Summary
Floresan olarak etiketlenmiş glikozun hücre dışı tükenmesi, glikoz alımı ile ilişkilidir ve eksize edilmiş organlarda ve hücre kültürlerinde glikoz alımının yüksek verimli taranması için kullanılabilir.
Abstract
Dünya çapında devam eden diyabet salgını, glikoz alımını etkileyen çevresel, beslenme, endokrin, genetik ve epigenetik faktörlerin tanımlanmasına olan talebi artırmaktadır. Hücre içi floresan ölçümü, in vitro hücrelerde floresan olarak etiketlenmiş glikoz (FD-glukoz) alımını test etmek veya glikoz tüketen dokuları in vivo olarak görüntülemek için yaygın olarak kullanılan bir yöntemdir. Bu tahlil, seçilen bir zaman noktasında glikoz alımını değerlendirir. Hücre içi analiz, FD-glikoz metabolizmasının, katabolik ve anabolik reaksiyonlara ve sinyalleşmeye katılan endojen glikozunkinden daha yavaş olduğunu varsayar. Bununla birlikte, dinamik glikoz metabolizması, farklı faktörlere yanıt olarak glikoz alımının kinetik ölçümlerini gerektiren alım mekanizmalarını da değiştirir. Bu makalede, hücre dışı FD-glukoz tükenmesini ölçmek için bir yöntem açıklanmakta ve hücre ve dokularda hücre içi FD-glukoz alımı ile korelasyonunu ex vivo olarak doğrulamaktadır. Hücre dışı glikoz tükenmesi, yüksek verimli kinetik ve doza bağımlı çalışmaların yanı sıra glisemik aktiviteye sahip bileşikleri ve dokuya özgü etkilerini tanımlamak için potansiyel olarak uygulanabilir.
Introduction
Glikoz alımını ölçme talebi, glikoz metabolizmasına bağlı çok sayıda hastalıkta salgın bir artışı ele alma konusundaki kritik ihtiyaçla birlikte artmaktadır. Dejeneratif metabolik hastalıkların altında yatan mekanizmalar, nörolojik ve bilişsel bozukluklar1, enflamatuar2 ve bulaşıcı hastalıklar3, kanser 4,5 ve yaşlanma6, enerji ve depolanması için glikoz metabolizmasına, anabolik süreçlere, proteine ve gen modifikasyonuna, sinyalleşmeye, genlerin düzenlenmesine ve nükleik asitlerin sentezi ve replikasyonuna bağlıdır 7,8,9 . Diabetes mellitus (DM), glukoz alım regülasyonunun arızalanması ile doğrudan ilişkilidir. DM, tip-1, -2 ve -3 diabetes mellitus, gestasyonel diyabet, gençlerin olgunluk başlangıçlı diyabeti ve bu hastalığın çevresel ve / veya genetik faktörlerin neden olduğu diğer türleri gibi kronik hastalıkların bir spektrumudur. 2016 yılında, diyabetle ilgili ilk DSÖ Küresel raporu, en yaygın DM ile yaşayan yetişkinlerin sayısının 1980'den bu yana neredeyse dört katına çıkarak 422 milyon yetişkine10 ulaştığını ve bu DM hastalarının sayısının son birkaç on yıldır katlanarak arttığını göstermiştir. Sadece 2019 yılında, 1,5 milyon ölüm tahmini doğrudan DM10'dan kaynaklandı. Bu dramatik yükseliş, tip-2 DM'deki artıştan ve aşırı kilolu ve obezite 10 dahil olmak üzere onu yönlendiren koşullardankaynaklanmaktadır. COVID-19 pandemisi, DM'li hastalarda mortalitede genel popülasyona kıyasla iki kat artış olduğunu ortaya koymuştur ve bu da glukoz metabolizmasının immün savunmadaki derin ancak tam olarak anlaşılmamış rolünü düşündürmektedir3. DM, obezite ve diğer hastalıkların önlenmesi, erken teşhisi ve tedavisi, farklı dokular tarafından glikoz alımının ölçümlerinin optimizasyonunu ve glukoz alımını etkileyen çevresel 11, beslenme 12, endokrin13, genetik14 ve epigenetik 15 faktörün tanımlanmasını gerektirir.
Araştırmada, hücre içi ve / veya doku glukoz alımı genellikle floresan olarak etiketlenmiş glikoz (FD-glukoz) in vitro 16,17,18 ve in vivo19 ile ölçülür. FD-glukoz, radyoaktif olarak etiketlenmiş glukoz 20, analitik kütle spektroskopisi analizi 21, metabolomik 22, nükleer manyetik rezonans yöntemleri23 ve pozitron emisyon tomografisi/bilgisayarlı tomografi (PET/BT)5,24 kullanılarak daha hassas yöntemlere kıyasla tercih edilen bir yöntem haline gelmiştir. FD-glikoz alımından farklı olarak, daha fazla biyolojik materyal gerektiren analitik yöntemler, çok adımlı bir numune hazırlama, pahalı aletler ve karmaşık veri analizini içerebilir. Hücre kültürlerinde FD-glikoz alımının etkili ve ucuz ölçümleri, kavram kanıtı deneylerinde kullanılmıştır ve diğer yöntemlerle doğrulama gerektirebilir.
Glukoz alım çalışmaları için FD-glukoz uygulamasının temeli, endojen glukoz25'e kıyasla FD-glukoz metabolizmasının azalmasıdır. Bununla birlikte, hem endojen glikoz hem de FD-glikoz, anabolik, katabolik ve sinyal süreçlerinde kullanılmak üzere tüm hücresel bölmeler arasında dinamik olarak dağıtılır. FD-glikozun bölümlendirilmesi ve zamana bağlı işlenmesi25 , floresan ölçümlerine müdahale eder ve bu tahlilin yüksek verimli tarama deneyleri, kinetik analiz, 3D hücre kültürü, ko-kültürler ve doku eksplant deneylerinde kullanımı için ana sınırlayıcı faktörleri temsil eder. Burada, FD-glukozun hücre dışı tükenmesi ile hücre içi alımı arasında yüksek bir korelasyon olduğunu gösteren veriler sunuyoruz, bu da FD-glukozun hücre içi glikoz alımı için vekil bir ölçüm olarak hücre dışı tükenmesini düşündürmektedir. Glikozun hücre dışı tükenmesinin ölçümü, insülin ile tedavi edilen farelerde glikoz alımındaki dokuya özgü farklılıkları doğrulamak için ve bu yöntemin bir ilke kanıtı sağlamak için deneysel bir ilaç18 uygulanmıştır.
Mevcut protokol, 3T3-L1 hücrelerinde FD-glukoz alımının hücre içi ve hücre dışı (Şekil 1) ölçümlerini tanımlamaktadır. Protokol bölümleri 1-7, 48 saat boyunca hücrelerin kültürünü ve büyümesini açıklar; hücre açlığı, stimülasyon ve temel hücre dışı ölçümler; ve hücre dışı FD-glukozun stimülasyon sonrası ölçümleri ve FD-glukoz ve proteinin hücre içi ölçümleri. Protokol bölüm 8, başka bir yerde tarif edilen insülin ve amino asit bileşiği 2'nin (AAC2) varlığı ve yokluğunda ob / ob farelerinden diseke edilen dokularda FD-glukozun hücre dışı alımının ex vivo ölçümünü açıklamaktadır18.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Hayvan çalışmaları, Ohio State Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi tarafından onaylanmıştır (OSU, protokol 2007A0262-R4).
NOT: Tüm prosedürler, üfleyici açık ve ışıklar kapalı olarak sınıf II biyogüvenlik kabininde yapılmalıdır.
1. Malzemelerin hazırlanması
NOT: Tüm malzemeler Malzeme Tablosunda listelenmiştir.
- Sınıf II biyogüvenlik kabininde Tablo 1'e göre Ortam 1, santrifüjleme Ortamı 2 ve floresan 2-deoksi-2-[(7-nitro-2,1,3-benzoksadiazol-4-il) amino]-D-glikoz (2-NBDG veya FD-glikoz) depolama ve çalışma çözeltileri hazırlayın. Kaputun altındaki tüm ışıkları kapatarak deney boyunca FD-glikozu ışıktan koruyun.
- Kullanıma hazır hücre kültürü reaktifleri kullanın: Tripsin-EDTA, fosfat tamponlu salin (PBS) ve glikozsuz ve fenol kırmızısı içermeyen Dulbecco'nun Modifiye Kartal Ortamı (bundan böyle glikozsuz DMEM olarak anılacaktır).
- 20 mL radyoimmünopresipitasyon testi (RIPA) lizis tamponu kullanın.
NOT: Aşağıdaki bölümlerde, insülin stimülasyonu olan ve olmayan 3T3-L1 fibroblastlarında farklı FD-glukoz dozlarının hücre dışı tükenmesi ve hücre içi alımı karşılaştırılmıştır (Şekil 2).
2. 3T3-L1 hücre kültürü ve bakımı
- Kültür 3T3-L1 fare fibroblastları, iki adet96 delikli plakada 20 mL Orta 1'de seyreltilmiş 1 x 10 6 hücreyi kaplayarak kaplar. Plaka kuyu başına 100 μL hücre süspansiyonu, bu süspansiyonun homojenliğinin bozulmasını sağlayarak homojenliğin korunmasını sağlar. 37 °C'lik bir inkübatörde (% 5 CO2 ve% 95 nem) yaklaşık% 70 -% 80 akıcılığa kadar ortam değiştirmeden hücreleri 48 saat büyütün.
- Hücreleri 48 saat boyunca aynı ortamda kültürleyerek akıcı ve oruç tutun. İstenilen açlık katabolik durumuna bağlı olarak kuluçka süresini 24-72 saat arasında değiştirin.
3. 3T3-L1 hücrelerinin açlığı
- 96 delikli plakalardaki hücrelerden gelen dekant ortam. Steril kağıt havlular kullanarak kalan sıvıyı emer.
- 96 delikli plakayı kuyucuk başına 100 μL PBS ile durulayın ve kalan sıvıyı steril kağıt havlularla emer.
- Kuyu başına 100 μL glikozsuz DMEM ekleyin ve 40 dakika kuluçkaya yatırın. Hücre tipine, uyaranlara ve istenen açlık seviyesine bağlı olarak kuluçka süresini ayarlayın.
NOT: Kuluçka zamanı, mevsime bağlı olarak optimizasyon gerektirebilir.
4. Farklı konsantrasyonlarda FD-glikoz çözeltilerinin hazırlanması
NOT: Şekil 2'deki deney, insülin ile stimülasyonu olan ve olmayan hücre dışı ve hücreler arası ortamları incelemektedir.
- Her stimülasyon koşulu için sekiz replikasyon (96 delikli bir plakada bir sıra) kullanın. Bu nedenle, her stimülasyon koşulu için 1 mL hazırlayın ( Tablo 2 ve aşağıda belirtilmiştir).
- İnsülin olmadan sekiz stimülasyon koşulu kullanın: 96 delikli bir plakada 2.5 μg / mL, 1 μg / mL, 0.5 μg / mL, 0.2 μg / mL, 0.1 μg / mL, 0.05 μg / mL ve 0 μg / mL (FD-glikozsuz kontrol) FD-glukoz.
- İnsülin ile sekiz stimülasyon koşulu kullanın (10 μg / mL, son konsantrasyon): Başka bir 96 delikli plakada 2.5 μg / mL, 1 μg / mL, 0.5 μg / mL, 0.2 μg / mL, 0.1 μg / mL, 0.05 μg / mL ve 0 μg / mL (FD-glikozsuz kontrol) FD-glukoz.
- Stimülasyon koşullarını hazırlamak için, 1 mL çalışma stoğu çözeltisi (1:1000 seyreltme veya 5 μg / mL) elde etmek için 999 μL glikozsuz DMEM'de 1 μL 5 mg / mL FD-glikoz çalışma çözeltisini (Tablo 1) seyreltin.
- Bu çalışan stok çözeltisini kullanarak, ışıksız bir biyogüvenlik kabinindeki deneylerden hemen önce 2 mL tüplerde 2.5 μg / mL, 1 μg / mL, 0.5g / mL, 0.2 μg / mL, 0.1 μg / mL, 0.1 μg / mL ve 0.05 μg / mL (Tablo 2) elde etmek için 1:2000, 1:10.000, 1:25.000, 1:50.000, 1:50.000 ve 1:100.000 seyreltme FD-glikoz hazırlayın.
- Adım 4.4'ü tekrarlayın ve yukarıda belirtilen koşulların her birine 1 μL insülin (10 mg / mL, son konsantrasyon) ekleyin.
NOT: Bu numunelerdeki nihai insülin konsantrasyonu 10 μg / mL = 1.7 nmol / mL'dir. Homojenizasyonu sağlamak için, başka çözeltiler eklemeden önce tüplere insülin ekleyin.
5. Aç kalan 3T3-L1 hücrelerinin tedavisi
- 40 dakikalık inkübasyondan sonra, glikozsuz DMEM'yi 96 delikli plakalar halinde her bir kuyucuktan boşaltın ve kalan sıvıyı steril kağıt havlularla emer.
- Yukarıda açıklanan çeşitli arıtma koşullarından her biri bir sütun boyunca kuyucuklara 100 μL (kuyu başına) ve aynı arıtma koşulundan her iki 96 kuyucuklu plakadaki sıra boyunca kuyucuklara (sekiz kopya) 100 μL (kuyu başına) ekleyin. İnsülinli ve insülinsiz koşulları kullanan plakaları etiketleyin. Kontrol kuyularına tek başına glikozsuz DMEM ekleyin (n = 8).
- Plakayı karanlıkta bir hücre kültürü inkübatöründe (37 ° C,% 5 CO2 ve% 95 nem) 40 dakika boyunca inkübe edin.
6. Uyarılmış 3T3-L1 hücreleri için hücre dışı ve hücreler arası ölçümler
- Hücreler 40 dakika boyunca uyarıldıktan sonra, stimülasyon ortamını her iki plakadan aynı deney düzenini koruyan yeni 96 delikli plakalara aktarın.
- Orijinal uyarılmış 96 delikli plakalardan kalan herhangi bir çözeltiyi, steril kağıt havlular üzerindeki hücrelerle boşaltın.
- İsteğe bağlı olarak, hücreleri PBS ile yıkayın. PBS'yi çıkarın ve steril kağıt havluların üzerinde kalan solüsyonu boşaltın.
- Her bir kuyucuğa 100 μL RIPA lizis tamponu ekleyin. İsteğe bağlı olarak, proteinleri korumak için RIPA tamponuna proteaz inhibitörü ekleyin. RIPA içeren plakaları 30 dakika boyunca bir çalkalayıcıya yerleştirin.
- Bir mikroplaka okuyucu (Malzeme Tablosu) kullanarak, sırasıyla 485 ve 535 nm uyarma (Ex) ve emisyon (Em) dalga boylarında floresansı, önce hücre dışı FD-glikoz içeren ortamda, daha sonra 30 dakikalık inkübasyonun sonunda RIPA-lize hücrelere sahip plakayı ölçün (bkz. adım 6.4).
7. Hücre içi glikoz alımının protein bazlı normalizasyonu
NOT: Hücre içi FD-glukoz alımı hücre sayısına bağlıdır. Hücresel lizatlardaki protein seviyeleri, hücre içi FD-glikoz seviyelerinin her bir kuyucuktaki hücre sayısına normalleştirilmesine izin veren hücre sayılarıyla orantılıdır.
- BCA protein testini üreticinin talimatlarına göre yapın (bkz. RIPA-lize hücreler içeren her kuyucuktaki protein konsantrasyonlarını sayısallaştırın.
- 10 μL RIPA homojenatı kullanın ve 96 delikli plakalardaki ölçümlerin doğruluğunu artırmak için protein konsantrasyonlarını üçlü olarak ölçün.
- Her 96 delikli plakadaki örneklerle birlikte analiz edilen protein standartlarına (0, 10, 20, 30, 40, 50 ve 60 μg / mL protein) dayanarak proteini sayısallaştırın.
- 562 nm'deki absorbansı ölçün ve protein standardı için elde edilen doğrusal regresyon formülüne dayanarak her numunedeki protein konsantrasyonlarını ölçün.
- Her bir kuyucukta floresan değeri / protein konsantrasyonu kullanarak hücre içi FD-glikoz seviyelerini normalleştirin. Hücre dışı FD-glukoz tükenmesi normalizasyon gerektirmez.
- İsteğe bağlı olarak, ek normalleştirme (%100) için denetim örneklerinde ortalama taban çizgisi değerlerini kullanın.
8. Organlarda hücre dışı FD glukoz tükenmesinin ex-vivo ölçümü
- Farelere, organ diseksiyonundan önce glikoz metabolizmasını uyaran bileşiklerle aşağıdaki gibi ön işlemden geçirin.
- Dokuz haftalık Lepob erkek fareleri kullanın (n = 11). Deneyden önce tüm fareleri düzenli bir chow diyetiyle besleyin.
- İntraperitoneal (i.p.) enjeksiyonlar için fareleri rastgele üç gruba ayırın.
- Kontrol Lepob grubundan farelere 0.1 mL steril PBS enjekte edin (n = 4).
- İnsülin Lepob grubundaki farelere, vücut ağırlığının gramı (BW) başına 12 IU insan insülini içeren 0.1 mL steril PBS enjekte edin (n = 3).
- AAC2 Lepob grubundaki farelere, gram vücut ağırlığı (BW) başına 0,1 nmol AAC2 içeren 0,1 mL steril PBS enjekte edin (n = 4).
- 15 dakika sonra, fareleri% 5 izofluran inhalasyonuna maruz bırakın ve anestezi uygulanan hayvanlardan kardiyak ponksiyon yoluyla kanı ekssanguinatedin 26.
- Her hayvandan viseral epididim beyaz yağ dokusunu (200 mg), karaciğeri (200 mg) ve tüm beyni disseke edin. Doku taşıma için Sınıf II biyogüvenlik başlığı kullanın.
- FD-glukoz (0.29 mM) çalışma solüsyonunu glikozsuz DMEM'de ışıksız bir Sınıf II Biyogüvenlik kabininde hazırlayın.
- Bir mikroplaka okuyucu kullanarak, FD-glikoz çalışma çözeltisinin (0.29 mM) sırasıyla 485 ve 535 nm emisyon dalga boylarında floresansını ölçün.
- Hasat edilen dokuları/organları PBS içeren 6 delikli bir plakada 1 dakika boyunca inkübe edin. Her doku veya organı ayrı bir kuyuda tutun.
- 1 dakika sonra, PBS'yi emmek için her bir mendili steril bir kağıt havluya yerleştirin. Dokuları/organları 4.000 μL glikozsuz DMEM içeren ayrı bir 6 delikli plakaya aktarın ve 2 dakika boyunca kuluçkaya yatırın.
- 2 dakika sonra, dokuları çıkarın ve 0.29 mM FD-glikoz çalışma çözeltisi (1 mL / kuyu) içeren 6 delikli bir plakanın kuyucuklarına aktarın. FD-glikoz çalışma çözeltisindeki dokuları içeren 6 delikli plakaları 37 ° C'de (% 5 CO2 ve% 95 nem) inkübe edin.
- Hücre dışı FD glikoz tükenmesinin kinetiğini analiz etmek için 0, 10, 20, 30, 40, 60, 90 ve 120 dakikalık inkübasyondan sonra her bir kuyucuktan 100 μL FD-glikoz çalışma çözeltisi toplayın. Toplamadan önce ve sonra sallayın.
- Bir mikroplaka okuyucu kullanarak, sırasıyla 485 ve 535 nm uyarma ve emisyon dalga boylarındaki floresanı ölçmek için 100 μL FD-glikoz çalışma çözeltisini 96 delikli plakalara aktarın.
- Floresansı, her hayvandaki her organ için 0 dakikalık değere (%100) normalleştirin (Şekil 3).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
İnsülin stimülasyonu olan ve olmayan farklı FD-glukoz konsantrasyonlarına yanıt olarak 3T3-L1 preadipositlerde hücre içi alım ve hücre dışı glukoz tükenmesi ölçüldü (Şekil 2). Şekil 2A , insülin varlığında önemli ölçüde artmış olan FD-glukozun hücre içi alımında doza bağlı bir artış göstermektedir. Aynı hücrelerde hücre dışı FD-glukozdaki eşzamanlı azalma, insülin stimülasyonunun insülin stimülasyonu olmayan örneklere kıyasla hücre dışı FD-glikoz seviyelerinin önemli ölçüde azalmasına yol açtığı Şekil 2B'de gösterilmiştir. FD-glukozun hücre içi alımı, insülinli ve insülinsiz örneklerde doza bağımlı bir şekilde FD-glukozun hücre dışı tükenmesi ile korelasyon göstermiştir (Şekil 2C). Bu nedenle, FD-glukozun hücre dışı tükenmesi, glikoz alımındaki bir değişikliği, hücre içi FD-glikoz alımı ile karşılaştırılabilir doğrulukla (R2 = 0.99, P < 0.001) ölçebilir.
Daha sonra, kanonik ve deneysel glikoz alımı indükleyicileri ile stimülasyon üzerine farklı dokuları inceleyen kinetik çalışmalarda hücre dışı FD-glukoz alım uygulamasını doğrulamak için deneysel bir ortam geliştirilmiştir (Şekil 3). Viseral beyaz yağ dokusu27,28 dahil olmak üzere periferik dokularda insülin direncinin Lepob mouse modelini seçtik. Bu farelerde insüline verilen iyi bilinen yanıtlar, leptin reseptörü ve glikoz taşıyıcı GLUT1 bağımlı mekanizmalar yoluyla hem periferik hem de sinir dokularına etki eden yeni bileşik AAC2'nin etkileri ile karşılaştırılmıştır18. Lepob farelere i.p. insülin veya AAC2 enjekte edildi. Organlar enjeksiyondan 15 dakika sonra diseke edildi. Daha sonra, hücre dışı FD-glukoz tükenmesinin kinetiği viseral yağ, karaciğer ve beyin ex vivo'da incelendi (Şekil 3). Periferik dokularda bildirilen insülin direnci ile uyumlu olarak, hücre dışı FD-glukoz, 120 dakikalık inkübasyon sırasında uyarılmamış kontrol viseral yağında tükenmemiştir (Şekil 3A). Buna karşılık, diseksiyondan önce farelerin insülin veya AAC2 ile ön muamelesi, sırasıyla 30 dakika ve 60 dakikalık bir zaman aralığında hücre dışı FD-glukozun önemli ölçüde tükenmesine yol açmıştır.
Karaciğerde glikoz alımı, insülin stimülasyonundan bağımsız olan GLUT2 dahil glikoz taşıyıcılarını kullanır29,30. Buna göre, hücre dışı FD-glukoz başlangıçta insülin ile uyarılmış karaciğer eksplantlarında uyarılmamış karaciğer eksplantlarında uyarılmamış karaciğer eksplantlarında tükenmemiştir (Şekil 3B), ancak insülin ile uyarılan karaciğer eksplantında 120 dakikalık inkübasyondan sonra FD-glukozun önemli ölçüde tükenmesi gözlenmiştir. başlangıç seviyelerine kıyasla (0 dk). Öte yandan, AAC2 ile önceden tedavi edilmiş karaciğer eksplantlarında hücre dışı FD glukozu zamana bağlı bir şekilde önemli ölçüde azalmıştır.
Beyinde, ana taşıyıcı diğer taşıyıcılar arasında GLUT1'dir31. FD-glukoz tükenme kinetiği, beyinde diğer dokulara kıyasla çarpıcı bir şekilde farklıydı (Şekil 3C). 60 dakikalık inkübasyondan sonra tedavi edilmeyen beyni içeren hücre dışı ortamda glikozun önemli ölçüde tükenmesi gözlenmiştir (0 dakikada% 100'den % 78'e). İnsülin ile tedavi edilen Lepob farelerinden beyinlerle inkübe edilen ortam, FD-glukozda ılımlı ancak önemli bir doğrusal düşüş göstermiştir (0 dakikada% 100'den% 95'e). AAC2 ile uyarılmış beyinler, ilk 20 dakika boyunca hücre dışı FD-glukozun derin ve hızlı bir şekilde azalmasına yol açar (0 dakikada% 100'den% 67.4'e). Birlikte, hücre dışı glikoz tükenmesi ölçümleri, bu dokulardaki glikoz alımında daha önce bildirilen farklılıkları in vivo32'yi desteklemektedir.
Şekil 1: Hücre dışı FD-glukoz tükenmesi yönteminin prensibi. 96 kuyucuklu formatta kültürlenmiş hücreler bu test için uygundur. Hayatta kalmak için, hücreler glikozu alır ve bu akış hücre dışı glikoz seviyelerini azaltır. Glikozun FD-glikoz ile değiştirilmesi, bu değişikliklerin izlenmesini sağlar. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: 3T3-L1 preadipositleri, insülinli ve insülinsiz farklı konsantrasyonlarda FD-glukoz (1.7 mM; 40 dakika inkübasyon) ile inkübasyondan önce 40 dakika boyunca glikozsuz bir ortamda inkübe edildi. (A, B) FD-glukoz (A) ve hücre dışı FD-glikoz tükenmesinin (B) doza bağımlı alımı (yani, insülin olmadan) (taranmış çubuklar) ve insülin ile uyarılmış hücreler (siyah çubuklar). FD-glukoz alımı protein konsantrasyonları ile normalleştirildi. Veriler, FD-glukoz olmadan inkübe edilen kontrolde ölçülen değerin % 'si olarak gösterilmektedir (ortalama SD, koşul başına n = 8). Anlamlılık eşlenmemiş t-testi ile incelendi. (C) (A) ve (B)'de tanımlanan deneylerde hücre içi ve hücre dışı FD-glukoz (%) ile (kareler) veya insülin olmadan (daireler) ölçülür. Pearson korelasyonu, P < 0.001. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Farklı organlarda ex vivo hücre dışı FD-glukoz tükenmesinin kinetiği. (A-C) Lepob farelere araç (PBS, n = 4), insülin (12 IU / kg BW, n = 3) ve AAC2 (1 nmol / g BW, n = 3) enjekte edildi. 15 dakika sonra dokular diseke edildi ve izole edildi. (A) viseral yağ, (B) karaciğer ve (C) beyin eksplantları FD-glukozda (0.29 mM) inkübe edildi. Hücre dışı glikoz tükenmesinin kinetiği, farklı zaman noktalarında ortamın alikotlarında ölçüldü. Veriler (ortalama SD), 0 dakikalık inkübasyonda her organdaki floresan % 'si olarak gösterilir. Anlamlılık P < 0.05, eşlenmemiş t-testi. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
| Çözüm/Orta | Bileşen |
| Etanol: DMSO (1: 1 / v / v) | 1-1.5 mL tüpte etanol (200 μL) ve DMSO (200 μL); hücre kültürü sınıfı etanol ve DMSO kullanın |
| Orta 1 | DMEM (89 mL), Penisilin/streptomisin (%1) (1 mL) ve buzağı serumu (%10) (10 mL) steril 50 mL tüpte |
| Santrifüj Ortamı 2 | DMEM (89 mL), Penisilin/streptomisin (%1) (1 mL) ve sığır serumu (%10) (10 mL) steril 50 mL tüpte |
| Depolama FD-glikoz çözeltisi 5 mg/mL (14.5 mM) | 0.5 mL tüpte FD glikoz (1 mg) ve Etanol: DMSO (1: 1 / v / v) (200 μL); -80 °C'de, tercihen argon veya azot atmosferi altında saklayın |
| Çalışma FD-glikoz çözeltisi 5 μg / mL (14.5 mM) | Depolama FD glikoz çözeltisi 5 mg / mL (1 μL), Glikozsuz DMEM (999 μL); deneyden hemen önce hazırlayın. |
Tablo 1: Kültür ortamı ve FD-glukoz çözeltilerinin hazırlanması.
| Seyreltme | Kontrol | 1:2x103 | 1:5x103 | 1:1x104 | 1:2.5x104 | 1:5x104 | 1:1x105 |
| Konsantrasyon (μg/mL) | 0 | 2.5 | 1 | 0.5 | 0.2 | 0.1 | 0.05 |
| Glikozsuz DMEM (μL) | 1000 | 500 | 800 | 900 | 960 | 980 | 990 |
| FD Glikoz 5 μg/mL (μL) | 0 | 500 | 200 | 100 | 40 | 20 | 10 |
Tablo 2: Şekil 2'de gösterilen deneyler için farklı konsantrasyonlarda FD-glikoz çözeltilerinin hazırlanması.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Hücre dışı FD-glukoz tükenmesinin hücre kültüründe normalize hücre içi glukoz alımı ile doğrudan karşılaştırılması, hücre dışı glikoz tükenmesinin glikoz alım değerlendirmesi için vekil bir ölçüm olabileceğini düşündüren yüksek bir korelasyon göstermiştir. Hücre dışı FD-glukoz ölçümü çok çeşitli FD glukoz konsantrasyonlarını kullanabilir, ayrıca 0.5-2.5 μg FD-glukoz / mL'nin optimal aralığı sağladığı görülmektedir. Hücre dışı FD-glukoz, hücre içi FD-glukoz alımı için gerekli hücre sayısına veya protein konsantrasyonlarına normalizasyon gerektirmez. Hücre dışı FD-glukoz ölçümlerinin beklenen sınırlaması, reaktif oksijen türlerini indükleyen ajanların ve eksplantlar içinde floresanı söndürebilen kan izlerinin araştırılmasıdır. Işık gibi floresanı etkileyen diğer çevresel faktörler de dikkate alınmalıdır. Birden fazla doku eksplantı kullanırken gereken uzun kullanım süresi, doku canlılığını ve glikoz metabolizmasını tehlikeye atabilir. Bu ek bir sınırlama olabilir. Eksize edilen dokuların, doku içindeki glikozun geçirgenliğine izin vermek için küçük bir boyut aralığında (50-300 mg) olması gerekir. Dokuların birden fazla operatör tarafından aynı anda taşınması, taşıma süresini kısaltabilir. Doku eksplantlarındaki glikoz alımını ölçmemiş olsak da, kültürlenmiş doku eksplantlarında biriken gözlemler, glikoz içeren ortamda, ilerleyici işlevsellik kaybı ile 17 güne kadar hayatta kaldıklarını göstermektedir33. Bu protokolde, eksplantlar için kısa inkübasyon süresi, nispeten fonksiyonel dokularda glikoz metabolizmasının izlenmesini sağlar. Beyin gibi karmaşık hücresel organizasyona sahip dokularda, boyut çözülemez bir sınırlama sunar, çünkü karmaşık dokunun parçalanması ve sonuçta ortaya çıkan hücre ölümü glikoz alımını etkiler. Bununla birlikte, beynin 24 saat boyunca inkübasyonu, daha önce endojen düzenleyici mekanizmanın tanımlanması için kullanılmış ve eksize edilmiş fare beyninin glikoz içeren ortam34'te göreceli fizyolojik işlevselliğini desteklemektedir. Ne olursa olsun, basitleştirilmiş prosedür ve hücre dışı FD-glikozun kolay erişilebilirliği, bu tahlilin yüksek verimli bir biçimde kullanılmasına izin verebilir. Baz ve insülin ile uyarılmış hücre dışı FD-glukoz tükenmesinin karşılaştırılması, bu tahlilin humoral, beslenmesel, patojenik, çevresel faktörleri veya glikoz alımını düzenleyen farmasötik ilaçları tanımlamak için uygulanabileceğini düşündürmektedir. Bu tahlil keşfi basitleştirse de, bulgular yolaklarıntitizlikle mekanik olarak aydınlatılması için kantitatif radyo-etiketleme 20 analitik yöntem 21,22,23 ve / veya görüntüleme yöntemleri 5,24 ile doğrulanmayı gerektirmiştir.
Bu protokoldeki kritik adımlar, hem bazal hem de uyarılmış FD-glikoz alımını etkileyen birleşme ve açlık süresinin optimizasyonunu içerir. Bu parametreler, yazarların gözlemlerine dayanarak mevsimden de etkilenebilir. Ayrıca, farklı hücre tipleri, farklı glikoz taşıyıcıları ve düzenleyici hormon / reseptör etkileşimleri dahil olmak üzere glikoz alımı için spesifik mekanizmalar kullanır32,35,36. Bu nedenle insülin/GLUT4 eksenleri tarafından düzenlenen kas veya yağ dokusu dışındaki dokuları temsil eden hücre kültürleri için insülin dışındaki pozitif kontrollerin göz önünde bulundurulması gerekmektedir. Sorun giderme ayrıca hücre birleşmesini ayarlamayı ve FD-glikoz ile oruç tutma / yeniden besleme süresini optimize etmeyi de içerir. Ek olarak, hücre dışı glikoz ölçümünün duyarlılığı, glikoz alımı için gerekli eşik seviyeleri dikkate alınarak, hücre dışı FD-glikoz seviyelerinin azaltılmasıyla geliştirilebilir. Şekil 2'de açıklanan deney, araştırmacıların bu testi diğer hücre kültürleriyle veya sorun giderme ile kullanılmak üzere özelleştirmelerine yardımcı olabilir.
Glikoz metabolizmasının içsel değişkenliği de daha yüksek bir örneklem büyüklüğü gerektiriyordu (n = 5-8). FD-glukoz kaybının hücre dışı ölçümleri, protein tarafından normalleştirilen FD-glukozun hücre içi alımı ile aynı doğruluğu göstermesine rağmen, normalizasyon tahlil değişkenliğini azaltabilir. Protein konsantrasyonlarının ölçülmesine ek olarak, hücredeki DNA içeriğinin ölçümü,37 numaralı hücrenin bir başka güvenilir vekil değerlendirmesi olabilir.
Kinetik ölçümler için hücre dışı FD-glukoza erişilebilir. Burada, glikoz alımının aracılarına organa özgü yanıtları tanımlamak için hücre dışı FD-glukozun kinetik ölçümlerinin basit bir prosedürü geliştirilmiştir. Bu ex vitro çalışmalar, Şekil 3'te gösterildiği gibi, organların FD-glikoz ve ex vivo kinetik ölçümlere maruz kalması ile birleştirilen çeşitli in vivo uyaranlara organ tepkisini doğrudan test edebilir. Ex vivo çalışmalar in vivo koşullara tam olarak benzemese de, birçok avantajı vardır. Organ eksplantları, değiştirilmiş gen ekspresyonu sergileyen ölümsüz hücre kültürlerinin aksine, karmaşık çok hücreli birincil hücre yapısını korur. Modern ilaç geliştirme, model organizmaları, transkriptom veya metabolom 22'ye dayalı glikoz alımının dolaylı değerlendirmesini, kapsamlı insülin kelepçe tekniğini38 veya pahalı görüntülemeyi32 kullanır. Ekilen organlarda hücre dışı FD-glukoz ölçümü bu teknolojilerin yerini almayacak olsa da, glikoz alımını dokuya özgü bir şekilde düzenleyen yeni terapötik hedeflerin keşfedilmesini kolaylaştırmak için bileşik, metabolit ve genlerin hızlı bir şekilde değerlendirilmesini sağlayacaktır. Belirli dokulardaki glikoz metabolizmasını ele alan güvenli tedavilerin geliştirilmesi, kanser, demans, yaşlanma, diyabet, otoimmün hastalıklar, obezite ve diğer ilgili uygulamalar için bir çözüm sunabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların ifşa edecek hiçbir sorunu yoktur ve çıkar çatışması yoktur.
Acknowledgments
Proje, Ralph ve Marian Falk Tıbbi Araştırma Katalizörü Ödülü ve Kathleen Kelly Ödülü tarafından desteklendi. Diğer destekler arasında Ulusal Araştırma Kaynakları Merkezi UL1RR025755 ve NCI P30CA16058 (OSUCCC), NIH Tıbbi Araştırma Yol Haritası yer aldı. İçerik yalnızca yazarların sorumluluğundadır ve Ulusal Araştırma Kaynakları Merkezi veya NIH'nin resmi görüşlerini temsil etmemektedir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3T3-L1 mouse fibroblasts | ATCC | CL-173 | Cell line |
| 96-well plates | Falcon | 353227 | Plastic ware |
| B6.V-Lepob/J male mice | Jackson Laboratory | stock number 000632 | Mice |
| BioTek Synergy H1 modular multimode microplate reader (Fisher Scientific, US) | Fisher Scientific, US | B-SHT | Device |
| Bovine serum | Gibco/ThermoFisher | 161790-060 | Cell culture |
| Calf serum | Gibco/ThermoFisher | 26010-066 | Cell culture |
| Cell incubator | Forma | Series II Water Jacket | Device |
| Diet (mouse/rat diet, irradiated) | Envigo | Teklad LM-485 | Diet |
| Dimethylsulfoxide (DMSO) | Sigma LifeScience | D2650-100mL | Reagent |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | Gibco/ThermoFisher | 11965-092 | Cell culture |
| Ethanol | Sigma Aldrich | E7023-500mL | Reagent |
| Fluorescent 2-deoxy-2-[(7-nitro-2,1,3-benzoxadiazol-4-yl) amino]-D-glucose) | Sigma | 72987-1MG | Assay |
| Glucose-free and phenol red-free DMEM | Gibco/ThermoFisher | A14430-01 | Cell culture |
| Human insulin 10 mg/mL | MilliporeSigma, Cat N 91077C | Cat N 91077C | Reagent |
| Isoflurane, 5% | Henry Schein | NDC 11695-6776-2 | Anestaetic |
| Penicillin/streptomycin (P/S) | Gibco/ThermoFisher | 15140-122 | Cell culture |
| Phosphate buffered solution | Sigma-Aldrich | DA537-500 mL | Cell culture |
| Pierce bicinchoninic acid (BCA) protein assay | ThermoFisher | Cat N23225 | Assay |
| Radioimmunoprecipitation assay lysis buffer | Santa Cruz Biotechnology | sc-24948 | Assay |
| Trypsin-EDTA (0.05%) | Gibco/ThermoFisher | 25300-054 | Cell culture |
References
- Kyrtata, N., Emsley, H. C. A., Sparasci, O., Parkes, L. M., Dickie, B. R. A systematic review of glucose transport alterations in Alzheimer's disease. Frontiers in Neuroscience. 15, 568 (2021).
- Garcia-Carbonell, R., et al. Critical role of glucose metabolism in rheumatoid arthritis fibroblast-like synoviocytes. Arthritis Rheumatology. 68 (7), 1614-1626 (2016).
- Kumar, A., et al. Is diabetes mellitus associated with mortality and severity of COVID-19? A meta-analysis. Diabetes & Metabolic Syndrome: Clinical Research & Review. 14 (4), 535-545 (2020).
- Lee, J. H., et al. Different prognostic impact of glucose uptake in visceral adipose tissue according to sex in patients with colorectal cancer. Scientific Reports. 11 (1), 21556 (2021).
- Miner, M. W. G., et al. Comparison of: (2S,4R)-4-[(18)F]Fluoroglutamine, [(11)C]Methionine, and 2-Deoxy-2-[(18)F]Fluoro-D-Glucose and two small-animal PET/CT systems imaging rat gliomas. Frontiers in Oncology. 11 (18), 730358 (2021).
- Gumbiner, B., Thorburn, A. W., Ditzler, T. M., Bulacan, F., Henry, R. R. Role of impaired intracellular glucose metabolism in the insulin resistance of aging. Metabolism. 41 (10), 1115-1121 (1992).
- Ebrahimi, A. G., et al. Beta cell identity changes with mild hyperglycemia: Implications for function, growth, and vulnerability. Molecular Metabolism. 35, 100959 (2020).
- Ruberto, A. A., et al. KLF10 integrates circadian timing and sugar signaling to coordinate hepatic metabolism. Elife. 10, 65574 (2021).
- Stocks, B., Zierath, J. R. Post-translational modifications: The signals at the intersection of exercise, glucose uptake, and insulin sensitivity. Endocrinology Reviews. , (2021).
- World Health Organization.
- Kolb, H., Martin, S. Environmental/lifestyle factors in the pathogenesis and prevention of type 2 diabetes. BMC Medicine. 15 (1), 131 (2017).
- Galicia-Garcia, U., et al. Pathophysiology of type 2 diabetes mellitus. International Journal of Molecular Science. 21 (17), 6275 (2020).
- Petrov, M. S., Basina, M. DIAGNOSIS OF ENDOCRINE DISEASE: Diagnosing and classifying diabetes in diseases of the exocrine pancreas. European Journal of Endocrinology. 184 (4), 151-163 (2021).
- Sirdah, M. M., Reading, N. S. Genetic predisposition in type 2 diabetes: A promising approach toward a personalized management of diabetes. Clinical Genetics. 98 (6), 525-547 (2020).
- Ramos-Lopez, O., Milagro, F. I., Riezu-Boj, J. I., Martinez, J. A. Epigenetic signatures underlying inflammation: an interplay of nutrition, physical activity, metabolic diseases, and environmental factors for personalized nutrition. Inflammation Research. 70 (1), 29-49 (2021).
- Yamamoto, N., et al. Measurement of glucose uptake in cultured cells. Current Protocols in Pharmacology. 71 (1), 12-14 (2015).
- Yang, L., et al. A sensitive and simple HPLC-FLD-based method for the measurement of intracellular glucose uptake. Food Chemistry. 372, 131218 (2021).
- Lee, A., et al. Amino acid-based compound activates atypical PKC and leptin receptor pathways to improve glycemia and anxiety like behavior in diabetic mice. Biomaterials. 239, 119839 (2020).
- Shukla, S. K., Mulder, S. E., Singh, P. K. Hypoxia-mediated in vivo tumor glucose uptake measurement and analysis. Methods in Molecular Biology. 1742, 107-113 (2018).
- Jakson, I., Ujvari, D., Brusell Gidlof, S., Linden Hirschberg, A. Insulin regulation of solute carrier family 2 member 1 (glucose transporter 1) expression and glucose uptake in decidualizing human endometrial stromal cells: an in vitro study. Reproductive Biology and Endocrinology. 18 (1), 117 (2020).
- Saparbaev, E., et al. Identification and quantification of any isoforms of carbohydrates by 2D UV-MS fingerprinting of cold ions. Analytical Chemistry. 92 (21), 14624-14632 (2020).
- Schulz, A., et al. Targeted metabolomics of pellicle and saliva in children with different caries activity. Scientific Reports. 10 (1), 697 (2020).
- Shulman, R. G. Nuclear magnetic resonance studies of glucose metabolism in non-insulin-dependent diabetes mellitus subjects. Molecular Medicine. 2 (5), 533-540 (1996).
- Cochran, B. J., et al. In vivo PET imaging with [(18)F]FDG to explain improved glucose uptake in an apolipoprotein A-I treated mouse model of diabetes. Diabetologia. 59 (18), 1977-1984 (2016).
- Lloyd, P. G., Hardin, C. D., Sturek, M. Examining glucose transport in single vascular smooth muscle cells with a fluorescent glucose analog. Physiological Research. 48 (6), 401-410 (1999).
- Beeton, C., Garcia, A., Chandy, K. G. Drawing blood from rats through the saphenous vein and by cardiac puncture. Journal of Visualized Experiments. (7), e266 (2007).
- DiSilvestro, D. J., et al. Leptin production by encapsulated adipocytes increases brown fat, decreases resistin, and improves glucose intolerance in obese mice. PLoS One. 11 (4), 0153198 (2016).
- Friedman, J. M. Leptin and the endocrine control of energy balance. Nature Metabolism. 1 (8), 754-764 (2019).
- Guillam, M. T., Burcelin, R., Thorens, B. Normal hepatic glucose production in the absence of GLUT2 reveals an alternative pathway for glucose release from hepatocytes. Proceedings of the National Academy of Sciences. 95 (21), USA. 12317-12321 (1998).
- Guillam, M. T., et al. Early diabetes and abnormal postnatal pancreatic islet development in mice lacking Glut-2. Nature Genetics. 17 (3), 327-330 (1997).
- Barros, L. F., et al. Kinetic validation of 6-NBDG as a probe for the glucose transporter GLUT1 in astrocytes. Journal of Neurochemistry. 109, 94-100 (2009).
- Sprinz, C., et al. Effects of blood glucose level on 18F-FDG uptake for PET/CT in normal organs: A systematic review. PLoS One. 13 (2), 0193140 (2018).
- Johnson, T. V., Martin, K. R. Development and characterization of an adult retinal explant organotypic tissue culture system as an in vitro intraocular stem cell transplantation model. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 49 (8), 3503-3512 (2008).
- de Urquiza, A. M., et al. Docosahexaenoic acid, a ligand for the retinoid X receptor in mouse brain. Science. 290 (5499), 2140-2144 (2000).
- Olson, A. L., Pessin, J. E. Structure, function, and regulation of the mammalian facilitative glucose transporter gene family. Annual Review of Nutrition. 16 (1), 235-256 (1996).
- Muhanna, D., Arnipalli, S. R., Kumar, S. B., Ziouzenkova, O. Osmotic adaptation by Na(+)-dependent transporters and ACE2: correlation with hemostatic crisis in COVID-19. Biomedicines. 8 (11), 460 (2020).
- Ligasova, A., Koberna, K. DNA dyes-highly sensitive reporters of cell quantification: comparison with other cell quantification methods. Molecules. 26 (18), 5515 (2021).
- DeFronzo, R. A., Tobin, J. D., Andres, R. Glucose clamp technique: a method for quantifying insulin secretion and resistance. American Journal of Physiology. 237 (3), 214-223 (1979).
