Summary
В протоколе описан метод введения контролируемого генетического разнообразия в геном вируса гепатита С путем комбинирования полноразмерного синтеза мутантной РНК с использованием подверженной ошибкам ПЦР и обратной генетики. Метод обеспечивает модель селекции фенотипа и может быть использован для геномов вирусов с положительной РНК длиной 10 кб.
Abstract
Отсутствие удобного метода итеративной генерации разнообразных полноразмерных вариантов вируса затрудняет изучение направленной эволюции РНК-содержащих вирусов. Интегрируя ПЦР с полным геномом, подверженным ошибкам, и обратную генетику, можно индуцировать мутагенез случайных замен на уровне генома. Мы разработали метод, использующий эту технику, для синтеза различных библиотек для идентификации вирусных мутантов с фенотипами, представляющими интерес. Этот метод, называемый полноразмерным синтезом мутантной РНК (FL-MRS), обладает следующими преимуществами: (i) возможность создания большой библиотеки с помощью высокоэффективной одноэтапной ПЦР, подверженной ошибкам; (ii) возможность создания групп библиотек с различными уровнями генетического разнообразия путем манипулирования достоверностью ДНК-полимеразы; (iii) создание полноразмерного ПЦР-продукта, который может непосредственно служить матрицей для синтеза мутантной РНК; и (iv) способность создавать РНК, которая может быть доставлена в клетки-хозяина в качестве неотобранного входного пула для скрининга вирусных мутантов желаемого фенотипа. Используя подход обратной генетики, мы обнаружили, что FL-MRS является надежным инструментом для изучения вирусно-направленной эволюции на всех этапах жизненного цикла вируса гепатита С, изолята JFH1. Этот метод, по-видимому, является бесценным инструментом, позволяющим использовать направленную эволюцию для понимания адаптации, репликации и роли вирусных генов в патогенезе и противовирусной резистентности у РНК-вирусов с положительным смыслом.
Introduction
Прямой генетический скрининг начинается с интересующего нас вирусного фенотипа, а затем, путем секвенирования его генома и сравнения его с геномом исходного штамма, предпринимается попытка идентифицировать мутацию (мутации), вызывающую этот фенотип. В отличие от этого, при обратном генетическом скрининге случайные мутации вводятся в ген-мишень с последующим исследованием результирующего фенотипа (фенотипов)1. Для подхода обратной генетики мутагенез in vitro является наиболее широко используемым методом для создания пула вариантов, которые впоследствии проверяются на наличие интересующих фенотипов. Сообщалось о различных генетических инструментах для достижения полногеномного случайного мутагенеза РНК-вирусов, включая подверженную ошибкам ПЦР (ep-PCR)2,3, кольцевое расширение полимеразы4 и мутагенез вставки мю-транспозона 5,6,7. Последние два метода дают библиотеки с ограниченным разнообразием последовательностей и склонны к введению больших вставок и делеций, которые являются очень летальными для вирусов и серьезно ограничивают восстановление инфекционных вариантов вируса.
ep-ПЦР является хорошо известным мощным методом мутагенеза, широко используемым в белковой инженерии для получения мутантных ферментов для селекции фенотипов с желаемыми свойствами, такими как повышенная термическая стабильность, субстратная специфичность и каталитическая активность 8,9,10. Эта методика проста в исполнении, потому что требует простого оборудования, не требует утомительных манипуляций, использует имеющиеся в продаже реагенты и является быстрой; Более того, он генерирует высококачественные библиотеки.
Здесь мы разработали новый метод синтеза полноразмерной мутантной РНК (FL-MRS) для получения полных геномов вируса гепатита С (HCV) путем интеграции ep-PCR, которая индуцирует мутагенез случайных замещений по всему геному и обратную генетику. Даже вставка или делеция одного нуклеотида крайне вредна для вирусов с положительной РНК ([+]ssRNA); следовательно, мутагенез замещения на основе ПЦР является предпочтительным методом для итеративной генерации больших, разнообразных библиотек полных (+)ss РНК вирусных геномов с хорошей жизнеспособностью.
FL-MRS — это простой подход, который может быть применен к любому РНК-вирусу с положительным смыслом и длиной генома ~10 кб благодаря тщательной разработке набора праймеров, который связывается с вирусным клоном кДНК. pJFH1 представляет собой инфекционный клон кДНК, который кодирует генотип вируса гепатита С 2a и может повторять все этапы жизненного цикла вируса. Используя подход FL-MRS, мы продемонстрировали синтез случайно мутагенизированных полногеномных библиотек (мутантных библиотек [ML]) для получения репликационно-компетентных вариантов JFH1, для которых не было предварительных знаний о свойствах, связанных с мутациями. При воздействии противовирусного препарата некоторые из вариантов вируса быстро преодолевали лекарственное давление с желаемым фенотипическим изменением. Используя описанный здесь протокол, можно создать множество вариантов вируса, что создает возможности для изучения эволюции (+)ssRNA-вирусов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
ПРИМЕЧАНИЕ: Используемый здесь штамм JFH1 (WT) был любезным подарком от Такадзи Вакиты, Национального института инфекционных заболеваний. Клеточная линия гепатомы человека, Huh7.5, была любезным подарком от Чарльза Райса из Рокфеллеровского университета. Схема метода представлена на рисунке 1.
1. Полногеномный мутагенез замещения JFH1 с использованием подверженной ошибкам ПЦР
- Для проведения ep-ПЦР подготовьте мастер-микс для четырех серий экспериментов с праймерами J-For 5'-GTTTTCCCAGTCAGCACGTTGTAAAACGACGGC-3' и J-Rev 5'-CATGATCTGCAAGAGAGACCAGTTACGGCACTCTC -3' (рис. 1A), а также компонентами реакции, описанными в таблице 1 , без матрицы pJFH1 (плазмида, выделенная из штамма JFH1).
- Распределите мастер-смесь по четырем пробиркам, добавьте 100 нг, 50 нг, 25 нг и 10 нг шаблона в отдельные пробирки и доведите общий объем реакции до 50 мкл. Примените условия циклирования, описанные в таблице 2, для амплификации фрагмента 9736 пары оснований (.о.), содержащего промотор Т7 и полноразмерный геном ВГС (рис. 2).
ПРИМЕЧАНИЕ: Продукт ep-PCR должен содержать последовательность промотора Т7, чтобы облегчить транскрипцию вирусного генома in vitro. Таким образом, прямой праймер должен располагаться выше промотора Т7 клона вирусной кДНК, а обратная последовательность праймера должна заканчиваться на 3'-конце генома вируса, чтобы облегчить расхождение транскрипции. Оптимизируйте каждый компонент реакции ep-PCR в диапазоне, рекомендованном производителем Taq ДНК-полимеразы, для достижения высокой амплификации. В дополнение к различным матричным количествам, несбалансированные dNTP (особенно низкая концентрация dATP и/или dGTP) также могут быть использованы для увеличения разнообразия в длине вирусных геномов от 6 до 8 kb. - Оценивают продукт ПЦР-ПЦР, амплифицируемый путем загрузки равных объемов продуктов ПЦР (5 мкл) и сравнения с известными количествами 1 килооснования (кб) лестницы ДНК путем проведения электрофореза в агарозном геле на основе 0,8% трис-ацетата-ЭДТА (ТАЕ)11. Очистите продукт с помощью комплекта для очистки колонки в соответствии с указаниями производителя.
- Оценивают концентрацию очищенного продукта, измеряя абсорбцию на длине волны 260 нм с помощью микрообъемного спектрофотометра12. При необходимости продукт EP-PCR вакуумируют для получения концентрации продукта ≥100 нг/мкл.
ПРИМЕЧАНИЕ: Более точную оценку можно сделать, загрузив двукратные серийные разведения продукта ep-PCR и сравнив их интенсивность с известными объемами 1 kb ДНК лестницы.
2. Синтез вирусной РНК
- Проводят реакцию 40 мкл для расщепления 5 мкг клонального pJFH1 с 4 ЕД фермента XbaI при 37 °C в течение 2 ч с последующей очисткой колонки и измерением абсорбции при 260 нм в микрообъемном спектрофотометре12. Организуют реакцию транскрипции in vitro в 20 мкл очищенного от колонки продукта ep-PCR или клонального pJFH1 (WT) с использованием коммерчески доступной крупномасштабной системы производства РНК в соответствии с инструкциями производителя.
- В пробирке для микроцентрифуги объемом 200 мкл смешайте примерно 1 мкг очищенного продукта ep-PCR (мутантные библиотеки) или XbaI , расщепленного клонального pJFH1, 10 мкл 2x буфера, содержащего рибонуклеотиды, и 2 мкл смеси ферментов Т7. Смешайте все компоненты и быстро раскрутите компоненты. Инкубируют реакционную смесь при 37 °C в течение 45 мин с последующим добавлением 1 фермента ДНКазы, свободной от U-РНКазы, и инкубируют при 37 °C в течение 30 мин (рис. 1C).
- Очистите синтезированную РНК in vitro с помощью набора для очистки РНК в соответствии с инструкциями производителя, элюируйте в 40 мкл воды, свободной от РНКазы и ДНКазы, и оцените концентрацию очищенной РНК, измерив абсорбцию при 260 нм с помощью микрообъемного спектрофотометра12. Вносите аликвоты по мере необходимости (5 мкг или 2 мкг), чтобы избежать замораживания-оттаивания, и храните их при температуре −80 °C. Проверьте целостность и размер вирусных транскриптов, используя 2 мкг РНК для электрофореза MOPS формальдегидом 0,8% в агарозном геле13 (рис. 3).
3. Оценка доли мутаций в продуктах ep-ПЦР (мутантные библиотеки)
ПРИМЕЧАНИЕ: На этом этапе доля нуклеотидов мутирует путем субклонирования продукта, полученного на этапе 2. было продемонстрировано преимущество использования ЭП-ПЦР для создания генетической гетерогенности с использованием двух полногеномных мутантных библиотек (ML50 и ML25) и клональных вирусных РНК, полученных из pJFH1. Доля мутаций была оценена в гене HCV NS5A, который также был фенотипическим геном считывания (лекарственной устойчивости) в этом исследовании.
- Организуют реакцию синтеза кДНК объемом 20 мкл, добавив примерно 1 мкг вирусной РНК, синтезированной на стадии 2, 5 мкМ обратного праймера 5'-GTGTACCTAGGTGTGCCGCTCTA-3' и 200 ЕД обратной транскриптазы в соответствии с рекомендациями производителя.
- Используя кДНК, амплифицируют фрагмент длиной 2571.н., который содержит полный ген NS5A. Для этого готовят реакционную смесь, содержащую 0,5 мкМ для праймеров 5272F и 7848R (конечная концентрация; Таблица 3), 1,5 мМ MgCl2, 1x ПЦР-буфер и 1 U высокоточной Taq-полимеразы в общем объеме 50 мкл и запустить цикл амплификации с использованием условий, описанных в таблице 4.
- Нанесите продукт на 0,8% агарозный гель на основе ТАЕ, чтобы убедиться, что размер продукта составляет 2571.н., а затем очистите продукт с помощью набора для очистки колонки в соответствии с указаниями производителя. Элюируют очищенный в колонке продукт в 40 мкл стерильной воды.
- Чтобы добавить к продукту выступ 3' A, добавьте 0,5 мкМ dATP и 1 U низкоточной Taq ДНК-полимеразы и инкубируйте весь продукт ПЦР при 70 °C в течение 30 мин вместе с 1x ПЦР-буфером и 1,5 мМ MgCl2(конечная концентрация). Очистите смесь с помощью комплекта для очистки колонки в соответствии с указаниями производителя.
ПРИМЕЧАНИЕ: В качестве альтернативы удалите продукт длиной ~9,7 кб из геля из шага 1.4. и выполнить клонирование с помощью имеющегося в продаже набора для клонирования продукта длинной ПЦР в соответствии с инструкциями производителя или выполнить NGS продукта ep-PCR с использованием платформы Illumina2. - Организуют реакцию лигирования, добавив 5 мкл 2-кратного лигированного буфера, 50 нг ДНК Т-вектора, примерно 3-кратный молярный избыток вставной ДНК, синтезированной на стадии 3.4., 3 единицы Вейсса ДНК-лигазы Т4 и безнуклеазную воду до общего объема 10 мкл. Инкубируют эту реакцию при комнатной температуре в течение 3 ч, а затем добавляют 100 мкл Escherichia coli DH5α с лигированной ДНК; тепловой шок элементов при 42 °C в течение 35 с (рис. 1B).
- Добавьте 1 мл среды Лурия-Бертани (LB) (без антибиотика) и инкубируйте при легком встряхивании в течение 1 ч при 37 °C для восстановления. Центрифугируют клеточную суспензию при концентрации 13 800 x g, выбрасывают надосадочную жидкость и ресуспендируют в 200 мкл свежей среды LB.
- Планшет 100 мкл трансформированных клеток E. coli DH5α помещают на планшет LB, содержащий 50 мкг/мл ампициллина, и инкубируют при 37 °C в течение 16 ч. Устанавливают минипрепы из 25-30 колоний в 5 мл среды LB + 50 мкг/мл ампициллина и выращивают в течение ночи при 37 °C.
- На следующий день экстрагируют плазмиды с помощью набора для очистки плазмид в соответствии с инструкциями производителя и проводят ферментное разложение рестрикции в объеме 10 мкл с 200 нг выделенных плазмид, 2 U EcoR1 и 1x рестрикционным буфером для всех колоний.
- После инкубации смесей для разложения при 37 °C в течение 3 ч продукты растворяют на 0,8% агарозном геле на основе ТАЕ для подтверждения вставки плазмидной ДНК.
- Для определения доли мутаций (выраженной в доле мутировавших нуклеотидов) в вирусных РНК, полученных из библиотек и клонального pJFH1, М13 обратного, 6208-SPF и 6748-SPF (табл. 3), проводят секвенирование по Сэнгеру плазмид 25 позитивных клонов с использованием праймеров M13 Forward, M13 reverse, 6208-SPF и 6748-SPF (табл. 3) (табл. 3).
4. Трансфекция вирусной РНК клеточной линии Huh7.5
ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте материалы для культивирования тканей, не содержащие РНКазы/ДНКазы, и работайте в стерильном шкафу биобезопасности класса II. Работать в рекомендованном помещении для локализации в соответствии с рекомендациями по биобезопасности организации.
- Поддерживайте клетки Huh7,5 путем инкубации в 5% инкубаторе CO2 при 37 °C в колбе для тканевой культуры T75см2 , содержащей 15 мл полной модифицированной орлиной среды (DMEM) Dulbecco с добавлением 10% (об./объем) фетальной бычьей сыворотки, пенициллина (100 Ед/мл) и стрептомицина (100 мкг/мл; Рисунок 1D).
- Разделите ячейки в соотношении 1:3, когда слияние достигнет 90%. Промойте клетки 1 предварительно подогретым фосфатно-солевым буфером (PBS; pH 7,4). Добавьте 5 мл 1x раствора трипсина-ЭДТА, чтобы полностью покрыть клеточный слой, осторожно встряхните колбу, а затем инкубируйте колбу при 37 °C в течение 5 минут.
ПРИМЕЧАНИЕ: Время инкубации может варьироваться; Инкубируйте клетки до тех пор, пока клеточный слой полностью не отделится от поверхности колбы с клеточной культурой. - Добавьте 10 мл 1x предварительно подогретого полного DMEM, диспергируйте клетки путем повторного пипетирования и соберите клеточную суспензию в стерильную центрифужную пробирку объемом 15 мл или 50 мл. Центрифугируйте клеточную суспензию при 252 х г в течение 5 мин при комнатной температуре. Выбросьте надосадочную жидкость, повторно суспендируйте клеточную гранулу в 6 мл полного DMEM и инкубируйте клетки при 37 °C в увлажненном инкубаторе с 5%CO2.
- Для непрерывного поддержания наивных, трансфицированных или инфицированных вирусом клеток Huh7.5 повторите шаг 4.2. и шаг 4.3.
- За 1 день до трансфекции разделяют клетки, как описано в шагах 4.1.-4.3., подсчитывают количество жизнеспособных клеток с помощью гемоцитометра, засеивают клетки Huh7,5 плотностью 0,6 x 10,6 в чашки диаметром 35 мм в 2 мл полного DMEM и инкубируют клетки при 37 °C в увлажненном инкубаторе с 5% CO2.
- На следующий день приготовьте транскрипт-липидный комплекс. Для этого 10 мкл трансфекционного реагента разводят в 50 мкл минимальной эссенциальной среды и отдельно разводят 5 мкг вирусных транскриптов в 50 мкл минимальной эссенциальной среды.
- Инкубируют обе смеси при комнатной температуре в течение 10 мин, а затем смешивают их в одной стерильной микроцентрифужной пробирке и далее инкубируют смесь при комнатной температуре в течение 30 мин до образования транскрипт-липидного комплекса.
- После 16 ч клеточной инкубации извлеките питательную среду из чашки для культивирования, промойте клетки 2 раза предварительно подогретым 1x PBS и добавьте 1,5 мл минимальной необходимой среды. Медленно добавьте в блюдо транскрипт-липидный комплекс и аккуратно перемешайте руками, чтобы обеспечить равномерное распределение комплексов.
- Инкубируют клетки в инкубаторе с 5%СО2 при 37 °C в течение 10 ч. Затем удалите среду, промойте трансфицированные клетки 2 раза 1 мл предварительно подогретого 1x PBS и добавьте 2 мл полного DMEM.
5. Производство вирусов
- Разделяйте трансфицированные клетки Huh7.5 каждые 2 дня или 3 дня, когда они достигнут 90% слияния. Собирайте вирусные надосадочные вещества при каждом расщеплении и храните их при температуре −80 °C для дальнейшего анализа.
- При каждом расщеплении отслеживайте распространение вируса с помощью фокусообразующего анализа (FFA), как описано в шаге 6.2. Собирайте вирус до тех пор, пока вирус не достигнет >80% трансфицированных клеток (рис. 1D).
ПРИМЕЧАНИЕ: Разделяйте трансфицированные клетки в соотношении 1:1 в течение первых нескольких пассажей, чтобы спасти максимальное количество вариантов вируса. Распространение вируса замедляется, а его жизнеспособность снижается с увеличением доли мутаций в полногеномных MLs2.
6. Количественная оценка титров вирусов
- Количественное определение вирусной РНК
- Выделите вирусную РНК из 140 мкл надосадочной жидкости культуры с помощью набора для выделения вирусной РНК в соответствии с инструкцией производителя.
- Настройте реакцию qRT-PCR на 10 мкл с помощью коммерческого набора для qRT-PCR в соответствии с инструкциями производителя. Для количественного определения РНК ВГС используют прямой праймер R6-130-S17, обратный праймер R6-290-R19 (конечная концентрация 0,2 мкМ каждый) и зонд R9-148-S21FT (конечная концентрация 0,3 мкМ) (таблица 3). Установите условия работы: 48 °C в течение 20 мин, 95 °C в течение 10 мин, а затем 45 циклов по 95 °C в течение 15 с и 60 °C в течение 1 мин.
ПРИМЕЧАНИЕ: Зонд должен содержать флуоресцентный репортерный краситель 6-карбоксифлуоресцеин (FAM) и гаситель красителя 6-карбокси-тетраметилродамин (TAMRA) на концах 5' и 3' соответственно. - Запускайте реакции в ПЦР-машине в режиме реального времени. Установите отрицательный контроль, т.е. РНК, извлеченную из надосадочной жидкости фиктивных инфицированных клеток, и воду, не содержащую нуклеаз, одновременно, чтобы обеспечить отсутствие перекрестного загрязнения.
- Параллельно постройте стандартную кривую, используя 10-кратное последовательно разбавленное известное число копий транскриптов ВГС (1 x 108 к 0) для количественного определения вирусной РНК. Выполните количественную оценку в трех экземплярах (рис. 1D).
- Количественное определение титра инфекционного вируса с использованием 50% инфекционной дозы тканевой культуры (TCID50)
- Примерно за 16 ч до добавления вируса распределите 6,5 x 10по 3 Huh7,5 клеток/лунку в 96-луночный планшет и инкубируйте клетки при 37 °C в инкубаторе с 5%CO2 .
- В шкафу класса биобезопасности II выполните 10-кратное последовательное разведение (по 1 мл каждое), охватывающее от 1 x 10−1 до 1 x 10−6 разведений (восемь разведений) собранного вируса (полученного, когда распространение вируса достигает >80% клеток, как описано в шаге 5). Добавьте 100 мкл/лунку (с восемью репликациями) разбавленного вируса, чтобы заразить клетки Huh7,5, и держите планшет в инкубаторе при температуре 37 °C с 5% CO2 в течение 3 дней.
- Через 3 дня промывают инфицированные клетки 3 раза 0,1 мл PBS каждый раз, фиксируют и пермеабилизируют клетки 0,1 мл ледяного метанола при −20 °C в течение 20 минут. Промойте лунки 1x PBS 3x, а затем 1x PBS-T (1x PBS/0,1% [v/v] Tween-20).
- После удаления PBS-T заблокируйте клетки на 30 мин при комнатной температуре 0,1 мл 1% бычьего сывороточного альбумина (BSA), содержащего 0,2% обезжиренного молока в PBST. Удаляют блокирующий раствор и обрабатывают клетки в течение 5 мин 0,1 мл 3%H2O2 , приготовленного в 1x PBS.
- Опять же, промывают клетки 2 раза 1x PBS и 1x PBS-T, затем добавляют 50 мкл/лунку анти-NS5A 9E10 mAb (1:10000, запас 1 мг/мл; любезный подарок от Чарльза Райса, Рокфеллеровский университет) и инкубируют при комнатной температуре в течение 1 ч. Промойте лунки еще раз 3 раза с помощью 1x PBS и 1 раз с PBS-T.
- Добавьте 50 мкл/лунку HRP-конъюгированного козьего противомышиного вторичного IgG (1:4000), инкубируйте в течение 30 минут при комнатной температуре, а затем удалите несвязанное антитело, промыв лунки 0,1 мл 1x PBS.
- Добавьте 30 мкл цветного субстрата DAB (диаминобензидина тетрагидрохлорида) и инкубируйте планшет при легком покачивании в течение 10 минут при комнатной температуре. Субстрат образует коричневый осадок на поверхности лунки, который указывает на антиген HCV NS5A. Удалите раствор DAB и промойте лунки 2 раза 1 PBS и 1 раз дистиллированной водой. Добавьте 100 мкл PBS, содержащего 0,03% азида натрия.
- Исследуйте каждую лунку под микроскопом с инвертированным светом с помощью 10-кратного объектива. Подсчитайте количество положительных скважин. Если лунка содержит одну или несколько NS5A-положительных клеток, то она положительна; если лунка показывает отсутствие NS5A-положительных клеток, то она отрицательная. Используйте калькулятор Рида и Мюнха для оценки конечной точки разбавления, которая заражает 50% лунок (TCID50)14,15. Обратной величиной разведения, необходимого для получения TCID50, является титр инфекционности вируса (единицы, образующие очаги) на единицу объема.
ПРИМЕЧАНИЕ: Титры заразности вирусов различаются для разных мутантных библиотек.
7. Выбор варианта вируса с лекарственной устойчивостью
- Пибрентасвир (ПИБ), ингибитор NS5A, растворяют в 100% ДМСО до концентрации 1 мМ и далее разбавляют его в полном ДМЕМ до концентрации 10 нМ.
- Чтобы определить 50% эффективную концентрацию ПИБ, высевают клетки Huh7,5 с плотностью 0,6 x 10 6/лунку в6-луночный планшет и инкубируют клетки при 37 °C в инкубаторе с 5% CO2 . После 16 ч клеточной инкубации добавляют дозу вируса ML50 или клонального вируса JFH1 для инфицирования 50% клеток, а затем, через 12 ч после заражения, обрабатывают клетки серией двойного разведения PIB в диапазоне от 0,5 до 100 пМ. Измерьте FFA и количественно определите FFU, как показано на шаге 6.2. после 3 дней инкубации.
- Постройте графики зависимости от дозы и эффекта, используя значения анализа снижения БОЕ в программном обеспечении для статистического анализа. По сигмоидальной кривой получаем 50%-ную эффективную концентрацию (EC50; Рисунок 5).
ПРИМЕЧАНИЕ: Диапазон эффективных концентраций может варьироваться в зависимости от класса, между противовирусными препаратами ВГС одного и того же класса и в зависимости от библиотеки мутантов. - Для эксперимента инфицировать наивные клетки Huh7.5 при 70%-ном слиянии с вирусом ML50 (варианты, производные от РНК ML50), чтобы заразить 50% клеток в течение 12 ч, а затем перенести инфицированные клетки на 6-луночные планшеты через 24 ч после заражения.
- Добавьте 1x EC50 PIB (47,3 пМ) к инфицированным клеткам через 16 часов после расщепления клеток. Делайте это после каждого деления клетки в течение шести последовательных пассажей (18 дней), за которыми следуют три цикла пассажа без лекарств, и отслеживайте распространение вируса с помощью СЖК, как описано в шаге 6.2. Масштабирование реагентов FFA в соответствии с областью роста. Собирайте вирусные надосадочные вещества при каждом прохождении и храните их при температуре −80 °C до использования.
ПРИМЕЧАНИЕ: Распространение вируса более чем на 50% клеток во время последующего лечения может быть определено как прорыв, а распространение вируса в период отмены препарата может быть определено как рецидив вируса16. - Извлеките вирусную РНК из надосадочной жидкости на 18-й день, как описано в шаге 6.1.1., а затем синтезируйте кДНК, как показано на этапе 3.1. Амплифицируют ген NS5A, используя 5 мкл разбавленной кДНК в соотношении 1:5 и компоненты ПЦР, описанные в шаге 3.2. Затем выполните шаги 3.3.-3.5. определить мутации лекарственной устойчивости NS5A в 6-8 позитивных бактериальных плазмидах с использованием праймеров секвенирования NS5A 6186F, 6862F и 6460R (табл. 3 и табл. 4).
ПРИМЕЧАНИЕ: В этом исследовании мы сообщили о замене в NS5A вариантов, выбранных во время лечения ПИБ при 1x EC50. Это исключит вклад замен, отличных от NS5A, в снижение восприимчивости к ПИБ.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
В соответствии с процедурами, описанными на рисунке 1, можно создать множество полноразмерных вариантов гепатита С и провести скрининг на наличие фенотипов лекарственной устойчивости, представляющих интерес. Полногеномные мутантные библиотеки синтезировали с использованием клонального pJFH1 в убывающих количествах (100-10 нг), как показано на рисунке 2. Средний выход продуктов ep-PCR (мутантных библиотек) варьировал от 3,8 до 12,5 нг/мкл. На рисунке 3 показаны вирусные транскрипты, синтезированные из клонально-pJFH1 и репрезентативной мутантной библиотеки (ML50, синтезированной с использованием 50 нг клонального pJFH1). Клональный pJFH1 линеаризовали с помощью расщепления XbaI , в то время как ML50 использовали непосредственно в реакции транскрипции in vitro . Доля мутаций в мутантных библиотеках (мутантных вирусных РНК) увеличивалась с уменьшением входного pJFH1 в реакции ep-ПЦР, как показано на рисунке 4. ML50, синтезированный с использованием 50 нг матрицы (clonal-pJFH1), содержал 4 замены на 10 000 копируемых.о., в то время как ML25, синтезированный с использованием 25 нг шаблона, содержал 9 замен. В клональном-pJFH1 не было обнаружено замен в количестве секвенированных нуклеотидов. Варианты вируса ML50 были менее восприимчивы (в 12,7 раза) к пибрентасвиру, ингибитору NS5A, по сравнению с клональным вирусом JFH1, как показано на рисунке 5. В таблице 5 представлены замены NS5A, идентифицированные в вариантах вируса ML50, отобранных против 1x EC50 лечения пибрентасвиром. Из восьми клонов NS5A четыре имели комбинацию D7V+F28C, в то время как V8A+F28C и F36L встречались в одном клоне каждый. Эти мутации находились в N-концевой области NS5A, которая, как известно, содержит клинически значимые мутации NS5A-резистентности17.
Рисунок 1: Схема стратегии FL-MRS и селекции фенотипа с лекарственной устойчивостью. (A) Клон кДНК pJFH1 (дикого типа) несет полноразмерный геном вируса 2a и промотор Т7. Праймер J-For находится выше промотора T7, а праймер J-Rev расположен на 3'-конце генома HCV. (B) Клонал-pJFH1 случайным образом мутагенизируется с помощью подверженной ошибкам ПЦР для создания генетических вариаций и создания полных библиотек мутантов генома. Клонал-pJFH1 линеаризуется при расщеплении XbaI . (C) Полногеномные продукты ep-PCR и линеаризованный клональный pJFH1 являются шаблонами для транскрипции in vitro . Долю мутаций в вирусных РНК ML и клонально-JFH1 определяли с помощью ТА-субклонирования NS5A и секвенирования по Сэнгеру положительных клонов ТА. (D) Репликационно-компетентные варианты, полученные после трансфекции мутантной вирусной РНК клеток Huh7.5, обрабатывали пибрентасвиром (ингибитор NS5A) для селекции NS5A-резистентных фенотипов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Электрофорез в агарозном геле продуктов ep-PCR. Полногеномные продукты ЭП-ПЦР ВГС, синтезированные с использованием различных матричных количеств (100 нг, 50 нг, 25 нг и 10 нг pJFH1), разделяли с помощью электрофореза в 0,8% агарозном геле ТАЕ. Ожидаемый размер продукта ep-PCR составляет 9,7 kb. Разделенные продукты визуализировали с помощью окрашивания бромидом этидия. Lane 1 — это лестница ДНК размером 1 кб; Полоса 6 - это управление без шаблона (помечено как H2O). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: MOPS формальдегид агарозный гель электрофорез вирусных транскриптов. В качестве матриц для реакции транскрипции in vitro использовали линеаризованный pJFH1 (Lane 2) и мутантную библиотеку, полученную с 50 нг (ML50) pJFH1, содержащей ep-PCR (Lane 3). Целостность транскриптов анализировали с помощью MOPS формальдегида 0,8% агарозного геля, окрашенного бромидом этидия. Дорожка 1 представляет собой лестницу РНК размером 1 кб. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4: Доля замен в мутантных библиотеках. Гены NS5A из РНК клонально-pJFH1, ML50 и ML25 амплифицировали с помощью высокоточной ПЦР с последующим добавлением 3'-A выступа, лигированием продукта Т-вектором и трансформацией E. coli DH5α с лигированным продуктом. Около 40 000 нуклеотидов/библиотек или клональных pJFH1 были секвенированы по Сэнгеру. Показана средняя доля мутаций на 10 000 копируемых.н. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 5: Оценка EC50 пибрентасвира в сравнении с вариантами ML50. Клетки Huh7.5 инфицировали клональным вирусом JFH1 или вариантами ML50 и обрабатывали серийными двукратными разведениями, начиная со 100 пМ пибрентасвира, с последующим введением СЖК через 3 дня. Сигмоидальные кривые «доза-реакция» с использованием значений анализа снижения ФОЕ были построены в программном обеспечении статистического анализа для оценки 50% эффективной концентрации. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
| Компоненты на 50 мкл | Требуемая стоимость запасов | Конечная концентрация/реакция |
| 10-кратный буфер для ПЦР | 5,0 мкл | В 1 раз |
| MgCl2 (50 мМ) | 1,5 мкл | 1,5 мМ |
| Расширитель базы знаний | 2,0 мкл | - |
| dNTP (10 мМ) | 1,0 мкл | 0,2 мМ |
| Прямой праймер (10 мкМ) | 1,0 мкл | 0,2 мкМ |
| Обратный праймер (10 мкМ) | 1,0 мкл | 0,2 мкМ |
| Taq ДНК-полимераза (10 Ед/мкл) | 0,5 мкл (разбавление 1:4) | 1 U |
| Шаблон (pJFH1, 20 нг/мкл) | от 0,5 до 5,0 мкл | от 10 до 100 нг |
| Вода | от 32,5 до 37,5 мкл | Отрегулируйте конечный объем 50 мкл |
Таблица 1. Компоненты ЭП-ПЦР для амплификации полного генома ВГС.
| Температура | Время | Цикл(ы) |
| 95 °С | 3 мин. | 1 |
| 95 °С | 30 сек | 30 |
| 60 °С | 25 сек | |
| 72 °С | 8 мин | |
| 72 °С | 10 мин | 1 |
| 4 °С | Держать |
Таблица 2. Циклические условия для эп-ПЦР полного генома ВГС.
| Проба | Букварь | Последовательность (5'-3') |
| Амплификация частичных NS4B-NS5A-частичных NS5B | 5272Ф | ТГГККККААААААТТТТГГ |
| 7848Р | GGCCATTTTCTCGCAGACCCGGAC | |
| Синтез кДНК | 9464Р | GTGTACCTAGGTGTGTGCCGCTCTA |
| ОТ-ПЦР | R9-148-S21FT (зонд TaqMan) | CTGCGGAACCGGTGAGTACAC |
| Р6-130-С17 | CGGGAGAGCCATAGTGG | |
| Р6-290-Р19 | АГТАККАААГГККТТТТКГГ | |
| Секвенирование праймеров для определения пропорций мутаций в продуктах ep-ПЦР | 6208-SPF | CCCAACTTGGCTCTCTTAC |
| 6748-SPF | GACGGTGTGCAGATCCATAG | |
| Секвенирование гена NS5A (и определение доли мутаций в продуктах ep-PCR) | 6186Ф | CAACGCAGAACGAGACCTCATCCC |
| 6862Ф | GACCTTTCCTATCAATTGCTACAC | |
| 6460Р | ТГГГГКГГКККТГАКТААА |
Таблица 3. Праймеры и последовательности, используемые в анализах.
| Температура | Время | Цикл(ы) |
| 95 °С | 4 мин. | 1 |
| 95 °С | 30 сек | 5 |
| 68 °С | 30 сек | |
| 72 °С | 2 мин. | |
| 95 °С | 30 сек | 5 |
| 66 °С | 30 сек | |
| 72 °С | 2 мин. | |
| 95 °С | 30 сек | 5 |
| 64 °С | 30 сек | |
| 72 °С | 2 мин. | |
| 95 °С | 30 сек | 5 |
| 62 °С | 30 сек | |
| 72 °С | 2 мин. | |
| 95 °С | 30 сек | 10 |
| 60 °С | 30 сек | |
| 72 °С | 2 мин. | |
| 72 °С | 10 мин | 1 |
| 4 °С | Держать |
Таблица 4. Циклические условия для усиления NS5A.
| Замена(ы) | Нет. клонов (n=6) |
| Д7В+Ф28К | 4 |
| В8А+Ф28С | 1 |
| Ф36Л | 1 |
Таблица 5. Пибрентасвир-резистентные замещения NS5A.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
В этом исследовании мы подробно описали простую и быструю процедуру FL-MRS, которая объединяет ep-PCR18 и обратную генетику для синтеза полногеномных библиотек HCV, которые затем могут быть использованы в системе клеточных культур для создания репликационно-компетентных вариантов для скрининга лекарственно-устойчивых фенотипов. Использование низкоточной Taq ДНК-полимеразы является обязательным условием ep-ПЦР, позволяющим встраивать замены при ПЦР-амплификации полноразмерного вирусного генома. Мы протестировали несколько низкоточных Taq ДНК-полимераз и обнаружили, что ДНК-полимераза Platinum Taq дает продукт ep-PCR размером ~10 kb с высоким выходом (данные не показаны). Мы рекомендуем использовать фиксированное количество тепловых циклов и варьировать величину входного шаблона для контроля доли мутаций в полногеномных библиотеках. Поскольку FL-MRS использует ошибочные полные геномы в качестве матриц для полноразмерных вирусных РНК, тщательная разработка набора праймеров имеет решающее значение для обеспечения того, чтобы реакция синтеза РНК производила вирусные транскрипты определенной длины: (i) прямой праймер должен быть расположен выше (~50 нуклеотидов) промотора Т7 клона кДНК для облегчения связывания Т7-полимеразы с продуктом ep-PCR; и (ii) последовательность обратного праймера должна заканчиваться на 3'-конце генома вируса, чтобы облегчить транскрипционный сток во время синтеза РНК in vitro .
Тем не менее, метод является относительно сырым, и нет никакого контроля за включением необходимого количества и типов замен в интересующие области генома. Основное преимущество FL-MRS заключается в том, что синтезированные полноразмерные транскрипты могут быть напрямую использованы для трансфекции клеток, что делает подход простым и эффективным для генерации большого пула вирусных вариантов. В отличие от этого, методы циркулярного расширения полимеразы и мутагенеза вставки мю-транспозонов требуют клонирования продукта ПЦР и скрининга трансформантов до отбора нужного фенотипа, что сильно ограничивает разнообразие пула мутантов. Несмотря на то, что наш метод значительно увеличивает вероятность получения нескольких желаемых фенотипов, при скрининге обычно требуется оценка отдельных вариантов вируса.
Интеграция ep-PCR с обратной генетикой вируса позволила быстро получить мутанты ВГС. Этот метод обладает потенциалом для создания сотен генетически модифицированных вирусов, что, по-видимому, невозможно с доступными в настоящее время методами мутагенеза in vitro . Метод, описанный здесь, легко адаптируется к клонам кДНК, несущим любые (+)ssRNA-вирусы, содержащие геномы длиной до ~10 kb.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторам нечего раскрывать.
Acknowledgments
Финансовая поддержка (номер гранта BT/PR10906/MED/29/860/2014) для этого исследования была предоставлена Департаментом биотехнологии правительства Индии.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 kb plus DNA ladder | Thermo Fisher | 10787018 | |
| 1.5 ml centrifuge tube | Tarsons | 500010 | |
| 15 ml centrifuge tube | Tarsons | 546021 | |
| 35 mm cell culture dish | Tarsons | 960010 | |
| 50 ml centrifuge tube | Tarsons | 546041 | |
| Acetic acid | Merck | A6283 | |
| Agarose | HiMedia | MB080 | |
| Agrose gel electrophoresis unit | BioRad | 1704406 | |
| Biosafety Cabinet, ClassII | ESCO | AC2 4S | |
| Bovine serum albumin | HiMedia | MB083 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5424-R | |
| CFX Connect Real-Time PCR Detection System | BioRad | 1855201 | |
| Cloning plates 90 mm | Tarson | 460091 | |
| CO2 Incubator | New Brunswick | Galaxy 170R | |
| Colibri Microvolume Spectrometer | Titertek-Berthold | 11050140 | |
| DAB Substrate Kit | Abcam | ab94665 | |
| dATP Solution | NEB | N0440S | |
| Deoxynucleotide (dNTP) Solution Set | NEB | N0446 | |
| Diethyl Pyrocarbonate (DEPC) | SRL chemical | 46791 | |
| Dimethyl sulphoxide (DMSO) | HiMedia | MB058 | |
| DMEM high glucose | Lonza | BE12-604F | |
| EcoR1-HF | NEB | R3101 | |
| EDTA tetrasodium salt dihydrate | HiMedia | GRM4918 | |
| Ethidium Bromide | Amresco | X328 | |
| Fetal bovine serum | Gibco | 26140079 | |
| Formaldehyde | Fishser Scientific | 12755 | |
| Gel Documentation System | ALPHA IMAGER | ||
| Goat anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, HRP | Thermo Fisher | A16066 | |
| Hydrogen peroxide 30% | Merck | 107209 | |
| Inverted microscope | Nickon | ECLIPSE Ts2 | |
| LB broth | HiMedia | M1245 | |
| Lipofectamine 2000 | Thermo Fisher | 116680270 | transfection reagent |
| Mechanical Pipette Set | Eppendorf | 3120000909 | |
| Methanol | Merck | 106009 | |
| Micro Tips 0.2-10 µl | Tarsons | 521000 | |
| Micro Tips 10 - 100 µl | Tarsons | 521010 | |
| Micro Tips 200-1000 µl | Tarsons | 521020 | |
| MOPS buffer | GeNei | 3601805001730 | |
| Nonessential aminoacids (NEAA) | Gibco | 11140050 | |
| One Shot TOP10 Chemically Competent E. coli | Invitrogen | C404010 | E.coli DH5α |
| Opti-MEM | Gibco | 1105-021 | minimal essential medium |
| PCR tubes 0.2 ml | Tarsons | 510051 | |
| Pencillin/streptomycin | Gibco | 15070063 | |
| pGEM-T Easy Vector System | Promega | A1360 | T-vector DNA |
| Phosphate buffer saline (PBS) | HiMedia | TI1099 | |
| Phusion High-Fidelity DNA Polymerase | NEB | M0530S | |
| Pibrentasvir | Cayman Chemical | 27546 | |
| Pipette controller | Gilson | F110120 | |
| Platinum Taq DNA Polymerase | Thermo | 10966034 | |
| Prism | GraphPad | statistical analysis software | |
| QIAamp Viral RNA Mini kit | Qiagen | 52904 | viral isolation kit |
| QIAprep Spin Miniprep Kit | Qiagen | 27106 | |
| QIAquick PCR Purification Kit | QIAGEN | 28104 | cokum purification kit |
| RNeasy Mini Kit | QIAGEN | 74104 | RNA cleanup kit |
| Serological Pipettes 25 ml | Thermo Fisher | 170357N | |
| Serological Pipettes 5 ml | Thermo Fisher | 170355N | |
| Serological Pipettes10 ml | Thermo Fisher | 170356N | |
| Single strand RNA Marker 0.2-10 kb | Merck | R7020 | |
| Skim milk | HiMedia | M530 | |
| Sodium azide 0.1 M solution | Merck | 8591 | |
| SuperScript III Reverse Transcriptase | Invitrogen | 18080044 | reverse transcriptase |
| T100 Thermal Cycler | BioRad | 1861096 | |
| T175 cell culture flask | Tarsons | 159910 | |
| T25 cell culture flask | Tarsons | 950040 | |
| T7 RiboMax Express Large Scale RNA Production System | Promega | P1320 | Large Scale RNA Production System |
| T75 cell culture flask | Tarsons | 950050 | |
| Taq DNA Polymerase | Genetix Biotech (Puregene) | PGM040 | |
| TaqMan RNA-to-CT 1-Step Kit | Applied Biosystems | 4392653 | |
| TaqMan RNA-to-CT 1-Step Kit | Thermo Fisher | 4392653 | commercial qRT-PCR kit |
| TOPO-XL--2 Complete PCR Cloning Kit | Thermo Fisher | K8050-10 | kit for cloning of long-PCR product |
| Tris base | HiMedia | TC072 | |
| Trypsin-EDTA solution | HiMedia | TCL007 | |
| Tween 20 | HiMedia | MB067 | |
| Vacuum Concentrator | Eppendorf, Concentrator Plus | 100248 | |
| Water bath | GRANT | JBN-18 | |
| Xba1 | NEB | R0145S |
References
- Desselberger, U.
- Singh, D., et al. Genome-wide mutagenesis of hepatitis C virus reveals ability of genome to overcome detrimental mutations. Journal of Virology. 94 (3), 01327 (2020).
- Agarwal, S., Baccam, P., Aggarwal, R., Veerapu, N. S. Novel synthesis and phenotypic analysis of mutant clouds for hepatitis E virus genotype 1. Journal of Virology. 92 (4), 01932 (2018).
- Edmonds, J., et al. A novel bacterium-free method for generation of flavivirus infectious DNA by circular polymerase extension reaction allows accurate recapitulation of viral heterogeneity. Journal of Virology. 87 (4), 2367-2372 (2013).
- Arumugaswami, V., et al. High-resolution functional profiling of hepatitis C virus genome. PLoS Pathogens. 4 (10), 1000182 (2008).
- Heaton, N. S., Sachs, D., Chen, C. -J., Hai, R., Palese, P. Genome-wide mutagenesis of influenza virus reveals unique plasticity of the hemagglutinin and NS1 proteins. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (50), 20248-20253 (2013).
- Eyre, N. S., et al. Genome-wide mutagenesis of dengue virus reveals plasticity of the NS1 protein and enables generation of infectious tagged reporter viruses. Journal of Virology. 91 (23), 01455 (2017).
- Cobb, R. E., Chao, R., Zhao, H. Directed evolution: Past, present, and future. AIChE Journal. American Institute of Chemical Engineers. 59 (5), 1432-1440 (2013).
- Sen, S., Venkata Dasu, V., Mandal, B. Developments in directed evolution for improving enzyme functions. Applied Biochemistry and Biotechnology. 143 (3), 212-223 (2007).
- Yuan, L., Kurek, I., English, J., Keenan, R.
- Green, M. R., Sambrook, J. Analysis of DNA by agarose gel electrophoresis. Cold Spring Harbor Protocols. 2019 (1), (2019).
- Desjardins, P., Conklin, D. NanoDrop microvolume quantitation of nucleic acids. Journal of Visualized Experiments. (45), e2565 (2010).
- Rio, D. C. Denaturation and electrophoresis of RNA with formaldehyde. Cold Spring Harbor Protocols. 2015 (2), 219-222 (2015).
- Lindenbach, B. D. Measuring HCV infectivity produced in cell culture and in vivo. Methods in Molecular Biology. 510, 329-336 (2009).
- Lei, C., Yang, J., Hu, J., Sun, X. On the calculation of TCID50 for quantitation of virus infectivity. Virologica Sinica. 36 (1), 141-144 (2021).
- Soni, S., Singh, D., Aggarwal, R., Veerapu, N. S. Enhanced fitness of hepatitis C virus increases resistance to direct-acting antivirals. The Journal of General Virology. 103 (2), (2022).
- Khan, S., Soni, S., Veerapu, N. S. HCV replicon systems: Workhorses of drug discovery and resistance. Frontiers in Cellular Infection Microbiology. 10, 325 (2020).
- Cadwell, R. C., Joyce, G. F. Randomization of genes by PCR mutagenesis. PCR Methods and Applications. 2 (1), 28-33 (1992).
