Summary
이 프로토콜은 오류가 발생하기 쉬운 PCR과 역유전학을 사용하여 전장 돌연변이 RNA 합성을 결합하여 C형 간염 바이러스 게놈에 제어 가능한 유전적 다양성을 도입하는 방법을 설명합니다. 이 방법은 표현형 선택을 위한 모델을 제공하며 10kb 길이의 양성 감지 RNA 바이러스 게놈에 사용할 수 있습니다.
Abstract
다양한 전장 바이러스 변이체의 반복 생성을 위한 편리한 방법이 없기 때문에 RNA 바이러스의 유도 진화 연구가 방해를 받고 있습니다. 전체 RNA 게놈 오류가 발생하기 쉬운 PCR과 역유전학을 통합함으로써 무작위 게놈 전체 치환 돌연변이 유발을 유도할 수 있습니다. 우리는 이 기술을 사용하여 다양한 라이브러리를 합성하여 관심 표현형을 가진 바이러스 돌연변이를 식별하는 방법을 개발했습니다. 전장 돌연변이 RNA 합성(FL-MRS)이라고 하는 이 방법은 다음과 같은 이점을 제공합니다: (i) 매우 효율적인 원스텝 오류가 발생하기 쉬운 PCR을 통해 대규모 라이브러리를 생성할 수 있는 능력; (ii) DNA 중합효소의 충실도를 조작하여 다양한 수준의 유전적 다양성을 가진 라이브러리 그룹을 만드는 능력; (iii) 돌연변이 RNA 합성을 위한 주형으로서 직접 작용할 수 있는 전장 PCR 산물의 생성; (iv) 원하는 표현형의 바이러스 돌연변이를 스크리닝하기 위해 선택되지 않은 입력 풀로 숙주 세포에 전달될 수 있는 RNA를 생성하는 능력. 우리는 역유전학 접근법을 사용하여 FL-MRS가 C형 간염 바이러스인 JFH1 분리물의 수명 주기의 모든 단계에서 바이러스 지향 진화를 연구할 수 있는 신뢰할 수 있는 도구라는 것을 발견했습니다. 이 기술은 양성 RNA 바이러스의 발병 기전 및 항바이러스 내성에서 바이러스 유전자의 적응, 복제 및 역할을 이해하기 위해 유도 진화를 사용하는 데 매우 유용한 도구인 것으로 보입니다.
Introduction
전방 유전자 스크리닝은 관심 있는 바이러스 표현형으로 시작한 다음 게놈의 염기서열을 분석하고 원래 균주의 표현형과 비교하여 해당 표현형을 유발하는 돌연변이를 식별하려고 시도합니다. 대조적으로, 역 유전자 스크리닝에서는 표적 유전자에 무작위 돌연변이가 도입된 후 결과 표현형을 검사합니다1. 역유전학 접근법의 경우, 시험관 내 돌연변이 유발은 관심 표현형을 연속적으로 스크리닝하는 변이체 풀을 만드는 데 가장 널리 사용되는 기술입니다. 오류가 발생하기 쉬운 PCR(ep-PCR)2,3, 원형 중합효소 확장4 및 Mu-transposon 삽입 돌연변이 유발 5,6,7을 포함하여 RNA 바이러스의 게놈 전체 무작위 돌연변이 유발을 달성하기 위한 다양한 유전 도구가 보고되었습니다. 후자의 두 가지 방법은 제한된 염기서열 다양성을 가진 라이브러리를 생성하고 바이러스에 매우 치명적이며 감염성 바이러스 변이체의 회복을 심각하게 제한하는 대규모 삽입 및 결실이 도입되기 쉽습니다.
ep-PCR은 향상된 열 안정성, 기질 특이성 및 촉매 활성 8,9,10과 같은 원하는 특성을 가진 표현형을 선택하기 위한 돌연변이 효소를 생성하기 위해 단백질 공학에서 널리 사용되는 잘 알려진 강력한 돌연변이 유발 기술입니다. 이 기술은 간단한 장비가 필요하고 지루한 조작이 필요하지 않으며 상업적으로 이용 가능한 시약을 사용하고 빠르기 때문에 수행하기 쉽습니다. 또한 고품질 라이브러리를 생성합니다.
여기서는 무작위 게놈 전체 치환 돌연변이 유발 및 역유전학을 유도하는 ep-PCR을 통합하여 C형 간염 바이러스(HCV)의 완전한 게놈을 생성하는 전장 돌연변이 RNA 합성(FL-MRS)을 위한 새로운 방법을 개발했습니다. 단일 뉴클레오티드 삽입 또는 결실조차도 양성 감지 RNA 바이러스([+]ssRNA)에 매우 해롭습니다. 따라서 PCR 기반 치환 돌연변이 유발은 생존력이 우수한 전체 (+)ss RNA 바이러스 게놈의 크고 다양한 라이브러리의 반복 생성에 선호되는 방법입니다.
FL-MRS는 바이러스 cDNA 클론에 결합하는 프라이머 세트의 세심한 설계를 통해 ~10kb 게놈 길이의 모든 양성 RNA 바이러스에 적용할 수 있는 간단한 접근 방식입니다. pJFH1은 HCV 유전자형 2a를 암호화하고 바이러스 수명 주기의 모든 단계를 재현할 수 있는 감염성 cDNA 클론입니다. FL-MRS 접근법을 사용하여 무작위로 돌연변이화된 전체 게놈 라이브러리(돌연변이 라이브러리[ML])를 합성하여 돌연변이와 관련된 특성에 대한 사전 지식이 없는 복제 가능한 JFH1 변이체를 생성하는 것을 입증했습니다. 항바이러스제에 노출된 일부 바이러스 변이체는 원하는 표현형 변화로 약물 압력을 빠르게 극복했습니다. 여기에 설명된 프로토콜을 사용하면 과다한 바이러스 변이체를 생성할 수 있어 (+)ssRNA 바이러스의 진화를 연구할 수 있는 기회를 얻을 수 있습니다.
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Protocol
참고: 여기에 사용된 JFH1 균주(WT)는 국립 전염병 연구소의 와키타 타카지 씨가 친절하게 선물한 것입니다. 인간 간종 세포주(Huh7.5)는 록펠러 대학의 찰스 라이스(Charles Rice)가 선물한 것입니다. 이 방법의 개략도는 그림 1에 나와 있습니다.
1. 오류가 발생하기 쉬운 PCR을 이용한 JFH1의 게놈 전체 치환 돌연변이 유발
- ep-PCR을 수행하려면 pJFH1 주형(JFH1 균주에서 분리된 플라스미드)이 없는 표 1에 설명된 반응 성분과 함께 프라이머 J-For 5'-GTTTTCCCAGTCAGCACGTTGTAAAACGACGGC-3' 및 J-Rev 5'-CATGATCTGCAGAGAGACCAGTTACGGCACTCTC -3'(그림 1A)을 사용하여 4세트의 실험을 위한 마스터 믹스를 준비합니다.
- 마스터 혼합물을 4개의 튜브에 분취하고, 100ng, 50ng, 25ng 및 10ng의 템플릿을 개별 튜브에 추가하고, 반응의 총 부피를 50μL로 조정합니다. 표 2에 설명된 순환 조건을 적용하여 T7 프로모터 및 전장 HCV 게놈을 포함하는 9736 염기쌍(bp) 단편을 증폭합니다(그림 2).
참고: ep-PCR 산물은 바이러스 게놈의 in vitro transcription을 용이하게 하기 위해 T7 promoter 서열을 포함해야 합니다. 그러므로, 순방향 프라이머는 바이러스 cDNA 클론의 T7 프로모터의 상류에 위치해야 하며, 역방향 프라이머 서열은 전사 유출을 용이하게 하기 위해 바이러스 게놈의 3'-말단에서 끝나야 합니다. 높은 수율 증폭을 달성하기 위해 Taq DNA 중합효소 제조업체에서 권장하는 범위 내에서 ep-PCR 반응의 각 성분을 최적화합니다. 다양한 템플릿 양 외에도 불균형 dNTP(특히 낮은 dATP 및/또는 dGTP 농도)를 사용하여 바이러스 게놈 길이의 다양성을 6-8kb 길이로 증가시킬 수있습니다 3. - 동일한 부피의 PCR 산물(5μL)을 로딩하고 0.8% 트리스-아세테이트-EDTA(TAE)-기반 아가로스 겔 전기영동을 실행하여 알려진 양의 1킬로베이스(kb) DNA 사다리와 비교하여 증폭된 ep-PCR 산물을 추정합니다11. 제조업체의 지시에 따라 컬럼 정제 키트를 사용하여 제품을 정제하십시오.
- 마이크로볼륨 분광광도계(12)를 이용하여 260nm에서 흡광도를 측정하여 정제된 생성물의 농도를 추정한다. 필요한 경우 ep-PCR 산물을 진공 농축하여 제품 농도≥100ng/μL를 얻습니다.
참고: ep-PCR 산물의 2중 연속 희석액을 로드하고 그 강도를 알려진 1kb DNA ladder 양과 비교하여 보다 정확한 추정을 할 수 있습니다.
2. 바이러스 RNA 합성
- 40μL 반응을 설정하여 37°C에서 2시간 동안 5μg의 클론-pJFH1을 4U의 XbaI 효소와 함께 분해한 후 컬럼을 정제하고 260nm에서 마이크로볼륨 분광광도계(12)에서 흡광도를 측정합니다. 제조업체의 지침에 따라 상업적으로 이용 가능한 대규모 RNA 생산 시스템을 사용하여 컬럼 정제된 ep-PCR 산물 또는 클론-pJFH1(WT)의 20μL 시험관 내 전사 반응을 설정합니다.
- 200μL 마이크로 원심분리 튜브에서 정제된 ep-PCR 산물(돌연변이 라이브러리) 또는 XbaI 분해 클론-pJFH1 약 1μg, 리보뉴클레오티드를 함유한 2x 완충액 10μL 및 T7 효소 혼합물 2μL를 혼합합니다. 모든 구성 요소를 혼합하고 구성 요소를 간략하게 회전시킵니다. 반응 혼합물을 37°C에서 45분 동안 배양한 후 1U RNase-free DNase 효소를 추가하고 37°C에서 30분 동안 배양합니다(그림 1C).
- 제조업체의 지침에 따라 RNA 클린업 키트를 사용하여 시험관 내에서 합성된 RNA를 정제하고, 40μL의 RNase 및 DNase가 없는 물에서 용출하고, 마이크로볼륨 분광광도계(12)를 사용하여 260nm에서 흡광도를 측정하여 정제된 RNA의 농도를 추정합니다. 동결-해동을 방지하기 위해 필요에 따라 부분 표본(5μg 또는 2μg)을 만들고 -80°C에서 보관합니다. MOPS 포름알데히드 0.8% 아가로스 겔 전기영동13 에 대해 2μg의 RNA를 사용하여 바이러스 전사체의 무결성과 크기를 확인합니다(그림 3).
3. ep-PCR 산물의 돌연변이 비율 추정(mutant library)
참고: 이 단계에서, 뉴클레오티드의 비율은 단계 2에서 수득한 산물을 서브클로닝하여 돌연변이를 일으켰다. 두 개의 전체 게놈 돌연변이 라이브러리(ML50 및 ML25)와 클론 pJFH1 유래 바이러스 RNA를 사용하여 유전적 이질성을 생성하기 위해 ep-PCR을 사용하는 이점을 입증하는 것으로 추정되었습니다. 돌연변이의 비율은 HCV NS5A 유전자에서 추정되었으며, 이 유전자는 이 연구에서 표현형 판독 유전자(약물 내성)이기도 했습니다.
- 제조업체의 권장 사항에 따라 2단계에서 합성된 바이러스 RNA 약 1μg, 5μM 역프라이머 5'-GTGTACCTAGTGTGTGCCGCTCTA-3' 및 200U 역전사 효소를 추가하여 20μL cDNA 합성 반응을 설정합니다.
- cDNA를 사용하여 완전한 NS5A 유전자를 구성하는 2571bp 단편을 증폭합니다. 이를 위해 5272F 및 7848R 프라이머에 대해 0.5μM를 포함하는 반응 혼합물을 준비합니다(최종 농도; 표 3), 총 부피 50μL에서 1.5mMMgCl2, 1x PCR 완충액 및 1U 고충실도 Taq 중합효소를 사용하고 표 4에 기재된 조건을 사용하여 증폭 사이클을 실행한다.
- 0.8% TAE 기반 아가로스 겔에 제품을 실행하여 2571bp의 제품 크기를 확인한 다음 제조업체의 지시에 따라 컬럼 정제 키트를 사용하여 제품을 정제합니다. 컬럼 정제 제품을 40μL의 멸균수에 용리합니다.
- 제품에 3'A 돌출부를 추가하려면 0.5μM dATP와 1U의 저충실도 Taq DNA 중합효소를 추가하고 전체 PCR 산물을 70°C에서 30분 동안 1x PCR 완충액 및 1.5mM MgCl2 (최종 농도)와 함께 배양합니다. 제조업체의 지시에 따라 컬럼 정제 키트를 사용하여 혼합물을 정제합니다.
참고: 또는 9.7단계의 겔에서 ~1.4kb 길이의 제품을 절제합니다. 제조업체의 지침에 따라 long-PCR 산물의 클로닝을 위해 시판되는 키트를 사용하여 클로닝을 수행하거나 Illumina 플랫폼2를 사용하여 ep-PCR 산물의 NGS를 수행합니다. - 5μL의 2x ligation buffer, 50ng의 T-vector DNA, 3.4단계에서 합성된 삽입 DNA의 약 3배 몰 초과, T4 DNA ligase의 Weiss 단위 3개 및 nuclease가 없는 물을 총 부피 10μL로 첨가하여 연결 반응을 설정합니다. 이 반응을 실온에서 3시간 동안 배양한 다음 100μL의 대장균 DH5α를 결찰된 DNA와 함께 첨가합니다. 42°C에서 35초 동안 셀에 열 충격을 가합니다(그림 1B).
- Luria-Bertani (LB) 배지 1mL(항생제 제외)를 넣고 회복을 위해 37°C에서 1시간 동안 부드럽게 흔들어 배양합니다. 셀 현탁액을 13,800 x g에서 원심분리하고, 상층액을 버리고, 200μL의 신선한 LB 배지에 재현탁시킵니다.
- 형질전환된 대장균 DH5α 세포 100μL를 50μg/mL 암피실린이 함유된 LB 플레이트에 담고 37°C에서 16시간 동안 배양합니다. 5mL의 LB 배지 + 50μg/mL 암피실린에 25-30개의 콜로니로 구성된 미니프렙을 설정하고 37°C에서 밤새 성장시킵니다.
- 다음 날, 제조업체의 지침에 따라 플라스미드 정제 키트로 플라스미드를 추출하고 모든 콜로니에 대해 200ng의 분리된 플라스미드, 2U의 EcoR1 및 1x 제한 완충액을 사용하여 10μL 부피의 제한 효소 분해를 수행합니다.
- 분해 혼합물을 37°C에서 3시간 동안 배양한 후, 0.8% TAE 기반 아가로스 겔에서 산물을 분리하여 플라스미드 DNA 삽입을 확인합니다.
- M13 Forward, M13 reverse, 6208-SPF 및 6748-SPF primer(표 3)를 사용하여 25개의 양성 클론의 플라스미드에 대한 Sanger 염기서열분석을 수행하여 라이브러리 및 클론 pJFH1에서 유래한 바이러스 RNA에서 돌연변이의 비율(돌연변이된 뉴클레오티드의 비율로 표현)을 결정합니다(그림 1B 및 그림 4).
4. Huh7.5 세포주의 바이러스 RNA transfection
참고: RNase/DNase-free 조직 배양 물질을 사용하고 멸균 클래스 II 생물 안전 작업대에서 작업하십시오. 조직의 생물안전 지침에 따라 권장된 격리 시설에서 일한다.
- 10%(vol/vol) 소 태아 혈청, 페니실린(100U/mL) 및 스트렙토마이신(100μg/mL; 그림 1D).
- 밀도가 1%에 도달하면 셀을 3:90 비율로 분할합니다. 1x 예열된 인산염 완충 식염수(PBS, pH 7.4)로 세포를 세척합니다. 5mL의 1x 트립신-EDTA 용액을 추가하여 세포층을 완전히 덮고 플라스크를 부드럽게 휘젓은 다음 플라스크를 37°C에서 5분 동안 배양합니다.
알림: 배양 시간은 다를 수 있습니다. 세포층이 세포 배양 플라스크 표면에서 완전히 분리될 때까지 세포를 배양합니다. - 10mL의 1x 예열된 complete DMEM을 추가하고, 반복 피펫팅으로 세포를 분산시킨 다음, 15mL 또는 50mL 멸균 원심분리 튜브에 세포 현탁액을 수집합니다. 셀 현탁액을 실온에서 252 x g에서 5분 동안 원심분리합니다. 상층액을 버리고 세포 펠릿을 6mL의 완전한 DMEM에 재현탁시킨 다음 37°C에서 5%CO2로 가습된 인큐베이터에서 세포를 배양합니다.
- naive, transfection, 바이러스에 감염된 Huh7.5 세포의 지속적인 유지를 위해 4.2단계를 반복합니다. 및 4.3단계.
- 형질주입 1일 전, 4.1.-4.3단계에 설명된 대로 세포를 분할하고, 혈구측정기를 사용하여 생존 가능한 세포의 수를 계산하고, Huh7.5 세포를 2mL의 완전한 DMEM에 35mm 접시에 0.6 x 106 밀도로 파종하고, 37°C에서 5%CO2로 가습된 인큐베이터에서 세포를 배양합니다.
- 다음 날, 전사체-지질 복합체를 준비합니다. 이를 위해 50μL의 최소 필수 배지에 10μL의 transfection 시약을 희석하고, 5μL의 최소 필수 배지에 5μg의 바이러스 전사체를 별도로 희석합니다.
- 두 혼합물을 실온에서 10분 동안 배양한 다음 단일 멸균 마이크로 원심분리기 튜브에 혼합하고 혼합물을 실온에서 30분 동안 추가로 배양하여 전사체-지질 복합체를 형성합니다.
- 세포 배양 16시간 후 배양 접시에서 배양 배지를 제거하고 예열된 1x PBS로 세포를 2배 세척하고 최소 필수 배지 1.5mL를 추가합니다. 전사지질 복합체를 접시에 천천히 추가하고 복합체가 균일하게 분포되도록 손으로 부드럽게 휘젓습니다.
- 37°C의 5%CO2 인큐베이터에서 10시간 동안 세포를 배양합니다. 그런 다음 배지를 제거하고 transfection된 세포를 1mL의 예열된 1x PBS로 2회 세척하고 2mL의 완전한 DMEM을 추가합니다.
5. 바이러스 생산
- 형질주입된 Huh7.5 세포를 2일마다 또는 90% 밀도에 도달하면 3일마다 분할합니다. 분할할 때마다 바이러스 상층액을 수집하고 추가 분석을 위해 -80°C에서 보관합니다.
- 분할할 때마다 6.2단계에 설명된 대로 초점 형성 분석(FFA)을 사용하여 바이러스의 확산을 모니터링합니다. 바이러스 확산이 transfection된 세포의 >80%에 도달할 때까지 바이러스를 채취합니다(그림 1D).
참고: transfection된 세포를 처음 몇 개의 통로에 대해 1:1 비율로 분할하여 바이러스 변이체의 최대 수를 구제합니다. 바이러스 확산은 전체 게놈 ML에서 돌연변이의 비율이 증가함에 따라 느려지고 생존력이 감소합니다2.
6. 바이러스 역가의 정량 분석
- 바이러스 RNA의 정량 분석
- 제조업체의 지침에 따라 바이러스 RNA 분리 키트를 사용하여 140μL의 배양 상층액에서 바이러스 RNA를 분리합니다.
- 제조업체의 지침에 따라 상용 qRT-PCR 키트를 사용하여 10μL qRT-PCR 반응을 설정합니다. HCV RNA 정량화를 위해 정방향 프라이머 R6-130-S17, 역방향 프라이머 R6-290-R19(각각 최종 농도 0.2μM) 및 프로브 R9-148-S21FT(최종 농도 0.3μM)를 사용합니다(표 3). 실행 조건을 48분 동안 20°C, 95분 동안 10°C로 설정한 다음 45초 동안 95°C, 1분 동안 60°C의 1주기로 설정합니다.
알림: 프로브는 형광 리포터 염료 6-카르복시플루오레세인(FAM)과 담금질 염료 6-카르복시-테트라메틸-로다민(TAMRA)을 각각 5' 및 3' 끝에 포함해야 합니다. - Real-Time PCR 기계에서 반응을 실행합니다. 교차 오염이 없도록 하기 위해 모의 감염 세포의 상층액에서 추출한 RNA와 뉴클레아제가 없는 물을 동시에 설정하는 음성 대조군을 설정합니다.
- 이와 동시에 바이러스 RNA의 정량화를 위해 10배 연속적으로 희석된 알려진 HCV 전사체 복제 수(1 x 108 대 0)를 사용하여 표준 곡선을 생성합니다. 정량화를 세 번에 걸쳐 수행합니다(그림 1D).
- 50% 조직 배양 감염 선량(TCID50)을 사용한 감염성 바이러스 역가 정량
- 바이러스를 추가하기 약 16시간 전에 6.5 x 103 Huh7.5 세포/웰을 96웰 플레이트에 담고 37°C에서 5%CO2 인큐베이터에서 세포를 배양합니다.
- 생물 안전 등급 II 캐비닛에서 수확한 바이러스의 1 x 10−1 내지 1 x 10−6 희석액(8회 희석)을 포함하는 10배 연속 희석(각각 1mL)을 수행합니다(바이러스 확산이 5단계에서 설명한 대로 세포의 >80%에 도달할 때 획득). 희석된 바이러스를 100μL/well(8회 복제)을 추가하여 Huh7.5 세포를 감염시키고 플레이트를 37°C의 인큐베이터에서 5%CO2로 3일 동안 유지합니다.
- 3일 후, 매번 0.1mL의 PBS로 감염된 세포를 3회 세척하고, -20°C에서 20분 동안 0.1mL의 얼음처럼 차가운 메탄올로 세포를 고정하고 투과시킵니다. 1x PBS 3x로 웰을 세척한 다음 PBS-T(1x PBS/0.1% [v/v] Tween-20)로 1x 세척합니다.
- PBS-T를 제거한 후 PBST에 0.2% 탈지유를 함유한 1% 소 혈청 알부민(BSA) 0.1mL로 실온에서 30분 동안 세포를 차단합니다. 차단 용액을 제거하고 1x PBS에서 제조된 0.1mL의 3%H2O2로 세포를 5분 동안 처리합니다.
- 다시 말하지만, 1x PBS로 2배, PBS-T로 1x 세포를 세척한 다음 항-NS5A 9E10mAb 50μL/웰(1:10000, 스톡 1mg/mL, Charles Rice, The Rockefeller University의 친절한 선물)을 추가하고 실온에서 1시간 동안 배양합니다. 우물을 다시 3x PBS로 1번, PBS-T로 1번 세척합니다.
- 50μL/웰의 HRP-conjugated goat anti-mouse secondary IgG(1:4000)를 추가하고 실온에서 30분 동안 배양한 다음 1x PBS 0.1mL로 웰을 세척하여 결합되지 않은 항체를 제거합니다.
- 30μL의 DAB(디아미노벤지딘 테트라하이드로클로라이드) 컬러 기질을 추가하고 실온에서 10분 동안 부드럽게 흔들면서 플레이트를 배양합니다. 기질은 웰 표면에 HCV NS5A 항원을 나타내는 갈색 침전물을 발생시킵니다. DAB 용액을 제거하고 우물을 2x PBS로 1번, 증류수로 1번 세척합니다. 0.03% 아지드화나트륨을 함유한 PBS 100μL를 추가합니다.
- 10x 대물렌즈를 사용하여 도립 광학 현미경으로 각 웰을 검사합니다. 양의 우물 수를 셉니다. 우물에 하나 이상의 NS5A 양성 세포가 포함되어 있으면 양수입니다. 웰에 NS5A 양성 세포가 없으면 음성입니다. Reed and Muench 계산기를 사용하여 웰의 50%를 감염시키는 종말점 희석을 추정합니다(TCID50)14,15. TCID50을 수득하는 데 필요한 희석액의 역수는 단위 부피당 바이러스 감염성 역가(초점 형성 단위)입니다.
참고: 바이러스 감염성 역가는 돌연변이 라이브러리에 따라 다릅니다.
7. 약물 내성 바이러스 변이체 선택
- NS5A 억제제인 pibrentasvir(PIB)를 100% DMSO에 1mM 농도로 용해시키고 완전 DMEM에서 10nM 농도로 더 희석합니다.
- PIB의 50% 유효 농도를 측정하기 위해 Huh7.5 세포를 6웰 플레이트에 0.6 x 106/웰 밀도로 파종하고 37°C에서 5%CO2 인큐베이터에서 세포를 배양합니다. 세포 배양 16시간 후 ML50 또는 클론 JFH1 바이러스의 바이러스 용량을 추가하여 세포의 50%를 감염시킨 다음 감염 후 12시간(h p.i.)에 0.5-100pM 범위의 PIB를 2배 희석하여 세포를 처리합니다. 6.2단계에서와 같이 FFA를 측정하고 FFU를 정량화합니다. 배양 3일 후.
- 통계 분석 소프트웨어에서 FFU-환원 분석 값을 사용하여 용량-반응 곡선을 플로팅합니다. 시그모이드 곡선에서 50% 유효 농도(EC50; 그림 5).
참고: 유효 농도 범위는 종류, 동일한 계열의 HCV 항바이러스제 간, 돌연변이 라이브러리에 따라 다를 수 있습니다. - 실험을 위해 ML50 바이러스(ML50 RNA에서 파생된 변이체) 용량으로 70% 합류하여 naive Huh7.5 세포를 감염시켜 12시간 동안 세포의 50%를 감염시킨 다음 감염된 세포를 감염 후 24시간 후에 6웰 플레이트로 옮깁니다.
- 세포 분할 16시간 후 감염된 세포에 1x EC50 PIB(47.3 pM)를 추가합니다. 모든 세포가 6회 연속 통과(18일) 후 3회 무약물 통과 주기를 거친 후 이 작업을 수행하고 6.2단계에서 설명한 대로 FFA를 사용하여 바이러스 확산을 모니터링합니다. 성장 영역에 따라 FFA 시약을 확장합니다. 각 통로에서 바이러스 상층액을 채취하고 사용할 때까지 -80°C에서 보관합니다.
참고: 치료 추적 관찰 중 세포의 50% 이상으로의 바이러스 확산은 돌파구로 정의될 수 있으며, 약물 회수 기간 동안의 바이러스 확산은 바이러스 재발로 정의될 수 있다16. - 6.1.1단계에서 설명한 대로 18일에 상층액에서 바이러스 RNA를 추출한 다음 3.1단계에 표시된 대로 cDNA를 합성합니다. 5μL의 1:5 희석된 cDNA와 3.2단계에서 설명한 PCR 성분을 사용하여 NS5A 유전자를 증폭합니다. 그런 다음 3.3.-3.5단계를 수행합니다. NS5A 염기서열분석 프라이머 6186F, 6862F 및 6460R을 사용하여 6-8개의 양성 박테리아 플라스미드에서 NS5A 약물 내성 돌연변이를 측정합니다(표 3 및 표 4).
참고: 이 연구에서는 1x EC50에서 PIB 처리 중에 선택된 변이체의 NS5A 치환을 보고했습니다. 이것은 PIB에 대한 감수성 감소에 대한 NS5A 이외의 치환의 기여를 배제합니다.
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Representative Results
그림 1에 설명된 절차에 따라 다양한 전장 HCV 변이체를 생성하고 관심 약물 내성 표현형을 스크리닝할 수 있습니다. 전체 게놈 돌연변이 라이브러리는 그림 2와 같이 감소량(100-10ng)으로 clonal-pJFH1을 사용하여 합성되었습니다. ep-PCR 산물(돌연변이 라이브러리)의 평균 수율은 3.8-12.5ng/μL 범위였습니다. 그림 3은 클론-pJFH1 및 대표적인 돌연변이 라이브러리(클론-pJFH1 50ng를 사용하여 합성된 ML50)에서 합성된 바이러스 전사체를 보여줍니다. clonal-pJFH1은 XbaI 분해를 통해 선형화되었고, ML50은 시험관 내 전사 반응에 직접 사용되었습니다. 그림 4와 같이 ep-PCR 반응에서 입력 pJFH1이 감소함에 따라 돌연변이 라이브러리(돌연변이 바이러스 RNA)의 돌연변이 비율이 증가했습니다. 50ng의 주형(clonal-pJFH1)을 사용하여 합성된 ML50은 10,000bp 복사당 4개의 치환을 가한 반면, 25ng의 주형을 사용하여 합성한 ML25는 9개의 치환을 가지고 있었습니다. 염기서열분석된 뉴클레오티드의 수 내에서 어떠한 치환도 클로날-pJFH1에서 발견되지 않았다. ML50 바이러스 변이체는 그림 5와 같이 클론-JFH1 바이러스에 비해 NS5A 억제제인 피브렌타스비르에 대한 감수성이 12.7배 낮았습니다. 표 5는 피브렌타스비르 처리의 1x EC50에 대해 선택된 ML50 바이러스 변이체에서 확인된 NS5A 치환을 나타낸 것이다. 8개의 NS5A 클론 중 4개는 D7V+F28C의 조합을 가지고 있는 반면, V8A+F28C 및 F36L은 각각 하나의 클론에서 발생했다. 이러한 돌연변이는 NS5A의 N-말단 부위에 있었으며, 이는 임상적으로 관련된 NS5A-내성 돌연변이17을 보유하고 있는 것으로 알려져 있다.
그림 1: FL-MRS 전략 및 약물 내성 표현형 선택의 개략도. (A) pJFH1 cDNA(야생형) 클론은 전장 유전자형 2a 바이러스 게놈 및 T7 프로모터를 운반합니다. 프라이머 J-For는 T7 프로모터의 업스트림에 있고, 프라이머 J-Rev는 HCV 게놈의 3' 말단에 위치합니다. (B) Clonal-pJFH1은 오류가 발생하기 쉬운 PCR을 사용하여 무작위로 돌연변이화되어 유전적 변이를 엔지니어링하고 전체 게놈 돌연변이 라이브러리를 생성합니다. Clonal-pJFH1은 XbaI 분해에 의해 선형화됩니다. (C) 전체 게놈 ep-PCR 산물 및 선형화된 클론-pJFH1은 in vitro transcription을 위한 템플릿입니다. ML 및 클론-JFH1의 바이러스 RNA에서 돌연변이의 비율은 NS5A의 TA 서브클로닝 및 양성 TA 클론의 Sanger 시퀀싱에 의해 결정되었습니다. (D) Huh7.5 세포의 돌연변이 바이러스 RNA 형질주입 후 생성된 복제 가능 변이체를 NS5A 내성 표현형의 선택을 위해 pibrentasvir(NS5A 억제제)로 처리했습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: ep-PCR 산물의 아가로스 겔 전기영동. 다양한 템플릿 양(pJFH1의 100ng, 50ng, 25ng 및 10ng)을 사용하여 합성된 HCV 전체 게놈 ep-PCR 산물을 0.8% TAE 아가로스 겔 전기영동을 사용하여 분리했습니다. ep-PCR 산물의 예상 크기는 9.7kb입니다. 분리된 생성물은 에티듐 브로마이드 염색에 의해 시각화되었습니다. 레인 1은 1kb DNA 사다리입니다. 레인 6은 템플릿이 없는 제어(H2O로 표시됨)입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 바이러스 전사체의 MOPS 포름알데히드 아가로스 겔 전기영동. 선형화된 pJFH1(레인 2) 및 ep-PCR(레인 3)을 포함하는 pJFH1 50ng(ML50)로 수득한 돌연변이 라이브러리를 시험관 내 전사 반응의 템플릿으로 사용했습니다. 전사체의 무결성은 에티듐 브로마이드로 염색된 MOPS 포름알데히드 0.8% 아가로스 겔을 사용하여 분석되었습니다. 레인 1은 1kb RNA ladder입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: 돌연변이 라이브러리의 치환 비율. 클론-pJFH1, ML50 및 ML25의 RNA에서 얻은 NS5A 유전자를 고충실도 PCR에서 증폭한 후 3' A 돌출부를 추가하고, T-벡터로 산물을 연결하고, 연결산물로 E. coli DH5α를 형질전환시켰습니다. 약 40,000개의 뉴클레오티드/라이브러리 또는 클론-pJFH1을 Sanger 염기서열분석하였다. 10,000bp 복제당 돌연변이의 평균 비율이 표시됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5: ML50 변이체에 대한 pibrentasvir의 EC50 추정치. Huh7.5 세포를 클론-JFH1 바이러스 또는 ML50 변이체에 감염시키고 100pM의 pibrentasvir에서 시작하여 연속 2배 희석으로 처리한 후 3일 후 FFA를 처리했습니다. FFU 환원 분석 값을 사용하는 S자 형 용량-반응 곡선을 통계 분석 소프트웨어에 표시하여 50 % 유효 농도를 추정했습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| 50 μL용 구성품 | 필요한 주식 가치 | 최종 농축/반응 |
| 10x PCR 완충액 | 5.0 μL | 1배 |
| 마그네슘화합물 2 (50 mM) | 1.5 μL | 1.5 밀리미터 |
| KB 익스텐더 | 2.0 μL | - |
| dNTP(10mM) | 1.0 μL | 0.2 밀리미터 |
| 포워드 프라이머(10μM) | 1.0 μL | 0.2 μM의 |
| 리버스 프라이머(10μM) | 1.0 μL | 0.2 μM의 |
| Taq DNA 중합효소(10U/μL) | 0.5μL(1:4 희석) | 1 유 |
| 템플릿 (pJFH1, 20 ng/μL) | 0.5 내지 5.0 μL | 10에서 100 ng |
| 물 | 32.5 내지 37.5 μL | 최종 부피 50μL로 조정 |
표 1. HCV 전체 게놈 증폭을 위한 Ep-PCR 구성 요소.
| 온도 | 시간 | 사이클(들) |
| 95 캜 | 3 민 | 1 |
| 95 캜 | 30초 | 30 |
| 60 캜 | 25초 | |
| 72 캜 | 8 민 | |
| 72 캜 | 10분 | 1 |
| 4 캜 | 들다 |
표 2. HCV 전체 게놈의 ep-PCR에 대한 순환 조건.
| 시험 | 입문서 | 시퀀스(5'-3') |
| 부분 NS4B-NS5A-부분 NS5B의 증폭 | 5272에프 | TGGCCCAAAGTGGAACAATTTTGG TGGCCCAAAGTGG |
| 7848R | GGCCATTTTCTCGCAGACCCGGAC (영어) | |
| cDNA 합성 | 9464R | GTGTACCTAGTGTGTGCCGCTCTA |
| qRT-PCR (영문) | R9-148-S21FT (TaqMan 프로브) | CTGCGGAACCGGTGAGTACAC |
| 재질 보기 R6-130-S17 JIS | CGGGAGAGCCATAGTGG | |
| 재질 보기 R6-290-R19 JIS | 아그타카카아그cctttcg | |
| ep-PCR 산물의 돌연변이 비율을 결정하기 위한 염기서열분석 프라이머 | 6208-SPF (영문) | CCCAACTACTTGGCTCTCTTAC (CCCAACTACTTGGCTCTCTTAC) |
| 6748-SPF (영문) | GACGGTGTGCAGATCCATAG | |
| NS5A 유전자 염기서열분석(및 ep-PCR 산물의 돌연변이 비율 결정) | 6186에프 | CAACGCAGAACGAGACCTCATCCC |
| 6862에프 | GACCTTTCCTATCAATTGCTACAC | |
| 6460R | TGGGCACGGCCT가타카아 |
표 3. 분석에 사용되는 프라이머 및 염기서열.
| 온도 | 시간 | 사이클(들) |
| 95 캜 | 4 민 | 1 |
| 95 캜 | 30초 | 5 |
| 68 캜 | 30초 | |
| 72 캜 | 2 민 | |
| 95 캜 | 30초 | 5 |
| 66 캜 | 30초 | |
| 72 캜 | 2 민 | |
| 95 캜 | 30초 | 5 |
| 64 캜 | 30초 | |
| 72 캜 | 2 민 | |
| 95 캜 | 30초 | 5 |
| 62 캜 | 30초 | |
| 72 캜 | 2 민 | |
| 95 캜 | 30초 | 10 |
| 60 캜 | 30초 | |
| 72 캜 | 2 민 | |
| 72 캜 | 10분 | 1 |
| 4 캜 | 들다 |
표 4. NS5A를 위한 사이클링 조건 amp합리화.
| 교체(들) | 아니요. 클론 수(n=6) |
| D7V+F28C | 4 |
| V8A+F28C | 1 |
| F36엘 | 1 |
표 5. NS5A의 피브렌타스비르 내성 치환.
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Discussion
이 연구에서는 HCV 전체 게놈 라이브러리를 합성하기 위해 ep-PCR18 과 역 유전학을 통합하는 간단하고 빠른 FL-MRS 절차를 자세히 설명했으며, 이는 세포 배양 시스템에서 약물 내성 표현형 스크리닝을 위한 복제 가능한 변이체를 생성하는 데 사용할 수 있습니다. 저충실도 Taq DNA 중합효소의 사용은 전체 길이 바이러스 게놈의 PCR 증폭 중에 치환을 통합할 수 있는 ep-PCR의 전제 조건입니다. 여러 저충실도 Taq DNA 중합효소를 테스트한 결과 Platinum Taq DNA 중합효소가 높은 수율로 ~10kb 크기의 ep-PCR 산물을 생성한다는 것을 발견했습니다(데이터는 표시되지 않음). 고정된 수의 열 주기를 사용하고 입력 템플릿 양을 변경하여 전체 게놈 라이브러리에서 돌연변이의 비율을 제어하는 것이 좋습니다. FL-MRS는 전체 길이 바이러스 RNA에 대한 템플릿으로 잘못된 전체 게놈을 사용하기 때문에, RNA 합성 반응이 정의된 길이의 바이러스 전사체를 생성하도록 하기 위해서는 프라이머 세트의 신중한 설계가 중요합니다: (i) 순방향 프라이머는 ep-PCR 산물에 대한 T7 중합효소 결합을 용이하게 하기 위해 cDNA 클론의 T7 프로모터의 업스트림(~50 뉴클레오티드)에 위치해야 합니다. (ii) 역프라이머 서열은 in vitro RNA 합성 중 전사 유출을 용이하게 하기 위해 바이러스 게놈의 3' 말단에서 끝나야 합니다.
그러나, 이 방법은 상대적으로 조잡하고, 게놈의 관심 영역에 필요한 치환 수와 유형을 통합하는 것에 대한 통제가 없다. FL-MRS의 주요 장점은 합성된 전장 전사체를 세포를 transfection하는 데 직접 사용할 수 있어 대규모 바이러스 변이체 풀을 생성하는 데 간단하고 효율적인 접근 방식을 제공한다는 것입니다. 대조적으로, 원형 중합효소 확장 및 Mu-트랜스포손 삽입 돌연변이 유발 방법은 원하는 표현형을 선택하기 전에 PCR 산물의 클로닝 및 형질전환체의 스크리닝을 필요로 하며, 이는 돌연변이체 풀의 다양성을 심각하게 제한합니다. 당사의 분석법은 원하는 여러 표현형을 산출할 가능성을 크게 증가시키지만, 일반적으로 스크리닝에는 개별 바이러스 변이체의 평가가 필요합니다.
ep-PCR과 바이러스 역유전학의 통합을 통해 HCV 돌연변이를 빠르게 생성할 수 있었습니다. 이 방법은 수백 가지의 유전자 변형 바이러스를 생성할 수 있는 잠재력을 가지고 있으며, 이는 현재 사용 가능한 체외 돌연변이 유발 기술로는 불가능해 보입니다. 여기에 설명된 방법은 최대 ~10kb 길이의 게놈을 포함하는 모든 (+)ssRNA 바이러스를 운반하는 cDNA 클론에 쉽게 적용할 수 있습니다.
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Disclosures
저자는 공개할 것이 없습니다.
Acknowledgments
이 연구에 대한 자금 지원(보조금 번호 BT/PR10906/MED/29/860/2014)은 인도 정부 생명공학부에서 제공했습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 kb plus DNA ladder | Thermo Fisher | 10787018 | |
| 1.5 ml centrifuge tube | Tarsons | 500010 | |
| 15 ml centrifuge tube | Tarsons | 546021 | |
| 35 mm cell culture dish | Tarsons | 960010 | |
| 50 ml centrifuge tube | Tarsons | 546041 | |
| Acetic acid | Merck | A6283 | |
| Agarose | HiMedia | MB080 | |
| Agrose gel electrophoresis unit | BioRad | 1704406 | |
| Biosafety Cabinet, ClassII | ESCO | AC2 4S | |
| Bovine serum albumin | HiMedia | MB083 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5424-R | |
| CFX Connect Real-Time PCR Detection System | BioRad | 1855201 | |
| Cloning plates 90 mm | Tarson | 460091 | |
| CO2 Incubator | New Brunswick | Galaxy 170R | |
| Colibri Microvolume Spectrometer | Titertek-Berthold | 11050140 | |
| DAB Substrate Kit | Abcam | ab94665 | |
| dATP Solution | NEB | N0440S | |
| Deoxynucleotide (dNTP) Solution Set | NEB | N0446 | |
| Diethyl Pyrocarbonate (DEPC) | SRL chemical | 46791 | |
| Dimethyl sulphoxide (DMSO) | HiMedia | MB058 | |
| DMEM high glucose | Lonza | BE12-604F | |
| EcoR1-HF | NEB | R3101 | |
| EDTA tetrasodium salt dihydrate | HiMedia | GRM4918 | |
| Ethidium Bromide | Amresco | X328 | |
| Fetal bovine serum | Gibco | 26140079 | |
| Formaldehyde | Fishser Scientific | 12755 | |
| Gel Documentation System | ALPHA IMAGER | ||
| Goat anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, HRP | Thermo Fisher | A16066 | |
| Hydrogen peroxide 30% | Merck | 107209 | |
| Inverted microscope | Nickon | ECLIPSE Ts2 | |
| LB broth | HiMedia | M1245 | |
| Lipofectamine 2000 | Thermo Fisher | 116680270 | transfection reagent |
| Mechanical Pipette Set | Eppendorf | 3120000909 | |
| Methanol | Merck | 106009 | |
| Micro Tips 0.2-10 µl | Tarsons | 521000 | |
| Micro Tips 10 - 100 µl | Tarsons | 521010 | |
| Micro Tips 200-1000 µl | Tarsons | 521020 | |
| MOPS buffer | GeNei | 3601805001730 | |
| Nonessential aminoacids (NEAA) | Gibco | 11140050 | |
| One Shot TOP10 Chemically Competent E. coli | Invitrogen | C404010 | E.coli DH5α |
| Opti-MEM | Gibco | 1105-021 | minimal essential medium |
| PCR tubes 0.2 ml | Tarsons | 510051 | |
| Pencillin/streptomycin | Gibco | 15070063 | |
| pGEM-T Easy Vector System | Promega | A1360 | T-vector DNA |
| Phosphate buffer saline (PBS) | HiMedia | TI1099 | |
| Phusion High-Fidelity DNA Polymerase | NEB | M0530S | |
| Pibrentasvir | Cayman Chemical | 27546 | |
| Pipette controller | Gilson | F110120 | |
| Platinum Taq DNA Polymerase | Thermo | 10966034 | |
| Prism | GraphPad | statistical analysis software | |
| QIAamp Viral RNA Mini kit | Qiagen | 52904 | viral isolation kit |
| QIAprep Spin Miniprep Kit | Qiagen | 27106 | |
| QIAquick PCR Purification Kit | QIAGEN | 28104 | cokum purification kit |
| RNeasy Mini Kit | QIAGEN | 74104 | RNA cleanup kit |
| Serological Pipettes 25 ml | Thermo Fisher | 170357N | |
| Serological Pipettes 5 ml | Thermo Fisher | 170355N | |
| Serological Pipettes10 ml | Thermo Fisher | 170356N | |
| Single strand RNA Marker 0.2-10 kb | Merck | R7020 | |
| Skim milk | HiMedia | M530 | |
| Sodium azide 0.1 M solution | Merck | 8591 | |
| SuperScript III Reverse Transcriptase | Invitrogen | 18080044 | reverse transcriptase |
| T100 Thermal Cycler | BioRad | 1861096 | |
| T175 cell culture flask | Tarsons | 159910 | |
| T25 cell culture flask | Tarsons | 950040 | |
| T7 RiboMax Express Large Scale RNA Production System | Promega | P1320 | Large Scale RNA Production System |
| T75 cell culture flask | Tarsons | 950050 | |
| Taq DNA Polymerase | Genetix Biotech (Puregene) | PGM040 | |
| TaqMan RNA-to-CT 1-Step Kit | Applied Biosystems | 4392653 | |
| TaqMan RNA-to-CT 1-Step Kit | Thermo Fisher | 4392653 | commercial qRT-PCR kit |
| TOPO-XL--2 Complete PCR Cloning Kit | Thermo Fisher | K8050-10 | kit for cloning of long-PCR product |
| Tris base | HiMedia | TC072 | |
| Trypsin-EDTA solution | HiMedia | TCL007 | |
| Tween 20 | HiMedia | MB067 | |
| Vacuum Concentrator | Eppendorf, Concentrator Plus | 100248 | |
| Water bath | GRANT | JBN-18 | |
| Xba1 | NEB | R0145S |
References
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