים לירידה מהירה עמוקה של גלוקוז מחוץ לתאים במהלך 20 הדקות הראשונות (מ-100% ב-0 דקות ל-67.4%). יחד, מדידות של דלדול גלוקוז חוץ-תאי תומכות בהבדלים שדווחו בעבר בספיגת הגלוקוז ברקמות אלה ב-vivo32.

Figure 1
איור 1: עקרון שיטת דלדול ה-FD-גלוקוז החוץ-תאי. תאים בתרבית בפורמט 96-well מתאימים לבדיקה זו. כדי לשרוד, התאים קולטים גלוקוז וזרם זה מקטין את רמות הגלוקוז החוץ-תאי. החלפת הגלוקוז ב- FD-גלוקוז מאפשרת ניטור של שינויים אלה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 2
איור 2: דלדול של גלוקוז FD חוץ-תאי נמצא בקורלציה עם הספיגה התוך-תאית במבחנה. 3T3-L1 פרדיפוציטים דגגרו במדיום נטול גלוקוז במשך 40 דקות לפני הדגירה עם ריכוזים שונים של גלוקוז FD עם ובלי אינסולין (1.7 mM; דגירה של 40 דקות). (א, ב) ספיגה תלוית מינון של FD-גלוקוז (A) ודלדול חוץ-תאי של FD-גלוקוז (B) בבקרה (כלומר, ללא אינסולין) (חטיפים שנבקעו) ותאים מגורה אינסולין (פסים שחורים). ספיגת FD-גלוקוז מנורמלה על ידי ריכוזי חלבונים. הנתונים מוצגים כאחוז מהערך שנמדד בבקרה מודגרת ללא FD-גלוקוז (ממוצע SD, n = 8 לכל מצב). המשמעות נבדקה על ידי מבחן t לא מזווג. (C) מתאם בין FD-גלוקוז תוך-תאי וחוץ-תאי (%) נמדד עם (ריבועים) או בלי (מעגלים) אינסולין בניסויים המתוארים ב-(A) ו-(B). מתאם פירסון, P < 0.001. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 3
איור 3: קינטיקה של דלדול FD-גלוקוז חוץ-תאי באיברים שונים ex vivo. (א-ג) לעכברי Lepob הוזרק רכב (PBS, n = 4), אינסולין (12 IU /kg BW, n = 3) ו- AAC2 (1 nmol / g BW, n = 3). לאחר 15 דקות נותחו הרקמות ובודדו. חומרים מכילים של (A) שומן הקרביים, (B) הכבד ו-(C) המוח דגגרו ב-FD-גלוקוז (0.29 mM). הקינטיקה של דלדול גלוקוז חוץ-תאי נמדדה באליקוטים של המדיום בנקודות זמן שונות. נתונים (ממוצע SD) מוצגים כאחוז של פלואורסצנציה בכל איבר ב 0 דקות של דגירה. משמעות P < 0.05, מבחן t לא מזווג. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

פתרון/בינוני רכיבים
אתנול:DMSO (1:1/v/v) אתנול (200 μL) ו- DMSO (200 μL) בצינור 1-1.5 מ"ל; השתמש באתנול ברמת תרבית תאים וב- DMSO
בינוני 1 DMEM (89 מ"ל), פניצילין/סטרפטומיצין (1%) (1 מ"ל) וסרום עגל (10%) (10%) (10 מ"ל) בצינור סטרילי של 50 מ"ל
צנטריפוגה בינונית 2 DMEM (89 מ"ל), פניצילין/סטרפטומיצין (1%) (1 מ"ל) וסרום בקר (10%) (10%) (10 מ"ל) בצינור סטרילי של 50 מ"ל
אחסון תמיסת FD-גלוקוז 5 מ"ג/מ"ל (14.5 מ"מ) גלוקוז FD (1 מ"ג) ואתנול:DMSO (1:1/v/v) (200 μL) בצינור 0.5 מ"ל; לאחסן ב -80 °C (80 °F), באופן מועדף מתחת לאטמוספירת ארגון או חנקן
תמיסת FD-גלוקוז עובדת 5 מיקרוגרם/מ"ל (14.5 מ"מ) תמיסת גלוקוז FD אחסון 5 מ"ג/מ"ל (1 μL), DMEM ללא גלוקוז (999 μL); להתכונן מיד לפני הניסוי.

טבלה 1: הכנת מדיית תרבית ותמיסות FD-גלוקוז.

דילול לשלוט 1:2x103 1:5x103 1:1x104 1:2.5x104 1:5x104 1:1x105
ריכוז (מיקרוגרם/מ"ל) 0 2.5 1 0.5 0.2 0.1 0.05
DMEM ללא גלוקוז (μL) 1000 500 800 900 960 980 990
FD גלוקוז 5 מיקרוגרם/מ"ל (μL) 0 500 200 100 40 20 10

טבלה 2: הכנת תמיסות FD-גלוקוז עם ריכוזים שונים לניסויים שהוכחו באיור 2.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

ההשוואה הישירה של דלדול FD-גלוקוז חוץ-תאי עם ספיגת גלוקוז תוך-תאית מנורמלת בתרבית תאים הראתה מתאם גבוה, מה שמרמז על כך שהתרוקנות גלוקוז חוץ-תאית עשויה להיות מדידה פונדקאית להערכת ספיגת גלוקוז. המדידה של FD-גלוקוז חוץ-תאי יכולה להשתמש במגוון רחב של ריכוזי גלוקוז FD, וגם 0.5-2.5 מיקרוגרם FD-גלוקוז/מ"ל נראים כמספקים את הטווח האופטימלי. FD-גלוקוז חוץ-תאי אינו דורש נורמליזציה למספר התאים או לריכוזי החלבון הדרושים לספיגת FD-גלוקוז תוך-תאי. המגבלה הצפויה של מדידות FD-גלוקוז חוץ-תאיות היא חקר של חומרים מעוררי חמצן תגובתי הגורמים למינים ועקבות של דם בתוך חומרים מוציאים שיכולים להרוות פלואורסצנציה. יש לקחת בחשבון גם גורמים סביבתיים אחרים המשפיעים על הפלואורסצנציה, כגון אור. זמן טיפול ממושך הנדרש תוך שימוש בחומרי רקמות מרובים עלול לפגוע בכדאיות הרקמות ובחילוף החומרים של הגלוקוז. זו יכולה להיות מגבלה נוספת. הרקמות שנכרתו צריכות להיות בטווח גודל קטן (50-300 מ"ג) כדי לאפשר חדירות של גלוקוז בתוך הרקמה. טיפול סימולטני ברקמות על ידי מפעילים מרובים יכול לקצר את זמן הטיפול. אף על פי שלא מדדנו את ספיגת הגלוקוז בתוך חומרי הרקמות, התצפיות המצטברות במוציאים של רקמות בתרבית מצביעות על כך שהם שורדים בתווך המכיל גלוקוז עד 17 יום עם אובדן תפקוד הדרגתי33. בפרוטוקול זה, זמן הדגירה הקצר לגולשים מאפשר ניטור של חילוף החומרים של הגלוקוז ברקמות מתפקדות יחסית. ברקמות עם ארגון תאי מורכב, כגון המוח, הגודל מציג מגבלה בלתי פתירה, מכיוון שהתפוררות של רקמה מורכבת ומוות תאי כתוצאה מכך משפיעה על ספיגת הגלוקוז. עם זאת, הדגירה של המוח במשך 24 שעות שימשה בעבר לזיהוי מנגנון ויסות אנדוגני, התומך בתפקוד פיזיולוגי יחסי של מוח עכבר נכרת בתווךהמכיל גלוקוז 34. ללא קשר, ההליך הפשוט והנגישות הקלה של FD-גלוקוז חוץ-תאי יכולים לאפשר שימוש בבדיקה זו בפורמט בתפוקה גבוהה. ההשוואה בין דלדול בסיסי של FD-גלוקוז חוץ-תאי מגורה באינסולין מצביעה על כך שניתן ליישם בדיקה זו כדי לזהות גורמים הומוריסטיים, תזונתיים, פתוגניים, סביבתיים, או תרופות המווסתות את ספיגת הגלוקוז. אף על פי שבדיקה זו מפשטת את התגלית, הממצאים דרשו אימות עם20 השיטות האנליטיות הכמותיות 21,22,23 ו/או שיטות הדמיה 5,24 להבהרה מכניסטית קפדנית של המסלולים.

השלבים הקריטיים בפרוטוקול זה כוללים אופטימיזציה של מפגש וזמן צום המשפיעים הן על ספיגת FD-גלוקוז בסיסית והן על ספיגת FD-גלוקוז מגורה. פרמטרים אלה עשויים להיות מושפעים גם מהעונה על סמך תצפיות המחברים. יתר על כן, סוגי תאים שונים משתמשים במנגנונים ספציפיים לספיגת גלוקוז, כולל מובילי גלוקוז שונים ואינטראקציות של הורמון/קולטן רגולטורי 32,35,36. לכן, יש לקחת בחשבון בקרות חיוביות שאינן אינסולין עבור תרביות התאים המייצגות רקמות שאינן רקמת שריר או שומן המווסתת על ידי צירי אינסולין/GLUT4. פתרון הבעיות כולל גם התאמת מפגש התאים ומיטוב הזמן לצום/שיפוץ עם FD-גלוקוז. בנוסף, ניתן לשפר את הרגישות של מדידת גלוקוז חוץ-תאית על-ידי הפחתת רמות ה-FD-גלוקוז החוץ-תאי, תוך התחשבות ברמות הסף הנדרשות לספיגת גלוקוז. הניסוי המתואר באיור 2 יכול לסייע לחוקרים להתאים אישית את הבדיקה הזו לשימוש בתרביות תאים אחרות או לפתרון בעיות.

השונות הפנימית של חילוף החומרים של הגלוקוז דרשה גם גודל מדגם גבוה יותר (n = 5-8). אף על פי שמדידות חוץ-תאיות של אובדן FD-גלוקוז הראו את אותו דיוק כמו ספיגה תוך-תאית של FD-גלוקוז מנורמל על-ידי חלבון, הנורמליזציה יכולה להפחית את השתנות הבדיקה. בנוסף למדידת ריכוזי החלבון, מדידת תכולת הדנ"א בתא יכולה להיות הערכה פונדקאית אמינה נוספת של תא מספר37.

FD-גלוקוז חוץ-תאי נגיש למדידות קינטיות. כאן פותח הליך פשוט של מדידות קינטיות של FD-גלוקוז חוץ-תאי כדי לזהות תגובות ספציפיות לאיברים למתווכים של ספיגת גלוקוז. מחקרי ex vitro אלה יכולים לבחון באופן ישיר את תגובת האיברים לגירויים שונים in vivo המשולבים עם חשיפה של איברים למדידות קינטיות של FD-גלוקוז ו-ex vivo , כפי שמוצג באיור 3. למרות שמחקרי ex vivo אינם דומים באופן מלא לתנאי in vivo , יש להם יתרונות רבים. מוציאי איברים שומרים על מבנה תאי ראשוני רב-תאי מורכב, בניגוד לתרביות תאים אלמותיות המציגות ביטוי גנים משתנה. פיתוח תרופות מודרניות משתמש באורגניזמי מודל, הערכה עקיפה של ספיגת גלוקוז על סמך שעתוק או מטבוליום22, טכניקת מהדק אינסולין מקיפה38, או הדמיה יקרה32. אף על פי שמדידת FD-גלוקוז חוץ-תאי באיברים מוסברים לא תחליף את הטכנולוגיות הללו, היא תספק הערכה מהירה של תרכובות, מטבוליטים וגנים כדי להקל על גילוי מטרות טיפוליות חדשניות המווסתות את ספיגת הגלוקוז באופן ספציפי לרקמות. פיתוח טיפולים בטוחים המטפלים בחילוף החומרים של גלוקוז ברקמות ספציפיות יכול להציע פתרון לסרטן, דמנציה, הזדקנות, סוכרת, מחלות אוטואימוניות, השמנת יתר ויישומים קשורים אחרים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

לכותבים אין בעיות לחשוף ואין להם ניגוד עניינים.

Acknowledgments

הפרויקט נתמך על ידי פרס ראלף ומריאן פאלק למחקר רפואי ופרס קתלין קלי. תמיכות אחרות כללו את המרכז הלאומי למשאבי מחקר UL1RR025755 ואת NCI P30CA16058 (OSUCCC), מפת הדרכים של NIH למחקר רפואי. התוכן הוא באחריותם הבלעדית של המחברים ואינו מייצג את הדעות הרשמיות של המרכז הלאומי למשאבי מחקר או של ה-NIH.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
3T3-L1 mouse fibroblasts ATCC CL-173 Cell line
96-well plates Falcon 353227 Plastic ware
B6.V-Lepob/J male mice Jackson Laboratory stock number 000632 Mice
BioTek Synergy H1 modular multimode microplate reader (Fisher Scientific, US) Fisher Scientific, US  B-SHT Device
Bovine serum Gibco/ThermoFisher 161790-060 Cell culture
Calf serum Gibco/ThermoFisher 26010-066 Cell culture
Cell incubator Forma Series II Water Jacket Device
Diet (mouse/rat diet, irradiated) Envigo Teklad LM-485 Diet
Dimethylsulfoxide (DMSO) Sigma LifeScience D2650-100mL Reagent
Dulbecco's Modified Eagle Medium Gibco/ThermoFisher  11965-092 Cell culture
Ethanol Sigma Aldrich E7023-500mL Reagent
Fluorescent 2-deoxy-2-[(7-nitro-2,1,3-benzoxadiazol-4-yl) amino]-D-glucose) Sigma 72987-1MG Assay
Glucose-free and phenol red-free DMEM Gibco/ThermoFisher A14430-01 Cell culture
Human insulin 10 mg/mL MilliporeSigma, Cat N 91077C Cat N 91077C Reagent
Isoflurane, 5% Henry Schein NDC 11695-6776-2 Anestaetic
Penicillin/streptomycin (P/S) Gibco/ThermoFisher 15140-122 Cell culture
Phosphate buffered solution Sigma-Aldrich DA537-500 mL Cell culture
Pierce bicinchoninic acid (BCA) protein assay ThermoFisher Cat N23225 Assay
Radioimmunoprecipitation assay lysis buffer Santa Cruz Biotechnology sc-24948 Assay
Trypsin-EDTA (0.05%) Gibco/ThermoFisher  25300-054 Cell culture

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Kyrtata, N., Emsley, H. C. A., Sparasci, O., Parkes, L. M., Dickie, B. R. A systematic review of glucose transport alterations in Alzheimer's disease. Frontiers in Neuroscience. 15, 568 (2021).
  2. Garcia-Carbonell, R., et al. Critical role of glucose metabolism in rheumatoid arthritis fibroblast-like synoviocytes. Arthritis Rheumatology. 68 (7), 1614-1626 (2016).
  3. Kumar, A., et al. Is diabetes mellitus associated with mortality and severity of COVID-19? A meta-analysis. Diabetes & Metabolic Syndrome: Clinical Research & Review. 14 (4), 535-545 (2020).
  4. Lee, J. H., et al. Different prognostic impact of glucose uptake in visceral adipose tissue according to sex in patients with colorectal cancer. Scientific Reports. 11 (1), 21556 (2021).
  5. Miner, M. W. G., et al. Comparison of: (2S,4R)-4-[(18)F]Fluoroglutamine, [(11)C]Methionine, and 2-Deoxy-2-[(18)F]Fluoro-D-Glucose and two small-animal PET/CT systems imaging rat gliomas. Frontiers in Oncology. 11 (18), 730358 (2021).
  6. Gumbiner, B., Thorburn, A. W., Ditzler, T. M., Bulacan, F., Henry, R. R. Role of impaired intracellular glucose metabolism in the insulin resistance of aging. Metabolism. 41 (10), 1115-1121 (1992).
  7. Ebrahimi, A. G., et al. Beta cell identity changes with mild hyperglycemia: Implications for function, growth, and vulnerability. Molecular Metabolism. 35, 100959 (2020).
  8. Ruberto, A. A., et al. KLF10 integrates circadian timing and sugar signaling to coordinate hepatic metabolism. Elife. 10, 65574 (2021).
  9. Stocks, B., Zierath, J. R. Post-translational modifications: The signals at the intersection of exercise, glucose uptake, and insulin sensitivity. Endocrinology Reviews. , (2021).
  10. World Health Organization. Global report on diabetes. World Health Organization. , (2016).
  11. Kolb, H., Martin, S. Environmental/lifestyle factors in the pathogenesis and prevention of type 2 diabetes. BMC Medicine. 15 (1), 131 (2017).
  12. Galicia-Garcia, U., et al. Pathophysiology of type 2 diabetes mellitus. International Journal of Molecular Science. 21 (17), 6275 (2020).
  13. Petrov, M. S., Basina, M. DIAGNOSIS OF ENDOCRINE DISEASE: Diagnosing and classifying diabetes in diseases of the exocrine pancreas. European Journal of Endocrinology. 184 (4), 151-163 (2021).
  14. Sirdah, M. M., Reading, N. S. Genetic predisposition in type 2 diabetes: A promising approach toward a personalized management of diabetes. Clinical Genetics. 98 (6), 525-547 (2020).
  15. Ramos-Lopez, O., Milagro, F. I., Riezu-Boj, J. I., Martinez, J. A. Epigenetic signatures underlying inflammation: an interplay of nutrition, physical activity, metabolic diseases, and environmental factors for personalized nutrition. Inflammation Research. 70 (1), 29-49 (2021).
  16. Yamamoto, N., et al. Measurement of glucose uptake in cultured cells. Current Protocols in Pharmacology. 71 (1), 12-14 (2015).
  17. Yang, L., et al. A sensitive and simple HPLC-FLD-based method for the measurement of intracellular glucose uptake. Food Chemistry. 372, 131218 (2021).
  18. Lee, A., et al. Amino acid-based compound activates atypical PKC and leptin receptor pathways to improve glycemia and anxiety like behavior in diabetic mice. Biomaterials. 239, 119839 (2020).
  19. Shukla, S. K., Mulder, S. E., Singh, P. K. Hypoxia-mediated in vivo tumor glucose uptake measurement and analysis. Methods in Molecular Biology. 1742, 107-113 (2018).
  20. Jakson, I., Ujvari, D., Brusell Gidlof, S., Linden Hirschberg, A. Insulin regulation of solute carrier family 2 member 1 (glucose transporter 1) expression and glucose uptake in decidualizing human endometrial stromal cells: an in vitro study. Reproductive Biology and Endocrinology. 18 (1), 117 (2020).
  21. Saparbaev, E., et al. Identification and quantification of any isoforms of carbohydrates by 2D UV-MS fingerprinting of cold ions. Analytical Chemistry. 92 (21), 14624-14632 (2020).
  22. Schulz, A., et al. Targeted metabolomics of pellicle and saliva in children with different caries activity. Scientific Reports. 10 (1), 697 (2020).
  23. Shulman, R. G. Nuclear magnetic resonance studies of glucose metabolism in non-insulin-dependent diabetes mellitus subjects. Molecular Medicine. 2 (5), 533-540 (1996).
  24. Cochran, B. J., et al. In vivo PET imaging with [(18)F]FDG to explain improved glucose uptake in an apolipoprotein A-I treated mouse model of diabetes. Diabetologia. 59 (18), 1977-1984 (2016).
  25. Lloyd, P. G., Hardin, C. D., Sturek, M. Examining glucose transport in single vascular smooth muscle cells with a fluorescent glucose analog. Physiological Research. 48 (6), 401-410 (1999).
  26. Beeton, C., Garcia, A., Chandy, K. G. Drawing blood from rats through the saphenous vein and by cardiac puncture. Journal of Visualized Experiments. (7), e266 (2007).
  27. DiSilvestro, D. J., et al. Leptin production by encapsulated adipocytes increases brown fat, decreases resistin, and improves glucose intolerance in obese mice. PLoS One. 11 (4), 0153198 (2016).
  28. Friedman, J. M. Leptin and the endocrine control of energy balance. Nature Metabolism. 1 (8), 754-764 (2019).
  29. Guillam, M. T., Burcelin, R., Thorens, B. Normal hepatic glucose production in the absence of GLUT2 reveals an alternative pathway for glucose release from hepatocytes. Proceedings of the National Academy of Sciences. 95 (21), USA. 12317-12321 (1998).
  30. Guillam, M. T., et al. Early diabetes and abnormal postnatal pancreatic islet development in mice lacking Glut-2. Nature Genetics. 17 (3), 327-330 (1997).
  31. Barros, L. F., et al. Kinetic validation of 6-NBDG as a probe for the glucose transporter GLUT1 in astrocytes. Journal of Neurochemistry. 109, 94-100 (2009).
  32. Sprinz, C., et al. Effects of blood glucose level on 18F-FDG uptake for PET/CT in normal organs: A systematic review. PLoS One. 13 (2), 0193140 (2018).
  33. Johnson, T. V., Martin, K. R. Development and characterization of an adult retinal explant organotypic tissue culture system as an in vitro intraocular stem cell transplantation model. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 49 (8), 3503-3512 (2008).
  34. de Urquiza, A. M., et al. Docosahexaenoic acid, a ligand for the retinoid X receptor in mouse brain. Science. 290 (5499), 2140-2144 (2000).
  35. Olson, A. L., Pessin, J. E. Structure, function, and regulation of the mammalian facilitative glucose transporter gene family. Annual Review of Nutrition. 16 (1), 235-256 (1996).
  36. Muhanna, D., Arnipalli, S. R., Kumar, S. B., Ziouzenkova, O. Osmotic adaptation by Na(+)-dependent transporters and ACE2: correlation with hemostatic crisis in COVID-19. Biomedicines. 8 (11), 460 (2020).
  37. Ligasova, A., Koberna, K. DNA dyes-highly sensitive reporters of cell quantification: comparison with other cell quantification methods. Molecules. 26 (18), 5515 (2021).
  38. DeFronzo, R. A., Tobin, J. D., Andres, R. Glucose clamp technique: a method for quantifying insulin secretion and resistance. American Journal of Physiology. 237 (3), 214-223 (1979).

Tags

ביוכימיה גיליון 182
דלדול גלוקוז חוץ-תאי כמדד עקיף לספיגת גלוקוז בתאים וברקמות <em>Ex Vivo</em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Kumar, S. B., Arnipalli, S.,… More

Kumar, S. B., Arnipalli, S., Abushukur, A., Carrau, S., Mehta, P., Ziouzenkova, O. Extracellular Glucose Depletion as an Indirect Measure of Glucose Uptake in Cells and Tissues Ex Vivo. J. Vis. Exp. (182), e63681, doi:10.3791/63681 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter