Summary
Il protocollo descrive un metodo per introdurre la diversità genetica controllabile nel genoma del virus dell'epatite C combinando la sintesi di RNA mutante a lunghezza intera utilizzando la PCR soggetta a errori e la genetica inversa. Il metodo fornisce un modello per la selezione del fenotipo e può essere utilizzato per genomi di virus a RNA a senso positivo lunghi 10 kb.
Abstract
La mancanza di un metodo conveniente per la generazione iterativa di diverse varianti virali a lunghezza intera ha impedito lo studio dell'evoluzione diretta nei virus a RNA. Integrando una PCR a RNA a base di errore del genoma completo e la genetica inversa, è possibile indurre una mutagenesi di sostituzione casuale a livello di genoma. Abbiamo sviluppato un metodo che utilizza questa tecnica per sintetizzare diverse librerie per identificare mutanti virali con fenotipi di interesse. Questo metodo, chiamato sintesi di RNA mutante a lunghezza intera (FL-MRS), offre i seguenti vantaggi: (i) la capacità di creare una grande libreria tramite una PCR altamente efficiente in una sola fase soggetta a errori; (ii) la capacità di creare gruppi di librerie con diversi livelli di diversità genetica manipolando la fedeltà della DNA polimerasi; (iii) la creazione di un prodotto di PCR full-length che possa fungere direttamente da modello per la sintesi di RNA mutante; e (iv) la capacità di creare RNA che può essere consegnato nelle cellule ospiti come pool di input non selezionato per lo screening di mutanti virali del fenotipo desiderato. Abbiamo scoperto, utilizzando un approccio di genetica inversa, che FL-MRS è uno strumento affidabile per studiare l'evoluzione virale-diretta in tutte le fasi del ciclo di vita del virus dell'epatite C, JFH1 isolato. Questa tecnica sembra essere uno strumento inestimabile per impiegare l'evoluzione diretta per comprendere l'adattamento, la replicazione e il ruolo dei geni virali nella patogenesi e nella resistenza antivirale nei virus a RNA a senso positivo.
Introduction
Lo screening genetico in avanti inizia con un fenotipo virale di interesse e poi, attraverso il sequenziamento del suo genoma e il confronto con quello del ceppo originale, tenta di identificare la mutazione o le mutazioni che causano quel fenotipo. Al contrario, negli screening genetici inversi, vengono introdotte mutazioni casuali in un gene bersaglio, seguite da un esame del fenotipo o dei fenotipi risultanti1. Per l'approccio di genetica inversa, la mutagenesi in vitro è la tecnica più utilizzata per creare un pool di varianti che vengono successivamente sottoposte a screening per i fenotipi di interesse. Sono stati descritti vari strumenti genetici per ottenere la mutagenesi casuale a livello di genoma dei virus a RNA, tra cui la PCR soggetta a errore (ep-PCR)2,3, l'estensione circolare della polimerasi4 e la mutagenesi da inserzione di Mu-trasposone 5,6,7. Gli ultimi due metodi producono librerie che ospitano una limitata diversità di sequenza e sono inclini all'introduzione di grandi inserzioni e delezioni, che sono altamente letali per i virus e limitano gravemente il recupero delle varianti virali infettive.
ep-PCR è una potente tecnica di mutagenesi ben nota ampiamente utilizzata nell'ingegneria proteica per generare enzimi mutanti per la selezione di fenotipi con proprietà desiderate, come una maggiore stabilità termica, specificità del substrato e attività catalitica 8,9,10. Questa tecnica è facile da eseguire perché richiede un'attrezzatura semplice, non comporta noiose manipolazioni, utilizza reagenti disponibili in commercio ed è veloce; Inoltre, genera librerie di alta qualità.
Qui, abbiamo sviluppato un nuovo metodo per la sintesi di RNA mutante a lunghezza intera (FL-MRS) per generare genomi completi del virus dell'epatite C (HCV) integrando ep-PCR, che induce mutagenesi di sostituzione casuale a livello di genoma e genetica inversa. Anche l'inserzione o la delezione di un singolo nucleotide è altamente deleteria per i virus a RNA a senso positivo ([+]ssRNA); quindi, la mutagenesi di sostituzione basata sulla PCR è il metodo preferito per la generazione iterativa di librerie ampie e diversificate di genomi di virus a RNA completi (+)ss con buona vitalità.
FL-MRS è un approccio semplice che può essere applicato a qualsiasi virus a RNA a senso positivo con una lunghezza del genoma di ~10 kb attraverso la progettazione meticolosa di un set di primer che si lega al clone di cDNA virale. pJFH1 è un clone di cDNA infettivo che codifica per il genotipo 2a dell'HCV e può ricapitolare tutte le fasi del ciclo di vita del virus. Utilizzando l'approccio FL-MRS, abbiamo dimostrato la sintesi di librerie di genoma completo mutagenizzate in modo casuale (librerie mutanti [ML]) per produrre varianti di JFH1 competenti per la replicazione per le quali non vi era alcuna conoscenza preliminare delle proprietà associate alle mutazioni. Dopo l'esposizione a un antivirale, alcune delle varianti virali hanno rapidamente superato la pressione del farmaco con il cambiamento fenotipico desiderato. Utilizzando il protocollo qui descritto, è possibile generare una pletora di varianti virali, creando opportunità per studiare l'evoluzione dei virus (+)ssRNA.
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Protocol
NOTA: Il ceppo JFH1 (WT) utilizzato qui è stato un gentile regalo di Takaji Wakita, National Institute of Infectious Diseases. La linea cellulare di epatoma umano, Huh7.5, è stata un gentile regalo di Charles Rice, della Rockefeller University. Uno schema del metodo è mostrato nella Figura 1.
1. Mutagenesi da sostituzione genomica di JFH1 mediante PCR a rischio di errore
- Per eseguire la ep-PCR, preparare la miscela master per quattro serie di esperimenti con i primer J-For 5'-GTTTTCCCAGTCAGCACGTTGTAAAACGACGGC-3' e J-Rev 5'-CATGATCTGCAGAGAGACCAGTTACGGCACTCTC -3' (Figura 1A), insieme ai componenti di reazione descritti nella Tabella 1 senza il modello pJFH1 (plasmide isolato dal ceppo JFH1).
- Aliquotare la miscela master in quattro provette, aggiungere 100 ng, 50 ng, 25 ng e 10 ng di stampo nelle singole provette e regolare il volume totale della reazione a 50 μL. Applicare le condizioni di ciclo descritte nella Tabella 2 per amplificare un frammento di coppia di basi (bp) 9736 che comprende il promotore T7 e il genoma dell'HCV a lunghezza intera (Figura 2).
NOTA: Il prodotto ep-PCR deve contenere la sequenza del promotore T7 per facilitare la trascrizione in vitro del genoma virale. Pertanto, il primer diretto deve essere localizzato a monte del promotore T7 del clone virale del cDNA e la sequenza del primer inverso deve terminare all'estremità 3' del genoma del virus per facilitare il deflusso della trascrizione. Ottimizzare ogni componente della reazione ep-PCR all'interno dell'intervallo raccomandato dal produttore della Taq DNA polimerasi per ottenere un'amplificazione ad alto rendimento. Oltre alle diverse quantità di stampo, i dNTP sbilanciati (in particolare la bassa concentrazione di dATP e/o dGTP) possono essere utilizzati anche per aumentare la diversità nella lunghezza dei genomi virali da 6-8 kb di lunghezza3. - Stimare il prodotto ep-PCR amplificato caricando volumi uguali dei prodotti PCR (5 μL) e confrontandolo con quantità note di 1 kilobase (kb) di scala di DNA eseguendo un'elettroforesi su gel di agarosio a base di Tris-acetato-EDTA (TAE) allo 0,8%11. Purificare il prodotto utilizzando un kit di purificazione a colonna come indicato dal produttore.
- Stimare la concentrazione del prodotto purificato misurando l'assorbanza a 260 nm utilizzando uno spettrofotometro a microvolumi12. Se necessario, concentrare sottovuoto il prodotto ep-PCR per ottenere una concentrazione di prodotto ≥100 ng/μL.
NOTA: Una stima più accurata può essere effettuata caricando due diluizioni seriali del prodotto ep-PCR e confrontando le loro intensità con le quantità note di 1 kb di scala di DNA.
2. Sintesi dell'RNA virale
- Impostare una reazione di 40 μL per digerire 5 μg di clonal-pJFH1 con 4 U di enzima XbaI a 37 °C per 2 ore, seguita dalla purificazione della colonna e dalla misurazione dell'assorbanza a 260 nm in uno spettrofotometro a microvolumi12. Impostare una reazione di trascrizione in vitro di 20 μL del prodotto ep-PCR purificato da colonna o clonal-pJFH1 (WT) utilizzando un sistema di produzione di RNA su larga scala disponibile in commercio secondo le istruzioni del produttore.
- In una provetta per microcentrifuga da 200 μL, miscelare circa 1 μg del prodotto ep-PCR purificato (librerie mutanti) o del clonal-pJFH1 digerito da XbaI , 10 μL di tampone 2x contenente ribonucleotidi e 2 μL di miscela enzimatica T7. Mescolare tutti i componenti e centrifugarli brevemente. Incubare la miscela di reazione a 37 °C per 45 minuti, seguita dall'aggiunta dell'enzima DNasi 1 U privo di RNasi e incubazione a 37 °C per 30 minuti (Figura 1C).
- Purificare l'RNA sintetizzato in vitro utilizzando un kit di purificazione dell'RNA secondo le istruzioni del produttore, eluire in 40 μL di acqua priva di RNasi e DNasi e stimare la concentrazione dell'RNA purificato misurando l'assorbanza a 260 nm utilizzando uno spettrofotometro a microvolumi12. Effettuare aliquote secondo necessità (5 μg o 2 μg) per evitare il gelo-disgelo e conservarle a −80 °C. Verificare l'integrità e le dimensioni dei trascritti virali utilizzando 2 μg di RNA per un'elettroforesi su gel di agarosio MOPS formaldeide allo 0,8%13 (Figura 3).
3. Stima della proporzione di mutazioni nei prodotti ep-PCR (librerie di mutanti)
NOTA: In questa fase, la proporzione di nucleotidi mutati mediante subclonazione del prodotto ottenuto nella fase 2. è stato stimato per dimostrare il vantaggio dell'impiego della ep-PCR per creare eterogeneità genetica utilizzando due librerie mutanti dell'intero genoma (ML50 e ML25) e RNA virali clonali derivati da pJFH1. La proporzione di mutazioni è stata stimata nel gene NS5A dell'HCV, che era anche il gene fenotipico (resistenza ai farmaci) in questo studio.
- Impostare una reazione di sintesi di cDNA da 20 μL aggiungendo circa 1 μg dell'RNA virale sintetizzato nella fase 2., 5 μM reverse primer 5'-GTGTACCTAGTGTGTGCCGCTCTA-3' e 200 U reverse transcriptase secondo le raccomandazioni del produttore.
- Utilizzando il cDNA, amplifica un frammento di 2571 bp che comprende il gene NS5A completo. Per fare ciò, preparare una miscela di reazione contenente 0,5 μM per i primer 5272F e 7848R (concentrazione finale; Tabella 3), 1,5 mM di MgCl2, 1 tampone PCR e 1 U Taq polimerasi ad alta fedeltà in un volume totale di 50 μL ed eseguire un ciclo di amplificazione utilizzando le condizioni descritte nella Tabella 4.
- Eseguire il prodotto su un gel di agarosio a base di TAE allo 0,8% per confermare la dimensione del prodotto di 2571 bp e quindi purificare il prodotto utilizzando un kit di purificazione a colonna come indicato dal produttore. Emulsionare il prodotto purificato a colonna in 40 μL di acqua sterile.
- Per aggiungere una sporgenza di 3' A al prodotto, aggiungere 0,5 μM di dATP e 1 U di Taq DNA polimerasi a bassa fedeltà e incubare l'intero prodotto PCR a 70 °C per 30 minuti insieme a 1x tampone PCR e 1,5 mM MgCl2 (concentrazione finale). Purificare la miscela utilizzando un kit di purificazione a colonna come indicato dal produttore
NOTA: In alternativa, asportare il prodotto lungo ~9,7 kb dal gel dal passaggio 1.4. ed eseguire la clonazione utilizzando un kit disponibile in commercio per la clonazione del prodotto a PCR lunga secondo le istruzioni del produttore o eseguire l'NGS del prodotto ep-PCR utilizzando una piattaforma Illumina2. - Impostare una reazione di legatura aggiungendo 5 μL di tampone di legatura 2x, 50 ng del DNA del vettore T, un eccesso molare di circa 3 volte del DNA dell'inserto sintetizzato nella fase 3.4., 3 unità Weiss di DNA ligasi T4 e acqua priva di nucleasi per un volume totale di 10 μL. Incubare questa reazione a temperatura ambiente per 3 ore e poi aggiungere 100 μL di Escherichia coli DH5α con il DNA legato; shock termico delle celle a 42 °C per 35 s (Figura 1B).
- Aggiungere 1 mL di terreno Luria-Bertani (LB) (senza antibiotici) e incubare con agitazione delicata per 1 ora a 37 °C per il recupero. Centrifugare la sospensione cellulare a 13.800 x g, scartare il surnatante e risospendere in 200 μL di terreno LB fresco.
- Piastra 100 μL di cellule DH5α di E. coli trasformate su una piastra LB contenente 50 μg/mL di ampicillina e incubare a 37 °C per 16 ore. Impostare miniprep di 25-30 colonie in 5 mL di terreno LB + 50 μg/mL di ampicillina e far crescere per una notte a 37 °C.
- Il giorno successivo, estrarre i plasmidi con un kit di purificazione dei plasmidi secondo le istruzioni del produttore ed eseguire la digestione degli enzimi di restrizione in un volume di 10 μL con 200 ng dei plasmidi isolati, 2 U di EcoR1 e 1x tampone di restrizione per tutte le colonie.
- Dopo aver incubato le miscele di digestione a 37 °C per 3 ore, sciogliere i prodotti su gel di agarosio a base di TAE allo 0,8% per confermare l'inserimento di DNA plasmidico.
- Eseguire il sequenziamento Sanger dei plasmidi di 25 cloni positivi utilizzando i primer M13 Forward, M13 reverse, 6208-SPF e 6748-SPF (Tabella 3) per determinare la proporzione di mutazioni (espressa come percentuale di nucleotidi mutati) negli RNA virali derivati dalle librerie e dal pJFH1 clonale (Figura 1B e Figura 4).
4. Trasfezione dell'RNA virale della linea cellulare Huh7.5
NOTA: Utilizzare materiali per colture tissutali privi di RNasi/DNasi e lavorare in una cabina sterile di biosicurezza di classe II. Lavorare nella struttura di contenimento raccomandata secondo le linee guida sulla biosicurezza dell'organizzazione.
- Mantenere le cellule Huh7,5 incubando in un incubatore al 5% di CO2 a 37 °C in un matraccio per coltura tissutale T75cm2 contenente 15 mL di terreno di coltura modificato di Dulbecco (DMEM) completo integrato con siero fetale bovino al 10% (vol/vol), penicillina (100 U/mL) e streptomicina (100 μg/mL; Figura 1D).
- Dividi le celle in un rapporto 1:3 quando la confluenza raggiunge il 90%. Lavare le celle con 1 soluzione salina tamponata con fosfato preriscaldata (PBS; pH 7,4). Aggiungere 5 mL di 1x soluzione di tripsina-EDTA fino a coprire completamente lo strato cellulare, agitare delicatamente il pallone e quindi incubare il pallone a 37 °C per 5 minuti.
NOTA: Il tempo di incubazione può variare; Incubare le cellule fino a quando lo strato cellulare non si è completamente staccato dalla superficie del pallone di coltura cellulare. - Aggiungere 10 mL di 1x DMEM completo preriscaldato, disperdere le cellule mediante pipettaggio ripetuto e raccogliere la sospensione cellulare in una provetta da centrifuga sterile da 15 mL o 50 mL. Centrifugare la sospensione cellulare a 252 x g per 5 minuti a temperatura ambiente. Scartare il surnatante, risospendere il pellet cellulare in 6 mL di DMEM completo e incubare le cellule a 37 °C in un incubatore umidificato con il 5% di CO2 .
- Per il mantenimento continuo di cellule Huh7.5 naive, trasfettate o infettate da virus, ripetere il passaggio 4.2. e il passaggio 4.3.
- 1 giorno prima della trasfezione, dividere le cellule come descritto nei passaggi 4.1.-4.3., contare il numero di cellule vitali utilizzando un emocitometro, seminare le cellule Huh7.5 a una densità di 0,6 x 106 in piastre da 35 mm in 2 mL di DMEM completo e incubare le cellule a 37 °C in un incubatore umidificato con il 5% di CO2 .
- Il giorno seguente, preparare il complesso trascritto-lipidico. Per fare ciò, diluire 10 μL di reagente di trasfezione in 50 μL di mezzo essenziale minimo e diluire separatamente 5 μg di trascritti virali in 50 μL di mezzo essenziale minimo.
- Incubare entrambe le miscele a temperatura ambiente per 10 minuti, quindi mescolarle in un'unica provetta sterile per microcentrifuga e incubare ulteriormente la miscela a temperatura ambiente per 30 minuti per formare il complesso trascritto-lipidico.
- Dopo 16 ore di incubazione cellulare, rimuovere il terreno di coltura dal piatto di coltura, lavare le cellule 2 volte con PBS 1x preriscaldato e aggiungere 1,5 ml di terreno essenziale minimo. Aggiungere lentamente il complesso trascritto-lipidico nel piatto e agitare delicatamente con le mani per garantire una distribuzione uniforme dei complessi.
- Incubare le cellule in un incubatore al 5% di CO2 a 37 °C per 10 ore. Quindi, rimuovere il terreno, lavare le cellule trasfettate 2 volte con 1 mL di PBS 1x preriscaldato e aggiungere 2 mL di DMEM completo.
5. Produzione di virus
- Dividere le cellule Huh7.5 trasfettate ogni 2 giorni o 3 giorni quando raggiungono il 90% di confluenza. Raccogliere i surnatanti virali ad ogni split e conservarli a -80 °C per ulteriori analisi.
- Ad ogni scissione, monitorare la diffusione del virus utilizzando un test di formazione del fuoco (FFA) come descritto al punto 6.2. Raccogliere il virus fino a quando la diffusione del virus raggiunge il >80% delle cellule trasfettate (Figura 1D).
NOTA: Dividere le cellule trasfettate in rapporto 1:1 per i primi passaggi per salvare il numero massimo di varianti virali. La diffusione del virus rallenta e la vitalità diminuisce con l'aumentare delle proporzioni di mutazioni nei ML dell'intero genoma2.
6. Quantificazione dei titoli virali
- Quantificazione dell'RNA virale
- Isolare l'RNA virale da 140 μL di surnatanti di coltura utilizzando un kit di isolamento dell'RNA virale secondo le istruzioni del produttore.
- Impostare una reazione qRT-PCR da 10 μL utilizzando un kit qRT-PCR commerciale secondo le istruzioni del produttore. Utilizzare il primer diretto R6-130-S17, il primer inverso R6-290-R19 (concentrazione finale 0,2 μM ciascuno) e la sonda R9-148-S21FT (concentrazione finale 0,3 μM) per la quantificazione dell'RNA dell'HCV (Tabella 3). Impostare le condizioni di funzionamento su 48 °C per 20 min, 95 °C per 10 min, quindi 45 cicli di 95 °C per 15 s e 60 °C per 1 min.
NOTA: La sonda deve contenere il colorante reporter fluorescente 6-carbossifluoresceina (FAM) e il colorante di tempra 6-carbossi-tetrametil-rodamina (TAMRA) rispettivamente alle estremità 5' e 3'. - Eseguire le reazioni in una macchina PCR in tempo reale. Impostare contemporaneamente controlli negativi, ovvero RNA estratto dai surnatanti di cellule fintamente infette e acqua priva di nucleasi per garantire l'assenza di contaminazione incrociata.
- Parallelamente, generare una curva standard utilizzando un numero di copie note diluito in serie di 10 volte dei trascritti di HCV (1 x 10 da8 a 0) per la quantificazione dell'RNA virale. Eseguire la quantificazione in triplice copia (Figura 1D).
- Quantificazione del titolo del virus infettivo utilizzando una dose infettiva del 50% di coltura tissutale (TCID50)
- Circa 16 ore prima dell'aggiunta del virus, mettere in piastra 6,5 x 103 cellule Huh7,5/pozzetto in una piastra da 96 pozzetti e incubare le cellule a 37 °C in un incubatore al 5% di CO2 .
- In una cabina di classe di biosicurezza II, eseguire diluizioni seriali di 10 volte (1 mL ciascuna) che coprono da 1 x 10−1 a 1 x 10−6 diluizioni (otto diluizioni) del virus raccolto (ottenuto quando la diffusione del virus raggiunge il >80% delle cellule come descritto al punto 5). Aggiungere 100 μL/pozzetto (con otto repliche) del virus diluito per infettare le cellule Huh7.5 e mantenere la piastra in un incubatore a 37 °C con il 5% di CO2 per 3 giorni.
- Dopo 3 giorni, lavare le cellule infette 3 volte con 0,1 mL di PBS ogni volta e fissare e permeabilizzare le cellule con 0,1 mL di metanolo ghiacciato a -20 °C per 20 min. Lavare i pozzetti con 1x PBS 3x e poi 1x con PBS-T (1x PBS/0.1% [v/v] Tween-20).
- Dopo aver rimosso il PBS-T, bloccare le cellule per 30 minuti a temperatura ambiente con 0,1 mL di albumina sierica bovina all'1% (BSA) contenente lo 0,2% di latte scremato in PBST. Rimuovere la soluzione bloccante e trattare le cellule per 5 minuti con 0,1 mL diH2O2 al 3% preparato in 1x PBS.
- Anche in questo caso, lavare le cellule 2 volte con 1x PBS e 1x con PBS-T, quindi aggiungere 50 μL/pozzetto di anticorpi monoclonali anti-NS5A 9E10 (1:10000, stock 1 mg/mL; un gentile regalo di Charles Rice, The Rockefeller University) e incubare a temperatura ambiente per 1 ora. Lavare nuovamente i pozzetti 3 volte con 1x PBS e 1x con PBS-T.
- Aggiungere 50 μL/pozzetto di IgG secondarie anti-topo di capra coniugate con HRP (1:4000), incubare per 30 minuti a temperatura ambiente, quindi rimuovere l'anticorpo non legato lavando i pozzetti con 0,1 mL di PBS 1x.
- Aggiungere 30 μL di substrato di colore DAB (diaminobenzidina tetracloridrato) e incubare la piastra con un leggero dondolio per 10 minuti a temperatura ambiente. Il substrato sviluppa un precipitato marrone sulla superficie del pozzo che indica l'antigene HCV NS5A. Rimuovere la soluzione DAB e lavare i pozzetti 2 volte con 1 PBS e 1 volta con acqua distillata. Aggiungere 100 μL di PBS contenente lo 0,03% di sodio azide.
- Esamina ogni pozzetto con un microscopio a luce invertita utilizzando un obiettivo 10x. Contare il numero di pozzetti positivi. Se il pozzetto contiene una o più cellule NS5A-positive, allora è positivo; se il pozzetto mostra un'assenza di cellule NS5A-positive, allora è negativo. Utilizzare un calcolatore di Reed e Muench per stimare la diluizione finale che infetta il 50% dei pozzetti (TCID50)14,15. Un reciproco della diluizione necessaria per ottenere il TCID50 è il titolo di infettività del virus (unità formanti focolai) per unità di volume.
NOTA: I titoli di infettività del virus variano a seconda delle librerie di mutanti.
7. Selezione delle varianti virali resistenti ai farmaci
- Sciogliere pibrentasvir (PIB), un inibitore di NS5A, in DMSO al 100% a una concentrazione di 1 mM e diluirlo ulteriormente in DMEM completo a una concentrazione di 10 nM.
- Per determinare la concentrazione effettiva del 50% di PIB, seminare le cellule Huh7.5 a una densità di 0,6 x 10 6 pozzetti in una piastra a6 pozzetti e incubare le cellule a 37 °C in un incubatore al 5% di CO2 . Dopo 16 ore di incubazione cellulare, aggiungere una dose virale di ML50 o del virus clonale JFH1 per infettare il 50% delle cellule, quindi, a 12 ore dall'infezione (h p.i.), trattare le cellule con una serie di PIB a doppia diluizione che va da 0,5 a 100 pM. Misurare l'FFA e quantificare l'FFU come al punto 6.2. dopo 3 giorni di incubazione.
- Tracciare le curve dose-risposta utilizzando i valori del saggio di riduzione FFU in un software di analisi statistica. Dalla curva sigmoidale si ricava la concentrazione efficace al 50% (EC50; Figura 5).
NOTA: L'intervallo di concentrazione efficace può variare a seconda della classe, tra antivirali HCV della stessa classe e a seconda della libreria mutante. - Per l'esperimento, infettare le cellule Huh7.5 naive al 70% di confluenza con una dose di virus ML50 (varianti derivate dall'RNA ML50) per infettare il 50% delle cellule per 12 ore, quindi trasferire le cellule infette su piastre a 6 pozzetti 24 ore dopo l'infezione.
- Aggiungere 1x EC50 PIB (47,3 pM) alle cellule infette dopo 16 ore di divisione cellulare. Eseguire questa operazione dopo ogni divisione cellulare per sei passaggi consecutivi (18 giorni), seguiti da tre cicli di passaggio senza farmaco, e monitorare la diffusione del virus utilizzando FFA come descritto nel passaggio 6.2. Reagenti FFA scale-up in base all'area di crescita. Raccogliere i surnatanti virali ad ogni passaggio e conservarli a -80 °C fino all'uso.
NOTA: La diffusione virale a più del 50% delle cellule durante il follow-up del trattamento può essere definita come una svolta e la diffusione virale durante il periodo di sospensione del farmaco può essere definita come recidiva virale16. - Estrarre l'RNA virale dal surnatante il giorno 18, come descritto nel passaggio 6.1.1., quindi sintetizzare il cDNA, come mostrato nel passaggio 3.1. Amplificare il gene NS5A utilizzando 5 μL di cDNA diluito 1:5 e i componenti della PCR descritti al punto 3.2. Quindi, seguire i passaggi 3.3.-3.5. per determinare le mutazioni di resistenza ai farmaci NS5A in 6-8 plasmidi batterici positivi utilizzando i primer di sequenziamento NS5A 6186F, 6862F e 6460R (Tabella 3 e Tabella 4).
NOTA: In questo studio, abbiamo riportato sostituzioni in NS5A di varianti selezionate durante il trattamento con PIB a 1x EC50. Ciò escluderà il contributo di sostituzioni diverse da NS5A nella ridotta suscettibilità al PIB.
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Representative Results
Una pletora di varianti complete di HCV può essere generata e sottoposta a screening per i fenotipi resistenti ai farmaci di interesse seguendo le procedure descritte nella Figura 1. Le librerie mutanti dell'intero genoma sono state sintetizzate utilizzando clonal-pJFH1 in quantità decrescenti (100-10 ng), come mostrato nella Figura 2. Le rese medie dei prodotti ep-PCR (librerie mutanti) variavano da 3,8 a 12,5 ng/μL. La Figura 3 mostra i trascritti virali sintetizzati dal clonal-pJFH1 e dalla libreria mutante rappresentativa (ML50 sintetizzato utilizzando 50 ng di clonal-pJFH1). Il clonal-pJFH1 è stato linearizzato tramite digestione XbaI , mentre ML50 è stato utilizzato direttamente nella reazione di trascrizione in vitro . La proporzione di mutazioni nelle librerie mutanti (RNA virali mutanti) è aumentata con la diminuzione dell'input pJFH1 nella reazione ep-PCR, come mostrato nella Figura 4. ML50 sintetizzato utilizzando 50 ng del modello (clonal-pJFH1) ha avuto 4 sostituzioni ogni 10.000 bp copiati, mentre ML25 sintetizzato utilizzando 25 ng di modello ha ospitato 9 sostituzioni. Non sono state trovate sostituzioni all'interno del numero di nucleotidi sequenziati nel clonal-pJFH1. Le varianti virali ML50 erano meno suscettibili (12,7 volte) a pibrentasvir, un inibitore di NS5A, rispetto al virus clonale JFH1, come mostrato nella Figura 5. La Tabella 5 mostra le sostituzioni di NS5A identificate nelle varianti virali ML50 selezionate contro 1x EC50 del trattamento con pibrentasvir. Degli otto cloni di NS5A, quattro avevano una combinazione di D7V+F28C, mentre V8A+F28C e F36L si trovavano in un clone ciascuno. Queste mutazioni si trovavano nella regione N-terminale di NS5A, che è nota per ospitare mutazioni clinicamente rilevanti per la resistenza a NS5A17.
Figura 1: Schema della strategia FL-MRS e selezione del fenotipo resistente ai farmaci. (A) Il clone di cDNA pJFH1 (wild-type) porta un genoma virale di genotipo 2a a lunghezza intera e un promotore T7. Il primer J-For si trova a monte del promotore T7 e il primer J-Rev si trova all'estremità 3' del genoma dell'HCV. (B) Clonal-pJFH1 viene mutagenizzata in modo casuale utilizzando la PCR soggetta a errori per ingegnerizzare le variazioni genetiche e creare librerie mutanti del genoma completo. Clonal-pJFH1 è linearizzato dalla digestione XbaI . (C) I prodotti ep-PCR dell'intero genoma e il clonal-pJFH1 linearizzato sono i modelli per la trascrizione in vitro . La proporzione di mutazioni negli RNA virali di ML e JFH1 clonale è stata determinata mediante subclonaggio TA di NS5A e sequenziamento Sanger di cloni TA positivi. (D) Le varianti competenti per la replicazione generate dopo la trasfezione di RNA virale mutante di cellule Huh7.5 sono state trattate con pibrentasvir (un inibitore di NS5A) per la selezione di fenotipi resistenti a NS5A. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Elettroforesi su gel di agarosio di prodotti ep-PCR. I prodotti ep-PCR dell'intero genoma dell'HCV sintetizzati utilizzando quantità variabili di modello (100 ng, 50 ng, 25 ng e 10 ng di pJFH1) sono stati separati utilizzando l'elettroforesi su gel di agarosio TAE allo 0,8%. La dimensione prevista del prodotto ep-PCR è di 9,7 kb. I prodotti separati sono stati visualizzati mediante colorazione con bromuro di etidio. La corsia 1 è una scala di DNA di 1 kb; La corsia 6 è un controllo senza modello (etichettato come H2O). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Elettroforesi su gel di agarosio formaldeide MOPS di trascritti virali. La pJFH1 linearizzata (Lane 2) e la libreria mutante ottenuta con 50 ng (ML50) di pJFH1 contenente ep-PCR (Lane 3) sono stati utilizzati come modelli per la reazione di trascrizione in vitro . L'integrità dei trascritti è stata analizzata utilizzando un gel di agarosio MOPS formaldeide allo 0,8% colorato con bromuro di etidio. La corsia 1 è una scala di RNA da 1 kb. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Proporzione di sostituzioni nelle librerie di mutanti. I geni NS5A degli RNA di pJFH1, ML50 e ML25 clonali sono stati amplificati in PCR ad alta fedeltà, seguiti dall'aggiunta di una sporgenza di 3' A, dalla legatura del prodotto con il vettore T e dalla trasformazione di E. coli DH5α con il prodotto legato. Circa 40.000 nucleotidi/libreria o clonal-pJFH1 sono stati sequenziati con metodo Sanger. Viene mostrata una proporzione media di mutazioni per 10.000 bp copiati. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5: Stima di EC50 di pibrentasvir rispetto alle varianti ML50. Le cellule Huh7.5 sono state infettate con il virus clonale JFH1 o con varianti ML50 e trattate con diluizioni seriali doppie a partire da 100 pM di pibrentasvir, seguite da FFA dopo 3 giorni. Le curve dose-risposta sigmoidali che utilizzano i valori del saggio di riduzione della FFU sono state tracciate in un software di analisi statistica per stimare la concentrazione efficace al 50%. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
| Componenti per 50 μL | Valore delle scorte richiesto | Concentrazione/reazione finale |
| 10 tamponi PCR | 5,0 μL | 1x |
| MgCl2 (50 mM) | 1,5 μL | 1,5 millimetri |
| Estensore KB | 2,0 μL | - |
| dNTP (10 mM) | 1,0 μL | 0,2 mM |
| Primer diretto (10 μM) | 1,0 μL | 0,2 μM |
| Primer inverso (10 μM) | 1,0 μL | 0,2 μM |
| Taq DNA polimerasi (10 U/μL) | 0,5 μL (diluito 1:4) | 1 U |
| Dima (pJFH1, 20 ng/μL) | Da 0,5 a 5,0 μL | Da 10 a 100 ng |
| Acqua | Da 32,5 a 37,5 μL | Regolare per il volume finale di 50 μL |
Tabella 1. Componenti Ep-PCR per l'amplificazione dell'intero genoma dell'HCV.
| Temperatura | Ore | Ciclo/i |
| 95 °C | 3 minuti | 1 |
| 95 °C | 30 secondi | 30 |
| 60 °C | 25 secondi | |
| 72 °C | 8 minuti | |
| 72 °C | 10 minuti | 1 |
| 4 °C | Tenere |
Tabella 2. Condizioni cicliche per l'ep-PCR del genoma completo dell'HCV.
| Saggio | Abbecedario | Sequenza (5'-3') |
| Amplificazione di NS4B-NS5A-NS5B parziale | 5272F | TGGCCCAAAGTGGAACAATTTTGG |
| 7848R | GGCCATTTTCTCGCAGACCCGGAC | |
| Sintesi di cDNA | 9464R | GTGTACCTAGTGTGTGCCGCTCTA |
| qRT-PCR | R9-148-S21FT (sonda TaqMan) | CTGCGGAACCGGTGAGTACAC |
| R6-130-S17 | CGGGAGAGCCATAGTGG | |
| R6-290-R19 | AGTACCACAAGGCCTTTCG | |
| Primer di sequenziamento per determinare le proporzioni di mutazioni nei prodotti ep-PCR | 6208-SPF | CCCAACTTGGCTCTCTTAC |
| 6748-SPF | GACGGTGTGCAGATCCATAG | |
| Sequenziamento del gene NS5A (e per determinare le proporzioni di mutazioni nei prodotti ep-PCR) | 6186F | CAACGCAGAACGAGACCTCATCCC |
| 6862F | GACCTTTCCTATCAATTGCTACAC | |
| 6460R | TGGGCACGGCCTGACTACAA |
Tabella 3. Primer e sequenze utilizzate nei saggi.
| Temperatura | Ore | Ciclo/i |
| 95 °C | 4 minuti | 1 |
| 95 °C | 30 secondi | 5 |
| 68 °C | 30 secondi | |
| 72 °C | 2 minuti | |
| 95 °C | 30 secondi | 5 |
| 66 °C | 30 secondi | |
| 72 °C | 2 minuti | |
| 95 °C | 30 secondi | 5 |
| 64 °C | 30 secondi | |
| 72 °C | 2 minuti | |
| 95 °C | 30 secondi | 5 |
| 62 °C | 30 secondi | |
| 72 °C | 2 minuti | |
| 95 °C | 30 secondi | 10 |
| 60 °C | 30 secondi | |
| 72 °C | 2 minuti | |
| 72 °C | 10 minuti | 1 |
| 4 °C | Tenere |
Tabella 4. Condizioni cicliche per l'amplificazione NS5A.
| Sostituzione(i) | No. Numero di cloni (n=6) |
| D7V+F28C | 4 |
| V8A+F28C | 1 |
| F36L | 1 |
Tabella 5. Sostituzioni di NS5A con resistenza a pibrentasvir.
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Discussion
In questo studio, abbiamo dettagliato una procedura FL-MRS semplice e rapida che integra ep-PCR18 e genetica inversa per sintetizzare librerie di genoma completo dell'HCV, che possono quindi essere utilizzate in un sistema di coltura cellulare per generare varianti competenti per la replicazione per lo screening di fenotipi resistenti ai farmaci. L'uso della Taq DNA polimerasi a bassa fedeltà è un prerequisito della ep-PCR che consente l'incorporazione di sostituzioni durante l'amplificazione PCR di un genoma virale completo. Abbiamo testato diverse Taq DNA polimerasi a bassa fedeltà e abbiamo scoperto che la DNA polimerasi Taq di platino ha prodotto un prodotto ep-PCR di dimensioni ~10 kb con una resa elevata (dati non mostrati). Si consiglia di utilizzare un numero fisso di cicli termici e di variare la quantità di modello di input per controllare la proporzione di mutazioni nelle librerie dell'intero genoma. Poiché FL-MRS utilizza genomi completi errati come modelli per RNA virali a lunghezza intera, un'attenta progettazione del set di primer è fondamentale per garantire che la reazione di sintesi dell'RNA produca trascritti virali di lunghezza definita: (i) il primer diretto deve essere localizzato a monte (~50 nucleotidi) del promotore T7 del clone di cDNA per facilitare il legame della polimerasi T7 al prodotto ep-PCR; e (ii) la sequenza di primer inversa deve terminare all'estremità 3' del genoma del virus per facilitare il deflusso della trascrizione durante la sintesi dell'RNA in vitro .
Tuttavia, il metodo è relativamente grezzo e non vi è alcun controllo sull'incorporazione del numero e del tipo di sostituzioni richieste nelle regioni di interesse nel genoma. Uno dei principali vantaggi di FL-MRS è che i trascritti sintetizzati possono essere utilizzati direttamente per trasfettare le cellule, il che rende l'approccio semplice ed efficiente per generare un ampio pool di varianti virali. Al contrario, i metodi di estensione circolare della polimerasi e di mutagenesi con inserzione di Mu-trasposone richiedono la clonazione del prodotto della PCR e lo screening dei trasformanti prima della selezione del fenotipo desiderato, il che limita fortemente la diversità del pool di mutanti. Sebbene il nostro metodo aumenti notevolmente la possibilità di produrre diversi fenotipi desiderati, la valutazione delle singole varianti virali è normalmente richiesta nello screening.
L'integrazione dell'ep-PCR con la genetica inversa del virus ci ha permesso di generare rapidamente mutanti dell'HCV. Questo metodo ha il potenziale per generare centinaia di virus geneticamente modificati, un'impresa apparentemente impossibile con le tecniche di mutagenesi in vitro attualmente disponibili. Il metodo qui descritto è facilmente adattabile ai cloni di cDNA che trasportano qualsiasi virus (+)ssRNA contenente genomi fino a ~10 kb di lunghezza.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Il sostegno finanziario (numero di sovvenzione BT/PR10906/MED/29/860/2014) per questo studio è stato fornito dal Dipartimento di Biotecnologia del governo indiano.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 kb plus DNA ladder | Thermo Fisher | 10787018 | |
| 1.5 ml centrifuge tube | Tarsons | 500010 | |
| 15 ml centrifuge tube | Tarsons | 546021 | |
| 35 mm cell culture dish | Tarsons | 960010 | |
| 50 ml centrifuge tube | Tarsons | 546041 | |
| Acetic acid | Merck | A6283 | |
| Agarose | HiMedia | MB080 | |
| Agrose gel electrophoresis unit | BioRad | 1704406 | |
| Biosafety Cabinet, ClassII | ESCO | AC2 4S | |
| Bovine serum albumin | HiMedia | MB083 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5424-R | |
| CFX Connect Real-Time PCR Detection System | BioRad | 1855201 | |
| Cloning plates 90 mm | Tarson | 460091 | |
| CO2 Incubator | New Brunswick | Galaxy 170R | |
| Colibri Microvolume Spectrometer | Titertek-Berthold | 11050140 | |
| DAB Substrate Kit | Abcam | ab94665 | |
| dATP Solution | NEB | N0440S | |
| Deoxynucleotide (dNTP) Solution Set | NEB | N0446 | |
| Diethyl Pyrocarbonate (DEPC) | SRL chemical | 46791 | |
| Dimethyl sulphoxide (DMSO) | HiMedia | MB058 | |
| DMEM high glucose | Lonza | BE12-604F | |
| EcoR1-HF | NEB | R3101 | |
| EDTA tetrasodium salt dihydrate | HiMedia | GRM4918 | |
| Ethidium Bromide | Amresco | X328 | |
| Fetal bovine serum | Gibco | 26140079 | |
| Formaldehyde | Fishser Scientific | 12755 | |
| Gel Documentation System | ALPHA IMAGER | ||
| Goat anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, HRP | Thermo Fisher | A16066 | |
| Hydrogen peroxide 30% | Merck | 107209 | |
| Inverted microscope | Nickon | ECLIPSE Ts2 | |
| LB broth | HiMedia | M1245 | |
| Lipofectamine 2000 | Thermo Fisher | 116680270 | transfection reagent |
| Mechanical Pipette Set | Eppendorf | 3120000909 | |
| Methanol | Merck | 106009 | |
| Micro Tips 0.2-10 µl | Tarsons | 521000 | |
| Micro Tips 10 - 100 µl | Tarsons | 521010 | |
| Micro Tips 200-1000 µl | Tarsons | 521020 | |
| MOPS buffer | GeNei | 3601805001730 | |
| Nonessential aminoacids (NEAA) | Gibco | 11140050 | |
| One Shot TOP10 Chemically Competent E. coli | Invitrogen | C404010 | E.coli DH5α |
| Opti-MEM | Gibco | 1105-021 | minimal essential medium |
| PCR tubes 0.2 ml | Tarsons | 510051 | |
| Pencillin/streptomycin | Gibco | 15070063 | |
| pGEM-T Easy Vector System | Promega | A1360 | T-vector DNA |
| Phosphate buffer saline (PBS) | HiMedia | TI1099 | |
| Phusion High-Fidelity DNA Polymerase | NEB | M0530S | |
| Pibrentasvir | Cayman Chemical | 27546 | |
| Pipette controller | Gilson | F110120 | |
| Platinum Taq DNA Polymerase | Thermo | 10966034 | |
| Prism | GraphPad | statistical analysis software | |
| QIAamp Viral RNA Mini kit | Qiagen | 52904 | viral isolation kit |
| QIAprep Spin Miniprep Kit | Qiagen | 27106 | |
| QIAquick PCR Purification Kit | QIAGEN | 28104 | cokum purification kit |
| RNeasy Mini Kit | QIAGEN | 74104 | RNA cleanup kit |
| Serological Pipettes 25 ml | Thermo Fisher | 170357N | |
| Serological Pipettes 5 ml | Thermo Fisher | 170355N | |
| Serological Pipettes10 ml | Thermo Fisher | 170356N | |
| Single strand RNA Marker 0.2-10 kb | Merck | R7020 | |
| Skim milk | HiMedia | M530 | |
| Sodium azide 0.1 M solution | Merck | 8591 | |
| SuperScript III Reverse Transcriptase | Invitrogen | 18080044 | reverse transcriptase |
| T100 Thermal Cycler | BioRad | 1861096 | |
| T175 cell culture flask | Tarsons | 159910 | |
| T25 cell culture flask | Tarsons | 950040 | |
| T7 RiboMax Express Large Scale RNA Production System | Promega | P1320 | Large Scale RNA Production System |
| T75 cell culture flask | Tarsons | 950050 | |
| Taq DNA Polymerase | Genetix Biotech (Puregene) | PGM040 | |
| TaqMan RNA-to-CT 1-Step Kit | Applied Biosystems | 4392653 | |
| TaqMan RNA-to-CT 1-Step Kit | Thermo Fisher | 4392653 | commercial qRT-PCR kit |
| TOPO-XL--2 Complete PCR Cloning Kit | Thermo Fisher | K8050-10 | kit for cloning of long-PCR product |
| Tris base | HiMedia | TC072 | |
| Trypsin-EDTA solution | HiMedia | TCL007 | |
| Tween 20 | HiMedia | MB067 | |
| Vacuum Concentrator | Eppendorf, Concentrator Plus | 100248 | |
| Water bath | GRANT | JBN-18 | |
| Xba1 | NEB | R0145S |
References
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