Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Extracellulär glukosutarmning som ett indirekt mått på glukosupptag i celler och vävnader ex vivo

Published: April 6, 2022 doi: 10.3791/63681
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1
1Department of Human Sciences, The Ohio State University

Summary

Extracellulär utarmning av fluorescerande märkt glukos korrelerar med glukosupptag och kan användas för screening med hög genomströmning av glukosupptag i utskurna organ och cellkulturer.

Abstract

Den pågående globala epidemin av diabetes ökar efterfrågan på identifiering av miljömässiga, näringsmässiga, endokrina, genetiska och epigenetiska faktorer som påverkar glukosupptaget. Mätningen av intracellulär fluorescens är en allmänt använd metod för att testa upptaget av fluorescerande märkt glukos (FD-glukos) i celler in vitro eller för avbildning av glukosförbrukande vävnader in vivo. Denna analys bedömer glukosupptaget vid en vald tidpunkt. Den intracellulära analysen förutsätter att metabolismen av FD-glukos är långsammare än för endogen glukos, som deltar i katabola och anabola reaktioner och signalering. Dynamisk glukosmetabolism förändrar emellertid också upptagsmekanismer, vilket skulle kräva kinetiska mätningar av glukosupptag som svar på olika faktorer. Denna artikel beskriver en metod för att mäta extracellulär FD-glukosutarmning och validerar dess korrelation med intracellulärt FD-glukosupptag i celler och vävnader ex vivo. Extracellulär glukosutarmning kan vara potentiellt tillämplig för kinetiska och dosberoende studier med hög genomströmning, samt för att identifiera föreningar med glykemisk aktivitet och deras vävnadsspecifika effekter.

Introduction

Efterfrågan på att mäta glukosupptaget ökar tillsammans med det kritiska behovet av att ta itu med en epidemisk ökning av en mängd sjukdomar som är beroende av glukosmetabolism. Underliggande mekanismer för degenerativa metaboliska sjukdomar, neurologiska och kognitiva störningar1, inflammatoriska2 och infektionssjukdomar3, cancer 4,5, liksom åldrande6, beror på glukosmetabolism för energi och dess lagring, anabola processer, protein och genmodifiering, signalering, reglering av gener och nukleinsyror syntes och replikation 7,8,9 . Diabetes mellitus (DM) är direkt relaterad till funktionsfel i glukosupptagsregleringen. DM är ett spektrum av kroniska sjukdomar som typ-1, -2 och -3 diabetes mellitus, graviditetsdiabetes, mognadsdiabetes hos unga och andra typer av denna sjukdom inducerad av miljömässiga och / eller genetiska faktorer. År 2016 visade den första WHO Global-rapporten om diabetes att antalet vuxna som lever med den mest utbredda DM nästan har fyrdubblats sedan 1980 till 422 miljoner vuxna10, och detta antal DM-patienter har ökat exponentiellt under de senaste decennierna. Bara under 2019 orsakades en uppskattning av 1,5 miljoner dödsfall direkt avDM 10. Denna dramatiska uppgång beror på ökningen av typ 2 DM och de förhållanden som driver den, inklusive övervikt och fetma10. COVID-19-pandemin avslöjade en tvåfaldig ökning av dödligheten hos patienter med DM jämfört med den allmänna befolkningen, vilket tyder på den djupa men dåligt förstådda rollen som glukosmetabolism i immunförsvaret3. Förebyggande, tidig diagnos och behandling av DM, fetma och andra sjukdomar kräver optimering av mätningar av glukosupptag av olika vävnader och identifiering av miljö11,näringsämne 12, endokrina13, genetiska14 och epigenetiska15 faktorer som påverkar glukosupptaget.

Inom forskning mäts vanligtvis intracellulärt och/eller vävnadsupptag av glukos med fluorescerande märkt glukos (FD-glukos) in vitro 16,17,18 och in vivo19. FD-glukos blev en föredragen metod jämfört med mer exakta metoder med radioaktivt märkt glukos20, analytisk masspektroskopianalys21, metabolomik22, kärnmagnetisk resonansmetod23 och positronemissionstomografi / datortomografi (PET / CT)5,24. Till skillnad från FD-glukosupptag kan analysmetoder som kräver mer biologiskt material involvera en flerstegs provberedning, dyra instrument och komplex dataanalys. Effektiva och billiga mätningar av FD-glukosupptag i cellkulturer har använts i proof-of-concept-experiment och kan kräva validering med andra metoder.

Grunden för FD-glukosapplikation för glukosupptagsstudier är den minskade metabolismen av FD-glukos jämfört med endogen glukos25. Icke desto mindre, både endogen glukos och FD-glukos distribueras dynamiskt mellan alla cellulära fack för användning i anabola, katabola, och signalering processer. Uppdelningen och tidsberoende bearbetning25 av FD-glukos stör fluorescensmätningarna och representerar de viktigaste begränsande faktorerna för användningen av denna analys i screeningexperiment med hög genomströmning, kinetisk analys, 3D-cellodling, samkulturer och vävnadsexplanteringsexperiment. Här tillhandahåller vi data som visar en hög korrelation mellan den extracellulära utarmningen av FD-glukos och dess intracellulära upptag, vilket tyder på extracellulär utarmning av FD-glukos som en surrogatmätning för intracellulärt glukosupptag. Mätningen av extracellulär utarmning av glukos tillämpades för att validera vävnadsspecifika skillnader i glukosupptag hos möss behandlade med insulin och ett experimentellt läkemedel18 för att ge ett principbevis för denna metod.

Det aktuella protokollet beskriver intracellulära och extracellulära (figur 1) mätningar av FD-glukosupptag i 3T3-L1-celler. Protokollavsnitt 1-7 förklarar odling och tillväxt av celler i 48 timmar; cellhushållning, stimulering och extracellulära baslinjemätningar; och poststimuleringsmätningar av extracellulär FD-glukos och intracellulära mätningar av FD-glukos och protein. Protokollavsnitt 8 beskriver ex vivo-mätningen av extracellulärt upptag av FD-glukos i vävnader som dissekeras från ob/ob-möss i närvaro och frånvaro av insulin och aminosyraförening 2 (AAC2) som beskrivs på annan plats18.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Djurstudier godkändes av Institutional Animal Care and Use Committee vid Ohio State University (OSU, protokoll 2007A0262-R4).

OBS: Alla procedurer måste göras i ett klass II biosäkerhetsskåp med fläkten på och lamporna släckta.

1. Beredning av material

OBS: Alla material är listade i materialförteckningen.

  1. Förbered Medium 1, centrifugering Medium 2 och lagrings- och arbetslösningar av fluorescerande 2-deoxi-2-[(7-nitro-2,1,3-bensoxadiazol-4-yl) amino]-D-glukos (2-NBDG eller FD-glukos) enligt tabell 1 i ett klass II biosäkerhetsskåp. Skydda FD-glukos från ljus under hela experimentet genom att stänga av alla lampor under huven.
  2. Använd färdiga cellodlingsreagenser: Trypsin-EDTA, fosfatbuffrad saltlösning (PBS) och glukosfri och fenolrödfri Dulbeccos Modified Eagle Medium (nedan glukosfri DMEM).
  3. Använd 20 ml radioimmunoprecipitationsanalys (RIPA) lysbuffert.
    OBS: I följande avsnitt jämförs extracellulär utarmning och intracellulärt upptag av olika FD-glukosdoser i 3T3-L1-fibroblaster med och utan insulinstimulering (figur 2).

2. 3T3-L1 cellodling och underhåll

  1. Odla 3T3-L1 musfibroblaster genom plätering av 1 x 106 celler utspädda i 20 ml Medium 1 i två 96-brunnsplattor. Platta 100 μL cellsuspension per brunn, vilket säkerställer att homogeniteten hos denna suspension bibehålls genom blandning. Odla celler i 48 timmar i en 37 ° C inkubator (5% CO2 och 95% luftfuktighet) utan att byta media tills cirka 70% -80% sammanflöde.
  2. Håll cellerna sammanflytande och fasta genom att odla dem i samma medium i 48 timmar. Variera inkubationstiden från 24-72 h beroende på önskat fastande kataboliskt tillstånd.

3. Svält av 3T3-L1-celler

  1. Dekantera media från celler i 96-brunnsplattorna. Absorbera den återstående vätskan med sterila pappershanddukar.
  2. Skölj 96-brunnsplattan med 100 μL PBS per brunn och absorbera den återstående vätskan med sterila pappershanddukar.
  3. Tillsätt 100 μL glukosfri DMEM per brunn och inkubera i 40 min. Justera inkubationstiden beroende på celltyp, stimuli och önskad fastenivå.
    OBS: Inkubationstiden kan kräva optimering beroende på säsong.

4. Beredning av FD-glukoslösningar med olika koncentrationer

OBS: Experimentet i figur 2 undersöker extracellulära och intercellulära medier med och utan stimulering med insulin.

  1. Använd åtta replikat (en rad i en 96-brunnsplatta) för varje stimuleringstillstånd. Förbered därför 1 ml för varje stimuleringstillstånd (specificerat i tabell 2 och nedan).
  2. Använd åtta stimuleringsförhållanden utan insulin: FD-glukos på 2,5 μg/ml, 1 μg/ml, 0,5 μg/ml, 0,2 μg/ml, 0,1 μg/ml, 0,05 μg/ml och 0 μg/ml (kontroll utan FD-glukos) i en 96-brunnsplatta.
  3. Använd åtta stimuleringsförhållanden med insulin (10 μg/ml, slutkoncentration): FD-glukos på 2,5 μg/ml, 1 μg/ml, 0,5 μg/ml, 0,2 μg/ml, 0,1 μg/ml, 0,05 μg/ml och 0 μg/ml (kontroll utan FD-glukos) i en annan 96-brunnsplatta.
  4. För att förbereda stimuleringsbetingelserna, späd 1 μl 5 mg / ml FD-glukos arbetslösning (tabell 1) i 999 μL glukosfri DMEM för att erhålla 1 ml arbetslösning (1: 1000 utspädning eller 5 μg / ml).
    1. Använd denna arbetsstamlösning och bered 1:2000, 1:5000, 1:10 000, 1:25 000, 1:50 000 och 1:100 000 utspädningar av FD-glukos för att erhålla 2,5 μg/ml, 1 μg/ml, 0,5 μg/ml, 0,2 μg/ml, 0,1 μg/ml och 0,05 μg/ml (tabell 2) i 2 ml rör omedelbart före experiment i ett biosäkerhetsskåp utan lampor.
  5. Upprepa steg 4.4 och tillsätt 1 μl insulin (10 mg/ml, slutkoncentration) till vart och ett av de villkor som anges ovan.
    OBS: Den slutliga koncentrationen av insulin i dessa prover är 10 μg / ml = 1,7 nmol / ml. För att uppnå homogenisering, tillsätt insulin i rören innan du lägger till andra lösningar.

5. Behandling av svältade 3T3-L1-celler

  1. Efter 40 minuters inkubation, dekantera den glukosfria DMEM från varje brunn i 96-brunnsplattor och absorbera den återstående vätskan med sterila pappershanddukar.
  2. Tillsätt 100 μL (per brunn) vardera från de olika behandlingsbetingelserna som beskrivs ovan till brunnar längs en kolonn och 100 μL (per brunn) från samma behandlingstillstånd till brunnarna längs raden (åtta replikat) i båda 96-brunnsplattorna. Märk plattorna som utnyttjade förhållandena med och utan insulin. Tillsätt enbart glukosfri DMEM till kontrollbrunnarna (n = 8).
  3. Inkubera plattan i 40 minuter i en cellodlingsinkubator (37 °C, 5 % CO2 och 95 % luftfuktighet) i mörker.

6. Extracellulära och intercellulära mätningar för stimulerade 3T3-L1-celler

  1. Efter att cellerna har stimulerats i 40 minuter, överför stimuleringsmediet från båda plattorna till nya 96-brunnsplattor som bibehåller samma experimentella layout.
  2. Dekantera eventuell kvarvarande lösning från de ursprungliga stimulerade 96-brunnsplattorna med celler på sterila pappershanddukar.
  3. Tvätta eventuellt celler med PBS. Ta bort PBS och dekantera eventuell återstående lösning på sterila pappershanddukar.
  4. Tillsätt 100 μl av RIPA-lysbufferten till varje brunn. Alternativt kan du lägga till proteashämmare i RIPA-bufferten för att skydda proteiner. Placera plattor som innehåller RIPA i en shaker i 30 minuter.
  5. Använd en mikroplattläsare (materialtabell) och mät fluorescens vid excitation (Ex) och emissions (Em) våglängder på 485 respektive 535 nm, först i mediet som innehåller extracellulär FD-glukos, och sedan plattan med RIPA-lyserade celler i slutet av 30 min inkubation (se steg 6.4).

7. Proteinbaserad normalisering av intracellulärt glukosupptag

OBS: Intracellulärt FD-glukosupptag beror på cellnumret. Proteinnivåerna i cellulära lysater är proportionella mot cellnumren som möjliggör normalisering av intracellulära FD-glukosnivåer till antalet celler i varje brunn.

  1. Utför BCA-proteinanalys enligt tillverkarens instruktioner (se materialtabell). Kvantifiera proteinkoncentrationerna i varje brunn som innehåller RIPA-lyserade celler.
  2. Använd 10 μL av RIPA-homogenatet och mät proteinkoncentrationerna i tre exemplar för att öka mätnoggrannheten i 96-brunnsplattor.
  3. Kvantifiera protein baserat på proteinstandarder (0, 10, 20, 30, 40, 50 och 60 μg / ml protein) analyserat tillsammans med prover på varje 96-brunnsplatta.
  4. Mät absorbansen vid 562 nm och kvantifiera proteinkoncentrationer i varje prov baserat på den linjära regressionsformeln erhållen för proteinstandarden.
  5. Normalisera nivåerna av intracellulär FD-glukos genom att använda fluorescerande värde / proteinkoncentration i varje brunn. Extracellulär FD-glukosutarmning kräver inte normalisering.
  6. Du kan också använda de genomsnittliga baslinjevärdena i kontrollprover för ytterligare normalisering (100 %).

8. Ex vivo-mätning av extracellulär FD-glukosutarmning i organ

  1. Förbehandla möss med föreningar som stimulerar glukosmetabolism före organdissektion, enligt följande.
  2. Använd nio veckor gamla Lepob hanmöss (n = 11). Foder alla möss med en vanlig chow-diet före experimentet.
  3. Tilldela möss slumpmässigt i tre grupper för intraperitoneala (i.p.) injektioner.
    1. Injicera möss från kontrollgruppen Lepob med 0,1 ml steril PBS (n = 4).
    2. Injicera möss från insulin Lepob-gruppen med 0,1 ml steril PBS, innehållande 12 IE humaninsulin per gram kroppsvikt (BW) (n= 3).
    3. Injicera möss från AAC2 Lepob-gruppen med 0,1 ml steril PBS, innehållande 0,1 nmol AAC2 per gram kroppsvikt (BW) (n = 4).
  4. Efter 15 minuter utsätts möss för inandning av 5% isofluran och exsanguerat blod genom hjärtpunktion från de sövda djuren26.
  5. Dissekera visceral epidydimal vit fettvävnad (200 mg), lever (200 mg) och hela hjärnan från varje djur. Använd en klass II biosäkerhetshuv för vävnadshantering.
  6. Förbered FD-glukos (0,29 mM) arbetslösning i glukosfri DMEM i ett klass II biosäkerhetsskåp utan ljus.
  7. Mät fluorescensen hos FD-glukos arbetslösning (0,29 mM) vid excitations- och emissionsvåglängder på 485 respektive 535 nm med hjälp av en mikroplattläsare.
  8. Inkubera de skördade vävnaderna /organen i en 6-brunnsplatta som innehåller PBS i 1 min. Hantera varje vävnad eller organ i en separat brunn.
  9. Efter 1 min, placera varje vävnad på en steril pappershandduk för att absorbera PBS. Överför vävnader/organ till en separat 6-brunnsplatta som innehåller 4 000 μl glukosfri DMEM och inkubera i 2 minuter.
  10. Efter 2 min, ta bort och överför vävnaderna till brunnar på en 6-brunnsplatta som innehåller 0,29 mM FD-glukoslösning (1 ml / brunn). Inkubera 6-brunnsplattorna som innehåller vävnader i FD-glukosarbetslösning vid 37 ° C (5% CO2 och 95% fuktighet).
  11. Samla 100 μL FD-glukosarbetslösning från varje brunn efter 0, 10, 20, 30, 40, 60, 90 och 120 min inkubation för att analysera kinetiken för extracellulär FD-glukosutarmning. Skaka före och efter insamling.
  12. Överför 100 μL FD-glukosarbetslösning till 96-brunnsplattor för att mäta fluorescensen vid excitation och emissionsvåglängder på 485 respektive 535 nm med hjälp av en mikroplattläsare.
  13. Normalisera fluorescensen till 0 min-värdet (100%) för varje organ i varje djur (figur 3).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Intracellulärt intag och extracellulär glukosutarmning mättes i 3T3-L1-preadipocyter, som svar på olika koncentrationer av FD-glukos (figur 2) med och utan insulinstimulering. Figur 2A visar en dosberoende ökning av det intracellulära upptaget av FD-glukos, vilket ökade signifikant i närvaro av insulin. Den samtidiga minskningen av extracellulär FD-glukos i samma celler visas i figur 2B, där insulinstimulering ledde till signifikant minskade extracellulära FD-glukosnivåer jämfört med proverna utan insulinstimulering. Det intracellulära intaget av FD-glukos korrelerade med den extracellulära utarmningen av FD-glukos på ett dosberoende sätt i prover med och utan insulin (figur 2C). Således kan extracellulär utarmning av FD-glukos mäta en förändring i glukosupptag med jämförbar noggrannhet (R2 = 0,99, P < 0,001) som intracellulärt FD-glukosupptag.

Därefter utvecklades en experimentell miljö för att validera extracellulär FD-glukosupptagsapplikation i kinetiska studier som undersökte olika vävnader vid stimulering med kanoniska och experimentella inducerare av glukosupptag (Figur 3). Vi valde Lepob-musmodellen av insulinresistens i perifera vävnader, inklusive visceral vit fettvävnad27,28. De väletablerade svaren på insulin hos dessa möss jämfördes med effekterna av den nya föreningen AAC2, som verkar på både perifera och nervösa vävnader via leptinreceptor och glukostransportör GLUT1-beroende mekanismer18. Lepob möss injicerades bl.a. med insulin eller AAC2. Organen dissekerades 15 min efter injektion. Därefter studerades kinetiken för extracellulär FD-glukosutarmning i visceralt fett, lever och hjärna ex vivo (Figur 3). I överensstämmelse med den rapporterade insulinresistensen i perifera vävnader utarmades inte extracellulär FD-glukos i icke-stimulerat visceralt kontrollfett under 120 minuters inkubation (figur 3A). Däremot ledde förbehandling av möss med insulin eller AAC2 före dissektion till signifikant utarmning av extracellulär FD-glukos inom ett tidsintervall på 30 min respektive 60 min.

Leverupptag av glukos använder glukostransportörer, inklusive GLUT2, som är oberoende av insulinstimulering29,30. Följaktligen var extracellulär FD-glukos initialt inte utarmad i insulinstimulerade leverexplantat jämfört med icke-stimulerade leverexplantat (figur 3B), även om signifikant utarmning av FD-glukos observerades efter 120 minuters inkubation i leverexplant stimulerad med insulin jämfört med de initiala nivåerna (0 min). Å andra sidan minskade extracellulär FD-glukos signifikant på ett tidsberoende sätt i leverexplantat förbehandlade med AAC2.

I hjärnan är huvudtransportören GLUT1 bland andra transportörer31. FD-glukosutarmningskinetiken var påfallande annorlunda i hjärnan jämfört med annan vävnad (figur 3C). Den signifikanta utarmningen av glukos observerades i det extracellulära mediet innehållande den icke-behandlade hjärnan efter 60 minuters inkubation (från 100% vid 0 min till 78%). Mediet inkuberat med hjärnor från insulinbehandlade Lepob-möss har visat måttlig men en signifikant linjär minskning av FD-glukos (från 100% vid 0 min till 95%). AAC2-stimulerade hjärnor leder till en djupgående snabb minskning av extracellulär FD-glukos under de första 20 minuterna (från 100% vid 0 min till 67,4%). Tillsammans stöder mätningar av extracellulär glukosutarmning de tidigare rapporterade skillnaderna i glukosupptag i dessa vävnader in vivo32.

Figure 1
Figur 1: Princip för den extracellulära FD-glukosutarmningsmetoden. Celler odlade i 96-brunnsformat är lämpliga för denna analys. För att överleva tar cellerna upp glukos och denna tillströmning minskar nivåerna av extracellulär glukos. Ersättningen av glukos med FD-glukos möjliggör övervakning av dessa förändringar. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 2
Figur 2: Utarmning av extracellulär FD-glukos korrelerad med det intracellulära upptaget in vitro. (A, B) Dosberoende upptag av FD-glukos (A) och extracellulär FD-glukosutarmning (B) i kontroll (dvs. utan insulin) (kläckta stänger) och insulinstimulerade celler (svarta staplar). FD-glukosupptag normaliserades av proteinkoncentrationer. Data visas som % av det värde som uppmätts i kontroll inkuberad utan FD-glukos (medelVÄRDE SD, n = 8 per tillstånd). Betydelsen undersöktes med oparade t-test. (C) Korrelation mellan intracellulär och extracellulär FD-glukos (%) mäter med (kvadrater) eller utan (cirklar) insulin i experiment som beskrivs i (A) och (B). Pearson korrelation, P < 0,001. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 3
Figur 3: Kinetik för extracellulär FD-glukosutarmning i olika organ ex vivo. (A-C) Lepob-möss injicerades med vehikel (PBS, n = 4), insulin (12 IE/kg BW, n = 3) och AAC2 (1 nmol/g BW, n = 3). Efter 15 minuter dissekerades vävnader och isolerades. Explantat av (A) visceralt fett, (B) lever och (C) hjärna inkuberades i FD-glukos (0,29 mM). Kinetiken för extracellulär glukosutarmning mättes i alikvoter av mediet vid olika tidpunkter. Data (medelvärde SD) visas som % av fluorescensen i varje organ vid 0 minuters inkubation. Signifikans P < 0,05, oparade t-test. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Lösning/Medium Komponenter
Etanol:DMSO (1:1/v/v) Etanol (200 μl) och DMSO (200 μL) i 1-1,5 ml rör; använda etanol av cellodlingskvalitet och DMSO
Medel 1 DMEM (89 ml), penicillin/streptomycin (1%) (1 ml) och kalvserum (10%) (10 ml) i sterilt 50 ml rör
Centrifugering Medium 2 DMEM (89 ml), penicillin/streptomycin (1%) (1 ml) och bovint serum (10%) (10 ml) i sterilt 50 ml rör
Förvaring av FD-glukoslösning 5 mg / ml (14,5 mM) FD-glukos (1 mg) och Etanol:DMSO (1:1/v/v) (200 μL) i 0,5 ml rör; Förvaras vid -80 °C, företrädesvis i argon- eller kväveatmosfär
Fungerande FD-glukoslösning 5 μg/ml (14,5 mM) Förvaring FD-glukoslösning 5 mg / ml (1 μl), glukosfri DMEM (999 μl); förbered dig omedelbart före experimentet.

Tabell 1: Beredning av odlingsmedier och FD-glukoslösningar.

Utspädning Kontroll 1:2x103 1:5x103 1:1x104 1:2,5x104 1:5x104 1:1x105
Koncentration (μg/ml) 0 2.5 1 0.5 0.2 0.1 0.05
Glukosfri DMEM (μL) 1000 500 800 900 960 980 990
FD-glukos 5 μg/ml (μl) 0 500 200 100 40 20 10

Tabell 2: Beredning av FD-glukoslösningar med olika koncentrationer för experiment som visas i figur 2.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Den direkta jämförelsen av extracellulär FD-glukosutarmning med normaliserat intracellulärt glukosupptag i cellkulturen visade en hög korrelation, vilket tyder på att extracellulär glukosutarmning kan vara en surrogatmätning för bedömning av glukosupptag. Mätningen av extracellulär FD-glukos kan använda ett brett spektrum av FD-glukoskoncentrationer, även 0,5-2,5 μg FD-glukos / ml verkar ge det optimala intervallet. Extracellulär FD-glukos kräver inte normalisering till cellantal eller proteinkoncentrationer som är nödvändiga för intracellulärt FD-glukosupptag. Den förväntade begränsningen av extracellulära FD-glukosmätningar är undersökningen av reaktiva syreartsinducerande medel och spåren av blod i explantat som kan släcka fluorescens. Andra miljöfaktorer som påverkar fluorescens, såsom ljus, bör också beaktas. Förlängd hanteringstid som krävs vid användning av flera vävnadsexplantat kan äventyra vävnadens livskraft och glukosmetabolism. Detta kan vara en ytterligare begränsning. De utskurna vävnaderna måste vara i ett litet storleksintervall (50-300 mg) för att möjliggöra permeabiliteten hos glukos inuti vävnaden. Samtidig hantering av vävnader av flera operatörer kan minska hanteringstiden. Även om vi inte mätte glukosupptaget i vävnadsexplantaten, tyder de ackumulerade observationerna i odlade vävnadsexplantat på att de överlever i det glukosinnehållande mediet i upp till 17 dagar med den progressiva förlusten av funktionalitet33. I detta protokoll möjliggör den korta inkubationstiden för explants övervakning av glukosmetabolism i relativt funktionella vävnader. I vävnaderna med komplex cellulär organisation, såsom hjärnan, presenterar storleken en olöslig begränsning, eftersom sönderdelningen av komplex vävnad och resulterande celldöd påverkar glukosupptaget. Inkubationen av hjärnan i 24 timmar har emellertid tidigare använts för identifiering av endogen regleringsmekanism, vilket stöder relativ fysiologisk funktionalitet hos utskuren mushjärna i glukosinnehållande medium34. Oavsett kan det förenklade förfarandet och enkel åtkomst av extracellulär FD-glukos tillåta användning av denna analys i ett format med hög genomströmning. Jämförelsen av grundläggande och insulinstimulerad extracellulär FD-glukosutarmning tyder på att denna analys kan tillämpas för att identifiera humorala, näringsmässiga, patogena, miljöfaktorer eller läkemedel som reglerar glukosupptaget. Även om denna analys förenklar upptäckten, krävde resultaten validering med den kvantitativa radiomärkningen20 analysmetoder 21,22,23 och /eller avbildningsmetoder 5,24 för rigorös mekanistisk belysning av vägarna.

De kritiska stegen i detta protokoll inkluderar optimering av sammanflöde och fastetid som påverkar både basalt och stimulerat FD-glukosupptag. Dessa parametrar kan också påverkas av säsong baserat på författarnas observationer. Dessutom använder olika celltyper specifika mekanismer för glukosupptag inklusive olika glukostransportörer och reglerande hormon/ receptorinteraktioner 32,35,36. Därför måste andra positiva kontroller än insulin övervägas för cellkulturer som representerar andra vävnader än muskel- eller fettvävnad som regleras av insulin/GLUT4-axlar. Felsökningen inkluderar också justering av cellsammanflöde och optimering av tid för fasta / återmatning med FD-glukos. Dessutom kan känsligheten för extracellulär glukosmätning förbättras genom att minska nivåerna av extracellulär FD-glukos, med hänsyn till de tröskelnivåer som krävs för glukosupptag. Experimentet som beskrivs i figur 2 kan hjälpa forskare att anpassa denna analys för användning med andra cellkulturer eller felsökning.

Den inneboende variationen i glukosmetabolismen krävde också en högre provstorlek (n = 5-8). Även om extracellulära mätningar av FD-glukosförlust uppvisade samma noggrannhet som intracellulärt upptag av FD-glukos normaliserat av protein, kan normaliseringen minska analysvariationen. Förutom mätningen av proteinkoncentrationer kan mätningen av DNA-innehållet i cellen vara en annan tillförlitlig surrogatbedömning av cellnummer37.

Extracellulär FD-glukos är tillgänglig för kinetiska mätningar. Här har ett enkelt förfarande för kinetiska mätningar av extracellulär FD-glukos utvecklats för att identifiera organspecifika svar på mediatorer av glukosupptag. Dessa ex vitro-studier kan direkt testa organresponsen på olika stimuli in vivo som kombineras med organens exponering för FD-glukos och ex vivo-kinetiska mätningar, som visas i figur 3. Även om ex vivo-studier inte helt liknar in vivo-förhållanden , har de flera fördelar. Organexplantat upprätthåller komplex multicellulär primärcellsstruktur, till skillnad från odödliga cellkulturer som uppvisar förändrat genuttryck. Modern läkemedelsutveckling använder modellorganismer, indirekt bedömning av glukosupptag baserat på transkriptom eller metabolom22, omfattande insulinklämteknik38 eller dyr avbildning32. Även om mätning av extracellulär FD-glukos i explanterade organ inte kommer att ersätta dessa tekniker, kommer det att ge en snabb bedömning av förening, metabolit och gener för att underlätta upptäckten av nya terapeutiska mål som reglerar glukosupptaget på ett vävnadsspecifikt sätt. Utvecklingen av säkra terapier som behandlar glukosmetabolism i specifika vävnader kan erbjuda en lösning för cancer, demens, åldrande, diabetes, autoimmuna sjukdomar, fetma och andra relaterade applikationer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författare har inga problem att avslöja och har ingen intressekonflikt.

Acknowledgments

Projektet stöddes av Ralph och Marian Falk Medical Research Catalyst Award och Kathleen Kelly Award. Andra stöd inkluderade National Center for Research Resources UL1RR025755 och NCI P30CA16058 (OSUCCC), NIH Roadmap for Medical Research. Innehållet är enbart författarnas ansvar och representerar inte de officiella åsikterna från National Center for Research Resources eller NIH.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
3T3-L1 mouse fibroblasts ATCC CL-173 Cell line
96-well plates Falcon 353227 Plastic ware
B6.V-Lepob/J male mice Jackson Laboratory stock number 000632 Mice
BioTek Synergy H1 modular multimode microplate reader (Fisher Scientific, US) Fisher Scientific, US  B-SHT Device
Bovine serum Gibco/ThermoFisher 161790-060 Cell culture
Calf serum Gibco/ThermoFisher 26010-066 Cell culture
Cell incubator Forma Series II Water Jacket Device
Diet (mouse/rat diet, irradiated) Envigo Teklad LM-485 Diet
Dimethylsulfoxide (DMSO) Sigma LifeScience D2650-100mL Reagent
Dulbecco's Modified Eagle Medium Gibco/ThermoFisher  11965-092 Cell culture
Ethanol Sigma Aldrich E7023-500mL Reagent
Fluorescent 2-deoxy-2-[(7-nitro-2,1,3-benzoxadiazol-4-yl) amino]-D-glucose) Sigma 72987-1MG Assay
Glucose-free and phenol red-free DMEM Gibco/ThermoFisher A14430-01 Cell culture
Human insulin 10 mg/mL MilliporeSigma, Cat N 91077C Cat N 91077C Reagent
Isoflurane, 5% Henry Schein NDC 11695-6776-2 Anestaetic
Penicillin/streptomycin (P/S) Gibco/ThermoFisher 15140-122 Cell culture
Phosphate buffered solution Sigma-Aldrich DA537-500 mL Cell culture
Pierce bicinchoninic acid (BCA) protein assay ThermoFisher Cat N23225 Assay
Radioimmunoprecipitation assay lysis buffer Santa Cruz Biotechnology sc-24948 Assay
Trypsin-EDTA (0.05%) Gibco/ThermoFisher  25300-054 Cell culture

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Kyrtata, N., Emsley, H. C. A., Sparasci, O., Parkes, L. M., Dickie, B. R. A systematic review of glucose transport alterations in Alzheimer's disease. Frontiers in Neuroscience. 15, 568 (2021).
  2. Garcia-Carbonell, R., et al. Critical role of glucose metabolism in rheumatoid arthritis fibroblast-like synoviocytes. Arthritis Rheumatology. 68 (7), 1614-1626 (2016).
  3. Kumar, A., et al. Is diabetes mellitus associated with mortality and severity of COVID-19? A meta-analysis. Diabetes & Metabolic Syndrome: Clinical Research & Review. 14 (4), 535-545 (2020).
  4. Lee, J. H., et al. Different prognostic impact of glucose uptake in visceral adipose tissue according to sex in patients with colorectal cancer. Scientific Reports. 11 (1), 21556 (2021).
  5. Miner, M. W. G., et al. Comparison of: (2S,4R)-4-[(18)F]Fluoroglutamine, [(11)C]Methionine, and 2-Deoxy-2-[(18)F]Fluoro-D-Glucose and two small-animal PET/CT systems imaging rat gliomas. Frontiers in Oncology. 11 (18), 730358 (2021).
  6. Gumbiner, B., Thorburn, A. W., Ditzler, T. M., Bulacan, F., Henry, R. R. Role of impaired intracellular glucose metabolism in the insulin resistance of aging. Metabolism. 41 (10), 1115-1121 (1992).
  7. Ebrahimi, A. G., et al. Beta cell identity changes with mild hyperglycemia: Implications for function, growth, and vulnerability. Molecular Metabolism. 35, 100959 (2020).
  8. Ruberto, A. A., et al. KLF10 integrates circadian timing and sugar signaling to coordinate hepatic metabolism. Elife. 10, 65574 (2021).
  9. Stocks, B., Zierath, J. R. Post-translational modifications: The signals at the intersection of exercise, glucose uptake, and insulin sensitivity. Endocrinology Reviews. , (2021).
  10. World Health Organization. Global report on diabetes. World Health Organization. , (2016).
  11. Kolb, H., Martin, S. Environmental/lifestyle factors in the pathogenesis and prevention of type 2 diabetes. BMC Medicine. 15 (1), 131 (2017).
  12. Galicia-Garcia, U., et al. Pathophysiology of type 2 diabetes mellitus. International Journal of Molecular Science. 21 (17), 6275 (2020).
  13. Petrov, M. S., Basina, M. DIAGNOSIS OF ENDOCRINE DISEASE: Diagnosing and classifying diabetes in diseases of the exocrine pancreas. European Journal of Endocrinology. 184 (4), 151-163 (2021).
  14. Sirdah, M. M., Reading, N. S. Genetic predisposition in type 2 diabetes: A promising approach toward a personalized management of diabetes. Clinical Genetics. 98 (6), 525-547 (2020).
  15. Ramos-Lopez, O., Milagro, F. I., Riezu-Boj, J. I., Martinez, J. A. Epigenetic signatures underlying inflammation: an interplay of nutrition, physical activity, metabolic diseases, and environmental factors for personalized nutrition. Inflammation Research. 70 (1), 29-49 (2021).
  16. Yamamoto, N., et al. Measurement of glucose uptake in cultured cells. Current Protocols in Pharmacology. 71 (1), 12-14 (2015).
  17. Yang, L., et al. A sensitive and simple HPLC-FLD-based method for the measurement of intracellular glucose uptake. Food Chemistry. 372, 131218 (2021).
  18. Lee, A., et al. Amino acid-based compound activates atypical PKC and leptin receptor pathways to improve glycemia and anxiety like behavior in diabetic mice. Biomaterials. 239, 119839 (2020).
  19. Shukla, S. K., Mulder, S. E., Singh, P. K. Hypoxia-mediated in vivo tumor glucose uptake measurement and analysis. Methods in Molecular Biology. 1742, 107-113 (2018).
  20. Jakson, I., Ujvari, D., Brusell Gidlof, S., Linden Hirschberg, A. Insulin regulation of solute carrier family 2 member 1 (glucose transporter 1) expression and glucose uptake in decidualizing human endometrial stromal cells: an in vitro study. Reproductive Biology and Endocrinology. 18 (1), 117 (2020).
  21. Saparbaev, E., et al. Identification and quantification of any isoforms of carbohydrates by 2D UV-MS fingerprinting of cold ions. Analytical Chemistry. 92 (21), 14624-14632 (2020).
  22. Schulz, A., et al. Targeted metabolomics of pellicle and saliva in children with different caries activity. Scientific Reports. 10 (1), 697 (2020).
  23. Shulman, R. G. Nuclear magnetic resonance studies of glucose metabolism in non-insulin-dependent diabetes mellitus subjects. Molecular Medicine. 2 (5), 533-540 (1996).
  24. Cochran, B. J., et al. In vivo PET imaging with [(18)F]FDG to explain improved glucose uptake in an apolipoprotein A-I treated mouse model of diabetes. Diabetologia. 59 (18), 1977-1984 (2016).
  25. Lloyd, P. G., Hardin, C. D., Sturek, M. Examining glucose transport in single vascular smooth muscle cells with a fluorescent glucose analog. Physiological Research. 48 (6), 401-410 (1999).
  26. Beeton, C., Garcia, A., Chandy, K. G. Drawing blood from rats through the saphenous vein and by cardiac puncture. Journal of Visualized Experiments. (7), e266 (2007).
  27. DiSilvestro, D. J., et al. Leptin production by encapsulated adipocytes increases brown fat, decreases resistin, and improves glucose intolerance in obese mice. PLoS One. 11 (4), 0153198 (2016).
  28. Friedman, J. M. Leptin and the endocrine control of energy balance. Nature Metabolism. 1 (8), 754-764 (2019).
  29. Guillam, M. T., Burcelin, R., Thorens, B. Normal hepatic glucose production in the absence of GLUT2 reveals an alternative pathway for glucose release from hepatocytes. Proceedings of the National Academy of Sciences. 95 (21), USA. 12317-12321 (1998).
  30. Guillam, M. T., et al. Early diabetes and abnormal postnatal pancreatic islet development in mice lacking Glut-2. Nature Genetics. 17 (3), 327-330 (1997).
  31. Barros, L. F., et al. Kinetic validation of 6-NBDG as a probe for the glucose transporter GLUT1 in astrocytes. Journal of Neurochemistry. 109, 94-100 (2009).
  32. Sprinz, C., et al. Effects of blood glucose level on 18F-FDG uptake for PET/CT in normal organs: A systematic review. PLoS One. 13 (2), 0193140 (2018).
  33. Johnson, T. V., Martin, K. R. Development and characterization of an adult retinal explant organotypic tissue culture system as an in vitro intraocular stem cell transplantation model. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 49 (8), 3503-3512 (2008).
  34. de Urquiza, A. M., et al. Docosahexaenoic acid, a ligand for the retinoid X receptor in mouse brain. Science. 290 (5499), 2140-2144 (2000).
  35. Olson, A. L., Pessin, J. E. Structure, function, and regulation of the mammalian facilitative glucose transporter gene family. Annual Review of Nutrition. 16 (1), 235-256 (1996).
  36. Muhanna, D., Arnipalli, S. R., Kumar, S. B., Ziouzenkova, O. Osmotic adaptation by Na(+)-dependent transporters and ACE2: correlation with hemostatic crisis in COVID-19. Biomedicines. 8 (11), 460 (2020).
  37. Ligasova, A., Koberna, K. DNA dyes-highly sensitive reporters of cell quantification: comparison with other cell quantification methods. Molecules. 26 (18), 5515 (2021).
  38. DeFronzo, R. A., Tobin, J. D., Andres, R. Glucose clamp technique: a method for quantifying insulin secretion and resistance. American Journal of Physiology. 237 (3), 214-223 (1979).

Tags

Biokemi utgåva 182
Extracellulär glukosutarmning som ett indirekt mått på glukosupptag i celler och vävnader <em>ex vivo</em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Kumar, S. B., Arnipalli, S.,… More

Kumar, S. B., Arnipalli, S., Abushukur, A., Carrau, S., Mehta, P., Ziouzenkova, O. Extracellular Glucose Depletion as an Indirect Measure of Glucose Uptake in Cells and Tissues Ex Vivo. J. Vis. Exp. (182), e63681, doi:10.3791/63681 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter