Summary
El protocolo describe un método para introducir una diversidad genética controlable en el genoma del virus de la hepatitis C mediante la combinación de la síntesis de ARN mutante de longitud completa mediante PCR propensa a errores y genética inversa. El método proporciona un modelo para la selección del fenotipo y se puede utilizar para genomas de virus de ARN de sentido positivo de 10 kb de largo.
Abstract
La falta de un método conveniente para la generación iterativa de diversas variantes virales de longitud completa ha impedido el estudio de la evolución dirigida en los virus de ARN. Al integrar una PCR propensa a errores en el genoma de ARN completo y una genética inversa, se puede inducir la mutagénesis de sustitución aleatoria de todo el genoma. Hemos desarrollado un método que utiliza esta técnica para sintetizar diversas bibliotecas con el fin de identificar mutantes virales con fenotipos de interés. Este método, llamado síntesis de ARN mutante de longitud completa (FL-MRS), ofrece las siguientes ventajas: (i) la capacidad de crear una gran biblioteca a través de una PCR altamente eficiente y propensa a errores en un solo paso; (ii) la capacidad de crear grupos de bibliotecas con diferentes niveles de diversidad genética mediante la manipulación de la fidelidad de la ADN polimerasa; iii) la creación de un producto de PCR de longitud completa que pueda servir directamente como molde para la síntesis de ARN mutante; y (iv) la capacidad de crear ARN que se puede entregar a las células huésped como un grupo de entrada no seleccionado para detectar mutantes virales del fenotipo deseado. Hemos encontrado, utilizando un enfoque de genética inversa, que FL-MRS es una herramienta confiable para estudiar la evolución dirigida al virus en todas las etapas del ciclo de vida del virus de la hepatitis C, aislado de JFH1. Esta técnica parece ser una herramienta invaluable para emplear la evolución dirigida para comprender la adaptación, la replicación y el papel de los genes virales en la patogénesis y la resistencia antiviral en los virus de ARN de sentido positivo.
Introduction
El cribado genético directo comienza con un fenotipo viral de interés y luego, a través de la secuenciación de su genoma y su comparación con el de la cepa original, intenta identificar la(s) mutación(es) causante(s) de ese fenotipo. Por el contrario, en los cribados genéticos inversos, se introducen mutaciones aleatorias en un gen diana, seguidas de un examen del fenotipo o fenotipos resultantes1. Para el enfoque de genética inversa, la mutagénesis in vitro es la técnica más utilizada para crear un conjunto de variantes que posteriormente se examinan en busca de fenotipos de interés. Se han descrito varias herramientas genéticas para lograr la mutagénesis aleatoria de virus de ARN en todo el genoma, incluida la PCR propensa a errores (ep-PCR)2,3, la extensión circular de la polimerasa4 y la mutagénesis de inserción de transposones Mu 5,6,7. Los dos últimos métodos producen bibliotecas que albergan una diversidad de secuencias limitada y son propensas a la introducción de grandes inserciones y deleciones, que son altamente letales para los virus y limitan gravemente la recuperación de variantes virales infecciosas.
La ep-PCR es una conocida y potente técnica de mutagénesis ampliamente utilizada en ingeniería de proteínas para generar enzimas mutantes para la selección de fenotipos con propiedades deseadas, como una mayor estabilidad térmica, especificidad del sustrato y actividad catalítica 8,9,10. Esta técnica es fácil de realizar porque requiere un equipo sencillo, no implica manipulaciones tediosas, utiliza reactivos disponibles en el mercado y es rápida; Además, genera bibliotecas de alta calidad.
Aquí, desarrollamos un método novedoso para la síntesis de ARN mutante de longitud completa (FL-MRS) para generar genomas completos del virus de la hepatitis C (VHC) mediante la integración de ep-PCR, que induce mutagénesis de sustitución aleatoria de todo el genoma y genética inversa. Incluso la inserción o deleción de un solo nucleótido es altamente perjudicial para los virus de ARN de sentido positivo ([+]ssRNA); por lo tanto, la mutagénesis de sustitución basada en PCR es el método preferido para la generación iterativa de bibliotecas grandes y diversas de genomas completos de virus de ARN (+)ss con buena viabilidad.
FL-MRS es un enfoque sencillo que se puede aplicar a cualquier virus de ARN de sentido positivo con una longitud de genoma de ~ 10 kb a través del diseño meticuloso de un conjunto de cebadores que se une al clon viral de ADNc. pJFH1 es un clon infeccioso de ADNc que codifica el genotipo 2a del VHC y puede recapitular todos los pasos del ciclo de vida del virus. Mediante el uso del enfoque FL-MRS, demostramos la síntesis de bibliotecas de genoma completo mutagenizadas aleatoriamente (bibliotecas de mutantes [ML]) para producir variantes de JFH1 competentes para la replicación para las que no había conocimiento previo de las propiedades asociadas con las mutaciones. Tras la exposición a un antiviral, algunas de las variantes virales superaron rápidamente la presión del fármaco con el cambio fenotípico deseado. Utilizando el protocolo descrito aquí, se puede generar una gran cantidad de variantes virales, creando oportunidades para estudiar la evolución de los virus (+)ssRNA.
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Protocol
NOTA: La cepa JFH1 (WT) utilizada aquí fue un amable regalo de Takaji Wakita, del Instituto Nacional de Enfermedades Infecciosas. La línea celular de hepatoma humano, Huh7.5, fue un amable regalo de Charles Rice, de la Universidad Rockefeller. En la Figura 1 se muestra un esquema del método.
1. Mutagénesis de sustitución de todo el genoma de JFH1 mediante PCR propensa a errores
- Para realizar ep-PCR, prepare la mezcla maestra para cuatro conjuntos de experimentos con cebadores J-For 5'-GTTTTCCCAGTCAGCACGTTGTAAAACGACGGC-3' y J-Rev 5'-CATGATCTGCAGAGAGACCAGTTACGGCACTCTC -3' (Figura 1A), junto con los componentes de reacción descritos en la Tabla 1 sin el molde pJFH1 (plásmido aislado de la cepa JFH1).
- Alícuota de la mezcla maestra en cuatro tubos, agregue 100 ng, 50 ng, 25 ng y 10 ng de molde en los tubos individuales y ajuste el volumen total de la reacción a 50 μL. Aplique las condiciones cíclicas descritas en la Tabla 2 para amplificar un fragmento de 9736 pares de bases (pb) que comprende el promotor T7 y el genoma completo del VHC (Figura 2).
NOTA: El producto ep-PCR debe contener la secuencia del promotor T7 para facilitar la transcripción in vitro del genoma viral. Por lo tanto, el cebador directo debe ubicarse aguas arriba del promotor T7 del clon de ADNc viral, y la secuencia inversa del cebador debe terminar en el extremo 3' del genoma del virus para facilitar la escorrentía de la transcripción. Optimice cada componente de la reacción ep-PCR dentro del rango recomendado por el fabricante de la ADN polimerasa Taq para lograr una amplificación de alto rendimiento. Además de las cantidades variables de plantilla, los dNTP desequilibrados (especialmente la baja concentración de dATP y/o dGTP) también se pueden utilizar para aumentar la diversidad en la longitud de los genomas virales de 6 a 8 kb de longitud3. - Estime el producto de ep-PCR amplificado cargando volúmenes iguales de los productos de PCR (5 μL) y comparándolo con cantidades conocidas de escalera de ADN de 1 kilobase (kb) mediante la ejecución de una electroforesis en gel de agarosa basada en Tris-acetato-EDTA (TAE) al 0,8%11. Purifique el producto utilizando un kit de purificación en columna según las indicaciones del fabricante.
- Estime la concentración del producto purificado midiendo la absorbancia a 260 nm utilizando un espectrofotómetro de microvolumen12. Concentrar al vacío el producto ep-PCR si es necesario para obtener una concentración de producto ≥100 ng/μL.
NOTA: Se puede hacer una estimación más precisa cargando diluciones en serie dos veces del producto ep-PCR y comparando sus intensidades con las cantidades conocidas de escalera de ADN de 1 kb.
2. Síntesis de ARN viral
- Establecer una reacción de 40 μL para digerir 5 μg de clonal-pJFH1 con 4 U de enzima XbaI a 37 °C durante 2 h, seguida de purificación en columna y medición de la absorbancia a 260 nm en un espectrofotómetro de microvolumen12. Configure una reacción de transcripción in vitro de 20 μL del producto ep-PCR purificado en columna o clonal-pJFH1 (WT) utilizando un sistema de producción de ARN a gran escala disponible comercialmente de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
- En un tubo de microcentrífuga de 200 μL, mezcle aproximadamente 1 μg del producto ep-PCR purificado (bibliotecas de mutantes) o clonal-pJFH1 digerido por XbaI , 10 μL de tampón 2x que contiene ribonucleótidos y 2 μL de mezcla de enzimas T7. Mezcle todos los componentes y gire brevemente hacia abajo. Incubar la mezcla de reacción a 37 °C durante 45 min, seguido de la adición de 1 U de enzima DNasa libre de RNasa e incubar a 37 °C durante 30 min (Figura 1C).
- Purifique el ARN sintetizado in vitro utilizando un kit de limpieza de ARN según las instrucciones del fabricante, eluya en 40 μL de agua libre de ARNasa y DNasa, y estime la concentración del ARN purificado midiendo la absorbancia a 260 nm utilizando un espectrofotómetro de microvolumen12. Hacer alícuotas según sea necesario (5 μg o 2 μg) para evitar la congelación-descongelación y almacenarlas a -80 °C. Verificar la integridad y el tamaño de los transcritos virales utilizando 2 μg de ARN para una electroforesis en gel de agarosa MOPS al 0,8% con formaldehído13 (Figura 3).
3. Estimación de la proporción de mutaciones en productos de ep-PCR (bibliotecas de mutantes)
NOTA: En este paso, la proporción de nucleótidos mutados por subclonación del producto obtenido en el paso 2. se estimó que demostraba la ventaja de emplear ep-PCR para crear heterogeneidad genética utilizando dos bibliotecas de mutantes del genoma completo (ML50 y ML25) y ARN virales clonales derivados de pJFH1. La proporción de mutaciones se estimó en el gen NS5A del VHC, que también fue el gen de lectura fenotípica (resistencia a los fármacos) en este estudio.
- Configure una reacción de síntesis de ADNc de 20 μL agregando aproximadamente 1 μg del ARN viral sintetizado en el paso 2., 5 μM de cebador inverso 5'-GTGTACCTAGTGTGTGCCGCTCTA-3' y 200 U de transcriptasa inversa según las recomendaciones del fabricante.
- Usando el ADNc, amplifica un fragmento de 2571 pb que comprende el gen NS5A completo. Para ello, prepare una mezcla de reacción que contenga 0,5 μM para los cebadores 5272F y 7848R (concentración final; Tabla 3), 1,5 mM de MgCl2, 1x tampón de PCR y 1 U de Taq polimerasa de alta fidelidad en un volumen total de 50 μL y ejecutar un ciclo de amplificación utilizando las condiciones descritas en la Tabla 4.
- Ejecute el producto en un gel de agarosa a base de TAE al 0,8% para confirmar el tamaño del producto de 2571 pb y luego purifique el producto con un kit de purificación en columna según las indicaciones del fabricante. Eluir el producto purificado en columna en 40 μL de agua estéril.
- Para añadir un voladizo de 3' A al producto, añadir 0,5 μM de dATP y 1 U de ADN polimerasa Taq de baja fidelidad e incubar todo el producto de PCR a 70 °C durante 30 min junto con 1x tampón de PCR y 1,5 mM de MgCl2 (concentración final). Purifique la mezcla utilizando un kit de purificación en columna según las indicaciones del fabricante
NOTA: Alternativamente, elimine el producto de ~ 9.7 kb de largo del gel del paso 1.4. y realizar la clonación utilizando un kit disponible en el mercado para la clonación de productos de PCR larga de acuerdo con las instrucciones del fabricante o realizar la NGS del producto de ep-PCR utilizando una plataforma Illumina2. - Configure una reacción de ligadura añadiendo 5 μL de tampón de ligadura 2x, 50 ng del ADN del vector T, aproximadamente 3 veces el exceso molar del ADN de la inserción sintetizado en el paso 3.4., 3 unidades Weiss de ADN ligasa T4 y agua libre de nucleasa hasta un volumen total de 10 μL. Incubar esta reacción a temperatura ambiente durante 3 h y luego añadir 100 μL de Escherichia coli DH5α con el ADN ligado; choque térmico de las células a 42 °C durante 35 s (Figura 1B).
- Añadir 1 mL de medio Luria-Bertani (LB) (sin antibiótico) e incubar agitando suavemente durante 1 h a 37 °C para su recuperación. Centrifugar la suspensión celular a 13.800 x g, desechar el sobrenadante y volver a suspender en 200 μL de medio LB fresco.
- Colocar 100 μL de células de E. coli DH5α transformadas en una placa LB que contenga 50 μg/mL de ampicilina e incubar a 37 °C durante 16 h. Coloque minipreparaciones de 25-30 colonias en 5 mL de medio LB + 50 μg/mL de ampicilina y crezca durante la noche a 37 °C.
- Al día siguiente, extraiga los plásmidos con un kit de purificación de plásmidos de acuerdo con las instrucciones del fabricante y realice la digestión enzimática de restricción en un volumen de 10 μL con 200 ng de plásmidos aislados, 2 U de EcoR1 y 1x tampón de restricción para todas las colonias.
- Después de incubar las mezclas de digestión a 37 °C durante 3 h, resuelva los productos en gel de agarosa a base de TAE al 0,8% para confirmar la inserción del ADN plasmídico.
- Realizar la secuenciación Sanger de los plásmidos de 25 clones positivos utilizando cebadores M13 Forward, M13 reverse, 6208-SPF y 6748-SPF (Tabla 3) para determinar la proporción de mutaciones (expresada como la proporción de nucleótidos mutados) en los ARN virales derivados de las bibliotecas y el clonal pJFH1 (Figura 1B y Figura 4).
4. Transfección de ARN viral de la línea celular Huh7.5
NOTA: Utilice materiales de cultivo de tejidos libres de RNasa/DNasa y trabaje en un gabinete estéril de bioseguridad de clase II. Trabajar en la instalación de contención recomendada según las pautas de bioseguridad de la organización.
- Mantener las células Huh7.5 incubando en una incubadora de CO2 al 5% a 37 °C en un matraz de cultivo de tejidos T75cm2 que contenga 15 ml de medio de águila modificado (DMEM) completo de Dulbecco suplementado con suero fetal bovino al 10% (vol/vol), penicilina (100 U/mL) y estreptomicina (100 μg/mL) completo; Figura 1D).
- Divida las celdas en una proporción de 1:3 cuando la confluencia alcance el 90%. Lave las células con 1 solución salina tamponada con fosfato precalentada (PBS; pH 7,4). Añadir 5 ml de solución de tripsina-EDTA 1x para cubrir completamente la capa celular, agitar suavemente el matraz y, a continuación, incubar el matraz a 37 °C durante 5 min.
NOTA: El tiempo de incubación puede variar; Incubar las células hasta que la capa celular se separe completamente de la superficie del matraz de cultivo celular. - Agregue 10 ml de DMEM completo precalentado 1x, disperse las células mediante pipeteo repetido y recoja la suspensión celular en un tubo de centrífuga estéril de 15 ml o 50 ml. Centrifugar la suspensión celular a 252 x g durante 5 min a temperatura ambiente. Deseche el sobrenadante, vuelva a suspender el gránulo celular en 6 mL de DMEM completo e incube las células a 37 °C en una incubadora humidificada con 5% de CO2.
- Para el mantenimiento continuo de células Huh7.5 vírgenes vírgenes, transfectadas o infectadas por virus, repita el paso 4.2. y el paso 4.3.
- 1 día antes de la transfección, dividir las células como se describe en los pasos 4.1.-4.3., contar el número de células viables con un hemocitómetro, sembrar las células Huh7.5 a una densidad de 0,6 x 106 en placas de 35 mm en 2 ml de DMEM completo e incubar las células a 37 °C en una incubadora humidificada con 5% de CO2.
- Al día siguiente, prepare el complejo transcritorio-lípido. Para ello, diluya 10 μL de reactivo de transfección en 50 μL de medio esencial mínimo y diluya por separado 5 μg de transcritos virales en 50 μL de medio esencial mínimo.
- Incubar ambas mezclas a temperatura ambiente durante 10 min, y luego mezclarlas en un solo tubo de microcentrífuga estéril e incubar la mezcla a temperatura ambiente durante 30 min para formar el complejo transcritorio-lípido.
- Después de 16 h de incubación celular, retire el medio de cultivo de la placa de cultivo, lave las células 2 veces con PBS precalentado 1x y agregue 1,5 ml de medio esencial mínimo. Agregue lentamente el complejo transcritorio de lípidos al plato y agite suavemente con las manos para asegurar una distribución uniforme de los complejos.
- Incubar las células en una incubadora de CO2 al 5% a 37 °C durante 10 h. A continuación, retire el medio, lave las células transfectadas 2 veces con 1 ml de PBS precalentado 1x y agregue 2 ml de DMEM completo.
5. Producción de virus
- Divida las células Huh7.5 transfectadas cada 2 días o 3 días cuando alcancen el 90% de confluencia. Recoja los sobrenadantes del virus en cada división y guárdelos a -80 °C para su posterior análisis.
- En cada división, controle la propagación del virus mediante un ensayo de formación de foco (FFA) como se describe en el paso 6.2. Cosechar el virus hasta que la propagación del virus alcance el >80% de las células transfectadas (Figura 1D).
NOTA: Divida las células transfectadas en una proporción de 1:1 durante los primeros pasajes para rescatar el máximo número de variantes virales. La propagación del virus se ralentiza y la viabilidad disminuye con el aumento de las proporciones de mutaciones en los ML del genoma completo2.
6. Cuantificación de los títulos de virus
- Cuantificación de ARN viral
- Aísle el ARN viral de 140 μL de sobrenadantes de cultivo utilizando un kit de aislamiento de ARN viral de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
- Configure una reacción de qRT-PCR de 10 μl con un kit comercial de qRT-PCR de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Utilice el cebador directo R6-130-S17, el cebador inverso R6-290-R19 (concentración final de 0,2 μM cada uno) y la sonda R9-148-S21FT (concentración final de 0,3 μM) para la cuantificación del ARN del VHC (Tabla 3). Ajuste las condiciones de funcionamiento a 48 °C durante 20 minutos, 95 °C durante 10 minutos y, a continuación, 45 ciclos de 95 °C durante 15 s y 60 °C durante 1 minuto.
NOTA: La sonda debe contener el colorante indicador fluorescente 6-carboxifluoresceína (FAM) y el colorante extinguidor 6-carboxi-tetrametil-rodamina (TAMRA) en los extremos 5' y 3', respectivamente. - Ejecute reacciones en una máquina de PCR en tiempo real. Configure controles negativos, es decir, ARN extraído de los sobrenadantes de células infectadas simuladas y agua libre de nucleasas simultáneamente para garantizar la ausencia de contaminación cruzada.
- Paralelamente, genere una curva estándar utilizando un número de copias conocidas diluido en serie de 10 veces de las transcripciones del VHC (1 x 108 a 0) para la cuantificación del ARN viral. Realice la cuantificación por triplicado (Figura 1D).
- Cuantificación del título de virus infeccioso utilizando una dosis infecciosa de cultivo de tejidos al 50% (TCID50)
- Aproximadamente 16 h antes de añadir el virus, coloque 6,5 x 103 Huh7,5 células/pocillo en una placa de 96 pocillos e incube las células a 37 °C en una incubadora con 5% de CO2 .
- En un gabinete de clase II de bioseguridad, realice diluciones seriadas de 10 veces (1 ml cada una) que cubran de 1 x 10−1 a 1 x 10−6 diluciones (ocho diluciones) del virus cosechado (obtenido cuando la propagación del virus alcanza el >80% de las células, como se describe en el paso 5). Añadir 100 μL/pocillo (con ocho repeticiones) del virus diluido para infectar las células Huh7.5 y mantener la placa en una incubadora a 37 °C con 5% de CO2 durante 3 días.
- Después de 3 días, lavar las células infectadas 3 veces con 0,1 ml de PBS cada vez, y fijar y permeabilizar las células con 0,1 ml de metanol helado a -20 °C durante 20 min. Lave los pocillos con 1x PBS 3x y luego 1x con PBS-T (1x PBS/0.1% [v/v] Tween-20).
- Después de retirar el PBS-T, bloquee las células durante 30 min a temperatura ambiente con 0,1 ml de albúmina sérica bovina (BSA) al 1% que contenga un 0,2% de leche desnatada en PBST. Retirar la solución bloqueante y tratar las células durante 5 min con 0,1 mL de H 2 O2al 3% preparado en 1x PBS.
- De nuevo, lavar las células 2 veces con 1x PBS y 1x con PBS-T, luego añadir 50 μL/pocillo de anti-NS5A 9E10 mAb (1:10000, stock 1 mg/mL; un amable regalo de Charles Rice, de la Universidad Rockefeller), e incubar a temperatura ambiente durante 1 h. Vuelva a lavar los pocillos 3 veces con 1x PBS y 1x con PBS-T.
- Añadir 50 μL/pocillo de IgG secundaria anti-ratón de cabra conjugada con HRP (1:4000), incubar durante 30 min a temperatura ambiente y, a continuación, eliminar el anticuerpo no unido lavando los pocillos con 0,1 ml de 1x PBS.
- Añadir 30 μL de sustrato de color DAB (tetraclorhidrato de diaminobencidina) e incubar la placa con un suave balanceo durante 10 min a temperatura ambiente. El sustrato desarrolla un precipitado marrón en la superficie del pocillo que indica el antígeno NS5A del VHC. Retire la solución DAB y lave los pocillos 2 veces con 1 PBS y 1 vez con agua destilada. Añadir 100 μL de PBS que contenga azida sódica al 0,03%.
- Examine cada pocillo bajo un microscopio de luz invertida con un objetivo de 10x. Cuente el número de pozos positivos. Si el pocillo contiene una o más células NS5A positivas, entonces es positivo; si el pocillo muestra una ausencia de células NS5A positivas, entonces es negativo. Utilice una calculadora de Reed y Muench para estimar la dilución final que infecta el 50% de los pocillos (TCID50)14,15. Un recíproco de la dilución requerida para producir el TCID50 es el título de infectividad del virus (unidades formadoras de focos) por unidad de volumen.
NOTA: Los títulos de infectividad del virus varían para las diferentes bibliotecas de mutantes.
7. Selección de variantes virales resistentes a los medicamentos
- Disolver pibrentasvir (PIB), un inhibidor de NS5A, en DMSO al 100% a una concentración de 1 mM y diluirlo en DMEM completo a una concentración de 10 nM.
- Para determinar la concentración efectiva del 50% de PIB, sembre células Huh7.5 a una densidad de 0.6 x 10 6/pocillo en una placa de6 pocillos e incube las celdas a 37 °C en una incubadora de CO2 al 5%. Después de 16 h de incubación celular, agregue una dosis de virus ML50 o virus clonal JFH1 para infectar el 50% de las células, y luego, a las 12 h después de la infección (h p.i.), trate las células con una serie de diluciones dobles de PIB que van de 0,5 a 100 pM. Mida el FFA y cuantifique el FFU como en el paso 6.2. después de 3 días de incubación.
- Grafique las curvas dosis-respuesta utilizando los valores del ensayo de reducción de FFU en un software de análisis estadístico. A partir de la curva sigmoidal, se obtiene la concentración efectiva del 50% (EC50; Figura 5).
NOTA: El rango de concentración efectiva puede variar dependiendo de la clase, entre los antivirales contra el VHC de la misma clase y dependiendo de la biblioteca de mutantes. - Para el experimento, infecte células Huh7.5 vírgenes al 70% de confluencia con una dosis del virus ML50 (variantes derivadas del ARN ML50) para infectar el 50% de las células durante 12 h, y luego transfiera las células infectadas a placas de 6 pocillos 24 h después de la infección.
- Añadir 1x EC50 PIB (47,3 pM) a las células infectadas después de 16 h de división celular. Haga esto después de cada división celular durante seis pases consecutivos (18 días), seguidos de tres ciclos de pasaje sin fármacos, y controle la propagación del virus utilizando FFA como se describe en el paso 6.2. Amplíe los reactivos FFA según el área de crecimiento. Coseche los sobrenadantes virales en cada paso y guárdelos a -80 °C hasta su uso.
NOTA: La diseminación viral a más del 50% de las células durante el seguimiento del tratamiento puede definirse como un avance, y la diseminación viral durante el período de abstinencia del fármaco puede definirse como una recaída viral16. - Extraiga el ARN viral del sobrenadante el día 18, como se describe en el paso 6.1.1., y luego sintetice el ADNc, como se muestra en el paso 3.1. Amplifique el gen NS5A utilizando 5 μL de ADNc diluido 1:5 y los componentes de PCR descritos en el paso 3.2. A continuación, siga los pasos 3.3.-3.5. para determinar mutaciones de resistencia a fármacos NS5A en 6-8 plásmidos bacterianos positivos utilizando los cebadores de secuenciación NS5A 6186F, 6862F y 6460R (Tabla 3 y Tabla 4).
NOTA: En este estudio, informamos sustituciones en NS5A de variantes seleccionadas durante el tratamiento con PIB a 1x EC50. Esto descartará la contribución de sustituciones distintas de NS5A en la reducción de la susceptibilidad al PIB.
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Representative Results
Se puede generar una gran cantidad de variantes completas del VHC y analizarlas en busca de fenotipos resistentes a los medicamentos de interés siguiendo los procedimientos descritos en la Figura 1. Las bibliotecas de mutantes del genoma completo se sintetizaron utilizando clonal-pJFH1 en cantidades decrecientes (100-10 ng), como se muestra en la Figura 2. Los rendimientos medios de los productos de ep-PCR (bibliotecas de mutantes) oscilaron entre 3,8 y 12,5 ng/μL. La Figura 3 muestra las transcripciones virales sintetizadas a partir del clonal-pJFH1 y la biblioteca de mutantes representativa (ML50 sintetizada con 50 ng de clonal-pJFH1). El clonal-pJFH1 se linealizó a través de la digestión XbaI , mientras que ML50 se utilizó directamente en la reacción de transcripción in vitro . La proporción de mutaciones en las bibliotecas de mutantes (ARN virales mutantes) aumentó con la disminución de la entrada de pJFH1 en la reacción ep-PCR, como se muestra en la Figura 4. ML50 sintetizado usando 50 ng de la plantilla (clonal-pJFH1) tuvo 4 sustituciones por cada 10.000 pb copiados, mientras que ML25 sintetizado usando 25 ng de plantilla albergó 9 sustituciones. No se encontraron sustituciones dentro del número de nucleótidos secuenciados en clonal-pJFH1. Las variantes virales ML50 fueron menos susceptibles (12,7 veces) al pibrentasvir, un inhibidor de NS5A, en comparación con el virus clonal JFH1, como se muestra en la Figura 5. En la Tabla 5 se muestran las sustituciones de NS5A identificadas en las variantes virales de ML50 seleccionadas frente a 1 EC50 de tratamiento con pibrentasvir. De los ocho clones de NS5A, cuatro tenían una combinación de D7V + F28C, mientras que V8A + F28C y F36L ocurrieron en un clon cada uno. Estas mutaciones se encontraban en la región N-terminal de NS5A, que se sabe que alberga mutaciones de resistencia a NS5A clínicamente relevantes17.
Figura 1: Esquema de la estrategia FL-MRS y selección de fenotipos farmacorresistentes. (A) El clon de ADNc pJFH1 (tipo salvaje) lleva un genoma completo del virus de genotipo 2a y un promotor T7. El cebador J-For está aguas arriba del promotor T7, y el cebador J-Rev se encuentra en el extremo 3' del genoma del VHC. (B) Clonal-pJFH1 se muta aleatoriamente mediante PCR propensa a errores para diseñar variaciones genéticas y crear bibliotecas de mutantes del genoma completo. Clonal-pJFH1 es linealizado por la digestión XbaI . (C) Los productos de ep-PCR del genoma completo y el clonal-pJFH1 linealizado son las plantillas para la transcripción in vitro . La proporción de mutaciones en los ARN virales de MLs y clonal-JFH1 se determinó mediante la subclonación de NS5A por TA y la secuenciación de Sanger de clones positivos de TA. (D) Las variantes competentes para la replicación generadas después de la transfección de ARN viral mutante de células Huh7.5 se trataron con pibrentasvir (un inhibidor de NS5A) para la selección de fenotipos resistentes a NS5A. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Electroforesis en gel de agarosa de productos ep-PCR. Los productos de ep-PCR del genoma completo del VHC sintetizados utilizando cantidades variables de plantilla (100 ng, 50 ng, 25 ng y 10 ng de pJFH1) se separaron mediante electroforesis en gel de agarosa TAE al 0,8%. El tamaño esperado del producto ep-PCR es de 9,7 kb. Los productos separados se visualizaron mediante tinción con bromuro de etidio. El carril 1 es una escalera de ADN de 1 kb; El carril 6 es un control sin plantilla (etiquetado como H2O). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Electroforesis en gel de formaldehído y agarosa MOPS de transcripciones virales. Se utilizaron pJFH1 linealizado (Carril 2) y la biblioteca de mutantes obtenida con 50 ng (ML50) de pJFH1 que contenía ep-PCR (Carril 3) como plantillas para la reacción de transcripción in vitro . La integridad de los transcritos se analizó utilizando un gel de agarosa MOPS formaldehído al 0,8% teñido con bromuro de etidio. El carril 1 es una escalera de ARN de 1 kb. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Proporción de sustituciones en bibliotecas mutantes. Los genes NS5A de los ARN de clonal-pJFH1, ML50 y ML25 se amplificaron en PCR de alta fidelidad, seguido de la adición de un saliente 3' A, la ligadura del producto con el vector T y la transformación de E. coli DH5α con el producto ligado. Alrededor de 40.000 nucleótidos/biblioteca o clonal-pJFH1 fueron secuenciados por Sanger. Se muestra una proporción media de mutaciones por cada 10.000 pb copiadas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: Estimación de la CE50 de pibrentasvir frente a las variantes ML50. Las células Huh7.5 se infectaron con variantes clonales del virus JFH1 o ML50 y se trataron con diluciones dobles en serie a partir de 100 pM de pibrentasvir, seguidas de FFA después de 3 días. Las curvas sigmoidales dosis-respuesta utilizando los valores del ensayo de reducción de FFU se trazaron en un software de análisis estadístico para estimar la concentración efectiva del 50%. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| Componentes para 50 μL | Valor de las existencias requeridas | Concentración/reacción final |
| Búfer de PCR 10x | 5,0 μL | 1 vez |
| MgCl2 (50 mM) | 1,5 μL | 1,5 mM |
| Extensor de KB | 2,0 μL | - |
| dNTPs (10 mM) | 1,0 μL | 0,2 mM |
| Imprimación directa (10 μM) | 1,0 μL | 0,2 μM |
| Imprimación inversa (10 μM) | 1,0 μL | 0,2 μM |
| ADN polimerasa Taq (10 U/μL) | 0,5 μL (diluido 1:4) | 1 U |
| Plantilla (pJFH1, 20 ng/μL) | De 0,5 a 5,0 μl | De 10 a 100 ng |
| Agua | De 32,5 a 37,5 μl | Ajuste para el volumen final de 50 μL |
Tabla 1. Componentes de Ep-PCR para la amplificación del genoma completo del VHC.
| Temperatura | Hora | Ciclo(s) |
| 95 °C | 3 minutos | 1 |
| 95 °C | 30 segundos | 30 |
| 60 °C | 25 segundos | |
| 72 °C | 8 minutos | |
| 72 °C | 10 minutos | 1 |
| 4 °C | Sostener |
Tabla 2. Condiciones cíclicas para la ep-PCR del genoma completo del VHC.
| Ensayo | Cebador | Secuencia (5'-3') |
| Amplificación de NS4B-NS5A-NS5B parcial | 5272F | TGGCCCAAAGTGGAACAATTTTGG |
| 7848R | GGCCATTTTCTCGCAGACCCGGAC | |
| Síntesis de ADNc | 9464R | GTGTACCTAGTGTGTGCCGCTCTA |
| qRT-PCR | R9-148-S21FT (sonda TaqMan) | CTGCGGAACCGGTGAGTACAC |
| R6-130-S17 | CGGGAGAGCCATAGTGG | |
| R6-290-R19 | AGTACCACAAGGCCTTTCG | |
| Cebadores de secuenciación para determinar las proporciones de mutaciones en productos de ep-PCR | 6208-FPS | CCCAACTACTTGGCTCTCTTAC |
| 6748-FPS | GACGGTGTGCAGATCCATAG | |
| Secuenciación del gen NS5A (y para determinar las proporciones de mutaciones en productos ep-PCR) | 6186F | CAACGCAGAACGAGACCTCATCCC |
| 6862F | GACCTTTCCTATCAATTGCTACAC | |
| 6460R | TGGGCACGGCCTGACTACAA |
Tabla 3. Imprimaciones y secuencias utilizadas en los ensayos.
| Temperatura | Hora | Ciclo(s) |
| 95 °C | 4 minutos | 1 |
| 95 °C | 30 segundos | 5 |
| 68 °C | 30 segundos | |
| 72 °C | 2 minutos | |
| 95 °C | 30 segundos | 5 |
| 66 °C | 30 segundos | |
| 72 °C | 2 minutos | |
| 95 °C | 30 segundos | 5 |
| 64 °C | 30 segundos | |
| 72 °C | 2 minutos | |
| 95 °C | 30 segundos | 5 |
| 62 °C | 30 segundos | |
| 72 °C | 2 minutos | |
| 95 °C | 30 segundos | 10 |
| 60 °C | 30 segundos | |
| 72 °C | 2 minutos | |
| 72 °C | 10 minutos | 1 |
| 4 °C | Sostener |
Tabla 4. Condiciones cíclicas para la amplificación NS5A.
| Sustitución(es) | No. de clones (n=6) |
| D7V+F28C | 4 |
| V8A+F28C | 1 |
| F36L | 1 |
Tabla 5. Sustituciones de resistencia a pibrentasvir de NS5A.
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Discussion
En este estudio, hemos detallado un procedimiento simple y rápido de FL-MRS que integra ep-PCR18 y genética inversa para sintetizar bibliotecas de genoma completo del VHC, que luego se pueden usar en un sistema de cultivo celular para generar variantes competentes para la replicación para el cribado de fenotipos resistentes a los medicamentos. El uso de la ADN polimerasa Taq de baja fidelidad es un requisito previo de la ep-PCR que permite la incorporación de sustituciones durante la amplificación por PCR de un genoma viral completo. Probamos varias ADN polimerasas Taq de baja fidelidad y descubrimos que la ADN polimerasa Taq de platino produjo un producto ep-PCR de tamaño ~10 kb con un alto rendimiento (datos no mostrados). Se recomienda utilizar un número fijo de ciclos térmicos y variar la cantidad de plantillas de entrada para controlar la proporción de mutaciones en las bibliotecas del genoma completo. Dado que FL-MRS utiliza genomas completos erróneos como plantillas para ARN virales de longitud completa, es fundamental un diseño cuidadoso del conjunto de cebadores para garantizar que la reacción de síntesis de ARN produzca transcripciones de virus de longitud definida: (i) el cebador directo debe ubicarse aguas arriba (~ 50 nucleótidos) del promotor T7 del clon de ADNc para facilitar la unión de la polimerasa T7 al producto ep-PCR; y (ii) la secuencia inversa del cebador debe terminar en el extremo 3' del genoma del virus para facilitar la escorrentía de la transcripción durante la síntesis de ARN in vitro .
Sin embargo, el método es relativamente rudimentario y no hay control sobre la incorporación del número y tipo de sustituciones requeridas en las regiones de interés del genoma. Una de las principales ventajas de FL-MRS es que los transcritos completos sintetizados se pueden utilizar directamente para transfectar células, lo que hace que el enfoque sea simple y eficiente para generar un gran grupo de variantes virales. Por el contrario, los métodos de extensión de la polimerasa circular y mutagénesis por inserción de transposones Mu requieren la clonación del producto de la PCR y el cribado de los transformantes antes de seleccionar el fenotipo deseado, lo que limita gravemente la diversidad del conjunto de mutantes. Aunque nuestro método aumenta en gran medida la posibilidad de producir varios fenotipos deseados, normalmente se requiere la evaluación de variantes virales individuales en el cribado.
La integración de la ep-PCR con la genética inversa del virus nos permitió generar rápidamente mutantes del VHC. Este método tiene el potencial de generar cientos de virus modificados genéticamente, una hazaña aparentemente imposible con las técnicas de mutagénesis in vitro disponibles actualmente. El método que se detalla aquí es fácilmente adaptable a clones de ADNc que portan cualquier virus (+)ssRNA que contenga genomas de hasta ~10 kb de longitud.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
El apoyo financiero (número de subvención BT/PR10906/MED/29/860/2014) para este estudio fue proporcionado por el Departamento de Biotecnología del Gobierno de la India.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 kb plus DNA ladder | Thermo Fisher | 10787018 | |
| 1.5 ml centrifuge tube | Tarsons | 500010 | |
| 15 ml centrifuge tube | Tarsons | 546021 | |
| 35 mm cell culture dish | Tarsons | 960010 | |
| 50 ml centrifuge tube | Tarsons | 546041 | |
| Acetic acid | Merck | A6283 | |
| Agarose | HiMedia | MB080 | |
| Agrose gel electrophoresis unit | BioRad | 1704406 | |
| Biosafety Cabinet, ClassII | ESCO | AC2 4S | |
| Bovine serum albumin | HiMedia | MB083 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5424-R | |
| CFX Connect Real-Time PCR Detection System | BioRad | 1855201 | |
| Cloning plates 90 mm | Tarson | 460091 | |
| CO2 Incubator | New Brunswick | Galaxy 170R | |
| Colibri Microvolume Spectrometer | Titertek-Berthold | 11050140 | |
| DAB Substrate Kit | Abcam | ab94665 | |
| dATP Solution | NEB | N0440S | |
| Deoxynucleotide (dNTP) Solution Set | NEB | N0446 | |
| Diethyl Pyrocarbonate (DEPC) | SRL chemical | 46791 | |
| Dimethyl sulphoxide (DMSO) | HiMedia | MB058 | |
| DMEM high glucose | Lonza | BE12-604F | |
| EcoR1-HF | NEB | R3101 | |
| EDTA tetrasodium salt dihydrate | HiMedia | GRM4918 | |
| Ethidium Bromide | Amresco | X328 | |
| Fetal bovine serum | Gibco | 26140079 | |
| Formaldehyde | Fishser Scientific | 12755 | |
| Gel Documentation System | ALPHA IMAGER | ||
| Goat anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, HRP | Thermo Fisher | A16066 | |
| Hydrogen peroxide 30% | Merck | 107209 | |
| Inverted microscope | Nickon | ECLIPSE Ts2 | |
| LB broth | HiMedia | M1245 | |
| Lipofectamine 2000 | Thermo Fisher | 116680270 | transfection reagent |
| Mechanical Pipette Set | Eppendorf | 3120000909 | |
| Methanol | Merck | 106009 | |
| Micro Tips 0.2-10 µl | Tarsons | 521000 | |
| Micro Tips 10 - 100 µl | Tarsons | 521010 | |
| Micro Tips 200-1000 µl | Tarsons | 521020 | |
| MOPS buffer | GeNei | 3601805001730 | |
| Nonessential aminoacids (NEAA) | Gibco | 11140050 | |
| One Shot TOP10 Chemically Competent E. coli | Invitrogen | C404010 | E.coli DH5α |
| Opti-MEM | Gibco | 1105-021 | minimal essential medium |
| PCR tubes 0.2 ml | Tarsons | 510051 | |
| Pencillin/streptomycin | Gibco | 15070063 | |
| pGEM-T Easy Vector System | Promega | A1360 | T-vector DNA |
| Phosphate buffer saline (PBS) | HiMedia | TI1099 | |
| Phusion High-Fidelity DNA Polymerase | NEB | M0530S | |
| Pibrentasvir | Cayman Chemical | 27546 | |
| Pipette controller | Gilson | F110120 | |
| Platinum Taq DNA Polymerase | Thermo | 10966034 | |
| Prism | GraphPad | statistical analysis software | |
| QIAamp Viral RNA Mini kit | Qiagen | 52904 | viral isolation kit |
| QIAprep Spin Miniprep Kit | Qiagen | 27106 | |
| QIAquick PCR Purification Kit | QIAGEN | 28104 | cokum purification kit |
| RNeasy Mini Kit | QIAGEN | 74104 | RNA cleanup kit |
| Serological Pipettes 25 ml | Thermo Fisher | 170357N | |
| Serological Pipettes 5 ml | Thermo Fisher | 170355N | |
| Serological Pipettes10 ml | Thermo Fisher | 170356N | |
| Single strand RNA Marker 0.2-10 kb | Merck | R7020 | |
| Skim milk | HiMedia | M530 | |
| Sodium azide 0.1 M solution | Merck | 8591 | |
| SuperScript III Reverse Transcriptase | Invitrogen | 18080044 | reverse transcriptase |
| T100 Thermal Cycler | BioRad | 1861096 | |
| T175 cell culture flask | Tarsons | 159910 | |
| T25 cell culture flask | Tarsons | 950040 | |
| T7 RiboMax Express Large Scale RNA Production System | Promega | P1320 | Large Scale RNA Production System |
| T75 cell culture flask | Tarsons | 950050 | |
| Taq DNA Polymerase | Genetix Biotech (Puregene) | PGM040 | |
| TaqMan RNA-to-CT 1-Step Kit | Applied Biosystems | 4392653 | |
| TaqMan RNA-to-CT 1-Step Kit | Thermo Fisher | 4392653 | commercial qRT-PCR kit |
| TOPO-XL--2 Complete PCR Cloning Kit | Thermo Fisher | K8050-10 | kit for cloning of long-PCR product |
| Tris base | HiMedia | TC072 | |
| Trypsin-EDTA solution | HiMedia | TCL007 | |
| Tween 20 | HiMedia | MB067 | |
| Vacuum Concentrator | Eppendorf, Concentrator Plus | 100248 | |
| Water bath | GRANT | JBN-18 | |
| Xba1 | NEB | R0145S |
References
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